3. metodologi penelitian 3.1 waktu dan tempat … · miring dan dipindahkan pada gelas obyek....
Post on 02-Mar-2019
227 Views
Preview:
TRANSCRIPT
3. METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu Dan Tempat Penelitian
Analisis laboratorium dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Hasil
Perairan, Mikrobiologi Hasil Perairan Program Studi THP, Laboratorium
Teknologi Industri Pertanian dan Laboratorium Terpadu Institut Pertanian Bogor.
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2010 hingga April 2011.
3.2 Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah telur tambakan
(Helostoma temminckii C.V) segar yang diperoleh dari pasar Pagi Samarinda-
Kalimantan Timur. Bahan pembantu yang digunakan adalah garam rakyat yang
diperoleh dari pasar Segiri-Samarinda. Bahan yang digunakan untuk analisis
adalah kalium khromat 5%, AgNO3 0,1 N, KH2PO4, H2SO4, NaOH, H3BO3, HCl,
NaCl, asam asetat, asam sulfinat, alkohol 96%, H2O2 3%, K2SO4, H3BO3 4%,
pereaksi biuret, violet Kristal, lugol, safranin, akuades, heksana, kertas saring,
tablet kjedhal. Medium agar yang digunakan dalam penelitian ini meliputi
trypticase soy agar (TSA), MIO medium (Motility Indole Ornithine), OF basal
medium (Oxidation Fermentation). Komposisi media agar yang digunakan dalam
penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol kaca ukuran 500
liter, baskom, timbangan, cawan petri, tabung reaksi, pipet transfer, gelas
erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, gelas pengaduk, labu takar, jarum ose,
Bunsen, autoklaf, water bath, spectrophotometer, vortex, mikroskop, timbangan
analitik, lemari es dan BBL crystal Gram positif kit (BD).
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan melalui 4 tahap, yaitu : (1) pembuatan produk
fermentasi telur tambakan, (2) isolasi bakteri, (3) identifikasi bakteri, (4) uji kimia
telur segar dan produk fermentasi telur tambakan.
14
3.3.1 Pembuatan produk fermentasi telur ikan tambakan
Produk fermentasi telur ikan tambakan diperoleh dari pengolah di daerah
Pasar Pagi Samarinda Kalimantan Timur. Dokumentasi proses pembuatan produk
fermentasi telur ikan tambakan dapat dilihat pada Lampiran 2. Pembuatan produk
fermentasi telur tambakan diawali dengan mempersiapkan bahan dan alat yang
digunakan untuk pembuatan produk tersebut. Persiapan bahan dan alat dilakukan
secara higienis untuk mengurangi kontaminasi bakteri patogen dan bakteri
kontaminan lain.
Cara pembuatan produk fermentasi telur tambakan adalah sebagai berikut:
bahan baku telur tambakan segar dibersihkan terlebih dahulu. Telur tambakan
yang telah dibersihkan tersebut kemudian diberi garam rakyat dengan
perbandingan setiap 1 kg telur ikan untuk 250 gram. Campuran antara telur
tambakan dan garam kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca yang sudah
bersih kemudian ditutup rapat, dan dimulai proses fermentasi. Proses fermentasi
berlangsung selama setahun dan penghentian proses fermentasi dilakukan dengan
cara penggorengan produk fermentasi telur tambakan pada suhu 100 oC selama 3
menit. Diagram alir proses pembuatan produk fermentasi telur tambakan dapat
dilihat pada Gambar 5.
3.3.2 Isolasi bakteri (BSN 2009)
Telur ikan tambakan yang telah difermentasi selama setahun kemudian
diisolasi bakterinya untuk mendapatkan isolat bakteri yang kemudian akan
diidentifikasi jenisnya. Isolat bakteri murni yang tumbuh dominan selama
fermentasi dipilih berdasarkan jumlah koloni yang paling banyak tumbuh.
Morfologi koloni diamati berdasarkan bentuk koloni, bentuk permukaan, bentuk
kemunculan diatas permukaan agar dan warna koloni.
Uji mikrobiologis dilakukan dengan perhitungan jumlah mikroba (Total
plate count) yang ada dalam sampel dengan pengenceran sesuai keperluan dan
dilakukan secara duplo. Pembuatan larutan contoh dengan cara mencampur
10 gram sampel dengan 90 ml larutan garam 0,85% steril kemudian diblender
hingga homogen. Prosedur total plate count (BSN 2009) dapat dilihat pada
Lampiran 3.
15
Gambar 5 Diagram alir proses pembuatan produk fermentasi telur tambakan.
Campuran diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung berisi
9 ml larutan garam 0,85% steril sehingga diperoleh pengenceran 10-2
. Kemudian
dilakukan prosedur serupa untuk pengenceran 10-3
dan seterusnya hingga
pengenceran 10-5
. Sebanyak 1 ml suspensi sel diteteskan ke dalam cawan kosong.
Media yang masih cair (54 0C) dituang ke cawan kemudian putar cawan untuk
menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi dengan posisi
terbalik didalam inkubator pada suhu 37 oC selama 24 jam. Jumlah koloni
dihitung berdasarkan rumus :
Ikan tambakan
Dicuci dan dibersihkan dengan air
Diberi garam 25% dan dimasukkan kedalam botol tertutup
Pemeraman selama 1 tahun
Produk fermentasi
telur tambakan
fermentasi
Ikan dibedah lalu telur dikeluarkan dari perut ikan
Penggorengan suhu 100 oC selama 3 menit
untuk menghentikan proses fermentasi
16
Koloni yang terpilih dari hasil kultur bakteri kemudian diisolasi dengan
metode goresan kuadran. Cawan petri yang telah berisi media TSA steril yang
telah padat dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam, untuk mendapatkan
koloni yang terpisah.
3.3.3 Identifikasi Bakteri
Identifikasi pada tahap awal dilakukan pemurnian dan pewarnaan Gram
untuk melihat kemurnian bakteri. Pewarnaan Gram juga dilakukan untuk melihat
bentuk bakteri dan reaksi terhadap pewarnaan Gram. Bakteri yang sudah murni
selanjutnya dilakukan uji biokimia untuk menentukan genus dan spesies dari
masing-masing bakteri (Cowan 1974).
(1) Pewarnaan Gram (BSN 2009)
Pewarnaan Gram pada bakteri dilakukan dengan cara mengamati sel-sel
bakteri yang telah mati dan diwarnai. Dengan cara tersebut, bentuk sel akan
menjadi lebih jelas karena warna sel dibuat kontras dengan medium
disekelilingnya, sehingga lebih mudah dilihat dibawah mikroskop. Bakteri yang
mempunyai sel dengan ukuran relatif kecil akan mudah dilihat. Pada pewarnaan
Gram diperlukan empat jenis larutan yaitu zat warna basa (kristal violet), larutan
iodium (lugol), alkohol dan safranin.
Preparat bakteri ditetesi dengan pewarna kristal violet dan dibiarkan
selama satu menit, kemudian dibilas dengan air. Selanjutnya preparat ditetesi
dengan larutan lugol dan dibiarkan selama satu menit, dicuci dengan air dan
dihilangkan warnanya menggunakan alkohol 96% selama 10-20 detik atau sampai
warna ungu tidak luntur lagi. Setelah dicuci sebentar kemudian diwarnai dengan
larutan safranin dan dibiarkan selama 10-20 detik lalu dibilas dengan air,
kemudian dikeringkan dan diperiksa di bawah mikroskop menggunakan minyak
imersi dan diamati bentuk sel serta reaksi Gram. Sel-sel bakteri yang tidak dapat
melepaskan warna akan tetap berwarna seperti warna violet kristal, yaitu biru
ungu disebut bakteri Gram positif. Sel-sel bakteri yang dapat melepaskan violet
kristal dan mengikat safranin sehingga berwarna merah atau merah muda disebut
bakteri Gram negatif. Prosedur pewarnaan Gram (BSN 2009) secara lengkap
dapat dilihat pada Lampiran 4.
17
(2) Uji motilitas (BSN2009)
Uji motilitas merupakan uji yang digunakan untuk melihat sifat
pergerakan bakteri yang dapat dilihat dengan pergerakan selnya. reaksi positif
ditandai oleh adanya pertumbuhan bakteri yang menyebar sedangkan untuk reaksi
yang negatif menunjukkan bakteri hanya tumbuh pada daerah tusukan saja.
Pengujian ini dilakukan dengan cara sebagai berikut: secara aseptis menggunakan
ose yang lurus bagian ujungnya, isolat bakteri ditusukkan ke dalam MIO media.
Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 35ºC selama dua hari. Bila pertumbuhan
menyebar, maka bakteri tersebut bergerak atau motil, dan bila pertumbuhan
bakteri tidak menyebar, hanya berupa garis saja, maka bakteri tersebut bersifat tidak
bergerak (non motil). Prosedur uji motilitas (BSN 2009) secara lengkap dapat
dilihat pada Lampiran 5.
(3) Uji katalase (BSN 2009)
Uji katalase digunakan untuk mengetahui adanya enzim katalase pada
bakteri, dimana enzim ini berperan dalam memecah hidrogen peroksida menjadi
air dan oksigen. Uji ini penting dilakukan untuk mengetahui sifat bakteri terhadap
kebutuhan akan oksigen. Secara aseptis diambil satu ose kultur bakteri dari agar
miring dan dipindahkan pada gelas obyek. Kemudian diteteskan 1-3 tetes larutan
H2O2 3%. Keberadaan enzim katalase ditandai dengan terbentuknya gelembung-
gelembung kecil oksigen yang terlihat seperti busa sabun. Prosedur uji katalase
(BSN 2009) secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 6.
(4) Uji oksidase (BSN 2009)
Uji oksidase berfungsi untuk menentukan oksidase sitokrom yang
biasanya terdapat pada mikroorganisme patogen. Secara aseptis diambil satu ose
kultur bakteri lalu digoreskan pada kertas saring yang sudah diberi pereaksi
oksidase atau biasa digunakan juga stik oksidase. Hasil reaksi dinyatakan negatif
jika tidak ada perubahan warna pada kertas saring dan dinyatakan positif jika
terjadi perubahan warna biru keunguan pada goresan dalam waktu singkat.
Prosedur uji oksidase (BSN 2009) secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 7.
18
(5) Uji oksidatif-fermentatif (BSN 2009)
Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam
menggunakan karbohidrat dengan cara fermentasi atau oksidasi. Bakteri yang
akan diuji, secara aseptis dengan menggunakan ose diinokulasikan kedalam
medium tegak yang sudah disiapkan terlebih dahulu. Setiap bakteri yang akan
diuji ditusukkan ke dalam dua tabung yang berisi media OF, tabung pertama
ditutupi dengan parafin 3-5 ml, sedangkan tabung kedua tanpa parafin. Inkubasi
dilakukan pada suhu 30 ºC selama 24 jam. Bila terjadi perubahan warna
(terbentuk warna kuning) pada kedua tabung, maka bakteri bersifat fermentatif.
Bila hanya tabung tanpa parafin yang berubah warna (terbentuk warna kuning)
maka bakteri bersifat oksidatif sedangkan bila tidak terjadi perubahan warna pada
kedua tabung tersebut berarti uji oksidatif-fermentatif bersifat negatif. Prosedur
uji oksidatif fermentatif(BSN 2009) secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 8.
(6) BBL crystal kit system
Bakteri kultur murni yang telah diperoleh, diidentifikasi untuk mengetahui
jenis bakteri pada produk fermentasi telur ikan tambakan. Metode identifikasi ini
menggunakan kit BBL crystal yang di produksi oleh perusahaan BD (Becton,
Dickinson and Company). Kit BBL crystal terdiri dari 29 microplates (mikro
cawan) yang berisi substrat biokimia dan enzim. Pengujian menggunakan kit ini
berdasarkan pada kemampuan mikrobia dalam memanfaatkan dan mendegradasi
substrat spesifik yang dapat dideteksi menggunakan berbagai macam sistem
indikator warna. Prosedur BBL Crystal ID GP secara lengkap dapat dilihat pada
Lampiran 9.
Prinsip dari metode ini adalah menanam bakteri pada microplates (mikro
cawan). Kemampuan bakteri dalam menghidrolisis substrat akan menghasilkan
perubahan warna dalam lubang mikro yang dapat terdeteksi secara visual. Data
warna-warna yang telah diperoleh akan dicocokkan pada tabel warna yang
memiliki nilai tertentu. Nilai-nilai tersebut selanjutnya dimasukkan dalam bank
data (software) BBL crystal dan diperoleh hasil identifikasi bakteri hingga tingkat
spesies. Tahapan pengujian mikrobiologi fermentasi telur tambakan dapat dilihat
pada Gambar 6.
19
Telur tambakan fermentasi
ditimbang 10 gram
digerus + 90 ml pengencer
suspensi
pengenceran secara desimal
(10-2
, 10-3
, 10-4
, 10-5
)
TSA + 0%; 5%; 10% NaCl A
Inkubasi 37 0C (24 jam)
Penghitungan koloni
Isolasi koloni
(bentuk, penampakan, warna)
Pemurnian isolat
(metode gores)
B
Isolat pada agar miring
Uji morfologi dan fisiologi
identifikasi
Gambar 6 Diagram alir pengujian mikrobiologi kuantitatif (A) dan kualitatif (B).
20
3.3.4 Analisis kimia
(1) Pengukuran nilai pH (AOAC 1995)
Terlebih dahulu pH meter dinyalakan, kemudian elektroda pH meter
dimasukkan dalam buffer 4,31 dan 6,86 lalu sampel sebanyak 5 gram ditimbang
dan diberi aquades sebanyak 100 ml, setelah itu dihaluskan. Setelah itu elektroda
dicelupkan pada larutan sampel dan dibiarkan beberapa saat sampai diperoleh
pembacaan yang stabil. Nilai yang diperoleh dari pembacaan pada pH meter
sampai angka digital menunjukkan nilai pH tetap.
(2) Kadar garam (Cl) (AOAC 1995)
Penetapan kadar garam sampel yang dilakukan berdasarkan metode Mohr
terdiri dari langkah-langkah berikut ini: sebanyak 5 gram sampel dimasukkan ke
dalam cawan porselin untuk diabukan pada suhu 600 oC selama 12 jam. Abu yang
diperoleh tersebut dilarutkan dengan aquades sampai volumenya mencapai
100 mL dan kemudian disaring. Hasil dari penyaringan tersebut dipipet sebanyak
10 mL kedalam beaker glass 50 ml, kemudian ditambahkan 3 mL K2CrO4 (kalium
khromat) 5%. Selanjutnya kedalam beaker glass dititrasi dengan larutan perak
nitrat (AgNO3) 0,2 N. Titik akhir titrasi tercapai setelah terbentuk endapan perak
khromat (Ag2CrO4) yang berwarna oranye atau jingga.
Rumus yang digunakan untuk menghitung kadar NaCl yaitu :
(k) Pengukuran Nilai pH (AOAC 1995)
(3) Kadar air (AOAC 1995)
Prosedur penentuan kadar air adalah sebagai berikut: Sampel yang sudah
homogen ditimbang 5 gram dan diletakkan di dalam cawan kosong yang sudah
ditimbang beratnya, dimana cawan dan tutupnya sudah dikeringkan di dalam oven
serta didinginkan di dalam desikator. Cawan yang berisi sampel kemudian ditutup
dan dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 100 ºC selama 5 jam atau sampai
beratnya konstan. Cawan lalu didinginkan di dalam desikator dan setelah dingin
cawan ditimbang.
x 100%
Titer x Normalitas AgNO3 x 58,5 x 10
Mg berat sampel Kadar NaCl (%) =
21
Kadar air ditentukan dengan rumus:
(4) Kadar abu (AOAC 1995)
Kadar abu ditentukan dengan prosedur sebagai berikut: Sampel sebanyak 5
gram dimasukkan ke dalam cawan pengabuan yang telah ditimbang dan dibakar di
dalam tanur serta didinginkan dalam desikator. Cawan yang berisi sampel
dimasukkan ke dalam tanur pengabuan dan dibakar sampai didapat abu yang
berwarna keabu-abuan. Suhu pemanasan dinaikkan secara bertahap sampai suhu
mencapai 550 ºC dan dibiarkan selama 1 jam. Setelah suhu tungku pengabuan
turun sekitar 200 °C, cawan yang berisi abu tersebut didinginkan di dalam
desikator selama 30 menit dan kemudian ditimbang beratnya.
Kadar abu ditentukan dengan rumus:
(5) Kadar protein (AOAC 1995)
Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode mikrokjeldahl, dengan
prosedur sebagai berikut: Sampel ditimbang sebanyak 1-2 gram, kemudian
dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Lalu di tambahkan berturut-turut 15 gram
NaSO4, 1 gram CuSO4, satu atau dua butir batu didih dan 25 ml asam sulfat pekat.
Larutan dididihkan sampai cairan menjadi jernih tidak berwarna atau hijau muda
(minimum 2 jam dan tidak kurang 30 menit). Setelah larutan didinginkan,
ditambahkan 200 mL air secara hati-hati. Untuk alat destilasi, 100 mL HCl 0,1 N
dipipet ke dalam erlenmeyer 500 mL. Satu ml indikator Conway ditambahkan
ke dalamnya. Labu dilengkapi dengan kondensor dan diletakkan sehingga ujung
kondensor tercelup ke dalam larutan asam. Labu Kjeldahl yang berisi contoh
yang sudah didestruksi diletakkan di dalam sistem, kemudian ditambahkan NaCl
50 %, kocok hati-hati campuran dengan gerakan memutar. Dipanaskan hingga
semua gelembung ammonia keluar (sampai jumlah destilat kira-kira 150 mL).
Setelah selesai, rangkaian destilasi dibongkar hati-hati, ujung kondensor dicuci
%100(g)contoh berat
(g) keringcontoh berat - (g)contoh berat (%)air Kadar
% 100 (g) sampelberat
(g)abu berat (%)abu Kadar
22
dengan akuades, dan kelebihan larutan HCl dititrasi dalam destilat dengan larutan
NaOH standar. Kadar protein ditentukan dengan rumus:
(6) Kadar lemak (AOAC 1995)
Penentuan kadar lemak dilakukan menggunakan metode ekstraksi soxhlet.
Cara penentuannya adalah dimasukkan sebanyak 5 g sampel yang sudah
dibungkus dengan kertas saring kedalam alat soxhlet, kemudian 50 mL pelarut
dietil eter dituang ke dalam labu lemak. Selanjutnya direfluks selama minimum
5 jam sampai pelarut yang turun kembali ke labu lemak berwarna jernih. Pelarut
yang ada di labu lemak tersebut didestilasi, labu yang berisi hasil ekstraksi
dipanaskan dalam oven pada suhu 100 ºC selama 60 menit atau sampai beratnya
tetap. Setelah didinginkan dalam desikator, labu lemak tersebut ditimbang sampai
memperoleh berat yang konstan. Kadar lemak ditentukan dengan rumus:
(7) Analisis logam berat (AOAC 1995)
Sampel ditimbang sebanyak 5 gram lalu dimasukkan ke dalam cawan
kemudian ditambahkan 5 mL MgNO3 10 % dalam etanol lalu dikeringkan dalam
oven selanjutnya diabukan pada suhu 600 0C. Hasil pengabuan kemudian
ditambahkan 2 mL HNO3, lalu dipanaskan kembali sampai kira-kira volume
tinggal 1 mL setelah itu dinginkan. Setelah dingin kemudian tambahkan 10 mL
HCl 3N dan dipanaskan lagi sampai kira-kira volume tinggal setengahnya. Setelah
itu didinginkan kembali, dan diencerkan dengan aquades sampai 50 mL dan
disaring, hasil saringan kemudian diukur dengan Spektroskopi serapan atom
(SSA).
6,25 N % protein Kadar
% 100 sampel mg
14,007 HCl N blanko ml - HCl ml N %
% 100 (g) sampelberat
(g)lemak berat (%)lemak Kadar
23
(8) Analisis mineral (AOAC 1995)
Metode ini dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer absorpsi
atom untuk menentukan kadar mineral yang terdapat didalam bahan pangan.
Prinsip alat ini adalah sesudah penghilangan bahan-bahan organik dengan
pengabuan kering atau basah, residu dilarutkan dalam asam encer. Larutan
disebarkan dalam nyala api yang ada didalam alat SSA sehingga absorpsi atau
emisi logam dapat dianalisis dan diukur pada panjang gelombang tertentu.
Sampel ditimbang sebanyak 5 gram lalu dimasukkan ke dalam cawan
kemudian ditambahkan 5 mL MgNO3 10 % dalam etanol. sampel dikeringkan
dalam oven, selanjutnya diabukan pada suhu 600 0C. Hasil pengabuan kemudian
ditambahkan 3 mL HNO3, dipanaskan kembali sampai kira-kira volume tinggal
1 mL setelah itu dinginkan. Setelah dingin kemudian tambahkan 10 mL HCl 3N
dan dipanaskan lagi sampai kira-kira volume tinggal setengahnya. Setelah itu
dinginkan kembali, dan diencerkan dengan aquades sampai 50 mL dan disaring,
untuk pengujian Mg, Ca, Na dan K, pipet larutan yang telah disaring sebanyak
25 mL lalu ditambahkan 1 mL lantannum 5% dan diencerkan hingga 50 mL
setelah itu di ukur dengan SSA.
(9) Analisis asam amino (AOAC 1995)
Prosedur analisis asam amino terdiri dari beberapa tahap yang secara rinci
dapat dilihat pada Lampiran 10, tahapan prosedur analisis asam amino tersebut
yaitu: (1) preaparsi sampel, (2) pembuatan pereaksi OPA, (3) pembuatan buffer
sebagai fase mobil, (4) pengaturan alat HPLC, (5) analisis asam amino, (6)
perhitungan asam amino. Hasil analisis asam amino bisa ditingkatkan dengan
memanfaatkan reaksi pra kolom gugus amino dengan pereaksi tertentu
membentuk suatu derivat yang dapat menyerap sinar UV atau berflouresensi.
Salah satu pereaksi pra kolom yang sangat populer dalam analisis asam amino
adalah ortoftalaldehida (OPA). Pereaksi OPA akan bereaksi dengan asam amino
primer dalam suasana basa yang mengandung merkaptoetanol membentuk
senyawa yang berfluoresensi, sehingga deteksinya dapat dilakukan dengan
detektor flouresensi.
Analisis asam amino dilakukan dengan cara melarutkan sampel yang telah
dihidrolisis dalam 5 mL HCl 0,01 N kemudian saring dengan kertas milipore.
24
Buffer Kalium Borat pH 10,4 ditambahkan dengan perbandingan 1:1. Lalu
kedalam vial kosong yang bersih dimasukkan 10 µL sampel dan ditambahkan
25 µL pereaksi OPA, dibiarkan selama 1 menit agar derivatisasi berlangsung
sempurna. sebanyak 5 µL diinjeksikan ke dalam kolom HPLC kemudian ditunggu
sampai pemisahan semua asam amino selesai. Waktu yang diperlukan sekitar 25
menit. Konsentrasi asam amino (dinyatakan dalam µmol AA) dalam sampel.
Prosedur analisis asam amino (AOAC 1995) secara lengkap dapat dilihat pada
Lampiran 10.
Konsentrasi asam amino (dinyatakan dalam µmol AA) dalam sampel
Persen asam amino dalam sampel adalah:
= µmol AA x Mr. AA x 100
µg sampel
(10) Analisis asam lemak (AOAC 1995)
Analisis dengan kromatografi gas didasarkan pada partisi
komponen-komponen dari suatu cairan di antara fase gerak berupa gas dan fasa
diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada
bahan pendukung inert. Komponen-komponen yang dipisahkan harus mudah
menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehingga suhu operasi biasanya
lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukan derivatisasi untuk contoh
yang sulit menguap. Dalam hal analisis asam lemak, maka mula-mula
lemak/minyak dihidrolisis menjadi asam lemak, kemudian ditransformasi menjadi
bentuk esternya yang bersifat lebih mudah menguap. Dalam metode ini,
transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil ester asam
lemak (FAME). Selanjutnya FAME ini dianalisis dengan alat kromatografi gas.
Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan membandingkan waktu
retensinya dengan standar pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi
dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada saat muncul puncak
25
pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan.Penentuan
kandungan komponen dalam contoh dapat dilakukan dengan teknik standar
eksternal atau internal standar. Luas puncak dari masing-masing komponen adalah
berbanding lurus dengan jumlah komponen tersebut dalam contoh. Untuk
meminimalkan kesalahan akibat volume injeksi, preparasi sampel, pengenceran
dan sebagainya, lebih baik digunakan teknik standar internal. Disamping itu
koreksi terhadap respon detektor dan interaksi antar komponen dalam matrik
contoh selama melewati kolom juga harus dilakukan. Prosedur analisis asam
lemak (AOAC 1995) secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 11. Metode
internal standar, jumlah dari masing-masing komponen dalam sampel dapat
dihitung dengan cara sebagai berikut :
Keterangan :
Cx = kosentrasi komponen x
Cs = kosentrasi standar internal
Ax = luas puncak komponen x
As = luas puncak standar internal
R = respon detektor terhadap komponen x relatif terhadap standar.
Pada metode standar, dilakukan preparasi yang sama, hanya contoh dan
standar dilakukan secara terpisah, tidak ada penambahan larutan standar ke dalam
contoh. Jumlah kandungan komponen dalam contoh dihitung sebagai berikut :
top related