260110130150 sheila pratiwi pewarnaan sederhana
Post on 11-Feb-2016
117 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN SEDERHANA
Senin, 3 Maret 2015
Kelompok III
Senin, Pukul 13.00 – 16.00 WIB
Nama NPM
Sheila Pratiwi 260110130150
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai TTD
(Dhiya) (Emanuel) (Puspagita)
Pewarnaan Sederhana
I. Tujuan
Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan
menggunakan satu macam zat pewarna
II. Prinsip
1. Ikatan ion
Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara komponen
seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut
kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.
2. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan hanya
terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan
suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum.
3. Teknik aseptis
Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi
bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang
percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun
praktikan. Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi.
III. Teori Dasar
Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat
kecil, bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan
mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2004).
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah
”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya
digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Mirojiah, 2014).
Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk,
susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna
khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal
terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion
positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan
Whleer, 1998)
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan
asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat
yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri
tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
(Dwidjoseputro, 1989).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode
pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan
gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan
diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan
gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk
mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan
untuk:
- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.
- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.
- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.
Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen untuk pemeriksaan
mikroskopik adalah: (Pelczar, 1986)
- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek. Fiksasi olesan
pada kaca objek.
- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan
pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial) (Pelczar, 1986)
Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara
langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui
biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk:
(Suriawiria, 1985)
- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.
- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik
dan kimia yang ada akan dapat diketahui (Suriawiria, 1985)
IV. Alat dan Bahan
1. Air suling dalam botol semprot
2. Alkohol
3. Bak Pewarna
4. Kaca Objek
5. Kertas Saring
6. Minyak Imersi
7. Mikroskop Majemuk
8. Ose
9. Pembakar Spirtus
10. Sampel air liur
11. Zat warna CGV dan metilen blue
V. Prosedur
Olesan bakteri dari air liur dibuat di atas kaca objek yang bersih dan
bebas lemak. Setelah dingin, preparat diletakkan di atas bak warna dan
digenangi dengan metilen blue, lalu didiamkan selama 2 menit. Lalu,
zat warna berlebih dituangkan dan preparat dibilas dengan air. Preparat
dikeringkan dengan kertas saring kemudian preparat ditetesi minyak
imersi dan diperiksa di bawah mikroskop dan digambarkan hasilnya.
Prosedur diulang dengan membuat preparat baru dengan sampel yang
sama dengan zat warna lain yaitu CGV.
VI. Hasil Pengamatan
VII. Pembahasan
Praktikum kali ini adalah menganai pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana
adalah teknik pewarnaan sel bakteri di mana zat warna yang digunakan hanya satu
zat warna dan pewarnaan ini hanya terbatas untuk identifikasi morfologi bakteri
saja. Zat warna yang biasa digunakan dalam teknik pewarnaan sederhana ini
antara lain Carbol Gentian Violet, Safranin, metilen blue, fuchsin, dan masih
banyak zat warna lainnya.
Sampel yang digunakan untuk praktikum kali ini adalah sampel dari air liur
seorang praktikan yang menjadi relawan di tiap kelompok. Prosedur diawali
dengan mengambil kaca objek dalam desiinfektan dan membersihkannya dengan
alkohol untuk meyakinkan bahwa kaca objek telah benar – benar bersih dan bebas
dari lemak. Lemak yang mungkin ada pada kaca objek bisa dilarutkan dengan
alkohol. Tahapan dilanjutkan mengambil sampel air liur yang berada dalam
cawan petri dengan ose yang harus dipijarkan terlebih dahulu. Pemijaran ose
tersebut berfungsi untuk mensterilisasi ose agar bebas dari kontaminan..
Pengambilan sampel dengan ose dilakukan di dekat api, begitupun dengan
pembukaan cawan petri saat pengambilan sampel. Hal ini dimaksudkan agar tidak
ada kontaminan yang masuk ke dalam sampel karena akan mengganggu hasil
pengamatan. Setelah ose berpijar, ose didinginkan di dekat api lalu sampel
diambil dengan ose dan diusapkan pada kaca objek yang telah bersih dan bebas
dari lemak. Ose kembali dipijarkan pada api sebelum disimpan kembali agar ose
tetap dalam keadaan steril. Setelah berhasil membuat usapan, kaca objek dengan
bakteri yang berada di dalam air liur difiksasi dengan cara dilewatkan di atas api.
Hal ini dimaksudkan agar bakteri tetap melekat di tempatnya (di atas kaca objek)
walaupun akan ada proses pewarnaan ataupun pembersihan zat warna dengan
aquades. Proses fiksasi ini hanya sekedar melewatkan preparat di atas api, bukan
memanaskannya karena bakteri bisa mati jika suhu terlalu panas. Daerah usapan
ditandai agar kita tahu di mana letak daerah usapan bakteri yang kita buat.
Selanjutnya, kaca objek yang telah difiksasi ditetesi dengan zat warna di atas bak
pewarna agar zat warna yang berlebih nantinya dialirkan ke bak warna dan tidak
mengotori daerah kerja lainnya. Zat warna yang digunakan praktikan pertama kali
oleh praktikan adalah metilen blue. Metilen blue diteteskan di daerah usapan
bakteri lalu didiamkan selama 2 menit. Setelah sekitar 2 menit, zat warna berlebih
dibuang dan kaca objek kemudian dialiri aquades untuk membersihkan sisa zat
warna. Preparat kemudian dikeringkan dengan kertas saring secara perlahan agar
bakteri tidak kemudian menempel di kertas saring. Sesudah kering kemudian
preparat ditetesi dengan minyak imersi untuk memudahkan pengamatan pada
mikroskop majemuk. Preparat lalu diamati dengan mikroskop.
Praktikan menggunakan perbesaran 10x pada mikroskop dan menemukan bentuk
bakteri sebagai berikut:
Pewarnaan sederhana hanya menggunakan satu pewarna saja dan karena itu
pewarnaan sederhana hanya terbatas pada pengamatan morfologi bakteri, bukan
untuk mengidentifikasi bakteri secara spesifik. Perlu teknik pewarnaan diferensial
untuk mengindentifikasi bakteri secara spesifik.
Pada pengamatan, ditemukan bakteri berbentuk coccus dan sedikit berbentuk
batang. Praktikan tidak dapat menyimpulkan bakteri apa yang ditemukan dari
hasil pengamatan karena belum dipastikan apakah bakteri tersebut adalah bakteri
gram positif atau negatif, memiliki kapsul atau tidak.
Berikutnya, praktikan kembali membuat preparat dari sampel air liur yang sama
namun kali ini dengan zat warna yang berbeda. Kaca objek dibersihkan dengan air
dan kembali dibersihkan dengan alkohol untuk menghilangkan seluruh zat warna
beserta bakteri dan juga memastikan bahwa kaca objek sudah bebas dari lemak.
Sampel air liur kemudian diambil dengan ose yang telah lebih dahulu dipijarkan
dan didinginkan dekat api. Daerah apusan yang dbuat di kaca objek kemudian
ditandai agar kita tahu daerah pengamatan bakteri nantnya. Tahapan procedural
masih sama setelah itu, yaitu melewatkan preparat di atas api yang fungsinya
adalah melekatkan bakteri tanpa merusak struktur selnya. Kali ini zat warna yang
digunakan adalah Carbol Gentian Violet atau yang lebih dikenal dengan singkatan
CGV. Sama halnya dengan pewarnaan sebelumnya, zat warna ditetesi pada
daerah apusan dan didiamkan. Hanya saja, waktu untuk mendiamkannya lebih
singkat yaitu hanya 30 detik; lebih singkat dibandingkan dengan pewarnaan
menggunakan metilen blue. Sisa zat warna dibiarkan mengalir ke bak pewarna.
Preparat kemudian dialirkan aquades untuk menghilangkan sisa zat warna dan
dikeringkan menggunakan kertas saring secara perlahan. Preparat yang telah
kering kemudian ditetesi minyak imersi dan diamati di bawah mikroskop.
Pengamatan dilakukan masih dengan perbesaran 10x. Dengan pewarnaan
menggunakan Carbol Gentian Violet ini hanya ditemukan bakteri berbentuk
coccus saja, tidak ditemukan bakteri berbentuk basil seperti yang ditmukan pada
percobaan sebelumnya. Hal ini mungkin disebabkan karena faktor bakteri yang
tidak merata pada sampel air liur atau bakteri mungkin terbawa saat pencucian
dengan air. Faktor lain yang mungkin tidak memaksimalkan pengamatan bakteri
yang praktikan lakukan adalah kurang optimalnya fiksasi sehingga masih ada
bakteri yang belum lekat, ataupun zat warna yang masih berlebih sehingga
mempersulit praktikan untuk mengamati morfologi dari bakteri yang ada.
VIII. Simpulan
Praktikan mampu mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari
bakteri, dengan menggunakan satu macam zat pewarna. Pewarna yang digunakan
adalah metilen blue untuk percobaan pertama dan CGV untuk percobaan kedua.
IX. Daftar Pustaka
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.
Gupte. 1990. Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi. Malang : UMM
Press
Mirojiah, Mety. 2014. Pengecatan Mikroba: Pengecatan Sederhana, Gram, dan
Kapsul.http://mety-mirojiah-fst12.web.unair.ac.id/artikel_detail-91780-
Umum-Pengecatan-mikroba-pengecatan-sederhana,-gram-dan-kapsul.html.
Diakses pada tanggal 7 Maret 2015
Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. Jakarta : UI Press
Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta : Gramedia
Umsl.2008. Staining Bacteria. www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf.
Diakses pada tanggal 7 Maret 2015
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta : Penerbit Erlangga
Waluyo, L . 2004 . Mikrobiologi Umum . Malang : Universitas Muhammadiyah
Malang Press
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
PEWARNAAN GRAM
Senin, 3 Maret 2015
Kelompok III
Senin, Pukul 13.00 – 16.00 WIB
Nama NPM
Sheila Pratiwi 260110130150
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015
Nilai TTD
(Dhiya) (Emanuel) (Puspagita)
Pewarnaan Gram
I. Tujuan
1. Menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram
negatif, dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram
2. Memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang terjadi
dalam prosedur tersebut.
II. Prinsip
1. Absorpsi
Absorpsi merupakan proses penyerapan suatu zat. Dalam hal ini
penyerapan yang dimaksud adalah kemampuan sel bakteri dalam
menyerap dan menjerap zat warna.
2. Pewarnaan Diferensial
Pewarnaan diferensial merupakan pewarnaan secara bertahap
dengan menggunakan pewarna tandingan untuk menentukan jenis
gram dari suatu bakteri.
3. Ikatan Ion
Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara
komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa.
4. Teknik Aseptis
Teknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin
preparasi bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic
digunakan sepanjang percobaan berlangsung baik alat, bahan,
lingkungan sekitar maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat
diterapkan metode sterilisasi.
III. Teori Dasar
Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat
berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri
merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bentuk
bakteri bermacam – macam yaitu elips, bulat, batang dan spiral. Bakteri lebih
sering diamati dalam olesan terwarnai dengan suatu zat pewarna kimia agar
mudah diamati atau dilihat dengan jelas dalam hal ukuran, bentuk, susunan
dan keadaan struktur internal dan butiran. Sel sel individu bakteri dapat
berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau spiral (heliks) (Pelczar &
Chan, 2007).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromoforiknya bermuatan positif) (Mirojiah, 2014).
Pewarnaan gram ditemukan pada tahun 1884 oleh seorang dokter kebangsaan
Denmark Christian Gram (membuat zat pewarna khusus) pewarna tersebut
merupakan pewarna differensial karena dapat membagi bakteri menjadi dua
kelompok fisiologi, yang akan memudahkan untuk identifikasi. Prosedur
pertama dari pewarnaan gram ini adalah memberi pewarna kristal violet,
setelah 1 menit dibilas dan kemudian akan diberikan pewarna yodium, setelah
satu menit dibilas dan kemudian akan diberi laputan alkohol 95% selama 30
detik, kemudian dibilas dan diberi pewarna safranin atau bismarck (untuk buta
warna merah) selama 1 menit. Zat pewarna kristal violet dan yodium akan
membentuk senyawa yang kompleks. Beberapa bakteri akan melepaskan zat
pewarna dengan mudah apabila dicuci dan beberapa bakteri yang lain zat
pewarna akan bertahan walaupun dicuci dengan alkohol 95%. Bakteri gram
positif akan terwarna ungu (kristal violet) dan bakteri gram negatif akan
terwarna merah (safranin) (Umsl, 2008).
Proses pewarnaan gram ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas
dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan
bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat
dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna
basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut
bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar
tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat
mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen
dinding sel tidak kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci.
Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka
warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna
dasar. Larutan yang biasa dipakai adalah ungu kristal, lartan iodium, alkohol
dan safranin (Tracy, 2005).
Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan
Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi,
struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi
penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal
violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan
berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk
kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin,
bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah
Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium
dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram
negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan
memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram
negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella,
Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman, 1983).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.
Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan
asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat
yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri
tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies
(Dwidjoseputro, 1989).
Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut
kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode
pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan
gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan
diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan
gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk
mewarnai sel bakteri (Umsl, 2008).
IV. Alat dan Bahan
1. Air suling dalam botol semprot
2. Alkohol
3. Bak Pewarna
4. Bakteri E.coli dan S. aureus
5. Kaca Objek
6. Kertas Saring
7. Minyak Imersi
8. Mikroskop Majemuk
9. Ose
10. Pembakar Spirtus
11. Sampel air liur
12. Zat warna CGV, lugol, dan fuchsin
V. Prosedur
Kaca objek bersih disiapkan dan dibuat olesan bakteri yang telah
disiapkan. Kaca objek lalu diletakkan di atas rak kawat di atas bak
pewarna dan digenangi Carbol Gentian Violet selama kurang lebih
satu menit lalu zat warna berlebih dibuang dan dibilas dengan air
suling. Olesan bakteri kembalii digenangi lugol selama 2 menit lalu zat
warna berlebih dibuang dan dibilas kembali dengan air suling. Olesan
kemudian dicuci dengan alkohol sampai zat warna larut lalu dibilas
dengan air suling. Olesan kemudian digenangi dengan pewarna
tandingan fuksin selama 30 detik dan zat warna berlebih dibuang,
dibilas dengan air suling. Preparat dikeringkan dengan kertas saring
dan ditetesi sedikit minyak imersi lalu diperiksa di bawah mikroskop
VI. Hasil Pengamatan
VII. Pembahasan
Praktikum kali ini adalah menganai pewarnaan gram. Pewarnaan gram adalah
teknik pewarnaan sel bakteri di mana lebih dari satu zat warna yang digunakan.
Teknik pewarnaan ini dapat mengidentifikasi morfologi dan jenis gram dari suatu
bakteri. Zat warna yang biasa digunakan dalam teknik pewarnaan sederhana ini
antara lain Carbol Gentian Violet yang dikomplekskan dengan lugol dan fuchsin
atau safranin sebagai zat warna tandingan.
Sampel yang digunakan untuk praktikum kali ini adalah sampel bakteri
Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Prosedur diawali dengan mengambil
kaca objek dalam desinfektan dan membersihkannya dengan alkohol untuk
meyakinkan bahwa kaca objek telah benar – benar bersih dan bebas dari lemak.
Lemak yang mungkin ada pada kaca objek bisa dilarutkan dengan alkohol.
Tahapan dilanjutkan mengambil sampel yang berada dalam tabung reaksi dengan
ose yang harus dipijarkan terlebih dahulu. Pemijaran ose tersebut berfungsi untuk
mensterilisasi ose agar bebas dari kontaminan. Pengambilan sampel dengan ose
dilakukan di dekat api, begitupun dengan pembukaan tabung reaksi saat
pengambilan sampel. Hal ini dimaksudkan agar tidak ada kontaminan yang masuk
ke dalam sampel karena akan mengganggu hasil pengamatan. Setelah ose berpijar,
ose didinginkan di dekat api lalu sampel diambil dengan ose dan diusapkan pada
kaca objek yang telah bersih dan bebas dari lemak. Ose kembali dipijarkan pada
api sebelum disimpan kembali agar ose tetap dalam keadaan steril. Setelah
berhasil membuat usapan, kaca objek dengan bakteri difiksasi dengan cara
dilewatkan di atas api. Hal ini dimaksudkan agar bakteri tetap melekat di
tempatnya (di atas kaca objek) walaupun akan ada proses pewarnaan ataupun
pembersihan zat warna dengan aquades. Proses fiksasi ini hanya sekedar
melewatkan preparat di atas api, bukan memanaskannya karena bakteri bisa mati
jika suhu terlalu panas. Daerah usapan ditandai agar kita tahu di mana letak
daerah usapan bakteri yang kita buat.
Selanjutnya, kaca objek yang telah difiksasi ditetesi dengan zat warna di atas bak
pewarna agar zat warna yang berlebih nantinya dialirkan ke bak warna dan tidak
mengotori daerah kerja lainnya. Zat warna yang digunakan praktikan pertama kali
oleh praktikan adalah Crystal Gentian Violet atau yang lebih dikenal dengan
sebutan CGV. CGV sebagai zat warna dasar diteteskan di daerah usapan bakteri
lalu didiamkan selama 1 menit. Setelah sekitar 1 menit, zat warna berlebih
dibuang dan kaca objek kemudian dialiri aquades untuk membersihkan sisa zat
warna. Kemudian preparat ditetesi dengan lugol sebagai zat pemantek atau
mordant dan didiamkan sekitar 2 menit. Setelah itu akan ditambahkan alkohol
sebagai decolorizing agent. Dalam tahapan ini, bakteri gram positif akan
mengalami denaturasi selama pemberian alkohol. Hal ini akan mengecilkan
pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium dari CGV dan lugol.
Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan
sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang.
Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding
sel bakteri gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alkohol,
maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan
bakteri gram negatif menjadi tidak berwarna dalam tahap ini. Bakteri gram negatif
hanya memiliki 1‐2 lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas
dinding sel yang lebih besar.
Setelah pencucian dengan alkohol, preparat digenangi zat warna pembanding
yaitu fuchsin. Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, karena pada saat
dekolorisasi pori-pori sel bakteri gram negatif terbuka dan zat warna pertama telah
luntur, zat warna pembanding akan masuk dan mewarnai sel bakteri gram negatif
sehingga bakteri yang tadinya sempat berwarna biru akan tergantikan dengan
warna kemerahan (sesuai dengan warna fuchsin). Sel bakteri gram positif
mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan
bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.
Preparat kemudian dibilas dengan aquades lalu diamati dengan mikroskop.
Praktikan menggunakan perbesaran 10x pada mikroskop dan menemukan bentuk
bakteri sebagai berikut:
Pada pengamatan, ditemukan bakteri berbentuk coccus dan sedikit berbentuk
batang. Bakteri yang berbentuk coccus berwarna biru yang dapat disimpulkan
bahwa bakteri tersebut adalah bakteri gram positif dan praktikan memperkirakan
bahwa bakteri tersebut adalah bakteri Staphylococcus aureus. Sedangkan untuk
bakteri yang berbentuk basil/batang, praktikan menemukan bakteri batang yang
terwarnai dengan zat warna tandingan yaitu fuchsin yang menandakan bahwa
bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif. Praktikan menyimpulkan bahwa
bakteri gram negatif tersebut adalah Escherichia coli.
Kemungkinan adanya kesalahan dalam pengamatan gram bakteri ini disebabkan
oleh fiksasi yang berlebihan yang mungkin bisa memecahkan dinding sel gram
positif sehingga melepaskan pewarna primer dan menerima pewarna tandingan,
atau mungkin pencucian menggunakan aquades yang terlalu deras dapat
menghilangkan warna yang seharusnya menjadi ciri untuk identifikasi bakteri.
VIII. Simpulan
1. Praktikan mampu menganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan
Gram negatif, dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram
2. Praktikan mampu memahami setiap langkah dan reaksi-reaksi kimia yang
terjadi dalam prosedur tersebut
Daftar Pustaka
Cappuccino, J. G. & Natalie. S. 1983. Microbiology A Laboratory Manual. New
York : Addison Wesley Publishing Company
Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan.
Mirojiah, Mety. 2014. Pengecatan Mikroba: Pengecatan Sederhana, Gram, dan
Kapsul.http://mety-mirojiah-fst12.web.unair.ac.id/artikel_detail-91780-
Umum-Pengecatan-mikroba-pengecatan-sederhana,-gram-dan-kapsul.html.
Diakses pada tanggal 7 Maret 2015
Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York : Mc
Graw Hill Book Company
Tracy.2005.GramStaining.www.tracy.k12.ca.us/thsadvbio/pdfs/gram%20stain.pdf
. Diakses pada tanggal 7 Maret 2015
Umsl.2008. Staining Bacteria. www.umsl.edu/~microbes/pdf/stainingbacteria.pdf.
Diakses pada tanggal 7 Maret 2015
top related