aktivitas enzim merkuri reduktase pada
TRANSCRIPT
AKTIVITAS ENZIM MERKURI REDUKTASE PADA Azotobacter SEBAGAI ENZIM PEREDUKSI
Hg2+ MENJADI Hg0 Nama Mahasiswa : Anjar Lulu Sakinah NRP : 1510 100 046 Jurusan : Biologi Dosen Pembimbing : Dr. Enny Zulaika, M.P. Abstrak
Merkuri adalah logam berat yang sangat tosik dan berbahaya. Beberapa bakteri dapat hidup di habitat yang tercemar merkuri disebut bakteri resisten merkuri, satu diantaranya adalah Azotobacter.
Tujuan penelitian adalah mendapatkan isolat unggul Azotobacter dari lahan Eco Urban Farming ITS yang resisten terhadap HgCl2 dan mengetahui kemampuan aktivitas enzim merkuri reduktase sebagai bioreduktor Hg2+ menjadi Hg0. Isolasi dilakukan menggunakan media selektif Azotobacter agar. Pengujian resistensi merkuri dilakukan dengan metode goresan agar miring yang megandung HgCl2. Aktivitas enzim merkuri reduktase dianalisis dengan metode MRA dan spektofotometri pada panjang gelombang 340 nm. Hasil isolasi mendapakan 10 isolat Azotobacter resisten HgCl2, isolat A5 dan A9 mempunyai resistensi 10 mg/L HgCl2 dengan pertumbuhan yang optimum dan mempunyai aktivitas merkuri reduktase relatif tinggi dengan daya reduksi ± 3 mg/L dan efisiensi reduksi >70% pada konsentrasi 5 mg/L HgCl2. Kata kunci: Azotobacter, enzim merkuri reduktase, gen mer operon, Merkuri HgCl2
vii
MERCURY REDUCTASE ACTIVITY OF Azotobacter ISOLATES AS A REDUCING AGENT
FOR MERCURIAL ION (Hg2+) Student Name : Anjar Lulu Sakinah NRP : 1510 100 046 Departement : Biology FMIPA ITS Supervisor : Dr. Enny Zulaika, MP. Abstract
Mercury is a heavy metal that its dangerous toxic. Some bacteria can living at contaminated mercury areas, called mercury resistant bacteria which one of them Azotobacter.
The purpose of this researched to get Azotobacter from Eco Urban Farming ITS land which resistant mercury HgCl2 and determine activity of mercury reductase enzyme for reduction Hg2+ to Hg0. Methods isolation used selective Azotobacter agar, mercury resistant with added HgCl2 different concentration, and activity of mercury reductase enzyme analyzed MRA method and spechtophotometry at 340 nm.
The result of isolation got 10 isolate Azotobacter what resistant mercury HgCl2, isolate A5 and A9 resistant 10 mg/L. with optimum growth and they have activity of mercury reductase enzyme more higher with reduction abilities ± 3 mg/L and efficiency reduction Hg2+ >70% in HgCl2 5 mg/L concentration. Keywords: Azotobacter, enzim merkuri reduktase, gen mer operon, Merkuri HgCl2.
ix
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Merkuri Merkuri mempunyai nama Hydragyrum yang bararti perak cair, di alam lebih banyak ditemukan dalam mineral. Di antaranya yang dihasilkan dari bijih Sinabar (HgS). Bijih Sinabar mengandung unsur merkuri antara 0,1%-4%. Merkuri diproduksi dengan membakar merkuri sulfida (HgS) di udara (Polii & Sonya, 2002). Logam merkuri dilambangkan dengan merkuri, pada sistem periodik unsur kimia merkuri menempati urutan (NA) 80 dan mempunyai bobot atom (BA 200,59) serta memiliki densitas sebesar 13,55 gr/cm3 (Sudarmaji dkk., 2006). Secara umum merkuri berwujud cair pada suhu kamar (250C) dengan titik beku paling rendah –390C dan masih berwujud cair pada suhu 1960C, merupakan logam yang paling mudah menguap jika dibandingkan dengan logam-logam yang lain, dapat melarutkan bermacam-macam logam untuk membentuk “alloy” yang disebut dengan “amalgam” (Polii & Sonya, 2002).
Industri pengecoran logam dan semua industri yang menggunakan merkuri sebagai bahan baku maupun bahan penolong, limbahnya merupakan sumber pencemaran merkuri. Sebagai contoh antara lain adalah industri klor alkali, peralatan listrik, cat, termometer, tensimeter, industri pertanian, dan pabrik detonator. Kegiatan lain yang merupakan sumber pencemaran merkuri adalah praktek dokter gigi yang menggunakan amalgam sebagai bahan penambal gigi (Sudarmaji dkk., 2006).
Di alam, merkuri terbagi menjadi tiga bentuk yaitu Hg0 (metalik merkuri), Hg2+ (merkurik merkuri) dan Hg2
2+ (merkurous merkuri). ketiga bentuk merkuri tersebut menjaga keseimbangan struktur kimia mengikuti :
Hg22+ ↔ Hg0 + Hg2+
(Dash & Das, 2012). Merkuri yang masuk ke tubuh manusia baik melalui
rantai makanan maupun melalui pernapasan dapat menghambat
5
6
enzim Glutathione reductase dan Seric phosproglucose isomerase serum dengan mengikat gugus –SH (sulfihidril) dan apabila terakumulasi merusak otak, ginjal dan hati. Kerusakan jangka panjangnya dapat merusak system saraf pusat yang dapat memberikan efek yang sangat berbahaya, selain itu juga dapat mengakibatkan rusaknya kromosom yang menyebabkan cacat bawaan. (Polii & Sonya, 2002). Merkuri anorganik berbahaya untuk protein dan DNA yang dapat menyebabkan penyakit fharing dan hepatitis sedangkan toksisitas metilmerkuri dikenal sebagai penyakit Minamata, yang merusak sistem neurologi termasuk encephalopathy yang dapat menyebabkan kematian (Osborn et al., 1997). Merkuri mempunyai toksisitas yang tinggi untuk semua organisme karena kekuatan afinitas terhadap grup thiol dalam protein (Takeuchi & Sugio, 2006). Metil merkuri berpotensi penyebab neurotoksin melalui proses bioakumulasi dan biomagnifikasi melalui rantai makanan (Martin et al., 2008).
Ada dua proses alam yang memediasi siklus merkuri di lingkungan yaitu proses geologi dan biologi. Gas merkuri (Hg0) dikeluarkan dari aktivitas alam dan antropogenik yang terdistribusi secara global keatmosfer dan terjadi foto-oksidasi mengakibatkan ion merkuri bercampur dengan ozon dan bergabung dengan air. Selanjutya munculnya hujan mengendapkan merkuri anorganik pada permukaan bumi yang akan diserap oleh mikroorganisme pada ekosistem akuatik. Kemudian merkuri tersebut direduksi kembali membentuk g as dan akan terevapoasi ke udara yang akan memulai awal siklus kembali. Metil merkuri yang terbentuk akan terakumulasi oleh makhluk hidup akuatik melalui rantai makanan, dan selanjutnya akan dimakan oleh predator organisme diatasnya sehingga konsentrasi merkuri semakin tinggi (Dash &Das, 2012). 2.2 Bakteri Resisten Merkuri Bakteri resisten merkuri adalah bakteri yang resisten merkuri dilingkungan habitatnya, baik yang besifat bakteri gram negatif dan bakteri gram positif. Resistensi merkuri oleh bakteri
7
disebabkan adanya gen mer operon yang terdiri dari 2 tipe yaitu mer spektrum sempit yang hanya resisten merkuri anorganik dan mer spektrum luas yaitu resisten terhadap merkuri organik dan merkuri anorganik (Brown et al., 2003). Gen mer operon terdapat di plasmid (Fox & Walsh, 1981) kromosom (Martin et al., 2008) transposons, dan integron (Dash & Das, 2012; Martin et al., 2008). Bakteri dikatakan resisten terhadap merkuri jika mampu tumbuh pada medium yang mengandung mekuri lebih dari 5 mg/L (De et al., 2003).
Gen mer operon terdiri dari gen-gen struktural di antaranya gen merkuri reduktase (merA) dan gen transport protein yaitu merT dan merP yang bersebelahan oleh merR dan merD yang melibatkan regulasi ekspresi gen strutural dalam respon ion garam merkuri (Brown et al., 2003). Mer operon terdiri dari gen regulator yaitu merR yang akan mentraskripsikan gen mer fungsional. MerR merupakan protein metalloregulator yang akan berikatan dengan wilayah promoter-operator baik secara regulasi positif dan regulasi negatif. MerR sebagai aktivasi transkripsi pada operon dengan adanya induksi Hg2+ dan akan menghambat transkripsi gen fungsional mer operon jika tidak ada Hg2+. Pada distal gen promoter terdapat merD sebagai protein regulator sekunder yang berikatan lemah pada wilayah operator-promoter (Dash & Das, 2012). MerA mempunyai fungsi mereduksi ion merkuri yang toksik menjadi logam merkuri Hg0 yang kurang toksik dan mudah menguap pada suhu kamar, sedangkan gen merB mempunyai fungsi mengkatalisis pemutusan ikatan merkurikarbon sehingga dihasilkan senyawa organik dan ion Hg2+(Barkay et al., 2003).
Dalam Osborn et al., (1997) ada lima mekanisme resistensi dan detoksifikasi merkuri meliputi: a. Penurunan serapan ion merkuri. Hal ini terjadi pada strain
Enterobacter aerogenes yang mengekspresikan protein dari dua plasmid dengan mengkode protein yang mampu mengurangi permeabilitas sel terhadap ion Hg2+ .
8
b. Demetilasi metilmerkuri pada Clostridium cochlearium T-2P dua plasmidnya mengkode gen yang mampu merespon demetilasi organomerkuri yang akan bereaksi dengan hydrogen sulfida menjadi merkuri sulfida yang insoluble.
c. Pengasingan metilmerkuri, pada Desulfovibrio desulfuricans, metilmerkuri dipertahankan pada level subtoksik dengan memproduksi hydrogen sulfide secara berkelanjutan kemudian bereaksi dengan metil merkuri menjadi dimetilmerkuri sulfide insoluble.
d. Metilasi merkuri, beberapa bakteri mampu mengurangi toksistas metil merkuri dengan pengasingan atau volatilisasi dengan mekanisme mengikat Hg2+ pada ikatan gugus metil.
e. Reduksi Hg2+ menjadi Hg0 secara enzimatis yang melibatkan gen merA Hg2+ akan direduksi menjadi Hg0.
2.3. Genera Azotobacter Azotobacter mempunyai sel besifat ovoid, mempunyai diameter 1,5-2,0 µm dan bersifat pleomorfik berkisar rod sampai coccus. Tidak memproduksi endospora tetapi membentuk kista. Merupakan bakteri Gram negatif, motil dengan flagel peritrik, dan beberapa ada yang tidak motil. Bersifat aerob tetapi dapat tumbuh pada kondisi sedikit oksigen, bersifat kemoorganotrof menggunakan gula, alkohol dan garam sebagai sumber karbon. Azotobacter mampu memfiksasi nitrogen dan secara umum bersifat nonsimbiotik. Membutuhkan molibdenum untuk fiksasi nitrogen, tetapi beberapa dapat diganti vanadium. Bersifat nonproteolitik, dan menggunakan nitrat, garam ammonium dan asam amino sebagai sumber nitrogen. Azotobacter bersifat katalase positif, dengan range pH yang mampu tumbuh 4,8-8,5 dan optimum pada pada pH 7-7,5 (Holt et al., 1994). Banyak ditemukan di tanah dan beberapa diair. ciri koloni pada kebanyakan spesies smooth, opaque, convex rendah. Azotobacter tumbuh membentuk kista mampu mensintesis alginat, serta
9
memproduksi siderophore untuk merespon saat zat besi terbatas (Brenner et al., 1957). Azotobacter termasuk bakteri fiksasi nitrogen yang hidup bebas, masuk dalam gamma protebateria, ukuran sel sepeti yeast, isolat mampu membentuk lapisan lendir, dan dapat membentuk struktur istirahat yang disebut kista seperti endospora, kista Azotobacter tidak khusus resisten terhadap panas, dan bukan bentuk dorman, Kista Azotobacter menunjukkan resisten terhadap desikasi, ultraviolet, desinterasi mekanik dan radiasi. (Madigan et al., 2006). Beberapa karakter koloni Azotobacter dapat dlihat pada Gambar 2.1.
a. b. c. d.
e. f. g. Gambar 2.1. Beberapa karakteristik koloni pada spesies Azotobacter. (a. Azotobacter nigricans b. Azotobacter chroococcum c. Azotobacter vinelandii (Jimenes et al., 2011). d. Azotobacter paspali e. Azotobacter armeniacus (Aquilanti et al., 2004). f. Azotobacter chroococcum kultur muda g. Azotobacter chroococcum kultur tua). (Salhia, 2010).
Pada penelitian Zulaika dkk. (2011), Azotobacter yang diisolasi dari sungai Kalimas Surabaya dapat hidup pada media yang mengandung 25 mg/L HgCl2. Pada penelitian Ghosh et al., (1999) Azotobacter chroococcum yang diisolasi dari tanah, sebagai bakteri fiksasi nitrogen yang resisten terhadap merkuri. Aktivitas enzim merkuri reduktase optimum pada 20 µM HgCl2 dari seluruh perlakuan. Penelitian Ray et al., (1989) ditemukan Azotobacter yang mampu memvolatilisasi merkuri mencapai
10
lebih dari 75%, Beijerinckia sebesar lebih dari 80%, dan Azomonas lebih dari 10%.
Mekanisme resistensi merkuri dikontrol oleh gen mer operon terdiri dari gen operator, promoter, dan regulator. Operon akan berfungsi ketika gen seperti merP, merT, merD, merA, merF, merC, dan merB diekspresikan sehingga menunjukkan mekanisme resistensi merkuri (Dash & Das, 2012). Bakteri Gram negatif menunjukkan toleransi lebih besar terhadap ion logam yang lebih besar dibandingkan Gram positif karena bakteri Gram negatif memiliki struktur dinding sel yang lebih kompleks sehingga mampu mengikat dan mengimobilisasi ion logam (Ahmad et al., 2005), termasuk logam merkuri. Berdasarkan Ahmad et al., (2005) mengemukakan bahwa kemampuan bakteri menghasilkan polisakarida ekstraseluler dapat melindungi sel dari pengaruh toksik logam berat, hasil penelitiannya memberikan indikasi bahwa bakteri heterotrof yang ditumbuhkan di dalam medium yang mengandung merkuri konsentrasi 150-200 μg/g akan mengalami penurunan viabilitas setelah 21 hari inkubasi. Grup bakteri heterotrof tidak dapat hidup pada inkubasi 28 h ari dengan kandungan logam berat 100 μg/g, dan tingginya logam berat akan menurunkan keanekaragaman bakteri penambat nitrogen.
2.4 Enzim Merkuri reduktase
Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel yang mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien dan membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana (Lehninger, 2004). Klasifikasi Enzim berdasarkan reaksi katalisisnya dibedakan menjadi 6 k elompok Tabel (2.1). Merkuri reduktase adalah flavoprotein yang merupakan enzim oksidoreduktase sebagai kunci detoksifikasi merkuri pada bakteri. Enzim ini mengkatalisis reaksi reduksi ion merkuri anorganik menjadi elemental merkuri yang volatil, selanjutnya secara non enzimatis dikeluarkan dari sel (Fox & Walsh, 1982).
11
Tabel 2.1. Klasifikasi enzim berdasarkan reaksi katalisis
No Katalisis Jenis reaksi yang dikatalisis
1 Oksidoreduktase Pemindahan elektron 2 Transferase Reaksi pemindahan gugus fungsional
3 Hidrolase Reaksi hidrolisis (Pemindahan gugus fungsional ke air)
4 Liase Penambahan gugus ke ikatan ganda atau sebaliknya
5 Isomerase Pemindahan gugus didalam molekul,
menghasilkan bentuk isomer
6 Ligase Pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O dan C-N oleh reaksi kondensasai yang berkaitan dengan penguraian ATP
(Lehninger, 2004). Flavin adenine dinucleotide (FAD) menggunakan
Nikotinamida adenine dinukleotida (NADPH) sebagai donor elektron. Adanya gugus thiol akan berikatan dengan Hg2+ membentuk dimercaptida, RS-Hg-SR dengan reaksinya sebagai berikut:
NADPH + RS-Hg-SR + H+ -> NADP+ + Hg0 + 2RSH
(Fox & Walsh, 1982). Mekanisme reduksi enzimatis terjadi melalui beberapa tahapan. Prosesnya diawali dengan masuknya ion Hg2+ ke dalam sel. MerP merupakan protein periplasma yang berfungsi untuk menyimpan sementara Hg2+ di periplasma kemudian melewatkan ion Hg2+ ke transporter inner membran yaitu merT. Dari merT, ion Hg2+ akan menuju molekul merkuri reduktase dimana sisi pengikatan substratnya terdapat pada bagian C-terminus. Hg2+
akan direduksi menjadi Hg0 dengan adanya transfer elektron dengan NADPH sebagai donor elektron dan Hg2+ sebagai akseptor elektron (Brown et al., 2003), secara enzimatis volatilisasi Hg2+ menjadi Hg0 ditunjukkan pada Gambar 2.2.
12
Purifikasi merA sudah terjadi awal tahun 1970 dari Pseudomonas K62 dan E.coli dilakukan oleh Barkay et al., (2003). Beberapa penelitian ekstraksi gen merA yang menyandi enzim merkuri reduktase dari bakteri diantaranya Citrobacter freundii mempunyai nukleotida panjang 1141 bp ( Martins et al., 2008). Penelitian Ghosh et al., 1999 telah memurnikan enzim merkuri reduktase dari Azotobacter chroococcum, Acidithiobacillus ferrooksidans (Takeuchi & Sugio, 2006). Pseudomonas aeruginosa PA09501 pada bagian plasmid pVS1 (Fox &Walsh, 1982), dan Citrobacter freundii (Martin et al., 2008).
Gambar 2.2. Mekanisme reduksi Hg2+ menjadi Hg0 pada bakteri Gram negatif (Barkay et al., 2003).
BAB III METODOLOGI
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Jurusan Biologi FMIPA ITS. Penelitian dilaksanakan dari Bulan Januari – Maret 2014. Sonikasi sel dilakukan di Tropical Disease Diagnostic Center (TDDC) Institute of Tropical Disease (ITD) Universitas Airlangga. 3.2 Alat, Bahan dan Cara Kerja 3.2.1 Isolasi Azotobacter
Sampel tanah diambil dari lahan Eco Urban Farming ITS secara komposit kemudian dilakukan isolasi bakteri 10 gram tanah dimasukkan kedalam 90 ml akuades steril, selanjutnya dibuat seri pengenceran 10-1 sampai 10-8 (Saraswati dkk., 2007). Larutan diambil 1 ml dari pengenceran ditumbuhkan pada media selekif Azotobacter agar (High selective media M372-500G) dengan 0,1 mg/L HgCl2 dengan metode spread dan diinkubasi pada suhu ruang. Koloni Azotobacter chroococcum tampak setelah 24 jam inkubasi dengan ciri putih basah dan berubah menjadi coklat gelap setelah 3-5 hari. Ciri koloni Azotobacter vinelandii dan Azomonas sama, hanya tidak berubah gelap. Sedangkan koloni Azotobacter paspali, setelah inkubasi 48 jam, pusat koloni menjadi kuning. (Saraswati dkk., 2007).
Koloni yang tumbuh diamati karakteristik koloninya dibandingkan dengan kontrol positif yaitu Azotobacter chroococcum (Fakultas Pertanian, UGM Yogyakarta). Koloni yang diduga Azotobacter dimurnikan dengan metode 16 gores pada media Nurient Agar dan dilakukan pewarnaan methylen blue untuk pengamatan kemurnian Azotobacter. Dilakukan pewarnaan Gram dan pewarnaan kista untuk memastikan bahwa isolat tersebut adalah Azotobacter.
13
14
3.2.2 Uji resistensi HgCl2 Uji resistensi dilakukan dengan menumbuhkan isolat Azotobacter pada media Azotobacter agar dan ditambahkan HgCl2 sesuai konsentrasi uji yaitu 0,5 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L dan seterusnya sampai konsentrasi yang mampu ditoleransi Azotobacter dengan interval selanjutnya 5 mg/L. Diinkubasi 24 jam pada suhu ruang dan diamati pertumbuhan koloninya sehingga didapatkan isolat Azotobacter yang tumbuh merupakan isolat resisten terhadap merkuri HgCl2 . 3.2.3 Pembuatan kurva pertumbuhan genera Azotobacter Satu ose koloni Azotobacter diinokulasikan ke dalam 40 ml media NB, dengan konsentrasi bahan ½ dari awalnya. Dihomogenkan dengan rotary shaker (100 rpm) dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 24 jam (sebagai stok kultur). Selanjutnya 40 ml stok kultur dimasukkan kedalam 160 ml media NB- HgCl2 0,1 mg/L dan diinkubasi diatas rotary shaker (100 rpm). Setiap selang 1 jam, diambil 2 ml dimasukkan kedalam kuvet diukur nilai kerapatan optik (OD; Optical Density) pada panjang gelombang (λ) 600 nm. Pengukuran OD dimulai dari jam ke-0 sampai jam ke-24. Dibuat kurva pertumbuhan dengan sumbu x sebagai waktu (t) dan sumbu y sebagai nilai OD. Dari kurva pertumbuhan akan didapat fase eksponensial sehingga akan didapatkan waktu inkubasi (µ jam) sebagai waktu awal perlakuan. 3.2.4 Persiapan ekstrak enzim Satu ose koloni Azotobacter diinokulasikan kedalam 10 ml media NB dihomogenkan dengan rotary shaker (100 rpm) diinkubasi dalam suhu ruang selama waktu eksponen, selanjutnya diambil 3 ml kultur sel dan diinokulasikan ke 30 ml NB-HgCl2 0,1 mg/L dan inkubasi lalu dipanen pada (µ jam) sesuai kurva pertumbuhan. Dilakukan perhitungan jumlah sel/ml dengan Haemocytometer Improved Nauber, kultur sel disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 20 menit pada suhu 4ºC, supernatan dibuang, pelet sel disuspensikan dengan 30 ml PBS
15
(Phospat Buffer Saline) pH±7. Suspensi sel disonikasi dengan ultrasonic processor (600 watt, amplitude 50%) selama 60 detik dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 30 menit pada suhu 4ºC (Ghosh et al., 1999; Sulastri, 2002) Supernatant sebagai ekstrak enzim dipindah secara hati-hati kedalam botol gelap yang bersih dan steril kemudian disimpan pada suhu -20oC (Ogunseitan, 1998). 3.2.5 Uji aktivitas enzim merkuri reduktase Metode pengukuran aktivitas enzim merkuri reduktase dilakukan dengan menambahkan ekstrak enzim kedalam larutan MRA (Mercury Reduktase Assay) dengan perbandingan 1:1. Larutan MRA terdiri dari 50 mM larutan PBS pH±7; 0,5 mM EDTA; 0.1% (vol/vol) β-mercaptoethanol, 100 µM NADH, 0,2 mM, MgSO4 dan HgCl2 (Meissner & Falkinham III, 1984; Ogunseitan, 1998), HgCl2 yang ditambahkan sesuai dengan perlakuan yang diuji yaitu 5 mg/L, 10 mg/L dan 15 mg/L. Inkubasi dilakukan selama 0, 30, 60, dan 120 menit pada suhu ruang. Pengukuran aktivitas enzim merkuri redukatase menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang λ 340 nm (Zeroual et al., 2003). Sebagai kontrol adalah larutan MRA tanpa penambahan ekstrak enzim yang diinkubasi 0 menit. Satu unit aktivitas enzim merkuri reduktase didefinisikan sebagai jumlah µM NADH yang teroksidasi per jumlah sel permenit dengan satuan µM NADH/jumlah sel/menit (Zeroual et al., 2003). Seluruh pengukuran aktivitas enzim merkuri redukatse dilakukan pengulangan tiga kali. 3.2.6 Pembuatan kurva standard NADH
Konsentrasi NADH yang digunakan adalah 100 µM sehingga konsentrasi yang dibuat untuk kurva standard NADH adalah 0 µM, 10 µM, 20 µM, 30 µM, 40 µM, 50 µM, 60 µM, 70 µM, 80 µM, 90 µM, dan 100 µM. Larutan NADH berbagai konsentrasi tersebut diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang λ 340 nm.
16
Perhitungan HgCl2 tereduksi (mg/L)
………………….... (1) Perhitungan Hg2+ tereduksi (mg/L)
……………………………. (2) 3.3 Rancangan Penelitian
Penelitian dilakukan pada skala laboratorium secara deskriptif kuantitatif dengan waktu inkubasi 0, 30, 60 dan 120. Selanjutnya dilakukan analisis secara kuantitatif berdasarkan hasil aktivitas enzim merkuri reduktase (unit) dan µM NADH teroksidasi serta konsentrasi Hg2+ yang tereduksi.
= (N µM/1.000.000) x 271,59 x 1000 Keterangan : N = NADH teroksidasi 1.000.000 = konversi M menjadi µM 271,59 = massa relatif HgCl2 1000 = konversi gram menjadi mg
= (Ar Hg/Mr HgCl2) x mg/L HgCl2 tereduksi Keterangan: Ar = massa atom relatif Hg (= 200,59) Mr = massa molekul relatif HgCl2 (= 271,59) (Zulaika, 2013).
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Azotobacter Isolasi Azotobacter diawali dengan pengenceran
bertingkat hingga 10-7 dengan akuades steril. Hal ini dilakukan supaya didapatkan koloni yang memenuhi standard penghitungan jumlah koloni yaitu 30-300 sehingga memudahkan untuk identifikasi. Koloni yang tumbuh pada media agar Azotobacter diasumsikan adalah genus Azotobacter, koloni yang digunakan sebagai isolat uji adalah koloni yang berwarna krem sampai coklat setelah 3-5 hari inkubasi yang diasumsikan Azotobacter chroococcum (Gambar 4.1), Kontrol positif yang digunakan adalah A. chroococcum dari fakultas pertanian Universitas Gajah Mada (UGM).
Koloni yang berwarna krem sampai coklat adalah isolat yang diidentifikasi sebagai A. chroococcum. Perubahan warna koloni disebabkan adanya mekanisme pengikatan nitrogen bebas oleh isolat A. chroococcum dengan indikator bromtimol biru sehingga media akan berubah menjadi biru. Isolat A. chroococcum akan melakukan metabolisme dengan memanfaatkan mannitol sebagai sumber karbon (C) dan mengubah pH media menjadi asam (pH rendah) ditandai dengan perubahan warna biru menjadi krem-coklat (Muhaimin dkk., 2013). Selain itu pada media agar Azotobacter ditambahkan molibdenum (Na2MoO4) sebagai kofaktor yang sangat esensial yang diperlukan untuk metabolisme N bakteria (Armiadi, 2009). Molibdenum adalah logam yang dibutuhkan untuk Azotobacter (Holt et al., 1994). Hasil isolasi Azotobacter didapatkan 10 isolat yang diberi kode A1a, A1b, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A9, dan A10.
17
18
Gambar 4.1 Isolat uji yang diidentifikasi sebagai Azotobacter chroococcum..(a) Isolat A1a. (b) Isolat A2. (c) Isolat A3. (d) Isolat A5 (e) Isolat A6. (f) Isolat A7. (g) Isolat A8. (h) Isolat A9. (i) Isolat A10.
19
Kesepuluh isolat hasil isolasi kemudian diamati secara makroskopis (Lampiran 1) dan dimurnikan untuk melihat kemurnian sel dilakukan pewarnaan sederhana dengan methylen blue (Lampiran 2). Sel yang sudah murni diduga A. chroococcum selanjutnya dilakukan generic assigment mengikuti Holt et al., (1994) untuk meyakinkan bahwa isolat tersebut adalah benar-benar A. chroococcum (Tabel 4.1).
Azotobacter dapat membentuk fase istrirahat yang secara khusus tidak resisten terhadap panas, dan bukan masa dorman, kista Azotobacter menunjukkan resisten terhadap desikasi, ultraviolet, perusakan mekanik, dan radiasi. (Madigan et al., 2006). Kista akan terbentuk pada akhir fase stasioner sebesar 1% dan jika diberi penambahan butanol pada media yang mengandung glukosa atau mannitol akan menjadi >90% setelah 5 hari inkubasi (Brenner et al., 1957). Kista yang menyelubungi sel Azotobacter yang telah diisolasi ditujukkan pada Gambar (4.2).
Tabel 4.1 Generic assigment isolat Azotobacter uji
Karakter Kode isolat
A1a A1b A2 A3 A5 A6 A7 A8 A9 A10 Bentuk sel basil-kokus + + + + + + + + + +
Ukuran sel 1,5-2,0 µm + - - + + + + - + -
Membentuk kista + + + + + + + + + +
Gram negatif + + + + + + + + + + Motil + + + + + + + + + + Fiksasi nitrogen + + + + + + + + + +
Membutukan Molibdenum + + + + + + + + + +
20
Gambar 4.2. Kista yang terbentuk pada isolat Azotobacter dengan pewarnaan Giemsa. 4.2 Uji Resistensi HgCl2
Pengujian resistensi 10 isolat Azotobacter terhadap HgCl2 dimulai dengan konsentrasi terendah sebesar 0,5 mg/L, kemudian dilanjutkan dengan konsentrasi 5 mg/L,10 mg/L, 15 mg/L, 15 mg/L, dan 20 mg/L. Isolat yang tumbuh pada media yang mengandung HgCl2 merupakan Azotobacter yang resisten terhadap merkuri. Hasil uji resistensi ditampilkan pada Tabel 4.2. Pada konsentasi 5 mg/L kesepuluh isolat mampu tumbuh dengan baik, hal ini menunjukkan 10 sudah termasuk bakteri resisten merkuri (BRM). Bakteri dikatakan resisten terhadap merkuri jika mampu tumbuh pada medium yang mengandung merkuri lebih dari 5 mg/L (De et al., 2003).
Pada konsentrasi HgCl2 10 mg/L hanya 6 isolat ditambah isolat kontrol A. chroococcum yang mampu tumbuh yaitu A1a dengan pertumbuhan 50%, isolat Azotobacter A5, A6 dengan pertumbuhan 100%, isolat Azotobacter A7, A9, dan A10 tumbuh dengan 100% serta A. chroococcum mencapai 50% . Selanjutnya yang digunakan sebagai isolat untuk uji aktivitas enzim merkuri reduktase adalah isolat yang 100% resisten pada konsentrasi HgCl2 20 mg/L dengan karakter koloni yang berbeda diantaraya adalah isolat Azotobacter A5 dan A9, kemudian ditambah isolat Azotobacter A1 sebagai pembanding, sebab karakter koloni
kista
21
Tabel 4.2 Persentase (%) tumbuh hasil uji resistensi HgCl2
Kode Isolat Konsentrasi HgCl₂ (mg/L)
0.5 5 10 15 20 A1a 100 60 50 - - A1b 100 100 - - - A2 100 100 - - - A3 100 80 - - - A5 100 90 100 50 50 A6 100 100 100 50 25 A7 100 90 100 50 - A8 100 80 - - - A9 100 100 80 35 30
A10 100 100 80 60 - Azotobacter
chroococcum 100 100 50 50 - *inkubasi dilakukan 48 jam
Azotobacter A1 yang mendekati kontrol A. chroococcum dan isolat kontrol A. chroococcum.
Bakteri resisten merkuri toleransi terhadap logam berat karena memunyai gen yang mengontrol mekanisme resisten terhadap merkuri didalam kromosom, plasmid, atau transposon (Zulaika, et al., 2012). Secara umum ada dua kemampuan resistensi bakteri yaitu dengan mekanisme enzimatis dan mekanisme biosorpsi (Rehman et al., 2007). 4.3 Kurva Pertumbuhan Genera Azotobacter
Kurva pertumbuhan digunakan untuk menentukan umur perlakuan dengan menghitung rata-rata waktu pada fase awal eksponensial dan fase akhir eksponensial. Pada isolat kontrol tidak dilakukan pengamatan kurva pertumbuhan, hasil kurva pertumbuhan dilakukan pada 3 isolat Azotobacter uji ditampilkan pada Gambar 4.3.
Pola pertumbuhan isolat Azotobacter A1a, A5 dan A9 mempunyai pola pertumbuhan yang hampir sama (Gambar 4.3). Fase lag merupakan fase adaptasi, pada kurva pertumbuhan tidak
22
G
amba
r 4.3
Kur
va p
ertu
mbu
han
Azot
obac
ter
A1a
, A5
dan
A9
s
23
dijumpai sebab hasil pengukuran OD (Optical Density) dilakukan setelah melakukan subkultur pada media yang sama. Apabila subkultur dilakukan dalam keadaan fase eksponensial pada medium yang sama maka tidak akan terjadi fase lag dan secara cepat akan memasuki kedalam fase eksponensial (Madigan et al., 2006). Pada penelitian ini pemindahan inokulum Azotobacter dilakukan setelah 24 jam, pada medium yang sama sehingga langsung terjadi fase eksponensial dan tidak tampak adanya fase adaptasi. Fase eksponensial pada isolat Azotobacter A5 dan A9 mempunyai pola hampir sama yaitu terjadi pada jam ke-1 sampai jam ke-13 berbeda dengan isolat Azotobacter A1a mempunyai fase eksponensial yang terjadi pada jam ke-1 sampai jam ke-17. Pertumbuhan sel pada fase eksponensial biasanya paling tinggi dibandingkan fase-fase yang lain pada pola pertumbuhan (Madigan et al., 2006). Selama pertumbuhan sel terjadi peningkatan massa sitoplasma pada saat fase eksponensial akibatnya massa sel akan meningkat pula (Cooper, 2003). Fase Stasioner merupakan fase dimana tidak terjadi peningkatan jumlah sel sehingga dapat dikatakan rasio pertumbuhan populasinya sama dengan 0 (Madigan et al., 2006). Fase stasioner dianggap sebagai fase stagnan dan ketika nutrisi pada media mulai habis maka terjadi cekaman dan sel akan mengeluarkan hasil metabolisme untuk bertahan, tetapi tidak akan lama sehingga pada akhirnya akan mati, kondisi demikian akan dimulai masuknya fase kematian (Llorens et al., 2010).
Berdasarkan fase pertumbuhan, umur perlakuan untuk pengujian aktivitas enzim merkuri reduktase saat dilakukan proses ektraksi enzim yaitu isolat Azotobacter A1a pada jam ke-9 isolat Azotobacter A5 dan A9 dilakukan pada jam ke-7. Kurva pertumbuhan ditampilkan pada Gambar 4.3.
24
4.4 Aktivitas Enzim Merkuri Reduktase dan NADH Teroksidasi
Pengukuran aktivitas enzim merkuri reduktase menggunakan metode MRA (mercury reductase assays) dengan konsentrasi HgCl2 5 mg/L, 10 mg/L dan 15 mg/L. Satu unit aktivitas enzim merkuri reduktase didefinisikan sebagai jumlah NADH yang teroksidasi per jumlah sel permenit (µM NADH/jumlah sel/menit) (Zeroual et al., 2003). Aktivitas enzim merkuri reduktase ditunjukkan pada Tabel 4.3. Aktivitas enzim merkuri reduktase tergantung adanya NADPH ataupun NADH sebagai bagian yang essensial untuk donor elektron (Meissner and Falkinham III, 1984).
Tabel 4.3 Aktivitas enzim merkuri reduktase
Isolat Waktu (menit)
Aktivitas Mer-red
(unit/109sel/ menit) pada Kons. HgCl₂
5 mg/L
Aktivitas Mer-red
(unit/109sel/ menit) pada Kons. HgCl₂
10 mg/L
Aktivitas Mer-red
(unit/109sel/ menit) pada Kons. HgCl₂
15 mg/L
A1a
30 0.00121± 0,001 0.00109±0,001 0.00114±0,000 60 0.00060± 0,001 0.00055±0,001 0.00056±0,000
120 0.00030± 0,003 0.00028±0,000 0.00030±0,001
A5
30 0.00255± 0,001 0.00271±0,005 0.00293±0,002 60 0.00117± 0,006 0.00014±0,004 0.00149±0,001
120 0.00060± 0,003 0.00072±0,001 0.00075±0,001
A9
30 0.00254± 0,012 0.00260±0,005 0.00285±0,002 60 0.00115± 0,005 0.00123±0,006 0.00138±0,007
120 0.00062± 0,006 0.00072±0,003 0.00073±0,003
Azotobacter chroococcum
30 0.00222± 0,001 0.00179±0,007 0.00183±0,001 60 0.00123 ± 0,001 0.00110±0,003 0.00107±0,002
120 0.00063 ± 0,001 0.00056±0,000 0.00053±0,005 Berdasarkan Tabel 4.3. Waktu inkubasi yang berbeda,
menunjukkan aktivitas enzim merkuri reduktase yang berbeda.
25
Semakin lama waktu inkubasi maka semakin rendah aktivitas enzim merkuri reduktase. Enzim merkuri reduktase memerlukan koenzim NADPH untuk mereduksi Hg2+ menjadi Hg0. Beberapa strain bakteri dapat menggunakan NADH sebagai koenzim (Gadd, 1990; Sulastri, 2002).
Aktivitas enzim dipengaruhi oleh adanya subsrat (Lehninger, 2004). Substrat yang digunakan untuk mereduksi Hg2+ menjadi Hg0 adalah NADH. Aktivitas enzim merkuri reduktase semakin lama semakin berkurang dengan waktu inkubasi yang semakin lama. Hal ini dikarenakan substrat semakin berkurang, substrat pada penelitian ini hanya diberikan satu kali dengan konsentrasi 100 µM sehingga NADH semakin habis dalam pengikatan enzim dan substrat. Hal ini tampak dari keseluruhan isolat A1a, A5, A9 dan isolat kontrol A. chroococcum. Dari ketiga waktu inkubasi aktivitas enzim merkuri reduktase paling efektif pada waktu inkubasi 30 menit, pada keseluruhan konsentrasi HgCl2 yang diberikan.
Aktivitas enzim merkuri reduktase membutuhkan donor elektron NADH untuk mereduksi Hg2+ menjadi Hg0. Konsentrasi NADH yang digunakan adalah 100 µM. Untuk menghitung NADH teroksidasi digunakan kurva standard NADH supaya Hg2+ tereduksi dapat dihitung. Kurva standard NADH menggunakan konsentrasi NADH secara bertingkat dari 0 µM sampai dengan 100 µM dengan interval 10 µM (Tabel 4.4). Berdasarkan nilai absorbansi NADH untuk kurva standard yaitu 10 µM sampai dengan 100 µM dibuat kurva standard NADH ditampilkan pada Gambar 4.4.
26
Tabel 4.4 Absorbansi NADH untuk kurva standard Konsentrasi NADH (µM)
Absorbansi (Å)
10 0.052 20 0.097 30 0.149 40 0.197 50 0.258 60 0.299 70 0.353 80 0.391 90 0.452
100 0.499
Gambar 4.4 Kurva standard NADH.
Berdasarkan Gambar 4.4 kurva standard NADH mempunyai persamaan linier Y= 0,005x + 0,0003. Selanjutnya persamaan ini digunakan untuk perhitungan NADH teroksidasi. NADH berfungsi sebagai substrat dan koenzim dalam reaksi oksidasi reduksi (pemindahan gugus H atau elektron). Pada reduksi Hg2+ menjadi Hg0 gugus yang berperan sebagi koenzim adalah nikotinamid yang dalam bentuk tereduksi dapat menyerap panjang gelombang 340 nm (Murray, 1996). Hasil NADH teroksidasi digunakan untuk menghitung Hg2+ tereduksi dan efisiensi reduksi Hg2+ (Tabel 4.5).
27
Tabel 4.5 NADH teroksidasi Kode Isolat/ Konsentrasi NADH teroksidasi (µM)
waktu inkubasi HgCl₂ (mg/L) 30 (menit)
60 (menit)
120 (menit)
A1a
5 7.25 7.22 7.30 10 6.50 6.59 6.75 15 6.81 6.74 7.14
A5
5 18.11 18.41 18.69 10 16.22 16.75 17.26 15 17.54 17.90 17.99
A9
5 15.20 13.77 14.86 10 15.55 14.74 17.19 15 17.07 16.58 17.42
Azotobacter chroococcum
5 13.32 14.73 15.12 10 10.74 13.15 13.49 15 10.98 12.77 12.77
Enzim merkuri reduktase mengkatalisis reaksi reduksi ion
merkuri anorganik menjadi elemental merkuri yang volatil, FAD menggunakan NADPH sebagai donor elektron (Fox & Walsh, 1982). NADPH dan NADH memiliki fungsi yang tidak berbeda sebagai donor elektron dengan potensial reduksi pada NADPH sebesar -0,320 volt dan NADH sebesar -0,315 volt sehingga mempunyai kemolaran yang sama yaitu sebesar 0,000622 µM (Voet& Voet, 1990).
Nilai NADH yang teroksidasi semakin tinggi maka nilai HgCl2 yang tereduksi juga akan semakin besar, begitu juga dengan Hg2+ tereduksi juga semakin besar, hal ini menunjukkan NADPH atau NADH sebagai donor elektron berperan dalam reaksi enzimatis dalam reduksi Hg2+menjadi Hg0. Secara kimia reaksinya adalah
NADPH + RS-Hg-SR + H+ -> NADP+ + Hg0 + 2RSH (Fox & Walsh, 1982)
Hg2+ tereduksi membutuhkan koenzim NADPH atau NADH sebagai donor elektron untuk mereduksi Hg2+ menjadi Hg0 volatil. Secara rinci hasil reduksi Hg2+ dapat dilihat pada Tabel 4.6.
28
Tabel 4.6. Hg2+ tereduksi dan efisiensi reduksi Hg2+.
Kode Isolat Konsentrasi
HgCl₂ (mg/L)
Hg²⁺ tereduksi (mg/L)
Efisiensi reduksi Hg²⁺(%)
30 60 120 30 60 120
A1a 5 1.45 1.45 1.47 39 39 40 10 1.30 1.32 1.35 18 18 18 15 1.37 1.35 1.43 12 12 13
A5 5 3.06 2.82 2.91 83 76 79 10 3.25 3.36 3.46 44 45 47 15 3.52 3.59 3.61 32 32 33
A9 5 3.05 2.76 2.98 83 75 81 10 3.12 2.96 3.45 83 40 47 15 3.42 2.96 3.49 31 30 32
A. chroococcum 5 2.67 2.95 3.03 72 80 82 10 2.15 2.64 2.71 29 36 37 15 2.20 2.56 2.56 20 23 23
Dari Tabel 4.6 isolat A1a mempunyai kemampuan
reduksi Hg2+ relatif rendah < 2 mg/L sedangkan pada isolat Azotobacer A5 danA9 relatif sama yaitu sebesar ±3 mg/L dan pada A. chroococcum ± 2 mg/L. Hal ini sesuai dengan hasil uji resistensi HgCl2, bahwa A5 dan A9 lebih resisten dibandingkan A1a, sehingga A5 dan A9 kemampuan reduksi Hg2+ lebih besar dari A1a. Pada hasil resistensi A5 dan A9 resisten optimum pada 10 mg/L HgCl2 dan mempunyai aktivitas enzim merkuri reduktase ± 3 mg/L, lebih tinggi dibandingkan isolat A1a dan kontrol A. chroococcum yang resisten optimum pada 5 mg/L HgCl2 . Konsenrasi substrat berpengaruh terhadap reaksi enzim (Lehninger, 2004), substrat yang ditambahkan dalam penelitian ini adalah NADH sebesar 100 µM yang hanya diberikan satu kali. Pada konsentrasi substrat yang rendah maka reaksi enzim akan menjadi rendah, tetapi reaksi akan meningkat jika kosentrasi substrat meningkat. Enzim bergabung dengan molekul substrat membentuk kompleks enzim substrat dengan mekanisme lock and key atau induced fit (Lehninger, 2004).
29
Berdasarkan Tabel 4.6 secara umum efisiensi reduksi Hg2+ relatif tinggi pada konsentrasi 5 mg/L yaitu >70% kecuali pada isolat A1a yaitu <40%, isolat A1a mempunyai resistensi terhadap HgCl2 yang rendah sehingga produksi enzim merkuri reduktase relatif rendah dibandingkan isolat yang mempunyai resistensi tinggi terhadap HgCl2. Isolat A5, A9 dan kontrol A. chroococcum mempunyai efisiensi reduksi Hg2+ >70% disemua inkubasi pada konsentrasi 5 mg/L HgCl2 dan akan menurun efisiensinya ketika konsentrasi HgCl2 menjadi 10 mg/L dan 15 mg/L yaitu 20-40% kecuali isolat A9 dikonsentrasi 10 mg/L HgCl2 ±80% dengan waktu inkubasi 30 menit efisiensi reduksi Hg2+ dapat dilihat pada diagram batang yang ditampilkan pada Gambar 4.5.
Mekanisme reduksi secara enzimatis disebabkan adanya gen mer operon yaitu gen merA yang menyandi enzim merkuri reduktase (Brown et al., 2003). Merkuri reduktase adalah enzim yang termasuk flavoprotein yaitu enzim oksidoreduktase untuk detoksifikasi merkuri anorganik (Hg2+) menjadi merkuri volatil (Hg0)(Fox & Walsh, 1982). Berdasarkan diagram batang pada Gambar 4.5 persen efisiensi reduksi Hg2+ isolat Azotobacter A5 mempunyai efisiensi reduksi paling tinggi yaitu mencapai 83% pada konsentrasi HgCl2 5 mg/L, 47% pada HgCl2 10 mg/L, dan 33% pada konsentrasi HgCl2 15 mg/L. Sedangkan isolat yang efisiensi reduksi paling rendah adalah isolat Azotobacter A1a yang mencapai 40% pada konsentrasi HgCl2 5 mg/L, 18% pada HgCl2 10 mg/L, dan 13% pada konsentrasi HgCl2 15 mg/L. Semakin besar persen efisensi reduksi Hg2+ maka isolat Azotobacter semakin baik dalam mereduksi Hg2+ menjadi Hg0 dan berpotensi sebagai agen bioremidiasi merkuri.
30
Gambar 4.5. NADH teroksidasi dan efisiensi reduksi Hg2+
31
Ada empat faktor yang mendukung efisiensi kerja enzim yaitu letak dan orientasi substrat dalam hubungannya dengan gugus katalitik, tegangan dan berubahnya ikatan objek oleh dorongan penempatan enzim, katalisator umum asam basa, dan katalisator kovalen (Lehninger, 2004). Enzim merkuri reduktase berikatan dengan molekul NADPH yang akan mendonorkan 2 elektron untuk Hg2+ menjadi Hg0 sehingga terjadi reduksi bilangan oksidasi. Secara invitro NADPH dapat diganti NADH sebab NADPH relatif tidak stabil jika digunakan untuk bioassays (Meissner& Falkinham II, 1983). Reaksi reduksi oksidasi pada mikroorganisme dimediasi oleh suatu molekul yang berfungsi sebagai koenzim yaitu NAD+/NADP+ dalam bentuk teroksidasi (Madigan et al., 2006) dan bentuk tereduksinya adalah NADH dan NADPH. Koenzim ini sebagai pembawa sementara ion H+ yang dipindahkan secara enzimatik dari molekul koenzim (Lehninger, 2004).
32
“Halaman ini sengaja dikosongkan “
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan Kesimpulan dari penelitian Aktivitas Enzim Merkuri Reduktase Pada Azotobacter Sebagai Enzim Pereduksi Hg2+ menjadi Hg0 adalah: 1. Hasil dari isolasi Azotobacter yang resisten HgCl2 dari lahan
eco urban farming ITS adalah 10 isolat yaitu A1a, A1b, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A9, A10. Pada isolat A5, A6 dan A9 resisten sampai 20 mg/L HgCl2, isolat A7, A10 dan kontrol A. chroococcum resisten sampai 15 mg/L, isolat A1a resisten sampai 10 mg/L HgCl2, isolat A1b, A2, A3 dan A8 resisten sampai 10 mg/L HgCl2.
2. Aktivitas enzim merkuri reduktase pada isolat Azotobacter A5 dan A9 mereduksi Hg2+ lebih unggul dibandingkan A1a dan kontrol A. chroococcum dengan daya reduksi Hg2+ mencapai ±3 mg/L
3. Isolat Azotobacter A5 dan A9 mempunyai daya efisiensi reduksi Hg2+ >70% sedangkan pada Isolat Azotobacter A1a daya efisiensi reduksinya <40% pada konsentrasi 5 mg/L HgCl2.
5.2 Saran Beberapa saran untuk penelitian lanjutan antara lain: 1. Perlu dilakukan sekuensing gen 16S rRNA pada masing-
masing isolat untuk mengetahui spesies tiap isolat Azotobacter yang didapatkan.
2. Modifikasi NADH sebagai donor elektron perlu diberikan dengan konsentrasi yang berbeda untuk reduksi Hg2+ menjadi Hg0 .
33
34
“Halaman ini sengaja dikosongkan”
41
Lampiran 1: Pengamatan makroskopis pada media Azotobacter agar dan Nutrien Agar
42
Lampiran 2: Pengamatan mikroskopis dengan pewarnaan methylen blue
43
Lampiran 3: Pengamatan mikroskopis dengan pewarnaan Gram
A10
44
Lampiran 4: Pengamatan kista dengan pewarnaan Geimsa
A10
45
Lampiran 5: Pengamatan uji resistensi HgCl2
Med
ia a
gar
Azo
toba
cter
–HgC
l 2 0,
5 m
g/L
M
edia
aga
r A
zoto
bact
er–H
gCl 2
5 m
g/L
.
Med
ia a
gar
Azo
toba
cte
–HgC
l 2 10
mg/
L
Med
ia a
gar
Azo
toba
cter
– H
gCl 2
15 m
g/L
Med
ia a
gar
Azo
toba
cter
– H
gCl 2
20 m
g/L
46
“Halaman ini sengaja dikosongkan”
47
Lampiran 6: Hasil perhitungan NADH teroksidasi dan aktivitas enzim merkuri reduktase
48
“halaman ini sengaja dikosongkan”
49
Lampiran 7: Pembuatan Larutan stok MRA (mercury reducatase assays). Dalam larutan 200 mL.
- PBS 50 mM disediakan sebanyak 200 ml - EDTA 0,5 mM dibuat dengan menimbang 292,2 mg NA-
EDTA kemudian dilarutkan. - MgSO4 200 µM dibuat dengan menimbang 4,8 mg
kemudian dilarutkan. - 0,1% 2-merchaptoetanol dibuat dengan mengukur 0,2 ml
kemudian dilarutkan. - 100 µM NADH dibuat dengan menimbang 14,2 m g
kemudian dilarutkan. Pembuatan Larutan stok HgCl2 1000 mg/L
- HgCl2 1000 mg dilarutkan dalam 1L/ 1000 m l akuades steril.
50
Lampiran 8: Skema kerja dalam penelitian Isolasi Azotobacter
Sampel tanah eco urban
farming ITS
- Dimasukkan 10 gram kedalam 90 ml akuades steril
- Dilakukan pengenceran 10-1 sampai 10-8
- Diambil 0,1 ml pada tiap pengenceran dan ditumbuhkan pada media selektif Azotobacter agar-0,1 mg/L HgCl2
- Diinkubasi 3- >5 hari kemudian diamati
- Dilakukan purifikasi dan pengamatan makroskopik serta mikroskopik
Isolat Azotobacter
51
Uji resistensi HgCl2 Isolat
Azotobacter
- Ditumbuhkan pada media Azotobacter agar dengan tambahan HgCl2 0,5 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L sampai konsentrasi yang mampu ditoleransi
- Diinkubasi 24 jam pada suhu ruang dan diamati pertumbuhannya
Isolat Azotobacter
uji
52
Kurva pertumbuhan Azotobacter Isolat
Azotobacter uji
Fase Eksponensial
- 1 ose diinokulasikan ke 40 ml NB konsentrasi ½ dari awal.
- Diinkubasi diatas rotary shaker 100 rpm selama 24 jam
Stok kultur
- Dimasukkan ke 160 ml NB- HgCl2 0,1 mg/L diinkubasi di rotary shaker (100 rpm)
- Diukur nilai kerapatan optik (OD; Optical Density) pada panjang gelombang (λ) 600 nm
53
Persiapan ekstrak enzim
Ekstrak enzim
Isolat Azotobacter uji pada fase eksponensial
- Diambil sebanyak 3 ml
- Diinokulasikan kedalam 30 ml NB- HgCl2 0,1 mg/L
- Diinkubasi lalu dipanen pada (µ jam)
fase eksponensial
- Disentrifugasi kecepatan 12000 rpm selama 20 menit suhu 40C
Pelet sel supernatan
- Disuspensikan dengan 30 ml PBS
- Disonikasi ultrasonic processor (600 watt, amplitude 50%) selama 60 detik
- Disentrifugasi kecepatan
12000 rpm selama 30 menit pada suhu 4ºC
54
Uji aktivitas enzim merkuri reduktase Ekstrak
enzim
MRA (mercury reductase
Assays)
Diambil 1 ml Diambil 1 ml
Diinkubasi 30, 60, dan 120
menit
Aktivitas enzim merkuri reduktase
- Diukur pada tiap inkubasi pada panjang gelombang λ 340 nm
Perbandingan 1:1
La
mpi
ran
6: H
asil
perh
itung
an N
AD
H te
roks
idas
i dan
akt
ivita
s enz
im m
erku
ri re
dukt
ase
06
/06/
2014
y =
0.00
5x +
0.0
003
Wak
tu
(men
it)Y
1Y
2Y
3b
aX
1X
2X
3(1
)(2
)(3
)0
0.37
00.
370
0.37
0b
aX
1X
2X
330
0.22
40.
170
0.18
60.
146
0.20
00.
184
0.00
030.
0050
29.1
400
39.9
400
36.7
400
2.32
12.5
603
17.2
155
15.8
362
15.2
040
0.06
293
0.08
621
0.07
931
0.07
615
600.
213
0.21
90.
198
0.15
70.
151
0.17
20.
0003
0.00
5031
.340
030
.140
034
.340
02.
3213
.508
612
.991
414
.801
713
.767
20.
0676
70.
0650
90.
0741
40.
0689
712
00.
213
0.19
30.
186
0.15
70.
177
0.18
40.
0003
0.00
5031
.340
035
.340
036
.740
02.
3213
.508
615
.232
815
.836
214
.859
20.
0676
70.
0762
90.
0793
10.
0744
3
00.
370
0.37
00.
370
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
130
0.13
50.
126
0.24
00.
235
0.24
40.
0003
0.00
5047
.940
046
.940
048
.740
03.
136
15.2
870
14.9
681
15.5
421
15.2
657
0.07
653
0.07
494
0.07
781
0.07
642
600.
165
0.15
40.
128
0.20
50.
216
0.24
20.
0003
0.00
5040
.940
043
.140
048
.340
03.
136
13.0
548
13.7
564
15.4
145
14.0
753
0.06
537
0.06
888
0.07
717
0.07
047
120
0.13
80.
153
0.13
60.
232
0.21
70.
234
0.00
030.
0050
46.3
400
43.3
400
46.7
400
3.13
614
.776
813
.820
214
.904
314
.500
40.
0739
80.
0692
0.07
462
0.07
26
00.
370
0.37
00.
370
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
084
0.09
50.
087
0.28
60.
275
0.28
30.
0003
0.00
5057
.140
054
.940
056
.540
07.
757.
3729
7.08
907.
2955
7.25
250.
0369
0.03
548
0.03
652
0.03
6360
0.09
40.
084
0.09
20.
276
0.28
60.
278
0.00
030.
0050
55.1
400
57.1
400
55.5
400
7.75
7.11
487.
3729
7.16
657.
2181
0.03
561
0.03
690.
0358
70.
0361
312
00.
091
0.08
40.
085
0.27
90.
286
0.28
50.
0003
0.00
5055
.740
057
.140
056
.940
07.
757.
1923
7.37
297.
3471
7.30
410.
036
0.03
690.
0367
70.
0365
6
00.
370
0.37
00.
370
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
129
0.13
40.
139
0.24
10.
236
0.23
10.
0003
0.00
5048
.140
047
.140
046
.140
03.
5413
.598
913
.316
413
.033
913
.316
40.
0680
80.
0666
70.
0652
50.
0666
760
0.11
10.
111
0.10
50.
259
0.25
90.
265
0.00
030.
0050
51.7
400
51.7
400
52.9
400
3.54
14.6
158
14.6
158
14.9
548
14.7
288
0.07
316
0.07
316
0.07
486
0.07
373
120
0.10
30.
105
0.09
80.
267
0.26
50.
272
0.00
030.
0050
53.3
400
52.9
400
54.3
400
3.54
15.0
678
14.9
548
15.3
503
15.1
243
0.07
542
0.07
486
0.07
684
0.07
571
y =
0.00
5x +
0.0
003
Wak
tu
(men
it)Y
1Y
2Y
3b
aX
1X
2X
3(1
)(2
)(3
)0
0.35
50.
355
0.35
5b
aX
1X
2X
330
0.18
80.
167
0.16
80.
167
0.18
80.
187
0.00
030.
0050
33.3
400
37.5
400
37.3
400
2.32
14.3
707
16.1
810
16.0
948
15.5
489
0.07
198
0.08
103
0.08
060.
0778
760
0.19
00.
194
0.16
70.
165
0.16
10.
188
0.00
030.
0050
32.9
400
32.1
400
37.5
400
2.32
14.1
983
13.8
534
16.1
810
14.7
443
0.07
112
0.06
940.
0810
30.
0738
512
00.
160
0.14
70.
159
0.19
50.
208
0.19
60.
0003
0.00
5038
.940
041
.540
039
.140
02.
3216
.784
517
.905
216
.870
717
.186
80.
0840
50.
0896
60.
0844
80.
0860
6
00.
355
0.35
50.
355
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
119
0.08
90.
093
0.23
60.
266
0.26
20.
0003
0.00
5047
.140
053
.140
052
.340
03.
136
15.0
319
16.9
452
16.6
901
16.2
224
0.07
526
0.08
482
0.08
355
0.08
121
600.
105
0.08
50.
086
0.25
00.
270
0.26
90.
0003
0.00
5049
.940
053
.940
053
.740
03.
136
15.9
247
17.2
003
17.1
365
16.7
538
0.07
972
0.08
610.
0857
80.
0838
612
00.
083
0.08
20.
087
0.27
20.
273
0.26
80.
0003
0.00
5054
.340
054
.540
053
.540
03.
136
17.3
278
17.3
916
17.0
727
17.2
640
0.08
673
0.08
705
0.08
546
0.08
642
00.
355
0.35
50.
355
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
096
0.10
80.
104
0.25
90.
247
0.25
10.
0003
0.00
5051
.740
049
.340
050
.140
07.
756.
6761
6.36
656.
4697
6.50
410.
0334
20.
0318
70.
0323
90.
0325
660
0.09
50.
103
0.1
0.26
00.
252
0.25
50.
0003
0.00
5051
.940
050
.340
050
.940
07.
756.
7019
6.49
556.
5729
6.59
010.
0335
50.
0325
20.
0329
0.03
299
120
0.09
20.
091
0.09
60.
263
0.26
40.
259
0.00
030.
0050
52.5
400
52.7
400
51.7
400
7.75
6.77
946.
8052
6.67
616.
7535
0.03
394
0.03
406
0.03
342
0.03
381
00.
355
0.35
50.
355
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
150.
149
0.19
50.
205
0.20
60.
160
0.00
030.
0050
40.9
400
41.1
400
31.9
400
3.54
11.5
650
11.6
215
9.02
2610
.736
30.
0579
10.
0581
90.
0452
0.05
377
600.
111
0.12
0.13
50.
244
0.23
50.
220
0.00
030.
0050
48.7
400
46.9
400
43.9
400
3.54
13.7
684
13.2
599
12.4
124
13.1
469
0.06
893
0.06
638
0.06
215
0.06
582
120
0.11
70.
116
0.11
50.
238
0.23
90.
240
0.00
030.
0050
47.5
400
47.7
400
47.9
400
3.54
13.4
294
13.4
859
13.5
424
13.4
859
0.06
723
0.06
751
0.06
780.
0675
1
y =
0.00
5x +
0.0
003
Wak
tu
(men
it)Y
1Y
2Y
3b
aX
1X
2X
3(1
)(2
)(3
)0
0.36
40.
364
0.36
4b
aX
1X
2X
330
0.16
90.
161
0.16
70.
195
0.20
30.
197
0.00
030.
0050
38.9
400
40.5
400
39.3
400
2.32
16.7
845
17.4
741
16.9
569
17.0
718
0.08
405
0.08
750.
0849
10.
0854
960
0.18
80.
172
0.15
40.
176
0.19
20.
210
0.00
030.
0050
35.1
400
38.3
400
41.9
400
2.32
15.1
466
16.5
259
18.0
776
16.5
833
0.07
586
0.08
276
0.09
052
0.08
305
120
0.15
50.
160
0.17
00.
209
0.20
40.
194
0.00
030.
0050
41.7
400
40.7
400
38.7
400
2.32
17.9
914
17.5
603
16.6
983
17.4
167
0.09
009
0.08
793
0.08
362
0.08
721
00.
364
0.36
40.
364
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
092
0.09
40.
080
0.27
20.
270
0.28
40.
0003
0.00
5054
.340
053
.940
056
.740
03.
136
17.3
278
17.2
003
18.0
931
17.5
404
0.08
673
0.08
610.
0905
60.
0878
600.
083
0.08
50.
081
0.28
10.
279
0.28
30.
0003
0.00
5056
.140
055
.740
056
.540
03.
136
17.9
018
17.7
742
18.0
293
17.9
018
0.08
960.
0889
70.
0902
40.
0896
120
0.08
40.
081
0.08
00.
280
0.28
30.
284
0.00
030.
0050
55.9
400
56.5
400
56.7
400
3.13
617
.838
018
.029
318
.093
117
.986
80.
0892
90.
0902
40.
0905
60.
0900
3
00.
364
0.36
40.
364
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
101
0.1
0.09
80.
263
0.26
40.
266
0.00
030.
0050
52.5
400
52.7
400
53.1
400
7.75
6.77
946.
8052
6.85
686.
8138
0.03
394
0.03
406
0.03
432
0.03
411
600.
103
0.10
40.
10.
261
0.26
00.
264
0.00
030.
0050
52.1
400
51.9
400
52.7
400
7.75
6.72
776.
7019
6.80
526.
7449
0.03
368
0.03
355
0.03
406
0.03
376
120
0.08
10.
091
0.08
90.
283
0.27
30.
275
0.00
030.
0050
56.5
400
54.5
400
54.9
400
7.75
7.29
557.
0374
7.08
907.
1406
0.03
652
0.03
523
0.03
548
0.03
574
00.
364
0.36
40.
364
Y1
Y2
Y3
ba
X1
X2
X3
300.
170.
164
0.17
40.
194
0.20
00.
190
0.00
030.
0050
38.7
400
39.9
400
37.9
400
3.54
10.9
435
11.2
825
10.7
175
10.9
812
0.05
480.
0565
0.05
367
0.05
499
600.
140.
131
0.14
20.
224
0.23
30.
222
0.00
030.
0050
44.7
400
46.5
400
44.3
400
3.54
12.6
384
13.1
469
12.5
254
12.7
702
0.06
328
0.06
582
0.06
271
0.06
394
120
0.12
10.
134
0.15
80.
243
0.23
00.
206
0.00
030.
0050
48.5
400
45.9
400
41.1
400
3.54
13.7
119
12.9
774
11.6
215
12.7
702
0.06
864
0.06
497
0.05
819
0.06
394
Perh
itung
an µ
M N
AD
H te
roks
idas
i
A1a
chro
ococ
cu
Perh
itung
an µ
M N
AD
H te
roks
idas
i
Perh
itung
an µ
M N
AD
H te
roks
idas
i
RA
TA
unit
aktiv
itas
A9 A5
NA
DH
te
roks
N
AD
H
tero
ks
Rat
a-ra
ta
NA
DH
te
roks
unit
aktiv
itas
mer
ed
unit
aktiv
itas
mer
ed
unit
aktiv
itas
mer
ed
Abs
N
AD
H
Tota
l N
AD
H
Tota
l N
AD
H
Tota
l N
AD
H
Jum
lah
sel x
109
NA
DH
te
roks
Is
olat
OD
1O
D2
OD
3A
bs
NA
DH
A
bs
NA
DH
A1a
chro
ococ
cu
NA
DH
100
µM
HgC
l2 1
5 m
g/L
RA
TA
unit
aktiv
itas
A9 A5
NA
DH
te
roks
N
AD
H
tero
ks
Rat
a-ra
ta
NA
DH
te
roks
unit
aktiv
itas
mer
ed
unit
aktiv
itas
mer
ed
unit
aktiv
itas
mer
ed
Abs
N
AD
H
Tota
l N
AD
H
Tota
l N
AD
H
Tota
l N
AD
H
Jum
lah
sel x
109
NA
DH
te
roks
Is
olat
OD
1O
D2
OD
3A
bs
NA
DH
A
bs
NA
DH
A1a
chro
ococ
cu
NA
DH
100
µM
HgC
l2 1
0 m
g/L
A9
A5
NA
DH
te
roks
R
ata-
rata
N
AD
H
tero
ks
unit
aktiv
itas
mer
ed
unit
aktiv
itas
mer
ed
unit
aktiv
itas
mer
ed
RA
TA
unit
aktiv
itas
Tota
l N
AD
H
Tota
l N
AD
H
Tota
l N
AD
H
Jum
lah
sel x
109
NA
DH
te
roks
N
AD
H
tero
ks
NA
DH
100
µM
HgC
l₂ 5
mg/
L
Isol
atO
D1
OD
2O
D3
Abs
N
AD
H
Abs
N
AD
H
Abs
N
AD
H
55
BIODATA PENULIS
Penulis dilahirkan dikota Wonosobo, Jawa Tengah pada tangal 15 Juni 1991 sebagai anak ke-4 dari 4 bersaudara dari pasangan Muhammad Mahmud Syihab dan Suprapti Mutmainah. Pendidikan formal ditempuh di TK Islam Wonosobo, SD Islam Miftahul-Huda Wonosobo, SMP Takhassus Al-Qur’an Wonosobo, SMA Takhassus Al-Qur’an Wonosobo. Penulis melanjutkan studi Strata-1 di
Jurusan Biologi ITS Surabaya pada tahun 2010 dan terdaftar dengan NRP.1510100046 melalui jalur SNMPTN. Selama kuliah penulis pernah mengikuti beberapa pelatihan, diantaranya Pelatihan Karya Tulis Ilmiah (PKTI), Emotional Spiritual Quation (ESQ), LKMM Pra-TD serta pernah menjadi Bendahara Umum-1 Himpunan Mahasiswa Biologi ITS periode 2012/2013.