Tugas Kelompok Tanggal :Kamis/01 Maret 2012

Pengantar Penelitian Biokimia Dosen :Prof. Dr. drh. Maria Bintang M.Sc

METODE PEMECAHAN SEL

Kelompok 7

Sarah Fitriani G84090013

Amar Muslim G84090019

Sisca Resha Saputri G84090041

M. Budi Rahmanwahid G84090045

Clara Shinta A.R G84090062

Puri Dermawan G84090084

Muvita Diah S G84090085

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

METODE PEMECAHAN SEL DALAM PENELITIAN BIOKIMIA

Pemecahan sel adalah langkah pertama dalam beberapa proses analitik

untuk melepaskan dan meneliti kandungan sel. Proses tersebut sangat penting

dalam percobaan fraksinasi untuk isolasi, pemurnian, dan pengujian organel

subselular. Dalam proses homogenisasi, maka jaringan dipecah dan dhancurkan,

sehingga melepaskan senyawa-senyawa intraselular membentuk suspense sel

yang disebut homogenat. Homogenate ini dapat digunakan secara langsung untuk

pengujian aktivitas enzim atau untuk mempelajari masuknya suatu senyawa

metabolit atau xebobiotik yang sulit dilakukan pada jaringan tubuh. (Bintang

2010)

Suhu tinggi dapat mendenaturasi sebagian besar enzim, sehingga proses

pemecahan umumnya dlakukan pada 4C, dalam ruangan laboratorium

berpendingin atau dalam skala kecil yang dilakukan dengan dua cara, yaitu cara

mekanik dan non-mekanik. Pemecahan sel secara mekanik dapat dilakukan

dengan dua cara, yaitu metode solid shear (pemecahan dalam bentuk padatan)

atau metode lquid shear atau pemecahan dalam cairan, sedangkan pemecahan sel

secara non-mekanik dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu enzmatik, fisik, dan

kimia. (Bintang 2010)

Teknik Mekanik

Ada beberapa cara mekanik yang dapat digunakan yakni, solid shear,

liquid shear, high pressure disruption, dan ultrasonic oscillaton. Secara mekanis

dalam bentuk cair yaitu pemecahan dengan gelembung netrasonik (sonikator), dan

agitasi mekanis dengan tekanan (pompa penekan “French pressure”). Betuk

padatnya yaitu dengan homogenisasi dan penggilingan dengan mortar/blender,

dan penghancuran dengan “Hammer mill. (Soedjarwo 2004). Teknik mekanik

terbagi menjadi pemecahan cair dan pemecahan padat.

a. Sonikasi (ultrasonic oscillaton)

Salah satu cara efektif untuk memecah sel yang dapat diterapkan

pada mikroorganisme ialah dengan gelombang bunyi berfrekuensi tinggi.

Efisiensi pemecahan sel dipengaruhi oleh keluaran daya alat, durasi penggunaan,

dan volume bahan yang diproses. Pendinginan dibutuhkan untuk mencegah

pemanasan berlebihan. Metode ini menggunakan alat sonikator dengan frekuensi

getaran 300-30.000 kali per menit. (Bintang 2010). Penelitian yang menggunakan

sonifikasi pada metode pemecahan selnya adalah pada penelitian “Identifikasi

Profil Protein Sarcoptes Scabiei Pada Kambing Dengan Analisis Sds-Page”.

Pada salah satu bagian metode dijabarkan bahwa setelah isolat dilarutkan dalam

satu ml PBS dan disonikasi pada 30 kHz, diulang sebanyak 16 kali, masing-

masing selama 4 menit dengan waktu istirahat 2 menit. Larutan hasil sonikasi

selanjutnya disentrifus. (Lastuti 2004) Pada prosiding skripsi yang berjudul

“Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase Yang Diamobilisasi Dengan Na-

Alginat”. Ragi roti ditimbang sebanyak 55 gram kemudian ditambah larutan

NaHCO3 0,1 M sebanyak 150 ml dan diaduk. Campuran tersebut dimasukkan ke

dalam tabung homogenizer kemudian diletakkan pada alat homogenizer.

Pencampuran dilakukan dengan kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Hasil

campuran yang telah homogen dimasukkan ke dalam erlemeyer lalu ditutup

dengan kapas yang dilapisi kasa dan alumunium foil serta diinkubasi pada suhu

40oC selama 24 jam. Campuran yang telah diinkubasi kemudian dilakukan

pemecahan sel menggunakan alat ultrasonikator dengan kuat getaran sebesar 16

rms selama 20 menit. (Hasanah dan Putra 2009)

b. Solid Shear

Metode pemecahan sel(tanaman, yeast, dan bakteri) ini dapat dilakukan

dengan cara menggerus bersama pasir kuarsa steril atau nitrogen cair di dalam

mortar. (Bintang 2010). Pada jurnal yang berjudul “Spesifitas Dan Sensitifitas

Antibodi Anti Erf3 Ragi Saccharomyces Cerevisia”.Dalam metode penelitannya

tercantum penggunaan glass bead, yakni pada bagian isolasi enzim, satu koloni

tunggal ragi ditumbuhkan dalam media cair YEPD dan diinkubasi pada suhu

30oC dengan pengocokan 150 rpm sampai mencapai OD600 : 0.5. Biakan

dipindahkan ke dalam 50mL media produksi dan diinkubasi kembali hingga

OD600 :1.5-2. Suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 2300g selama 10

menit, pellet sel dicuci dengan buffer lisis dan disentrifugasi kembali dengan

kecepatan 2300g selama 15 menit. Pelet sel diresuspensi dengan buffer lisis +

PMSF dan dimasukkan ke dalam tabung sorval. Kedalam suspense ditambahkan

glass bead sampai batas miniskus bawah dan di vortex selama 10 menit.

(Hermanto 2010)

c.Liquid Share

Pemecahan cair, menggunakan blender dengan kecepatan tinggi atau dapat

juga menggunakan alat pelumat(homogenizer), tetapi biasanya hanya dilakukan

beberapa detik saja untuk menghancurkan sel mikroorganisme karena

mikroorganisme memiliki sel yang kecil. Misalnya terdapat dalam metode

penelitian sebuah jurnal yang berjudul “Seleksi Dan Pengujian Aktivitas Enzim L-

Histidine Decarboxylase Dari Bakteri Pembentuk Histamin”. Isolasi enzim

dilakukan dengan menumbuhkan isolate bakteri pembentuk kadar histamin

tertinggi dan Morganella morganii (sebagai kontrol) dalam media sintetik.

Sebanyak 2 ml inokulum (8,7 x 109 sel/ml), ditambahkan pada Erlenmeyer 100

ml berisi 20 ml medium sintetik, kemudian diinkubasi selama 18 jam dalam

shaker dengan kecepatan 125 g pada 37C. Pemisahan hasil fermentasi dilakukan

dengan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 g selama 15 menit, kemudian dicuci

dengan bufer fosfat pH 6,8. Pasta sel yang diperoleh disuspensikan dengan bufer

fosfat pH 6,8 (5 ml/g berat basah sel). Pemecahan dinding sel dilakukan dengan

tissue homogenizer selama 5 menit dengan kecepatan 11.000 g. Ekstrak enzim

kasar dipisahkan dari sel dengan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 g selama 15

menit. (Mangunwardoyo 2007)

d. High Pressure Disruption

Merupakan teknik pemecahan sel dengan menggunakan tekanan tinggi.

Metode ini digunakan untuk memecah sel mikroorganisme. Selain itu metode ini

juga digunakan untuk pemecahan sel hewan (1000 psi) dan bakteri (1000-2000

psi). (Bintang 2010).

e. Agitasi dan Abrasi

Pasta ditempatkan pada wadah yang megandung butir-butir gelas dan

digetakan dengan cepat. timbulnya gaya gesek akibat gradien kecepatan oleh

tumbukan antar butiran dan antara butiran dengan mikroorganisme menyebakan

pecahnya sel.

f. Peralatan Pemecahan Sel Secara Mekanik

1. Alu penghomogen

Alu penghomogen dapat digunakan untuk menghancurkan sel hewan dengan

efektif namun lembut. Teknik ini merusak seluruh sel kecuali organelnya. Ada

dua macam alu penghomogen, yaitu penghomogen Dounce dan Potter–Elvehjem.

Penghomogen Dounce terdiri dari sebuah tabung gelas, tertutup pada salah satu

ujungnya, dan dua buah alu (piston) yang dapat masuk ke dalam tabung tersebut

namun berbeda keketatannya. Jaringan sampel dipotong kecil-kecil dan

dimasukkan ke dalam tabung penghomogen bersama larutan penyangga, lalu alu

"L" (loose, longgar) digunakan terlebih dahulu untuk menghancurkan jaringan

tersebut menjadi campuran cair. Alu "T" (tight, ketat) lalu digunakan untuk

menghancurkan sel dan mengeluarkan isinya. Umumnya homogenisasi dilakukan

dalam jumlah tertentu gerakan alu naik dan turun di dalam tabung.Penghomogen

Potter–Elvehjem bekerja dengan cara sama, namun alu-nya berbentuk lebih

tabung sehingga gaya pemecahnya dapat disebar ke permukaan yang lebih luas.

Penghomogen tipe ini juga tersedia dalam versi automatis dan bermotor.

2. Blendor Waring

Blendor Waring merupakan sejenis blender yang terdiri dari rotor berkecepatan

tinggi dengan bilah pemotong yang dipasang di dalam wadah kaca. Seberapa

hancurnya sel bergantung pada kecepatan putaran bilah. Pada kecepatan tinggi,

alat ini dapat merusak mitokondria dan nukleus serta bahkan

mendenaturasi protein. Alat ini paling banyak digunakan untuk

jaringan tumbuhan dan hewan, namun kurang efektif untuk mikroorganisme.

3. Penggerusan

Beberapa jenis alat dapat digunakan untuk menggerus sel. Dengan alat yang

disebut disintegrator Edmund-Bühler, sel bakteri digetarkan bersama manik-

manik kaca di dalam wadah berpembungkus. Sel pecah akibat tumbukan,

sobekan, dan gesekan antarpermukaan keras. Agar tidak memanas, cairan

pendingin dialirkan melalui pembungkus.

4. Bom Parr

Dengan alat yang disebut bom Parr, sampel diberi

gas nitrogen dengan tekanan sangat tinggi sehingga nitrogen memasuki cairan sel.

Ketika tekanannya dihilangkan, gelembung-gelembung nitrogen meledak keluar

dan merusak sel, namun tidak terlalu merusak organel.

5. Ekstrusi dalam tekanan tinggi

Dengan menggunakan alat seperti sel tekanan French, sel dipecah dengan ekstrusi

melalui lubang sempit dalam tekanan sampai 8.000 psi

Teknik Non-Mekanik

Beberapa cara non-mekanik yang dapat digunakan, yaitu teknik enzimatik, teknik

fisik, dan teknik kmiawi.

a. Teknik Enzimatik

Pemecahan sel secara sederhana dapat dilakukan oleh enzim, karena enzim

dapat mencerna membrane sel hewan, dinding sel tumbuhan , dan mikroba.

Sebagai contoh, kombinasi antara pektinase dan selulase yang mencerna selulosa

dan pectin pada dinding sel tanaman; kitinase pada dinding sel fungi dan

serangga; lisozim pada dinding sel bakteri yang mengandung peptidoglikan; serta

koagulase dan tripsin yang mencerna protein sel hewan. (Bintang 2010).

Pemecahan dinding sel dengan cara ini merupakan cara paling efektif. Enzim litik

yang umum digunakan adalah lisozim yang diperoleh dari putih telur enzim ini

memecah ikatan b-1,4 glikosida dari polisakarida (asam muramat) penyusun

dinding sel. Dinding sel bakteri gram positif lebih banyak mengandung

polisakarida dibandingkan dengan bakteri gram negatif, sehinggan penggunaan

enzim litik lebih efektif untuk memecah dinding sel bakteri gram positif. EDTA

perlu ditambahkan pada media sebelum enzim ini digunakan untuk memecah

dinding sel bakteri gram negatif, untuk mengikat ion-ion divalen yang dapat

menginaktifkan enzim ini. Enzim lisozim dapat digunakan secara komersial pada

ekstraksi enzim glukosa isomerase dari streptomyces sp.

Nasran et all 2003, dalam jurnal yang berjudul “Produksi Kitinase Dan

Kitin Deasetilase Dari Vibrio Harveyi” menyatakan proses konversi kitin secara

kimiawi dapat dilakukan menggunakan larutan NaOH pada kadar dan suhu tinggi.

Teknologinya relatif mudah, tetapi mutu kitosan yang dihasilkan dengan cara ini

kurang seragam, meskipun telah dibantu dengan pengadukan. Hal ini lebih

disebabkan karena hidrolisis secara kimiawi bersifat acak/tidak spesifik pada

ikatan/gugus tertentu seperti hidrolisis oleh enzim. Teknologi alternatif adalah

menggunakan enzim kitinase dan kitin deasetilase. Kedua jenis enzim ini terdapat

secara ekstraseluler dalam lapisan lender lambung dan usus serta darah beberapa

jenis ikan.

b. Teknik Fisik

Pemecahan sel dengan cara ini dapat dilakukan melalui dua metode, yaitu

osmotic shock dan freezing-thawing. Contoh metode osmotic shock adalah sel

darah merah yang dimasukkan ke dalam aquades(larutan hipotonik), sehingga sel

darah pecah. (Bintang 2010). Bakteri gram negatif lebih rentan terhadap

perubahan tekanan osmosa yang besar dibandingkan bakteri gram positif. Bila

bakteri diletakkan dalam media dengan tekanan osmosis tinggi (mis. larutan

sukrosa 20%) sampai dicapai keadaan setimbang, kemudain dipindahkan ke

dalam air, maka akan timbul aliran air dari media ke dalam sel, sehingga akan

menyebabkan pecahnya dinding sel. Pada artikel ilmiah yang berjudul “Keutuhan

Membran Spermatozoa Sapi Friesian Holstein (Fh) Dalam Bahan Pengencer Skim

Kuning Telur, Tris Kuning Telur Dan Andromed® Setelah Proses Pembekuan”

digunakan metode freezing-thawing dalam prosedurnya, yakni straw yang telah

dikemas atau diatur di atas rak straw, kemudian diletakkan di atas Nitrogen cair

±1 cm di atas permukaan Nitrogen cair, processing dalam container sampai

suhunya mencapai -140⁰C. Freezing dilanjutkan setelah pre freezing yaitu straw

direndam dalam Nitrogen cair yang suhunya -196⁰C. (Yunita 2011)

c. Teknik Kimia

Dengan menggunakan pelarut organic seperti etil asetat atau toluene, dan

menggunakan detergen sepesrti SDS, Triton X-100, dan Tweeen 80. Detergent-

detergent anionik, kationik, dan non-ionik cukup efektif untuk merusak membran

sel. Contoh detergent yang sering digunakan untuk isolasi enzim antara lain:

setiltrimetil amonium bromida (kationik), natrium lauril sulfat (anionik), tweens,

spans dan triton (non-ionik).Pada kondisi pH dan kekuatan ion yang sesuai,

detergent akan berinteraksi dengan lipoprotein untuk membentuk misel. akibatnya

lipoprotein yang merupakan konstituen membran dapat larut dan enzim dapat

dikeluarkan. Pemilihan dan penggunaan detergent ini harus cukup selektif, karena

beberapa enzim dapat menjadi tak aktif akibat denaturasi protein dan

pengendapan oleh detergent. Umumnya detergent harus segera dipisahkan

sebelum enzim hasil isolasi digunakan. Pada jurnal yang berjudul “PCR Tanpa

Isolasi DNA dari Sel Epitel Rongga Mulut”, salah satu prosedurnya menggunakan

teknik kimia dalam pemecahan sel, yakni penggunaan Tween 20 yakni, lisis sel

epitel untuk memperoleh DNA mitokondria dilakukan dengan cara menginkubasi

10 μL sampel dalam 200 μL campuran reaksi yang terdiri dari bufer lisis (50 mM

Tris-HCl pH 8,5; 1 mM EDTA pH 8,0; 0,5 % Tween-20) dan proteinase-K 200

(μg/mL. Inkubasi dilakukan pada suhu 50 oC selama 1 jam disusul dengan 95 oC

selama 3 menit6) dalam mesin Mastercycler® 5330 (Eppendorf). (Gustiananda

dan Noer 2000)

Teknik pemecahan sel dalam metode kimiawi lebih banyak digunakan

untuk preparasi DNA. Sel diperlakukan dengan pemaparan senyawa kimia yang

mempengaruhi dinding sel. Dinding sel E.coli dan bakteri sejenis dilemahkan oleh

lisozim, EDTA, atau campuran keduanya. Lisozim memotong senyawa polimer

dinding sel, sedangkan EDTA mengikat ion magnesium yang menjaga struktur

dinding sel dan juga menghambat enzim yang akan memotong DNA. Dengan cara

ini, cukup untuk memecahkan sel, tetapi biasanya ditambah detergen, seperti

natrium dedosil sulfat (SDS). Detergen ini membantu proses lisis dengan

menghilangkan lipid pada dinding sel. Pada preparasi DNA plasmid lisis

dilakukan pada suasana alkali pH 12. Keadaan ini, molekul DNA kromosom

terfragmentasi dan terdenaturasi. Sedangkan DNA plasmid terdenaturasi tetapi

masih saling terpaut antara masing-masing untai dan tidak terpotong karena

ukurannya kecil. Jika campuran kalium asetat dan asam asetat ditambahkan

sampai netral, fragmen DNA akan membentuk gumpalan kusut bersama dengan

sebagian besar protein dan RNA. DNA plasmid kembali renaturasi menjadi untai

ganda dan terlarut. Setelah sel lisis, partikel yang tidak larut seperti dinding sel,

dihilangkan dengan sentrifugasi. Buffer 7.8 digunakan dalam isolasi DNA

kromosom yang mengandung lisozim untuk menghasilkan speroplas. Penambahan

detergen yang lebih lemah misalnya sarkosil dimaksudkan untuk memecah

speroplas. Protein sel dipecah dengan proteinase K semalam. Dengan cara ini

DNA kromosom tidak terfragmentasi dan jumlah protein menjadi tinggal sedikit

(Sudjadi 2008).

Metode Isolasi DNA dan Pemecahan Sel Bakteri

Pemecahan dinding sel-sel atau jaringan yang akan diisolasi DNA-nya,

seperti sel-sel darah merah, kultur sel bakteri, dan jaringan hewan atau tanaman.

Sel-sel dari kultur sel atau bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 8.000-10.000

rpm selama 10 menit.

1. Debris sel dipisahkan dari larutan DNA.

2. Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA yang murni.

3. Presipitasi DNA dengan ethanol dingin

4. Pemurnian DNA dari ekstrak sel dengan menggunakan salah satu

kemikalia seperti berikut ini: Fenol, Fenol : kloroform, Isopropanol,

Fenol:kloroform:isoamylalkohol.

5. Selain itu untuk pemurnian DNA dari kontaminan protein digunakan

enzim protease yaitu Pronase atau Proteinase-K, dan kontaminan RNA dengan

menggunakan RNase.

6. Pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein dapat dilakukan dengan

menggunakan densitas gradien sentrifugasi Cesium Chlorida (CsCl), dengan cara

ini DNA akan terpisah pada band yang berbeda dengan protein dan RNA bahkan

antara linier DNA dan sirkuler DNA. Selain itu, dengan menggunakan garam

dengan konsentrasi tinggi, seperti 0,25 M sodium acetate atau 0,1 M sodium

chlorida.

7. Presipitasi akhir DNA dapat dilakukan dengan menggunakan ethanol yang

dingin dibawah kondisi ionik yang kuat. Dan dicuci dengan EtOH 70%.

8. Pellet DNA dilarutkan dengan buffer TE atau ddH2O steril.

Pemecahan dinding bakteri dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu:

(1) Secara fisik: sel dipecah dengan kekuatan mekanik atau resonansi

(2) Secara kimiawi : sel dirusak dengan buffer lisis berisi senyawa kimia yang

dapat merusak intregitas barrier dinding sel, senyawa kimia yang dipakai

biasanya, al.: lisosim, EDTA (etilen diamin tetra asetat), Tris-Cl, atau deterjen,

SDS (sodium dodecyle sulphate).