I. PENDAHULUAN

I.a. Latar Belakang

I.b. Tujuan

II. METODOLOGI

II.a. Alat dan Bahan

Alat yang dibutuhkan dalam praktikum ini adalah gelas kimia, HPLC, statip,

Erlenmeyer. Bahan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah teh hijau, teh hitam,

aquades, kopi bubuk, kopi arabika bubuk, kopi robusta bubuk, dan coklat bubuk.

II.b. Tempat

Praktikum ini dilaksanakan di Laboratorium Pengawasan Mutu dan

Laboratorium Instrumen Departemen Teknologi Industri Pertanian

II.c. Metode

1. Ekstraksi Kafein

2. Penentuan Kadar Kafein

Sebanyak 10

mg kafein

ditimbang

Dimasukkan ke

dalam labu

ukur 100 ml

Larutkan

sampai

tanda tera

Aduk dengan

sonifikasi

selama 5 menit

Larutan

disaring

Larutan

diinjeksikan

ke alat HPLC

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

III.a. Hasil Praktikum

[Terlampir]

III.b. Pembahasan

Kafein merupakan jenis alkaloid yang secara alamiah terdapat dalam biji

kopi, daun teh, daun mete, biji kola, biji coklat, dan beberapa minuman penyegar.

Kafein memiliki berat molekul 194.19 dengan rumus kimia C8H10N8O2 dan pH 6.9

(larutan kafein 1% dalam air). Kafeina memiliki molekul metabolit yaitu 1-3-7-asam

trimetilurat, paraksantina, teofillina dan teobromina dengan masing-masing lintasan

metabolismenya. Kafein ialah alkaloid yang tergolong dalam keluarga

methylxanthine bersama-sama senyawa tefilin dan teobromin. Pada keadaan asal,

kafein ialah serbuk putih yang pahit. Nama sistematik kafein ialah:

1,3,7-trimetilxanthine atau 3,7-dihidro-1,3,7-trimetil-1H-purin-2,6-dione

Sifat umum kafein menurut Siswoputranto (1993) adalah sebagai berikut:

Titk beku : 238°C

Titik didih : 178°C

Tekanan uap : 760 mm Hg pada 178 °C

Berat molekul: 197,19

Kelarutan di air: 2,17%

pH : 6,9 (1% larutan)

Dalam praktikum yang telah dilakukan, ekstraksi kafein dari tiap-tiap bahan

menggunakan metode HPLC. High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. HPLC termasuk metode analisis

terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam

cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode

lainnya (Snyder dan Kirkland, 1979; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu

antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

Resolusi yang baik

Dapat digunakan bermacam-macam detektor

Kolom dapat digunakan kembali

Mudah melakukan "sample recovery"

Untuk zat yang labil & tidak mudah menguap

Dilakukan pada suhu kamar

Dapat untuk senyawa anorganik & Mr besar

Gambar Skema alat HPLC

Prinsip kerja & Instrumentasi

• Fasa gerak zat cair (eluen/pelarut)

Pelarut yang baik untuk cuplikan, murni, jernih, tidak kental, sesuai dengan

detektor.

• Pompa motor

Berfungsi sebagai penggerak fasa gerak, syaratnya tahan korosi dan

minimum tekanan pompa 6000 psi.

• Pemasukkan cuplikan

Syarat pemasukkan cuplikan yaitu tekanan tidak turun. Teknik yang dipakai

untuk memasukkan cuplikan dengan injeksi syringe disuntikkan melalui

septum (tahan P = 1500 psi).

• Kolom

Fungsi kolom menyaring kotoran dan menjenuhkan fasa diam. Ukuran kolom

dari diameter 4-5 mm.

• Detektor

Detektor HPLC digunakan untuk senyawa organik adalah detektor UV 254

nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak

senyawa dengan range yang lebih luas.

Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang dapat

memisahkan setiap komponen dalam suatu campuran. Pemisahan ini didasarkan pada

perbedaan migrasi setiap komponen yang disebabkan karena perbedaan sifat

interaksi dari setiap komponen pada fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase

geraknya metoda kromatografi cair dan kromatografi gas. Salah satu contoh dari

pengembangan metode kromatografi cair dalam HPLC (High Performance Liquid

Chromatgraphy) atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan

memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang distribusi

ukurannya sempit (kolom) dan fase gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir

yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan

dengan resolusi tinggi dan waktu yang relatif singkat.

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini

menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama

dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar

merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut

yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi

sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil

untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan

yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang

melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-

komponen dalam campuran.

Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat

ditingkatkan dengan mengoptimasi perameter –perameter HPLC yaitu retensi,

selektivitas, dan evisiensi. Secara praktis parameter-parameter tersebut dapat

dioptimalkan dengan mengubah:

1. komposisi dari fase gerak

2. laju alir

3. sifat kimia dari fase gerak

4. jenis kolom

Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif. Untuk

analisa kualitatif dengan membandingkan kromatografi sampel dengan kromatogram

baku pembanding berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan untuk analisa kuantitatif

dapat ditentukan dengan menggunakan persamaan:

Cx = Ax / Ap x Cp

Keterangan:

Cx = Konsentrasi sampel

Ax = Peak area sampel (Luas puncak)

Ap = Peak area pembanding (Luas puncak)

Cp = Konsentrasi pembanding

Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju

detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu

dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang

maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi

yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan

bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari

pelarut)

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada

ukuran partikel)

komposisi yang tepat dari pelarut

temperatur pada kolom

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.

Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan

ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa

panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar

melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan

mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap Jumlah cahaya

yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui

berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak

mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa

akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada

gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai

pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205

nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-

masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan

menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat

menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang

diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa

murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama. Area yang berada dibawah

puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat

dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang

berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana). Jika larutan X kurang pekat, area

dibawah pucak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama.

Kafein mengikat reseptor adenosina diotak. Adenosina ialah nukleotida yang

mengurangi aktivitas sel saraf saat tertambat pada sel tersebut. Seperti

adenosina, molekul kafein juga tertambat pada reseptor yang sama, tetapi akibatnya

berbeda. Kafein tidak akan memperlambat aktivitas sel saraf atau otak, sebaliknya

menghalangi adenosina untuk berfungsi. Dampaknya aktivitas otak meningkat dan

mengakibatkan hormon epinefrinterlepas. Hormon tersebut akan menaikkan detak

jantung, meninggikan tekanan darah, menambah penyaluran darah ke otot-otot,

mengurangi penyaluran darah ke kulit dan organ dalam dan mengeluarkan glukosa

dari hati. Lebih jauh, kafein juga menaikkan permukaan neurotransmiter dopamin di

otak.

Produk Kandungan kafein

Secangkir Kopi Bubuk 85 mg

Secangkir Teh 35 mg

Sebotol Coco cola 35 mg

Minuman energi (kratingdaeng, M-150,Galin Bugar, dll ) 50 mg

Kopi Instan 2.8 – 5.0%

Kopi Moka (mentah) 1.08%

Kopi Moka (sangrai) 0.82%

Kopi Robusta Jawa 1.48%

Kopi Arabika 1.16%

Kopi Liberika (mentah) 1.59%

Kopi Liberika (sangrai) 2.19%

Sumber: Johnson, E. L. and Steven son, R. (1978).

Tanaman kopi termasuk dalam famili Rubiaceae dan terdiri atas banyak jenis

antara Coffea arabica, Coffea robusta dan Coffea liberica. Negara asal tanaman kopi

adalah Abessinia yang tumbuh di dataran tinggi (Ridwansyah, 2003). Tanaman kopi

Robusta tumbuh baik di dataran rendah sampai ketinggian sekitar 1.000 m diatas

permukaan laut, daerah-daerah dengan suhu sekitar 200C. Kopi Robusta digolongkan

lebih rendah mutu citarasanya dibandingkan dengan citarasa kopi Arabika. Hampir

seluruh produksi kopi Robusta di seluruh dunia dihasilkan secara kering dan untuk

mendapatkan rasa lugas tidak boleh mengandung rasa-rasa asam dari hasil

fermentasi. Kopi Robusta memiliki kelebihan yaitu kekentalan lebih dan warna yang

kuat (Siswoputranto, 1992).

Tanaman kopi arabika menghendaki daerah-daerah yang lebih tinggi sampai

ketinggian sekitar 1700 m diatas permukaan laut, daerah-daerah yang umumnya

dengan suhu sekitar 10-16°C. Tanaman kopi liberika dapat tumbuh di dataran

rendah. Kopi Arabika adalah kopi yang paling baik mutu cita rasanya, tanda-

tandanya adalah biji picak dan daun hijau tua dan berombak-ombak (Ridwansyah,

2003).

Bentuk murni kafein dijumpai sebagai kristal berbentuk tepung putih atau

berbentuk seperti benang sutera yang panjang dan kusut. Bentuk kristal benang itu

berkelompok akan terlihat seperti bulu domba. Kristal kafein mengikat satu molekul

air, dapat larut dalam air mendidih. Didalam pelarut organic maka pengkristalan

yang terjadi tanpa ikatan molekul air. Kafein mencair pada suhu 235-237°C dan akan

menyublin pada suhu 1760 C dialam ruangan terbuka. Kafein mengeluarkan bau

yang wangi, mempunyai rasa yang sangat pahit dan mengembang di dalam air

(Ridwansyah, 2003).

Kadar kafein dalam kopi robusta yang dihasilkan pada percobaan sebesar

947,1087763 ppm (0,947 gram kafein/ 1 kg kopi robusta). Sedangkan, menurut

Clarke and Macrae (1987) kadar kafein dalam kopi robusta 2 % bobot kering atau

sekitar 20 gram kafein per 1 kg kopi robusta. Hasil percobaan sangat berbeda jauh

dengan literatur. Kopi robusta sampel lebih rendah kadar kafeinnya dibandingkan

kadar kafein kopi robusta dari literatur karena kopi robusta yang digunakan sebagai

sampel bukan kopi yang baru. Kopi tersebut telah disimpan sekitar lebih dari 20

tahun. Kafein adalah basa moncidic yang lemah dan dapat memisah dengan

penguapan, serta mudah diuraikan oleh alkalis yang panas (Ridwansyah, 2003).

Sehingga seiring berjalannya waktu, kadar kafein yang terdapat dalam biji

kopi semakin berkurang. Kadar kafein dalam kopi arabika sebesar 1 % bobot kering

atau sama dengan 10 gram kafein dalam 1 kg kopi arabika (Clarke and Macrae,

1987). Kadar kafein dalam kopi arabika yang dihasilkan pada percobaan sebesar

2082,3698745 ppm (2,082 gram kafein/ 1 kg kopi arabika). Seperti halnya kopi

robusta, kopi arabika yang digunakan sebagai sampel telah disimpan sekitar lebih

dari 20 tahun. Kadar kafein kopi arabika sampel lebih kecil dibandingkan kadar

kafein kopi arabika literatur. Kopi yang telah lama disimpan mengakibatkan

kafeinnya terdegradasi menjadi kafeol dan terpisah dari kafein. Sehingga kadar

kafein kopi arabika sampel menjadi lebih kecil dibanding literatur.

Ekstraksi kafein dari kopi, untuk menghasilkan kopi tanpa kafein (kopi decaf)

dan ekstraksi kafein tersebut dapat dilakukan dengan alcohol, benzene, kloroform,

trichloroethylene dan diklorometana semuanya telah digunakan selama bertahun-

tahun tetapi untuk alasan kesehatan dipilih ekstraksi air yaitu: biji kopi direndam

dalam air yang mengandung senyawa lain selain kafein dan berkontribusi terhadap

rasa kopi, Kafein dapat diisolasi dengan adsorpsi arang aktif atau dengan cara

penyulingan, rekristalisasi, atau osmosis terbalik. Air kemudian dituang kembali

dengan kacang-kacangan hingga menguap dan kering, sehingga tercipta kopi tanpa

kafein dengan rasa aslinya. Kafein yang telah diekstraksi biasanya digunakan

kembali dalam pembuatan obat-obatan maupun makanan.

Kopi bubuk yang beredar dipasaran biasanya merupakan campuran antara

kopi arabika dan kopi robusta. Kopi instan atau kopi bubuk mengandung 65

miligram kafein per porsi; kopi diseduh di perkolator memiliki 80 miligram, dan kopi

yang dibuat menggunakan metode tetes memiliki 155 miligram (Matissek, R. 1997).

Namun berdasarkan hasil praktikum, didapatkan banyaknya kafein dalam bahan kopi

bubuk dengan rendemen 17.35% adalah sebanyak 10413.6768767 ppm.

Dibandingkan dengan kadar kafein standar yang digunakan, area sample kopi bubuk

adalah yang palung luas yaitu sebesar 12129.8. Namun hal ini belum memastikan

kopi bubuk memiliki kadar kafein tertinggi karena kadar kafein dalam bahan the

hijau yang digunakan adalah yang terbesar (12778.9105926 ppm). Kadar kafein kopi

bubuk cukup tinggi karena luasan permukaan kopi bubuk lebih besar dibandingkan

dengan kopi mentah sehingga proses ekstraksi kopi bubuk dapat lebih efisien.

Cokelat yang didapatkan dari biji kakao mengandung sejumlah kecil kafeina.

Efek rangsangan yang dihasilkan oleh coklat berasal dari efek kombinasi

teobromina, teofilina, dan kafeina. Coklat mengandung jumlah kafeina yang sangat

sedikit untuk mengakibatkan rangsangan yang setara dengan kopi. 28 gram sajian

coklat susu batangan mengandung kadar kafeina yang setara dengan secangkir kopi

yang didekafeinasi. Menurut Matissek, R (1997), bukti awal penggunaan kafein

kakao berasal dari residu yang ditemukan di sebuah pot tembikar Maya kuno

bertanggal ke 600 SM. Di Dunia Baru, cokelat dikonsumsi dalam minuman pahit dan

pedas disebut xocolat, sering dibumbui dengan vanili, lada chile, dan achiote.

Xocolat diyakini untuk melawan kelelahan, sebuah keyakinan yang mungkin

disebabkan oleh kandungan theobromine dan kafein. Chocolate adalah sebuah

kemewahan yang penting baik di seluruh Mesoamerika pra-Columbus, dan biji

coklat sering digunakan sebagai mata uang. Hal ini menunjukkan penggunaan

cokelat yang meluas dan dapat diterima di berbagai wilayah. Karena itu, pengolahan

cokelat terus berkembang hingga kini.

Hasil praktikum ekstraksi kafein dengan bahan cokelat bubuk menunjukkan

bahwa cokelat bubuk yang digunakan sebagai sampel uji memang memiliki kadar

kafein yang rendah. Hal ini sesuai dengan literature yang ada. Walaupun bahan

adalah bubuk halus dengan luas permukaan besar, namun dari hasil tersebut

didapatkan bahwa kadar kafein dalam bahan cokelat hanya sebanyak 145.6629571

ppm. Kafein dalam cokelat bubuk sangat rendah karena dalam cokelat kandungan

bahan alkaloid yang dominan memang bukanlah cokelat melainkan teobromin.

Selain karena itu, proses pengolahan cokelat bubuk biasanya dilakukan dengan

proses fermentasi yang panjang sehingga kandungan alkaloid dalam cokelat menurun

akibat paparan oksigen (oksidasi). Pengolahan cokelat yang ada juga biasanya

bertujuan untuk mengurangi kafein yang ada sehingga rasa cokelat bubuk tidak

terlalu pahit untuk digunakan dalam produk pangan lainnya.

Kafein (caffeine) yang dikandung dalam teh adalah sekitar 7,6% dari berat

kering. Jumlah kafein dalam takaran satu cangkir teh (sekitar 200 ml) adalah sebesar

50 mg atau sekitar 40% dari setengah cangkir yang sama jika kita menyeduh kopi.

Kandungan kafein pada teh ini lebih rendah disebabkan karena formasinya yang

begitu kompleks yang tergabung dalam polyphenol teh, sehingga efek perangsang

yang ditimbulkannya juga lebih ringan. Efek rangsangan yang ringan ini membantu

untuk meningkatkan daya konsentrasi dan kewaspadaan. Menurut Canada's Food

Guides to Healthy Eating, tingkat kafein dalam teh tersebut dapat dikatakan memiliki

efek positif. Kebanyakan orang bisa minum teh hingga 10 atau 12 cangkir per hari

dan masih pada batas maksimum kafein yang dianjurkan (Dunianya Sari, 2010).

Hasil perhitungan dengan HPLC untuk kadar kafein dalam teh hijau sebesar

12778,9105926 ppm, sedangkan kadar kafein yang terkandung dalam teh hitam

sebesar 9789,7899511 ppm. Area sampel untuk teh hijau lebih luas daripada area

sampel teh hitam yaitu sebesar 9256,32617 untuk teh hijau dan 8527,74902 untuk teh

hitam. Dalam literature yang didapatkan, kadar kafein dalam teh hijau seharusnya

lebih sedikit bila dibandingkan dengan teh hitam yaitu sebesar 45 mg untuk teh hitam

dan 20 mg untuk teh hijau. Perbedaan hasil ini mungkin disebabkan teh hijau yang

diuji disini masih segar (baru saja dibuka) sehingga zat-zat xanthin yang terdapat

dalam teh hijau belum banyak yang menguap sedangkan pada teh hitam zat-zat

xanthinnya sudah banyak yang hilang karena sudah lama dibuka. Selain itu, lamanya

pengekstraksian kafein dari bahan juga akan mempengaruhi jumlah kafein yang

dihasilkan.

IV. PENUTUP

IV.a. Kesimpulan

Kromatografi merupakan salah satu teknik pemisahan yang dapat

memisahkan setiap komponen dalam suatu campuran. Pemisahan ini didasarkan pada

perbedaan migrasi setiap komponen yang disebabkan karena perbedaan sifat

interaksi dari setiap komponen pada fase diam dan fase gerak. Metode HPLC dapat

digunakan untuk analisa kualitatif dan kuantitatif. Untuk analisa kualitatif dengan

membandingkan kromatografi sampel dengan kromatogram baku pembanding

berdasarkan waktu retensinya. Sedangkan untuk analisa kuantitatif dapat ditentukan

dengan menggunakan perhitungan lebih lanjut. Hasil dari ekstraksi kafein dalam

berbagai bahan di praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa kadar

kafein dalam bahan uji kopi bubuk, kopi mentah arabika, kopi mentah robusta,

cokelat bubuk, teh hijau, dan teh hitah adalah 10413.6768767, 2082.3698745,

947.1087763, 145.6629571, 12778.9105926, dan 9789.7899511 secara berturut-

turut. Kadar kafein dalam bahan yang tertinggi adalah dalam bahan uji teh hijau.

Sedangkan kadar kafein bahan yang terendah ada pada bahan cokelat bubuk. Proses

ekstraksi dapat berjalan dengan lebih efisien apabila luas permukaan bahan uji makin

besar. Artinya, makin kecil ukuran bahan maka proses ekstraksi akan makin efisien.

Selain itu proses penyimpanan bahan sebelum ekstraksi juga sangat berpengaruh

terhadap kadar kafein bahan. Makin lama bahan disimpan di udara terbuka, kafein di

dalam bahan akan makin sedikit karena terjadinya oksidasi kafein. Misalnya dalam

yang telah lama disimpan mengakibatkan kafeinnya terdegradasi menjadi kafeol dan

terpisah dari kafein.

IV.b. Saran

Saran yang dapat diajukan dalam pelaksanaan praktikum kali ini diantaranya

adalah penambahan jumlah alat HPLC yang digunakan sehingga pada waktu

praktikum dilakukan hanya sedikit waktu yang terbuang untuk menunggu alat

bekerja. Selain itu, penyediaan alat yang digunakan akan lebih baik jika terdapat

pada satu ruangan sehingga saat praktikum berlangsung akan lebih terlihat tertib

karena praktikan tidak melakukan mobilisasi berlebihan.

DAFTAR PUSTAKA

Clarke, R. J. and Macrae, R. 1987. Coffe Chemestry (Volume 1). Elsevier Applied

Science, London and New York.

Dunianya Sari. 2010. Kopi dan Teh: semakin lama diseduh kadar kafeinnya semakin

tinggi??. http://dunianyasari.blogspot.com/2010/12/kopi-dan-teh-semakin-

lama-diseduh-kadar.html [diakses 20 Maret 2011]

Harry G. Brittain, Richard J. Prankerd (2007). Profiles of Drug Substances,

Excipients and Related Methodology, volume 33: Critical Compilation of Pka

Values for Pharmaceutical Substances. Academic Press. ISBN 012260833X

Johnson, E. L. and Steven son, R. 1978. Basic Liquid Chromatography. Varian,

California.

Matissek, R (1997). Evaluation of Xanthine Derivativesi in Chocolate: Nutritional

and Chemical Aspects. European Food Research and Technology 205 (3):

175–84.

Ridwansyah. 2003. Pengolahan Kopi. www.library-usu.ac.id [diakses 20 Maret

2011]

Siswoputranto, P .S. 1993. Kopi Internasional dan Indonesia. Kanasius. Jakarta.

Snyder, L. R and Kirkland J.J 1979. Introduction to Modern Liquid

Chromatography. Second Edition. John Wiley & Sons.Inc NewYork,

Chihester, Briebane, Toronto, Singapur.