26

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang telah

dilaksanakan di Laboratorium Teknobio-Industri, Fakultas Teknobiologi,

Universitas Atma Jaya Yogyakarta. Penelitian ini telah dilaksanakan mulai

pada bulan Oktober 2013 sampai Januari 2014. Jadwal penelitian dapat

dilihat pada Lampiran 1.

B. Alat dan bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain laminair air

flow ESCO, erlemeyer, petridish, tabung reaksi, rak tabung reaksi, gelas

ukur, gelas beker, panci, pinset, botol kaca, mikroskop RRC L-301,

autoklaf STMN-Y222 OMRON, microwave Panasonic, inkubator

Memmert, oven, rotary evaporator RV06-ML KIKA WERKE,

spektrofotometer UV-1800 Shimadzu, pipet ukur dan pro-pipet,

mikropipet, tips, jarum ose, jarum tusuk, timbangan elektrik AL204,

lampu spiritus, vortex 37600 Mixer Termolyne, kertas payung, plastik

wrap, karet, label, tabung Durham, blender Maspion MT-1207, ayakan,

trigalski, pembolong kertas, aluminium foil, corong, kertas saring, tissue,

korek api, dan kamera digital Canon.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain daun

pohpohan segar sebanyak 1 kg yang berasal dari perkebunan Ibu Ade yang

27

berada di Tamansari, Ciapus-Bogor, isolat Escherichia coli, dan

Streptococcus aureus, ampisilin 500 mg, etil asetat teknis, n-heksan teknis,

methanol, akuades steril, alkohol 70%, medium Nutrient Agar, medium

Nutrient Broth, pati, cat Gram A, cat Gram B, cat Gram C, cat Gram D,

cat nigrosin, minyak emersi, H2O2 3%, medium glukosa cair, medium

sukrosa cair, medium laktosa cair, larutan phenol red, medium casein, eter,

larutan erlich, deterjen, akuades, metanol 30%, kloroform, amoniak,

larutan Dragendorf, larutan Meyer, larutan Wagner, eter, larutan

Lieberman, dan asetat anhidrat.

C. Rancangan Percobaan

Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial

dengan perlakuan variasi pelarut dan lima (5) kali ulangan pada setiap

perlakuan yang diujikan pada bakteri Escherichia coli, dan Staphylococcus

aureus. Kontrol positif menggunakan ampisilin dan kontrol negatif

menggunakan metanol tanpa ekstrak, etil asetat tanpa ekstrak, dan n-

heksana tanpa ekstrak. Rancangan percobaan dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 3. Pengaruh Variasi Pelarut Daun Pohpohan terhadap Zona Hambat

bakteri uji.

Jenis Pelarut Pengulangan Bakteri

E.coli S.aureus

Metanol +

Ekstrak

1 EM1EC EE1SA

2 EM2EC EE2SA

3 EM3EC EE3SA

4 EM4EC EE4SA

5 EM5EC EE5SA

Etil asetat +

Ekstrak

1 EA1EC EA1SA

2 EA2EC EA2SA

28

3 EA3EC EA3SA

4 EA4EC EA4SA

5 EA5EC EA5SA

n-heksana +

Ekstrak

1 EH1EC EH1SA

2 EH2EC EH2SA

3 EH3EC EH3SA

4 EH4EC EH4SA

5 EH5EC EH5SA

Metanol

1 KM1EC KM1SA

2 KM2EC KM2SA

3 KM3EC KM3SA

4 KM4EC KM4SA

5 KM5EC KM5SA

Etil asetat

1 KA1EC KA1SA

2 KA2EC KA2SA

3 KA3EC KA3SA

4 KA4EC KA4SA

5 KA5EC KA5SA

n-heksana

1 KH1EC KH1SA

2 KH2EC KH2SA

3 KH3EC KH3SA

4 KH4EC KH4SA

5 KH5EC KH5SA

Ampisilin

1 KP1EC KP1SA

2 KP2EC KP2SA

3 KP3EC KP3SA

4 KP4EC KP4SA

5 KP5EC KP5SA

Keterangan :

EM = Ekstrak daun pohpohan dengan pelarut metanol

EA = Ekstrak daun pohpohan dengan pelarut etil asetat

EH = Ekstrak daun pohpohan dengan pelarut n-heksana

KM = Kontrol pelarut metanol

KA = Kontrol pelarut etil asetat

KH = Kontrol pelarut n-heksana

KP = Kontrol positif ampisilin

D. Pelaksanaan

1. Penentuan waktu pengeringan daun pohpohan

Penentuan waktu pengeringan daun pohpohan dilakukan

dengan suhu optimal pengeringan daun menggunakan oven adalah

29

40oC (Rivai dkk., 2010). Pada proses pengeringan dilakukan

pengukuran setiap 2 jam sekali dengan mengurangi berat awal

sebelum dikeringkan dengan berat setelah kering. Dalam menentukan

berat kering, proses pengeringan dilakukan sampai berat yang hilang

tidak mengalami perubahan yang signifikan.

2. Pembuatan serbuk daun pohpohan (Rivai dkk., 2010)

Daun pohpohan yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu

untuk menghilangan kotoran yang masih menempel pada bahan

kemudian ditiriskan. Daun pohpohan dikeringkan menggunakan oven

pada suhu 40 oC selama 9 jam. Daun yang telah kering kemudian

dibuat serbuk menggunakan blender.

3. Ekstraksi (Korompis dkk., 2010 dengan modifikasi)

Serbuk daun pohpohan sebanyak 50 gram direndam pelarut n-

heksan, etil asetat, dan metanol masing-masing 500 ml (perbandingan

1:10 (w/v)) direndam selama 24 jam, kemudian disaring sehingga

diperoleh filtrat I dan debris I. Debris I dimaserasi kembali dalam

pelarut dengan perbandingan 1:10 (w/v) selama 24 jam. Setelah itu,

disaring lagi untuk mendapatkan filtrat II dan debris II. Hal yang sama

dilakukan untuk memperolah debris III. Selanjutnya, filtrat I, II, dan

III digabungkan kemudian pelarut diuapkan menggunakan rotary

evaporator. Suhu yang digunakan untuk proses penguapan

menggunakan rotary evaporator sebesar 65 oC untuk pelarut heksan,

30

75 oC untuk pelarut etil asetat dan 60

oC untuk pelarut metanol. Suhu

yang digunakan mendekati titik didih dari masing-masing pelarut.

4. Pembuatan medium pertumbuhan untuk bakteri uji

a. Medium Nutrien Agar (NA) (Johnson dan Case, 2010)

Nutrien Agar (NA) dapat dibuat dengan mencampurkan

1000 ml aquades (distilled water), dengan 5 g peptone, 3 g beef

extract, dan ditambahkan 15 g agar. Pelarutan bahan-bahan

tersebut dilakukan dengan suhu 100 oC kemudian didinginkan pada

suhu 40 oC hingga agar mengeras. Setelah pembuatan medium,

tahap selanjutnya adalah sterilisasi medium. Sterilisasi yang paling

umum dengan menggunakan panas salah satunya adalah dengan

menggunakan panas bertekanan dengan suhu 121 oC selama 15

menit, dengan tekanan 1 atm atau 15 psi (pounds of pressure).

b. Medium Nutrien Broth Cair (Cappucinno dan Sherman, 2011)

Nutrien broth (NB) Cair merupakan medium komplek

dasar yang dapat dibuat dengan menggabungkan 1000 ml aquades

(distilled water), dengan 5 g peptone yang merupakan protein yang

tidak kompleks sebagai sumber nitrogen, dan ditambahkan ekstrak

daging 3 g yang mengandung turunan dari daging, sumber karbon

organik, nitrogen, vitamin, dan garam anorganik. Setelah

pembuatan medium, tahap selanjutnya adalah sterilisasi medium.

31

5. Sterilisasi alat dan medium (Zimbro dkk., 2009 dengan modifikasi)

Alat-alat dicuci bersih dan dikeringkan, kemudian dibungkus

dengan kertas payung. Medium yang masih cair dimasukan ke dalam

erlenmeyer kemudian ditutup dengan kapas dan kertas payung. Alat

dan bahan yang akan disterilisasi dimasukan ke dalam autoclave dan

dipanaskan pada suhu 121oC tekanan 1 atm (atmosfer) selama 15

menit untuk medium dan 20 menit untuk alat.

6. Indentifikasi bakteri uji

a. Pengamatan morfologi koloni (Cappucinno dan Sherman, 2011)

Biakan mikrobia diambil sebanyak satu ose kemudian

diinokulasikan pada medium NA dengan metode streak plate, dan

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Setelah 24 jam

dilakukan pengamatan terhadap morfologi koloni yang meliputi

bentuk, tepian, dan kenaikan (elevation) koloni, kemudian difoto.

b. Pengamatan morfologi sel (Cappucinno dan Sherman, 2011)

Gelas benda dibersihkan secara aseptis menggunakan

alkohol. Larutan nigrosin diteteskan pada ujung gelas benda,

kemudian diambil satu ose biakan mikrobia dan dicampurkan pada

larutan nigrosin. Gelas benda yang lain digunakan untuk meratakan

larutan nigrosin yang sudah dicampur dengan biakan mikrobia

dengan cara menarik larutan menggunakan ujung gelas benda ke

bagian lain dari gelas benda hingga terbentuk lapisan. Kemudian

32

ditunggu hingga sedikit mengering dan diamati di bawah

mikroskop perbesaran 100-400 kali, kemudian difoto.

c. Pengecatan Gram (Cappucinno dan Sherman, 2011)

Gelas benda dibersihkan secara aseptis menggunakan

alkohol. Aquades diteteskan sebanyak satu tetes di atas gelas

benda. Satu ose biakan mikrobia diambil dan dicampur tetesan

aquades yang ada di gelas benda, kemudian difiksasi menggunakan

pengeringan udara atau pemanasan dengan api. Biakan yang telah

difiksasi ditetesi secara hati-hati dengan larutan crystal violet

(Gram A) dan dibiarkan selama satu menit. Setelah selesai

dibersihkan dengan akuades, kemudian ditetesi larutan Iodin

mordant (Gram B) dan dibiarkan selama satu menit, kemudian

dibersihkan dengaan akuades. Alkohol 95% (Gram C) dialirkan

tetes demi tetes untuk menghilangkan pewarnaan (decolorize)

sampai menunjukan noda biru, kemudian dibersihkan dengan

akuades. Dilakukan pewarnaan kembali dengan larutan safranin

(Gram D) selama 45 detik, kemudian dibersihkan dengan akuades

dan dikeringkan dengan kertas saring. Hasil pewarnaan diamati di

bawah mikroskop dengan perbesaran 100-400 kali, kemudian

difoto.

d. Uji motilitas (Cappucinno dan Sherman, 2011)

Biakan mikrobia diambil menggunakan jarum steril dan

diinokulasikan dengan cara ditusukkan pada medium agar padat

33

(Nutrient Agar) pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi selama

24 jam pada suhu 37 oC. Setelah 24 jam dilakukan pengamatan

dengan melihat pola pertumbuhan dan penyebaran mikrobia pada

agar padat, kemudian difoto.

e. Uji katalase (Cappucinno dan Sherman, 2011)

Gelas benda dibersihkan secara aseptis menggunakan

alkohol. Satu ose biakan mikrobia diambil dari koloni biakan dan

dipindahkan pada gelas benda yang sudah dibersihkan. Ditetesi

hidrogen peroksida (H2O2) kemudian diamati adanya gelembung

udara atau tidak. Hasil positif menunjukkan adanya gelembung

udara sedangkan hasil negatif tidak menunjukkan adanya

gelembung udara, kemudian difoto.

f. Uji sifat biokimia

Menurut Waluyo (2010) sifat biokimia bakteri dapat diuji

dengan uji fermentasi karbohidrat, uji reduksi nitrat, dan uji

pembentukan indol. Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan

cara, satu ose biakan mikrobia diambil kemudian diinokulasikan

pada medium cair laktosa, dekstrosa (glukosa), sukrosa, kemudian

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC. Setelah 24 jam

dilakukan pengamatan terhadap perubahan warna medium dan

pembentukan gas, kemudian difoto.

Uji reduksi nitrat dilakukan dengan cara, satu ose biakan

mikrobia diambil kemudian diinokulasikan pada medium nitrat cair

34

dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37 oC. Setelah 2 hari

dilakukan pengujian adanya nitrit dengan menambahkan 1 ml asam

sulfanilat dan 1 ml α-naftalamin dan digojog hingga terjadi

perubahan warna menjadi merah yang menunjukkan hasil positif,

kemudian difoto.

Uji pembentukan indol dilakukan dengan cara, satu ose

biakan mikrobia diambil kemudian diinokulasikan pada medium

triptofan cair atau hidrolisat kasein, kemudian diinkubasi selama 4

hari pada suhu 37 oC. Setelah 4 hari pengujian indol dilakukan

dengan metode Coles dan Onslow (untuk indol dalam bentuk uap),

kapas penutup tabung bagian bawah ditetesi dengan reagen

Ehrlich, kemudian tabung direndam pada suhu 80 oC sehingga

terjadi perubahan warna kapas menjadi merah ungu yang

menunjukkan adanya indol, kemudian difoto.

7. Identifikasi kandungan kimia tumbuhan (Harborne, 1987)

a. Uji Flavonoid

Ekstrak daun pohpohan sebanyak 0,1 g ditambahkan

dengan 5 ml metanol 30 % kemudian dipanaskan selama 5 menit.

Filtrat ditambahkan dengan H2SO4. Hasil positif ditunjukkan

dengan adanya perubahan warna menjadi merah setelah

ditambahkan H2SO4, kemudian difoto.

b. Uji Alkaloid

Ekstrak daun pohpohan sebanyak 0,1 g ditambah dengan 5

ml kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan

35

dan diasamkan dengan 2 tetes H2SO4 2M. Fraksi asam dibagi

menjadi 3 tabung yang masing-masing ditambah pereaksi

Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Alkaloid pada sampel ditandai

dengan adanya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah

pada pereaksi Dragendof, dan endapan coklat pada pereaksi

Wagner, kemudian difoto.

c. Uji Triterpenoid dan Steroid

Ekstrak daun pohpohan sebanyak 0,1 g ditambah 5 ml

etanol 30 % kemudian dipanaskan selama 5 menit, kemudian

didinginkan dan disaring. Filtrat diuapkan, kemudian ditambah

larutan eter. Lapisan eter ditambah dengan pereaksi Lieberman

Burchard (3 tetes asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat).

Perubahan warna menjadi merah atau ungu menandakan adanya

triterpenoid sedangkan warna hijau menandakan steroid, kemudian

difoto.

8. Perbanyakan bakteri uji (Cappucino dan Sherman, 2011 dengan

modifikasi)

Kultur mikrobia yang dihasilkan dari tahap uji kemurnian

masing-masing diinokulasikan ke dalam medium NA miring

menggunakan jarum ose secara aseptis, kemudian diinkubasi pada

suhu 37 oC selama 24 jam. Selanjutnya, isolat bakteri hasil

perbanyakan diambil sebanyak 1-2 ose kemudian dimasukkan ke

dalam 20 ml medium cair pada Erlenmeyer secara aseptis kemudian

diinkubasi pada shaker incubator selama 24 jam suhu 37 oC.

36

9. Pembuatan kurva standar bakteri (Handayani dkk. 2006 dengan

modifikasi).

Tabung reaksi sebanyak enam masing-masing diisi starter

bakteri uji dan medium nutrient broth dengan perbandingan 0:6; 1:5;

2:4; 3:3; 4:2; 5:1. Kultur bakteri diukur absorbansinya dengan panjang

gelombang optimum masing-masing bakteri E. coli λ = 580-630 nm,

S. aureus λ = 580-630 nm), selanjutnya dilakukan perhitungan total

plate count (TPC) pada masing-masing tabung reaksi dan dilakukan

perhitungan untuk mendapatkan rumor regresi linearnya.

10. Pengukuran kurva pertumbuhan bakteri (Johnson dan Case, 2010

dengan modifikasi)

Kultur mikrobia diambil sebanyak 10 ml dan diinokulasikan ke

dalam medium NA cair 100 ml, kemudian diinkubasi selama 24 jam.

Pada saat inkubasi, setiap 2 jam dilakukan pengukuran absorbansi

dengan spektrofotometer. Pengukuran absorbansi dilakukan pula pada

medium NA tanpa bakteri yang disebut kontrol, kemudian medium

NA setelah diinokulasi bakteri sebagai 0 jam, dengan panjang

gelombang optimum masing-masing bakteri (E. coli λ = 580-630 nm,

S. aureus λ = 580-630 nm) dan dilakukan perhitungan total plate

count (TPC) pada kultur bakteri dari 0 jam sampai 24 jam, setiap 2

jam (Kusmiati, dan Agustini, 2006; dan Dewi, 2010).

11. Uji antibakteri berdasarkan zona hambat dengan paper disk (Waluyo,

2010)

Kultur mikrobia diambil 0,1 ml diinokulasikan pada medium

NA dengan metode spread plate. Paper disk ditetesi ekstrak daun

37

pohpohan kemudian diletakkan di atas medium sebanyak 4-6 paper

disk secara simetri dengan jarak paling kecil 20 mm dari tepi cawan

petri. Kemudian diinkubasi selama 16-18 jam dengan suhu 37 oC.

Setelah diinkubasi, zona hambat yang terjadi diamati, diukur dan

difoto. Kemudian sebagai pembanding digunakan antibiotik ampisilin

yang dilihat zona hambatnya pada mikrobia uji. Luas zona hambat

dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

Keterangan:

d1 : diameter kertas saring (cm)

d2 : rata-rata diameter zona hambat (cm)

12. Pengukuran Konsentrasi Hambat Minimum (Cappucino dan Sherman,

2011 dengan modifikasi)

Pengukuran Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) dapat

dilakukan dengan menggunakan metode seri pengenceran. Tabung

reaksi disiapkan 8 buah untuk setiap pengenceran ekstrak. Masing-

masing tabung reaksi diberi label dari 1 sampai 8 pada masing-masing

seri pengenceran ekstrak, kemudian ditambahkan pelarut yang sesuai

dengan ekstrak masing-masing sebanyak 9 ml dari tabung reaksi no 2

sampai 8.

Ekstrak daun pohpohan yang sudah dipekatkan dengan rotary

evaporator dianggap memiliki konsentrasi 100%. Ekstrak daun

pohpohan 100% dimasukkan ke dalam tabung no 1 sebanyak 10 ml,

kemudian diambil dan ditambahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung 2

38

dan dihomogenkan dengan vortex. Dilakukan pengenceran konsentrasi

hingga mendapat konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,625, 1,8125,

dan 0,90625% dengan cara: 1 ml larutan pada tabung 2 diambil dan

dimasukkan ke dalam tabung 3 kemudian divortex. Larutan dari

tabung 3 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung 4 kemudian

divortex, langkah ini diulang hingga sampai pada tabung 8. Pada

tabung 8, 1 ml larutan dibuang agar volume total setiap tabung adalah

9 ml.

Tabel 4. Serial Pengenceran ekstrak daun pohpohan untuk mengetahui

KHM.

Penambahan

(ml): Nomor Tabung Reaksi

1 2 3 4 5 6 7 8

Pelarut 0 9 9 9 9 9 9 9

Ekstrak

daun

pohpohan

10 1 1 1 1 1 1 1

Presentase

ekstrak (%) 100 50 25 12,25 6,25 3,625 1,8125 0,90625

Volume

total 9 9 9 9 9 9 9 9

Kultur mikrobia diambil 0,1 ml diinokulasikan pada medium

NA dengan metode spread plate. Paper disk ditetesi ekstrak daun

pohpohan kemudian diletakkan di atas medium sebanyak 4-6 paper

disk secara simetri dengan jarak paling kecil 20 mm dari tepi cawan

petri. Kemudian diinkubasi selama 16-18 jam dengan suhu 37 oC.

Setelah diinkubasi, zona hambat yang terjadi diamati, diukur dan

difoto. Kemudian sebagai pembanding digunakan antibiotik ampisilin

yang dilihat zona hambatnya pada mikrobia uji. Luas zona hambat

dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

39

Keterangan:

d1 : diameter kertas saring (cm)

d2 : rata-rata diameter zona hambat (cm)

E. Analisis data

Data yang diperoleh dianalisis menggunakan ANAVA dengan

tingkat kepercayaan sebesar 95%. Apabila hasil ANAVA menunjukkan

hasil yang beda nyata, analisis dilanjutkan dengan Duncan’s Multiple

Range Test (DMRT) untuk mengetahui beda nyata antara perlakuan

(Gazpers, 1994). Analisis ANAVA dan DMRT dilakukan dengan

menggunakan program SPSS 15.0.