BIOTEKNOLOGI PETERNAKAN

Penelitian Bioteknologi/Biologi Molekuler dan Pengembangan Agribisnis

Pengaturan Keamanan ProdukBPET/MATRIK/SAN

Pengertian, Ruang Lingkup dan Perkembangan Bioteknologi

Dasar Bioteknologi :

Sifat dan Fungsi Material Genetik (Central Dogma)

Teknologi Rekombinan (Prinsip dan Dasar RekGen,

Teknologi Hibridoma, Fusiprotoplasma, Poliploidisasi)

Teknologi Produksi protein Heterologous dan Biokonversi

Teknologi Produksi dan Reproduksi Ternak, Hormon, Obat

Bioteknologi

Tanaman Pakan

Bioteknologi

Pakan

Bioteknologi

Ternak

PotongDNA & Vektor Oleh Gunting DNA(Enz.Restriksi)

SambungDNA olehEnz.Ligase

Transformasi Rek.DNAFusi sel/Prot

ScreeningKandidat

Klon

PengurutanDNA/PCR

BioinformatikaGeneBank

C. Prinsip dan Teknik Dasar

Rekayasa Genetika (DNA Kloning)

BPAKAN/MIT/SAN

Enzim Restriksi = ER (Gunting DNA)

ER = Endonuklease = enzim yang dapat memotong rantai

ganda DNA pada tempat-tempat tertentu (dengan cara

mengenal runutan/sekuen DNA tertentu)

Sifat-Sifat =

1. Terdapat 2 golongan ER (I, II, dan III)

2. Namanya diambil dari mana enzim tsb. diisolasi

3. Bersifat palindromik = jika ditarik garis sumbu

di tengah-tengah sekuens pengenal tsb. akan

terlihat runutan basa yang simitris.

AluI Arthrobacter luteus AG CT

TC GA

BamHI Bacillus amyloliquefaciens H G GATC C

C CTAG G

BPAKAN/MIT/SAN

Vektor Kloning (VK)

A. Syarat-Syarat (minimal):

1. Mempunyai ORI (Origin of Replication)

2. Mengandung MCS (Multiple Cloning Sites)+

Kelengkapannya (Promotor, Terminator,

Gen Struktural, Gen Regulator, dll.)

3. Mempunyai penanda seleksi/Marker Selection

B. Macam-Macam Vektor :

1. Plasmid prokariot 4. Kosmid

2. Plasmid eukariot 5. Virus eukariot

3. Bakterio fage lamda 6. Dll.

VK adalah Suatu susunan DNA (alami atau buatan) yang

dapat berperan sebagai wahana untuk membawa/

menyisipkan DNA sasaran/target

BPAKAN/MIT/SAN

Enzim Ligase = EL = Menyambung DNA

EL adalah enzim yang berperan dalam menyambungkan

fragmen-fragmen DNA, melalui ikatan fosfodiester antara

ujung 3’OH dengan gugus 5’P pada ujung rantai DNA

TRANSFORMASI DNA

PROKARIOT : 1. Transformasi : a. Cara Kimia

b. Cara Listrik

2. Konjugasi

3. Transduksi (Virus)

EUKARIOT : 1. Mikroinjeksi

2. Agrobacterium

3. Biobalistik/Shotgun

4. Fusi Protoplas : a. Cara Kimia

b. ElektrofusiBPAKAN/MIT/SAN

Screening/Seleksi DNA TargetPerangkat Seleksi :

1. Penanda / marker

a. Homologous atau Heterologous

b. Gen struktural atau Gen regulator

c. Gen penyandi antibiotika

2. Teknik Seleksi

Pengurutan DNATujuan = mendapatkan susunan nukleotidanya (ATGC)

Prosesnya melibatkan :

1. Sintesis DNA (Replikasi DNA)

Denaturasi : utas double DNA menjadi utas tunggal

Annealing : penempelan primer/pancing DNA

Extension : pemanjangan DNA

2. Identifikasi nukleotida

1 ATGGCAGCTACTCAGGAAGATGTGTACTCTGATCCCGGTTCTCCTATGATGCGGAGAACT 60

M A A T Q E D V Y S D P G S P M M R R T

61 CAAGCTGGGACATACATTATTGCCAGGATAAAGAAGGAAAGTGATGAAGGAAGATATATT 120 Q A G T Y I I A R I K K E S D E G R Y I

121 ATACTGAATGGAAATGGTGCTACACCAGAAGGAAACATTCCATTCCTTGATCTGTTTGAC 180

I L N G N G A T P E G N I P F L D L F D

181 ATAAATACAGGTAAAAAAATGGAACGAATCTGGGAGAGCGATAAGGAGAAGTATTATGAG 240

I N T G K K M E R I W E S D K E K Y Y E

241 ACTGTTGTTGCTCTAATGTCTGATCAAGAAGAAGGGGATTTGTATTTAGATAAACTGAAG 300

T V V A L M S D Q E E G D L Y L D K L K

301 ATACTGACTTCTAAAGAGTCAAAAACTGAAAACACCCAATACTACTTTGTTAGCTGGCCA 360

I L T S K E S K T E N T Q Y Y F V S W P

361 GATAAAAACATAGTTCAGGTTACAAATTTCCCTCATCCATACCCTCAGCTTGCATCATTG 420

D K N I V Q V T N F P H P Y P Q L A S L

421 CAGAAAGAGATGATCAGATATGAAAGAAAAGACGGGGTTCAACTTACTGCTACATTATAC 480

Q K E M I R Y E R K D G V Q L T A T L Y

481 CTACCACCAGGTTACAATCCATCAACAGATGGCCCTTTGCCATGCCTGGTTTGGTCTTAC 540

L P P G Y N P S T D G P L P C L V W S Y

541 CCAGGAGAATTTAAGAACAAAGATGCTGCTGGACAAGTTCGTGGTCTCCAAATGAATTTG 600

P G E F K N K D A A G Q V R G L Q M N L

601 CTGGAATAGGCTCCACATCTTCCTGAGTAGCTGCCATCGCCCGAAACTTCATTCGTT L E *

Enzymes that do cut: AluI ApoI BsaI DdeI DpnI MboII MseI TaqII TatI XcmI

Enzymes that do not cut: AatII AloI ApaI AvaI BamHI BglI ClaI DraI EcoRI HindIII KpnI

NdeI NotI PstI PvuI SalI SmaI SpeI SphI SspI SwaI TaqI

XbaI XhoI XmnI

AMINOACYL PEPTIDASE (GeneBank Accession Number AF091304)

Nucleotide &

Amino Acid

Sequence of

gmAP

Encoding:

Aminoacyl

Peptidase

DNA Sequencing

Isolation of Clones

DNA Sequencing

CviRI

TspRI|

Fnu4HI|| Hin4I

BmrI ||| BpmI |

BsrI| ||| HphI |

NlaIV || ||| SimI | |

CviJI| || ||| ThaI | | |

HaeIII| || ||| AciI | | | |

MnlI Sau96I|| || ||| BsaI | | | | |

Pfl1108I | BbvI ||| || ||| BsmAI | | | | |

Sth132I | |BscGI CviJI BccI| ||| ||TseI||| BsrDI | | | | |

| | | | | || ||| || |||| | | | | | |

ACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCA

121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180TGATGCTATGCCCTCCCGAATGGTAGACCGGGGTCACGACGTTACTATGGCGCTCTGGGT

a T T I R E G L P S G P S A A M I P R D P -

b L R Y G R A Y H L A P V L Q * Y R E T H -

c Y D T G G L T I W P Q C C N D T A R P T -

Searching RE Sites

Score E

Sequences producing significant alignments: (bits) Value

gb|AAD40979.1|AF089851_1 (AF089851) peroxisomal copper-cont... 304 e-117

gb|AAD23730.1|AC005956_20 (AC005956) putative copper amine ... 296 e-112

sp|Q07123|AMO2_ARTS1 COPPER METHYLAMINE OXIDASE PRECURSOR (... 163 5e-56

sp|Q07121|AMO1_ARTS1 COPPER AMINE OXIDASE PRECURSOR (MAOXI)... 163 5e-56

sp|Q59118|AMOH_ARTGO HISTAMINE OXIDASE (COPPER AMINE OXIDAS... 146 3e-48

gb|AAB03385.2| (U31869) copper amine oxidase [Aspergillus n... 155 2e-47

sp|P46881|PAOX_ARTGO PHENYLETHYLAMINE OXIDASE PRECURSOR (AM... 138 1e-43

pdb|1AV4| Crystal Structures Of The Copper-Containing Am... 138 9e-43

GeneBank

Database

Bioinformatics

From GeneBank :

a. Nama gen

b. % homologi

CONTOH

APLIKASI

PENGKLONAN GEN-GEN YANG DIINDUKSI Al:1. Konstruksi Pustaka cDNA:

- Penanaman

- Isolasi RNAtotal

- Pemurnian mRNA

- Sintesis cDNA

- Transformasi ke vektor

- Penapisan transforman

2. Penapisan diferensial (koloni & pita)

3. Konfirmasi cDNA sasaran

Metode Pengklonan Gen-Gen Ketahanan Aluminium

PENGURUTAN cDNA REGULASI/EKSPRESI

INFORMASI GENETIK

PEMILIHAN GENOTIPE KEDELAI DAN PENENTUAN KADAR Al UNTUK INDUKSI GEN

Stres Sriyon. Gjep. Sicin. YBL Sindo. Slmt Lumut Arks.

0.0mM 100 100 100 100 100 100 100 100

0.4mM 72 75 88 77 76 92 55 89

0.8mM 65 62 76 69 71 74 43 75

1.2mM 54 53 68 65 67 67 39 68

1.6mM 47 46 65 55 58 59 38 66

2.0mM 43 41 54 54 56 57 36 64

2.4mM 37 38 51 49 52 49 33 61

2.8mM 35 33 40 47 40 46 31 58

3.2mM 33 32 34 44 45 45 30 57

Rataan panjang dan bobot kering akar mutlak (%) relatif

terhadap kontrol pada beberapa galur kedelai

I. Pemilihan Genotipe Kedelai dan

Penentuan Kadar Al untuk Induksi Gen

Penanaman

Transformasi

II. Pengklonan Gen² yg Diinduksi Al

RNA

total

cDNA+VEKTOR

AAAA

TTTTT

5’

mRNA

Not I

AAAA

TTTTTNot I5’

3’

AAAA

TTTTTSal INot ISal I

AAAA

TTTTTNot ISal I

1. Konstruksi Pustaka cDNA

A

B

C

D

Ringkasan Konstruksi Pustaka cDNA

2. Ilustrasi Biologis Penapisan Diferensial

Kontrol (-Al)Stres (+Al)

Populasi mRNA

Sintesis cDNA

* * * *Pustaka cDNALabel cDNA Label cDNA

Ligasi & transformasi

* ** * ** *

* ** * ** *

Replika &

membran blot

* ** * ** *

* ** * ** *

X-ray Film

Kandidat

klon gen

diinduksi Al

Penapisan pertama dari 140.000 koloni 68 kandidat

B. Penapisan Diferensial-I

Pelacak cDNA+Al Pelacak cDNA-Al

B. Penapisan Diferensial-II

Pelacak cDNA+Al Pelacak cDNA-Al

Penapisan kedua: 68 kandidat 25 klon positif

Isolasi plasmid dari

kandidat klon/koloni

terpilih penapisan II

Dipotong dengan enzim

restriksi NotI-SalI

Prosedur Southern Blot

Pelacak cDNA berasal

dari cDNA tanpa dan

stres 0.8 mM Al selama

24 jam.

C. Konfirmasi cDNA Target

1 ATGGCAGCTACTCAGGAAGATGTGTACTCTGATCCCGGTTCTCCTATGATGCGGAGAACT 60

M A A T Q E D V Y S D P G S P M M R R T

61 CAAGCTGGGACATACATTATTGCCAGGATAAAGAAGGAAAGTGATGAAGGAAGATATATT 120 Q A G T Y I I A R I K K E S D E G R Y I

121 ATACTGAATGGAAATGGTGCTACACCAGAAGGAAACATTCCATTCCTTGATCTGTTTGAC 180

I L N G N G A T P E G N I P F L D L F D

181 ATAAATACAGGTAAAAAAATGGAACGAATCTGGGAGAGCGATAAGGAGAAGTATTATGAG 240

I N T G K K M E R I W E S D K E K Y Y E

241 ACTGTTGTTGCTCTAATGTCTGATCAAGAAGAAGGGGATTTGTATTTAGATAAACTGAAG 300

T V V A L M S D Q E E G D L Y L D K L K

301 ATACTGACTTCTAAAGAGTCAAAAACTGAAAACACCCAATACTACTTTGTTAGCTGGCCA 360

I L T S K E S K T E N T Q Y Y F V S W P

361 GATAAAAACATAGTTCAGGTTACAAATTTCCCTCATCCATACCCTCAGCTTGCATCATTG 420

D K N I V Q V T N F P H P Y P Q L A S L

421 CAGAAAGAGATGATCAGATATGAAAGAAAAGACGGGGTTCAACTTACTGCTACATTATAC 480

Q K E M I R Y E R K D G V Q L T A T L Y

481 CTACCACCAGGTTACAATCCATCAACAGATGGCCCTTTGCCATGCCTGGTTTGGTCTTAC 540

L P P G Y N P S T D G P L P C L V W S Y

541 CCAGGAGAATTTAAGAACAAAGATGCTGCTGGACAAGTTCGTGGTCTCCAAATGAATTTG 600

P G E F K N K D A A G Q V R G L Q M N L

601 CTGGAATAGGCTCCACATCTTCCTGAGTAGCTGCCATCGCCCGAAACTTCATTCGTT L E *

Enzymes that do cut: AluI ApoI BsaI DdeI DpnI MboII MseI TaqII TatI XcmI

Enzymes that do not cut: AatII AloI ApaI AvaI BamHI BglI ClaI DraI EcoRI HindIII KpnI

NdeI NotI PstI PvuI SalI SmaI SpeI SphI SspI SwaI TaqI

XbaI XhoI XmnI

AMINOACYL PEPTIDASE (GeneBank Accession Number AF091304)

DNA Sequencing

PENGURUTAN DNA

Isolation of Clones

DNA Sequencing

CviRI

TspRI|

Fnu4HI|| Hin4I

BmrI ||| BpmI |

BsrI| ||| HphI |

NlaIV || ||| SimI | |

CviJI| || ||| ThaI | | |

HaeIII| || ||| AciI | | | |

MnlI Sau96I|| || ||| BsaI | | | | |

Pfl1108I | BbvI ||| || ||| BsmAI | | | | |

Sth132I | |BscGI CviJI BccI| ||| ||TseI||| BsrDI | | | | |

| | | | | || ||| || |||| | | | | | |

ACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCA

121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180TGATGCTATGCCCTCCCGAATGGTAGACCGGGGTCACGACGTTACTATGGCGCTCTGGGT

a T T I R E G L P S G P S A A M I P R D P -

b L R Y G R A Y H L A P V L Q * Y R E T H -

c Y D T G G L T I W P Q C C N D T A R P T -

Searching RE Sites

Score E

Sequences producing significant alignments: (bits) Value

gb|AAD40979.1|AF089851_1 (AF089851) peroxisomal copper-cont... 304 e-117

gb|AAD23730.1|AC005956_20 (AC005956) putative copper amine ... 296 e-112

sp|Q07123|AMO2_ARTS1 COPPER METHYLAMINE OXIDASE PRECURSOR (... 163 5e-56

sp|Q07121|AMO1_ARTS1 COPPER AMINE OXIDASE PRECURSOR (MAOXI)... 163 5e-56

sp|Q59118|AMOH_ARTGO HISTAMINE OXIDASE (COPPER AMINE OXIDAS... 146 3e-48

gb|AAB03385.2| (U31869) copper amine oxidase [Aspergillus n... 155 2e-47

sp|P46881|PAOX_ARTGO PHENYLETHYLAMINE OXIDASE PRECURSOR (AM... 138 1e-43

pdb|1AV4| Crystal Structures Of The Copper-Containing Am... 138 9e-43

GeneBank

Database

Bioinformatics

From GeneBank :

a. Nama gen

b. % homologi

C.2. Expression on Plant :

Glycine max, C. pubescens, P.purpureum

Glycine max Glycine max Centrocema Pennisetum

cv. Lumut cv. Slamet pubescens purpureum

(%) (%) (%) (%) Clone

gmali12

gmali15

gmali22

gmAO

gmAP

25 30 34 35 25 29 30 33 25 27 31 26 25 28 30 26

22 22 26 30 25 25 31 35 20 28 30 34 25 30 32 33

30 36 50 34 32 30 35 48 18 20 22 25 30 30 35 35

25 30 35 40 20 20 22 35 0 0 0 0 20 20 24 25

20 22 24 27 22 20 25 27 42 42 47 48 15 15 15 20

10. Kuda, Babi, anjing (snuppy) dan generasi selanjutnya

10. Kuda, Babi, anjing (snuppy) dan generasi selanjutnya

BIOTEKNOLOGI PETERNAKAN

Penelitian Bioteknologi/Biologi Molekuler dan Pengembangan Agribisnis

Pengaturan Keamanan ProdukBPET/MATRIK/SAN

Pengertian, Ruang Lingkup dan Perkembangan Bioteknologi

Dasar Bioteknologi :

Sifat dan Fungsi Material Genetik (Central Dogma)

Teknologi Rekombinan (Prinsip dan Dasar RekGen,

Teknologi Hibridoma, Fusiprotoplasma, Poliploidisasi)

Teknologi Produksi protein Heterologous dan Biokonversi

Teknologi Produksi dan Reproduksi Ternak, Hormon, Obat

Bioteknologi

Tanaman Pakan

Bioteknologi

Pakan

Bioteknologi

Ternak

KUNCI KEHIDUPAN

TEKNOLOGI PRODUKSIPROTEIN REKOMBINAN

(HETEROLOGOUS)

TEKNOLOGI REKOMBINAN

KE

-O4