Laporan Praktikum

Western Blot

Disusun oleh:

Makhyan Jibril Al Farabi

Program Studi Magister Ilmu Biomedik

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2012

1. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Teknik western blot, atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan

untuk menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot menggunakan gel

elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida. Protein tersebut

akan ditransfer ke nitroselulosa atau PVDF dan diberi antibody spesifik untuk identifikasi

protein target (Burnette, 1981).

Saat ini, telah banyak reagen antibody baik poliklonal maupun monoklonal untuk

10.000 jenis protein. Sehingga western blot sangat bermanfaat untuk digunakan bersama

antibody tersebut. Metode ini awalnya ditemukan oleh George stark pada Universitas

Stanford. Nama western blot diberikan pada teknik tersebut oleh Neal Burnette and Sushant

Bhat, merupakan nama yang dimiripkan dengan teknik deteksi DNA southern blot yang

ditemukan Edwin southern dan Northern blot yang digunakan deteksi RNA (Towbin et al.,

1979)

1.2. Tujuan

Untuk mengetahui proses pelaksanaan western blot dan cara interpretasinya

2. METODE

2.1 Persiapan Sampel

Sampel bisa diambil dari kultur sel maupun bagian dari jaringan. Untuk jaringan yang

solid bperlu dilakukan penghancuran menggunakna blender atau homogenizer. Detergen,

garam dan buffer juga bisa digunakan untuk melisiskan membrane sel. Protease dan

phospatase inhibitor diberikan untuk mencegah terjadinya pemecahan jaringan dengan

enzimnya sendiri. Perispan jaringan biasanya dilakukan apda suhu dingin untuk mencegah

degradasi protein. Untuk memisahkan komponen sel dengan organel, dilakukan sentrifugasi.

Gambar 1. Langkah dalam persiapan sampel western blot

Protein dari sampel diseparasi mengunakan elektoforesis SDS page berdasarkan

isoelektrik poin, berat molekul, kelistrikan atau kombinasinya. SDS PAGE akan

mempertahankan polipeptida dalam bentuk denaturasi setelah dibersihkan dari struktur

sekunder dan tersier sehingga protein dapat dipisah berdasarkan berat molekul.

2.2 Transfer

Untuk membuat protein dari SDS page bisa dideteksi oleh antibody, protein tersebut

perlu ditransfer dari gel ke membrane nitroselulosa atau polyindylidene difluoride (PVDF).

Membrane tersbut diletakkan di atas gel dan ditambahkan buffer. Protein akan masuk pada

membrane dan siap dideteksi dengan western blot (Renart et al., 1979)

Gambar 2. Langkah dalam SDS PAGE

Untuk mengecek keseragaman dari transfer protein dari gel ke membrane dapat dicek dengan

pewarnaan commasie brilliant blue dan ponceau S .

2.3 Blocking

Blocking dilakukan untuk mencegah antibody sekunder bereaksi dengan protein non

spesifik yang masuk pada sampel. Blocking biasanya menggunakan BSA atau susu skim

tanpa lemak pada TBS. pemberian Tween 20 atau Tritonn X-100 dapat memperjelas hasil

final dari western blot mengurangi false positif

2.4 Deteksi Dua Langkah

Pada saat deteksi membran dengan antibody, untuk deteksi dua langkah dilakukan

persiapan antibody primer yang dibentuk dari produksi mandiri. Antibody primer dengan

antigen yang di inginkan diberikan sesuai dengan sampelnya. Antibody primer yang

digunakan pada sampel ini ialah antibody poliklonal terhadap protein Shigella 49kDa. Solusi

antibody dan membran dapat disimpan setelah itu diberikan antibody sekunder yang

berikatan dengan antibody primer. Sehingga dengan bantuan horseradish peroxidase akan

terjadi luminasi sesuai dengan jumlah protein.

Gambar 2. Langkah dalam Western blot

3. HASIL

Gambar 1. Pita Protein yang Terbentuk                                  

Regresi Linier

NO

BM MARKER JARAK TRACKING LOG BM RF

1 260 52.41497

30.07575

82 135 8 2.13033 0.12121

4 2

3 95 101.97772

40.15151

5

4 72 12.51.85733

20.18939

4

5 52 181.71600

30.27272

7

6 42 22.51.62324

90.34090

9

7 34 271.53147

90.40909

1

8 26 331.41497

3 0.5

9 17 43.51.23044

90.65909

1

10 10 60 10.90909

1

RF = jarak tracking / jarak total, dimana jarak total yakni 66 mm

0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.60

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

f(x) = − 0.593389701633797 x + 1.3655007082979R² = 0.905561542917878

Series2Linear (Series2)

Gambar 2.0 Grafik regresi Linier Kurva Standar Marker

Sampel 1. OMP Shigella

JARAK TRACKING RF LOG BM BM

80.12121

2 2.09745125.155

5

12.50.18939

41.98247

296.0444

5

13.50.20454

51.95692

290.5569

2

14.250.21590

91.93775

986.6480

3

34.50.52272

71.42035

926.3244

2

38.50.58333

31.31815

620.8044

5

Sampel 2. Pili Shigella

JARAK TRACKING RF LOG BM BM

34.50.52272

71.42035

926.3244

2

38.50.58333

31.31815

620.8044

5

5. KESIMPULAN

Teknik western blot, atau juga disebut sebagai imunoblot telah sering digunakan

untuk menganalisis protein spesifik pada sampel. Western blot menggunakan gel

elektroforesis yang ditranfer pada nitroselulosa atau PVDF dan diberi antibody spesifik untuk

identifikasi protein target. Pada praktikum ini pemberian antibody poliklonal Shigella 49 kDa

mengalami kros reaksi pada sampel OMP Shigella dengan BM 125, 96, 90, 86 dan 26 kDa

sedangkan pada pili kros reaksi terjadi pada 26 dan 20 kDa.

DAFTAR PUSTAKA

Burnette WN. 1981. "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A". Analytical Biochemistry 112 (2): 195–203.

Towbin H, Staehelin T, Gordon J. 1979. "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 (9): 4350–54

Renart J, Reiser J, Stark GR. 1979. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure". Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 (7): 3116–20.