JSV 31 (2), Desember 2013 .JURNALSAINVETERINER

ISSN : 0126 - 0421

Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar SediaanInjeksi Obat Hewan Enrofloksasin

Validation of the Spectrophotometry method on the concentration assessment ofEnrofloxacine as the animal drug

Ambarwati" Novida AriyaDil daD Maria Fatima Palupi'

I Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan, Gunungsindur Bogor 16340Email: ambarthiwa@gmail.com

Abstract

Validation for analysis of enrofloxacin injection method using spectrophotometry has been conducted.Enrofloksasin in a solution ofNaOH (sodium hydroxide) 0.1 N, measured at the maximum wavelength (A)271nm. The parameters of validation that were carried out are precision, accuracy, linearity, limit of detection andlimit of quantitation. Precision showed good results with coefficien variation (CV) results smaller than that ofCV Horwitz. Accuracy parameters calculated by the method of analysis to determine levels of analyte in a knownactive ingredient purity and yielded 0.449%. Linearity parameters showed good results with r = 0.9996. Limit ofdetection value was obtained for 0.757 flg / mL and limit of quantification of 2.522 flg / mL. The results ofvalidation test of enrofloxacin injection analysis using spectrophotometric method can be used as a good methodto provide a valid test of quality assurance veterinary drugs.

Key words: validation, enrofloxacin, spectrophotometry, precision, accuracy

Abstrak

Telahdilakukanvalidasi terhadap metode uji kadar obat hewan enrofloksasin dalam bentuk sediaan injeksi,digunakan metode spektrofotometri. Enrofloksasin dalam larutan NaOH (natrium hidroksida) 0,1 N, diukurpada panjang gelombang maksimum (A)271nm. Parameter validasiyang digunakan antara lain: presisi, akurasi,linearitas, batas deteksi dan batas kuantitasi. Parameter presisi menunjukkan hasil yang baik, dengan nilaikoefisien variasi (CV) hasil uji lebih kecil daripada CV Horwitz. Parameter akurasi dihitung dengan metodeanalisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan aktifyang diketahui kemumiannya dan memberikan hasil0,449 %. Parameter linearitas menunjukkanhasil yang baik dengan nilai r = 0,9996.Nilai batas deteksi diperolehsebesar 0,757 flg/mL dan nilai batas kuantitasi sebesar 2,522 flg/mL. Hasil validasi uji kadar enrofloksasinbentuk sediaan injeksi dengan metode spektrofotometri memberikan hasi1 yang dapat diterima dan dapatdigunakan sebagai metodeyang valid untuk menjamin mutu hasiluji obat hewan.

Kata kUDCi:validasi, enrofloksasin, spektrofotometri, presisi, akurasi

266

-- - ---- -- ---

Ambarwati et al.

Pendahuluan

Salah satu misi, tugas dan fungsi Balai Besar

Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan

(BBPMSOH) dalam SK Menteri Pertanian No.

628/Kpts/OT.140/12/2003 adalah melaksanakan

pengembangan tehnik dan metoda pengujian mutu

obat hewan. Balai Besar Pengujian Mutu dan

SertifikasiObat Hewan, selaku laboratoriumpenguji

harus melakukan validasi terhadap metode baku

yang dimodifikasi, dengan berpedoman pada ISO

SNI/IEC 17025:2008.

Menurut ISO IEC 17025:2008,validasi adalah

konfirmasi melalui pengujian dan penyediaan bukti

obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu

maksud terpenuhi (Hadi, 2007). Salah satu jenis

validasi adalah validasi metode analisis/pengujian

(Aswad dkk., 2011). Metode pengujian ialah

prosedur tertentu untuk melaksanakan pengujian.

Validasi metode pengujian adalah suatu tindakan

penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan

percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk

penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter unjuk

kerja pengujian antara lain adalah presisi

(keseksamaanlrepitabilitas), akurasi (kecermatan)

(Shelke dkk., 2009), spesifisitas (selektifitas), batas

deteksi, batas kuantitasi, rentang linearitas, kekuatan

(robustness) dan ketangguhan (rudgedness) (Hadi,

2007; Harmita, 2004). Pemilihan parameter yang

akan diuji tergantung dari jenis dan metode

pengujian yang akan divalidasi.

Penggunaan metode yang valid memegang

peranan yang penting guna mendapatkan data yang

valid dari suatu laboratorium, di samping pengujian

dilakukan oleh personel yang kompeten, dengan

267

instrumentasi yang telah terkalibrasi serta sumber

daya laboratorium yang mendukung. Tujuan

memvalidasi metode adalah untuk mengetahui

sejauh mana penyimpangan metode tidak dapat

dihindari pada kondisi normal, dengan seluruh

elemen terkait telah terlaksana dengan baik dan

benar (Hadi, 2007).

Validasi metode sangat diperlukan oleh

laboratorium, karena dapat mengetahui tingkat

kepercayaan yang dihasilkan dari suatu metode

pengujian (Hadi, 2007). Hasil validasi metode

analisis dapat digunakan sebagai bahan acuan untuk

menentukan apakah metode terse but dapat

digunakan untuk pengujian mutu secara rutin atau

tidak. Validasi ulang perlu dilakukan meskipun

validasi sebelumnya menghasilkan data yang sesuai

dengan kriteria penerimaan, karena metode yang

dinyatakan valid pada kondisi tertentu belum pasti

valid pada kondisi lain dikarenakan perbedaan

peralatan dan pereaksi yang digunakan, analis yang

mengerjakan, waktu dan sebagainya (Oktavia,

2006). Selain itu, validasi metode merupakan salah

satu bentuk jaminan mutu hasil kepada pelanggan,

dengan metode yang digunakan telah terbukti baik,

maka hasil yang dikeluarkan oleh BBPMSOH

adalah valid.

Enrofloksasin merupakan fluorokuinolon

pertama yang diperkenalkan dan digunakan sebagai

obat hewan (Zahid dan Isnindar, 2013).

Kemoterapeutika ini adalah senyawa quinolon

pertama yang digunakan dalam veteriner, yang

mempunyai aktivitas antibakterisidal dan

berspektrum antimikrobial luas terhadap

mikroorganisme Gram positif dan Gram negatif

(Dimitrova dkk., 2006) serta aktif baik pada fase

diam maupun fase pertumbuhan dari replikasi

bakteri dengan absorbsi yang lebih baik dan dapat

mencapai jaringan lebih cepat (Zahid dan Isnindar,

2013).

Enrofloksasin secara kimia dikenal sebagai 3-

kuinolin asam karboksilat, l-siklopropil- 7-(4-etil-l-

piperazinil)-6- fluoro-1 ,4-dihidro-4-okso, dengan

rumus empiris C9H22FN303dan berat molekul dari

359,4 g/mol (Gambar I). Serbuk kristal berbentuk

jarum berwama putih atau agak kuning, tidak berbau

dan berasa dan tersedia dalam garam hidroklorida,

laktat dan sodium. Enrofloksasin sangat larut dalam

as am at au bas a media, larut dalam

dimetilformamida, sedikit larut dalam kloroform,

metanol dan tidak larut dalam air (Zahid dan

Isnindar,2013).

o 0

...0F

Nl

~N1CH]

Gambar 1. Struktur kimia enrofloksasin

Enrofloksasin memiliki aktivitas antibakteri

berspektrum luas terhadap bakteri Gram negatif dan

Gram positif dan aktif baik pada fase diam maupun

pertumbuhan dari replikasi bakteri. Enrofloksasin

tidak membentuk ikatan komplek dengan protein

plasma, sehingga memungkinkan metabolit secara

bebas melewati membran plasma (Mitchell, 2006).

Enrofloksasin merupakan antimikrobia yang

cukup luas dikenal di dunia veteriner. Jumlah obat

hewan yang mengandung enrofloksasin dan telah

terdaftar di Indonesia terus meningkat dari 62

produk enrofloksasin pada tahun 2009 menjadi 73

produk enrofloksasin pada tahun 2012 (Anonim,

- --

Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat

2012). Peningkatan jumlah sampel yang cukup

signifikan dan pentingnya memberikan jaminan

mutu hasil pengujian obat hewan dengan hasil uji

yang valid maka perlu dilakukan validasi terhadap

metode pengujian. Penelitian ini bertujuan untuk

memvalidasi metode analisis kadar enrofloksasin

sediaan injeksi menggunakan spektrofotometer

dengan cara melakukan dan menguraikan tehnik

validasi metode analisis.

Materi dan Metode

Bahan yang disiapkan yaitu sampel obat hewan

injeksi yang mengandung enrofloksasin, natrium

hidroksida/N aOH (Merck) dan standar

enrofloksasin (Sigma-Fluka). Alat yang dipakai

dalam pengujian adalah sebagai berikut: neraca

digital (Libror), magnetic stirrer, vortex mixer

(Iuchi), labu ukur 50 mL, 100 mL, 1000 mL (Scott-

Duran), pipet volumetrik (Pyrex-Iwaki-A), kuvet

dan spektrofotometer UV-Vis double beam

(Shimadzu).

Uji Presisi

Sejumlah sampel setara dengan 50-100 mg

enrofloksasin dipipet dan dimasukkan ke dalam labu

ukur 50 mL dan diencerkan dengan pelarut NaOH

0,1 N. Pengenceran bertingkat dibuat menggunakan

pelarut NaOH 0,1 N sehingga diperoleh konsentrasi

akhir 10 ~g/mL (Anonim, 2009).

Standar enrofloksasin ditimbang dengan tepat

10 mg, kemudian dibuat pengenceran bertingkat

digunakan pelarut NaOH 0,1 N sehingga diperoleh

konsentrasi akhir 10 ~g!mL. Absorbansi sampel

diukur dengan spektrofotometer UV/Vis pada

268

-- - - -

-- --- ----

Ambarwati et at.

panjang gelombang maksimum 271 nm (Anonim,

2009).

Kadar yang didapat dari sampel dihitung dan

pengujian sampel di atas diulang sebanyak 7 kali,

kemudian dihitung koefisien variasi (CV) (BPOM,

2009; Harmita, 2004). Rumus untuk menghitung

persentase kadar enrofloksasin adalah sebagai

berikut (Rumus 1):

Aspl CsXXd-x x 100%Astd Cspl

AsplAstdCstdCspl

=absorbansi sampel= absorbansi standar= konsentrasi standar= konsentrasi sampel

Nilai CV diperoleh dengan menghitung standar

deviasi (SD) dan relatif standar deviasi (RSD)

dengan rumus sebagai berikut (Rumus 2)

(Kantasubrata,2011):

SD =

SDRSD =

x

CV = RSD x 100 %

n =jumlah pengulanganx = kadar enrofloksasinpengujian ke-xx' = reratakadar enrofloksasin

Nilai CV hitung ini, kemudian dibandingkan

dengan CV Horwitz (Rumus 3) (Kantasubrata,

2011):

269

CV Horwitz (%) = t-O.510gC

CV hitung (%) < ; xCV Horwitz

C = konsentasi analit saat diukur

UjiAkurasi

Penghitungan untuk kerja akurasi

digunakan metode analisis dalam menetapkan kadar

analit dalam bahan aktif yang diketahui

kemumiannya (BPOM, 2009). Sejumlah 10 mg

standar enrofloksasin ditimbang dan dilakukan

pengenceran hingga diperoleh konsentrasi akhir 10

)lg/mL. Absorbansi larutan terse but diukur

menggunakan spektrofotometer UV/Vis pada

panjang gelombang maksimum 271 nm. Penetapan

kadar seperti di atas diulang sebanyak 7 kali (Hadi,

2007). Nilai perolehan kembali dihitung dengan

rumus (Rumus4) (Kantasubrata,2011):

1 nilai benar - n nilai hitung 1Akurasi (%)= x 100%

nilai benar

Uji Linearitas

Sejumlah 10 mg standar enrofIoksasin

ditimbang dan dibuat pengenceran bertingkat pada 5

konsentrasi (BPOM, 2009) digunakan NaOH 0,1 N

sehingga didapatkan konsentrasi 1,25; 2,5; 5,0; 10

dan 20 )lg/mL.Absorbansi tiap konsentrasi tersebut

diukur menggunakan spektrofotometer UVNis

pada panjang gelombang 271 nm dan nilai koefisien

korelasi (r) dihitung. Nilai r didapat dari analisis

regresl linier dengan (Rumus 5) (Kantasubrata,

2011):y = bx + a

a = intersepb = slopex = absprbansi

HasH dan Pembahasan

Uji Presisi

Keseksarnaan (presisi) rnerupakan ukuran

yang rnenunjukkan derajat kesesuaian antara hasil

uji individual, diukur rnelalui sebaran hasil

individual dari reratajika prosedur diterapkan secara

berulang-ulang pada sarnpel yang diarnbil dari

carnpuran yang hornogen (Harrnita, 2004).

Pengujian presisi dilakukan dengan cara

keterulangan yang dilaksanakan oleh penguji yang

sarna. Hasil pengujian kadar enrofloksasin

rnenggunakan spektrofotorneter UVNis adalah

sebagai berikut: Nilai CV pengujian ini adalah 0,934

%, sedangkan CV Horwitz yang terhitung adalah

11,314 %. CV hasil pengujian dengan rnetode ini

Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat

lebih kecil daripada CV Horwitz. Menurut Harmita

(2004), suatu rnetode pengujian dikatakan seksarna

jika rnetode rnernberikan simpangan baku relatif

(RSD) atau CV 2 % atau kurang. Sedangkanrnenurut

Kantasubrata (2011), persyaratan repitabilitas

adalah baikjika nilai CVhitung lebih kecil atau sarna

dengan CV Horwitz, sehingga dapat dikatakan

bahwa rnetode uji enrofloksasin rnenggunakan

spektrofotornetri ini rnernpunyai presisi yang baik

(Tabell dan 2).

UjiAkurasi

Nilai akurasi dihitung rnelalui penetapan

kadar standar untuk rnenernukan perolehan kernbali

terhadap nilai kadar standar sebenamya.

Tabel 1. Hasil Uji Kadar Enrofloksasin dengan Spektrofotorneter

Pengulanganke:

1234567

RerataSD

RSD

Kadar Enrofloksasin(%)

102,64102,50102,24103,96104,75103,96102,64

103,240,965

9,345 x 10-3

Tabel 2. Nilai Perolehan Kembali Standar Enrofloksasin

Pengulanganke:

1234567

RerataSD

CV (%)

Kadar Enrofloksasin (%)

100,7798,6998,99100,6898,099100,0898,79

99,441,0571,063

270

- -- - -- - ----- - - - - --

--------

Ambarwati et al.

Akurasi penghitungan kadar enrofloksasin di

atas adalah 0,449 %. Semakin kecil nilai akurasi,

maka semakin mendekati nilai kebenaran suatu zat

(semakin akurat) (Kantasubrata, 2011). Sedangkan,

menurut Harmita (2004), selisih kadar pada berbagai

penentuan harus 5 % atau kurang pada setiap

konsentrasi anal it dengan prosedur yang dilakukan.

Oleh sebab itu, metode ini memiliki akurasi yang

baik.

Uji Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan metode

Tabel 3. HasH Absorbansi untuk Uji Linearitas

untuk mendatangkan hasil uji yang secara langsung

sebanding dengan konsentrasi analit dalam suatu

rentang kerja yang diberikan (Harmita, 2004). HasH

absorbansi pada uji linearitas terdapat dalam Tabel3,

Gambar 2.

Dari data Tabel 3. Nilai r yang didapatkan

adalah 0,9996, sedangkan syarat suatu metode uji

mempunyai linearitas yang baik jika nilai r lebih

besar 0,98 (BPOM, 2009). Hal ini membuktikan

bahwa metode uji enrofloksasin dengan metode

spektrofotometrimempunyai linearitas yang baik.

Std Enrofloksasin(~g/mL)0,001,252,505,0010,0020,00

IntersepSlope

R

Absorbansi

0,0000,1180,2350,4910,9891,872

0,009860,094080,9996

10 20

kons8ntrasl

y = O,094lx + 0.0097RJ= 0.9991

~kurvastandar enro

-Linear (kurvastandar enro)

30

Gambar 2. Kurva kalibrasi larutan standar enrofloksasin

271

2.0

.- 1.541'

'iof 1.05t

it 0.5

0.0

0

Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Definisi batas deteksi menurut Rarmita (2004)

adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang

dapat dideteksi dan masih memberikan respon

signifikan dibandingkan dengan blanko.

Berdasarkan perhitungan, diperoleh batas deteksi

pada konsentrasi 0,757 flg/mL untuk pengujian

enrofloksasin dengan metode spektrofotometri. Ini

berarti bahwa enrofloksasin pada konsentrasi

tersebut masih dapat terbaca absorbansinya, namun

tidak dapat digunakan dalam perhitungan, karena

dapat membuat bias perhitungan.

Batas kuantitasi merupakan parameter pada

analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil

analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi

kriteria cermat dan seksama. Nilai batas kuantitasi

pada pengujian ini sebesar 2,522 flg/mL.

Konsentrasi tersebut merupakan konsentrasi terkecil

yang tidak menimbulkan bias perhitungan.

Metode uji kadar obat hewan enrofloksasin

menggunakan spektrofotometer telah divalidasi

dengan presisi, akurasi dan linearitas yang baik.

Nilai batas deteksinya yaitu 0,757 flg/mL dan batas

kuantitasinya yaitu 2,522 flg/mL. Berdasarkan hasil

validasi ini, maka metode uji kadar enrofloksasin

bentuk sediaan injeksi dengan spektrofotometri

dapat digunakan sebagai metode uji yang baik,

karena mampu memberikan jaminan mutu hasil uji

yang valid.

Ucapan Terima Kasih

Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada

Emi Rusmiati yang telah membantu selama proses

pembuatan tulisan ini.

Validasi Metode Spektrofotometri pada Uji Kadar Sediaan Injeksi Obat

Daftar Pustaka

Anonim. (2009) Farmakope Obat Rewan Indonesia.Jilid II. Edisi IV. Direktorat Jenderal Petemakandan Kesehatan Rewan. Jakarta.

Anonim. (2012) Indeks Obat Rewan Indonesia.Edisi VII. Asosiasi Obat Rewan Indonesia.Jakarta. 56-58, 81-85,89-90, 132-135.

Aswad, M., Fatmawaty, A., Nursamsiar,Rahmawanti. (2011) Validasi MetodeSpektrofotometri Sinar Tampak untuk AnalisisFormalin dalam Tahu. Majalah Farmasi danFarmakologi. 15:26-29.

BPOM. (2009) Petunjuk Operasional PenerapanCara Pembuatan Obat yang Baik. BadanPengawas Obat dan Makanan RepublikIndonesia. 583-609.

Dimitrova, D.J., Lashev, L.D., Yaney, St.G.,Pandova, V.T. (2006) Pharmacokinetics ofEnrofloxacin and Its Metabolite Ciprofloxacinin Male and Female turkeys followingIntravenous and Oral Administration. V.Research Com. 30:415.

Radi, A. (2007) Pemahaman dan PenerapanISO/IEC 17025: Persyaratan UmumKompetensi Laboratorium Pengujian danLaboratorium Kalibrasi. PT. Gramedia PustakaUtama.259-274.

Rarmita. (2004) Petunjuk Pelaksanaan ValidasiMetode dan Cara Perhitungannya. MajalahIlmuKefarmasian.I: 117-135.

Kantasubrata, J.K. (2011) Pelatihan Validasi danVerifikasi Metode Pengujian. Disampaikandalam Pelatihan Validasidan Verifikasi.BadanStandardisasiNasional.

Mitchell, M. A. (2006) Enrofloxacin: TherapeuticReview..!.Exotic Pet. Med. 15:66-69.

Oktavia, E. (2006) Tehnik Validasi Metode AnalisisKadar Ketoprofen secara Kromatografi CairKinerja Tinggi. Buletin Tehnik Pertanian. 11:23 - 28.

272

---

Ambarwati et al.

Shelke, S., Dongre, S., Rathi, A., Dhamecha, D.,Maria, S., Dehghan, M.H.G. (2009) ResearchArticle: Development and Validation of UVSpectrophotometric Method of CefuroximeAxetil in Bulk and Phrmaceutical Formulation.AsianJ. Research Chern.2: 222-224.

273

Zahid, M. dan Isnindar. (2013) Ulasan Ilmiah:Penggunaan Antibiotik FluorokuinolonSebagai Obat Hewan. Buletin Pengujian MutuObatHewan 12:13-22.