Validasi Metode AnalisisParameter Uji Dalam Validasi Metode Analisis akan menguji cara-cara pemeriksaan atau pengujian (misalnya identifikasi, penetapan kadar zat aktif, menguji sisa/residu, dan sebagainya) agar yakin bahwa pengujian yang dilakukan tersebut sudah benar dan hasil pengujian yang dilakukan benar-benar terpercaya. Ada beberapa parameter uji yang meliputi, antara lain:

akurasi (Accuracy); presisi (precision);

o ripitabilitas (repeatibilty);o Presisi antara (intermediate precision);o reprodusibilitas/keterulangan (reproducibility)

spesivisitas (specify)/Selektifitas (selectivity); batas deteksi (limit of detection/LOD); batas kuantitasi (limit of quantitation/LOQ); linearitas (Linearity); dan rentang (range).

Penentuan Parameter uji yang dilakukan, sangat tergantung dari jenis Pengujian yang dilakukan serta sumber dari prosedur pengujian tersebut. Lihat tabel berikut :

 

Akurasi (ketepatan) Merupakan kemampuan suatu metode analisa untuk memperoleh nilai yang sebenarnya

(ketepatan pengukuran). Akurasi dinyatakan sebagai prosentase (%) perolehan kembali (recovery). Akurasi dinilai dengan menggunakan sedikitnya 9 penentuan dengan sedikitnya 3 tingkat konsentrasi dalam rentang pengujian metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3 replikasi untuk tiap prosedur analisis lengkap). Ketepatan metode analisa dihitung dari besarnya rata-rata (mean, x) kadar yang diperoleh dari serangkaian pengukuran dibandingkan dengan kadar sebenarnya.

Recovery = Hasil Analisi

Nilai sebenarnyax 100 %

Syarat recovery : 98 – 102 %Terdapat 5 metode penentuan akurasi untuk penetapan kadar bahan aktif obat dalam

bahan baku dan produk obat, yaitu : 1. Menggunakan metode analisis untuk menetapkan kadar analit dalam bahan

baku berkhasiat yang diketahui kemurniannya (misalnya bahan baku pembanding sekunder).

2. Bahan baku berkhasiat atau cemaran dalam jumlah yang diketahui ditambahkan kedalam plasebo. Metode analisis ini akan digunakan untuk penetapan kadar bahan baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat.

3. Bila plasebo tidak bisa diperoleh, verifikasi akurasi metode dapat dilakukan dengan teknik standar adisi, yaitu dengan menambahkan sejumlah tertentu analit kedalam produk obat yang telah diketahui kadarnya. Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar bahan baku berkhasiat/cemaran dalam produk obat

4. Menambahkan cemaran dalam jumlah tertentu ke dalam bahan baku berkhasiat/produk obat. Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar cemaran dalam bahan baku berkhasiat dan produk obat

5. Membandingkan dua metode analisis untuk mengetahui ekivalensinya, yaitu membandingkan hasil yang diperoleh dari metode analisis yang divalidasi terhadap hasil yang diperoleh dari metode analisis yang valid (akurasi metode analisis yang valid ini telah diketahui). Metode analisis ini digunakan untuk penetapan kadar bahan baku berkhasiat dalam bahan baku berkhasiat, produk obat dan penetapan kadar cemaran.

  Presisi (Ketelitian)

Merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk menunjukkan kedekatan dari suatu seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen.

Terdapat 3 kategori pengujian presisi, yaitu : 1. Keterulangan (repeatability), dinilai dengan menggunakan minimum 9 penentuan

dalam rentang penggunaan metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3 replikasi).

2. Presisi Antara, yaitu perbedaan antar operator/analis dengan sumber reagensia dan hari yang berbeda.

3. Reprodusibilitas, dengan menggunakan beberapa laboratorium untuk validasi metode analisis, agar diketahui pengaruh lingkungan yang berbeda terhadap kinerja metode analisis.

Macam-macam Presisi Presisi dinyatakan dalam bentuk RSD (relative standart deviation) atau SRB (sebaran

baku relatif) . Persyaratan RSD sebagai berikut :

Spesifitas/SelektifitasMerupakan kemampuan suatu metode analisa untuk membedakan senyawa yang diuji dengan

derivat/metabolitnya. Adanya perbedaan nyata antara resolusi antara dua puncak yang berdampingan dan kemurnian tiap puncak dalam kromatogram.

Untuk HPLC, Rs : 1,2 – 1,5.

Untuk Spektrofotometer UV/Vis: jarak dua puncak berdampingan: resolution factor   (Rf) > 2,5.Lakukan scanning (pemindaian) sampel yang diuji lihat kromatogram dari dua puncak

yang berdekatan (Rs) harus tidak kurang dari 1,5 atau terlihat adanya puncak yang terpisah dari scanning dengan spektrofotometer UV/Vis. Pemisahan dua puncak yang berdekatan dalam kromatogram, resolusi (R) ditentukan dengan persamaan :

Di mana t2 dan t1 adalah waktu retensi dua komponen, W1 dan W2 adalah lebar puncak. Komponen pertama dan komponen kedua yang diukur dengan jalan ekstrapolasi sisi puncak yang relatif lurus sampai garis dasar (base line).Resolusi harus lebih besar dari 1,5. 

Hasil Kromatogram Uji Selektifitas/Spesifitas yang memenuhi persyaratan 

Hasil Kromatogram uji selektifitas yang tidak memenuhi persyaratan

Batas Deteksi (Limit of Detection/LOD)Merupakan jumlah analit terkecil yang masih bisa dideteksi namun tidak perlu dapat terukur.

Ada beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk menentukan batas deteksi tergantung pada jenis metode analisis apakah metode analisis instrumental atau noninstrumental.

1. Berdasarkan evaluasi visualEvaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental,  tapi dapat juga digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas deteksi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan menetapkankadar terendah yang dapat dideteksi dengan baik.

2. Berdasarkan rasio signal terhadap noisePendekatan ini hanya dapat diterapkan pada metode analisis yang memberikan baseline noise. Penentuan signal to noise dilakukan dengan membandingkan pengukuran signal sampel yang diketahui mengandung analit dalam konsentrasi rendah dan blanko, kemudian dapat ditetapkan konsentrasi minimum analit yang dapat dideteksi dengan baik. Rasio signal to noise sama dengan 3 atau 2 : 1 umumnya dianggap dapat diterima untuk memperkirakan batas deteksi.

Simpangan respon dan kemiringan (“slope”) kurva kalibrasi, batas deteksi dapat dinyatakan sebagai :

LOD

Batas Kuantitasi (Limit of Quantitation/LOQ)Merupakan jumlah analit terkecil yang yang masih bisa diukur dengan akurat (tepat) dan

presisi (teliti)/reprodusible. Beberapa pendekatan yang dapat digunakan untuk penentuan batas kuantitasi tergantung pada jenis metode analisis instrumental atau noninstrumental.

1. Berdasarkan evaluasi visualEvaluasi visual dapat digunakan untuk metode analisis noninstrumental, tapi dapat juga digunakan untuk metode analisis instrumental. Batas kuantitasi ditentukan dengan melakukan analisis terhadap sampel yang diketahui konsentrasinya dan  menetapkan kadar terendah analit yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima

2. Berdasarkan rasio signal terhadap noise

Pendekatan ini hanya dapat digunakan pada metode analisis yang memberikan baseline noise. Penentuan rasio signal terhadap noise dilakukan dengan membandingkan signal yang diukur dari sampel yang mempunyai konsentrasi analit yang rendah dan blankonya, kemudian ditentukan konsentrasi terendah analit yang dapat ditetapkan secara kuantitatif dengan baik, umumnya pada rasio signal terhadap noise 10:1.

Simpangan baku dari respon dan kemiringan (slope) kurva kalibrasi, batas kuantitasi dapat dinyatakan sebagai :

LOQ 

LinearitasMerupakan kemampuan suatu metode analisa untuk menunjukkan hubungan secara langsung

atau proporsional antara respons detektor dengan perubahan konsentrasi analit. Linieritas diuji secara statistik, yaitu Linear Regression (y = a + bx); dimana b adalah kemiringan slope garis regresi dan a adalah perpotongan dengan sumbu y.

Koefisien korelasi (r) = Σ ( x−Xbar )( y−Ybar)

√[ Σ ( x−Xbar ) Σ ( y−Ybar ) ]                                                Keterangan:

x = pengukuran individual dalam N pengukuran x (bar) = nilai rata-rata pengukurany = nilai individual sebenarnya dalam N nilai sebenarnyay (bar) = nilai rata-rata sebenarnya.

Pengujian dilakukan paling tidak dengan menggunakan 5 kadar yang berbeda, kemudian dilihat apakah memberikan respons yang linear apa tidak, yang ditunjukkan dengan nilai r ≥ 0,98.

Pegujian Linearitas  

Ketegaran (robustness)Merupakan kapasitas suatu metode analisis untuk TIDAK terpengaruh oleh variasi-variasi

kecil dalam parameter metode analisa. Contoh variasi kecil dalam metode analisa secara HPLC, antara lain: pH fase gerak, suhu, tekanan, stabilitas, jumlah pelarut organik yang dimodifikasi, konsentrasi buffer, konsentrasi additive, flow rate, suhu kolom, dan lain-lain.

 KRITERIA PENERIMAANMetode Analisa dinyatakan memenuhi syarat (valid), jika :

Seluruh parameter uji (Spesifitas/selektifitas, Linearitas, Akurasi, Presisi, LOD, LOQ dan Robustness) memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.

Tidak ada perbedaan bermakna antar analis atau antar dosis yang diuji atau antar lab. (t uji < t tabel).

 VALIDASI ULANGValidasi ulang mungkin diperlukan pada kondisi sebagai berikut:

perubahan sintesis bahan aktif obat; perubahan komposisi produk jadi; dan perubahan prosedur analisis.

Tingkat validasi ulang yang diperlukan tergantung pada sifat perubahan. Perubahan tertentu lain mungkin juga memerlukan validasi ulang.