val. metode cemaran s. aureus

7/24/2019 Val. Metode Cemaran s. Aureus

1/16

VALIDASI METODE ANALISIS CEMARAN

Staphylococcus aureusPADA PUPUK HAYATI

LESTARI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011


2/16

ABSTRAKLESTARI. Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureus pada Pupuk Hayati.Dibimbing oleh GAYUH RAHAYU dan NISARACHMANIA MUBARIK.

Pupuk hayati komersial harus bebas kontaminan sebelum dipasarkan, sehingga pupukhayati harus diuji mikrobiologi cemarannya. Metode analisis cemaran mikrob pada pupuk hayati

yang tervalidasi belum tersedia, oleh sebab itu metode uji yang terstandard harus dibuat. Penelitianini bertujuan untuk menyediakan metode standard pengujian cemaran S. aureuspada pupuk hayati

melalui validasi metode berdasarkan presisi dan akurasi. Presisi ditetapkan berdasarkan nilaiHorwitz sedangkan akurasi ditetapkan berdasarkan persen perolehan kembali dan uji T. Metodeacuannya adalah SNI 2332.9:2011 untuk menguji keberadaan S. aureus. Dalam pengujian inimikrob rujukan yang digunakan ialah mikrob yang tersertifikasi (S. aureus IPBCC 5.11.666).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode SNI 2332.9:2011 yang diterapkan untuk pupukhayati memiliki presisi cukup baik. Simpangan baku relatif (SBR) untuk sampel yang membawa

cemaran S.aureus(berturut-turut sebesar 0,20 dan 0,19) kurang dari 2/3 nilai Horwitz (0,84 dan0,78). Persen perolehan kembali cemaran S. aureus ialah sebesar 172,34 %. Nilai perolehankembali masuk dalam kisaran (48-291%) yang ditetapkan oleh Environmental Protection Agency.Uji T pada akurasi dan presisi jumlah sel S. aureusmemperlihatkan hasil yang berbeda nyata pada = 0,05. Berdasarkan nilai presisi dan akurasi (persen perolehan kembali), metode SNI

2332.9:2011 dapat diaplikasikan sebagai metode uji cemaran mikrob pupuk hayati.

Kata kunci : validasi, metode analisis mikrobiologi, presisi, akurasi.

ABSTRACTLESTARI. Validation Method of Staphylococcus aureus Contamination Analysis in BiologicalFertilizer. Supervised by GAYUH RAHAYU and NISA RACHMANIA MUBARIK.

Commercial bio-fertilizers must be free from contaminants. Yet, microbial testing

methodology which validated for bio-fertilizers is not available. Therefore, such a method shouldbe made available by validation procedure of certain reference method. This study aims to providea standard method of testing microbial contamination S. aureus on bio-fertilizer. This methodshould fulfill the validation parameters, such as precision and accuracy. Precision is estimated bythe Horwitzs value and that of accuracy from the percent recovery. Precision is estimated bycomparing the relative standard deviation (RSD) to the Horwitzs value and accuracy is estimated

by percentage of recovery and T test. The reference methods used is SNI 2332.9:2011 for thepresence of S. aureus. In this research the contaminatS. aureus IPBCC 5.11.666)is used as a

reference mataerial. he result indicated that SNI 2332.9:2011 have a high precision, since therelative standard deviation for sample and contaminant (0.20 and 0.19) of less than 2/3 valueHorwitz (0.84 and 0.78). Percent recovery of contaminant S. aureus is 172.34%. The value of S.aureuswere in the range limit (48-291%) of the Environmental Protection Agency. T-test of the

accuracy and precision S. aureustest showed significantly different at = 0.05. Based on the valueof precision and accuracy (% recovery), SNI 2332.9:2011 can be applied as microbial

contamination test method bio-fertilizer.

Key word: validation, testing method for microbiology, precision, accuracy.


3/16

VALIDASI METODE ANALISIS CEMARAN

Staphylococcus aureusPADA PUPUK HAYATI

LESTARI

Skripsisebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011


4/16

Judul : Validasi Metode Analisis Cemaran Staphylococcus aureuspada Pupuk

Hayati

Nama : Lestari

NIM : G34070090

Disetujui :

Pembimbing I

Dr. Ir. Gayuh Rahayu

NIP. 195801051983032002

Pembimbing II

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si.

NIP. 19671127 199302 2 001

Diketahui,

Ketua Departemen Biologi

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.NIP 19641002 198903 1 002

Tanggal Lulus :


5/16

RAWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Wonogiri pada tanggal 10 Januari 1989 dari Bapak Timan dan IbuWarti. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara.

Tahun 2001 penulis lulus dari SD Negeri 025 Delik, Kabupaten Kampar, Riau. Tahun 2004

penulis lulus dari SLTP Negeri 4 Bulukerto, Kabupaten Wonogiri, Jawa Tengah. Tahun 2007penulis lulus dari SMA Negeri 1 Kerinci Kanan, Kabupaten Siak Sri Indrapura, Riau. Pada tahun

yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Bibit Unggul Daerah (BUD).Pada tahun 2008 penulis diterima di Departemen Biologi Fakultas Matematika dan IlmuPengetahuan Alam (FMIPA).

Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi pengajar TPA di desa Balumbang Jaya

tahun 2009. Selain itu, penulis pernah aktif berorganisasi di Serambi Ruhiyah Mahasiswa FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (SERUM-G) pada tahun 2008-2009 serta menjadi panitia

diberbagai kegiatan antara lain Ekspresi Muslimah (Eksmus), dan Masa Perkenalan MahasiswaBaru (MPKMB) IPB angkatan 45. Pada tahun 2010/2011 penulis pernah menjadi Senior Resident(SR) di Asrama TPB IPB.


6/16

PRAKATA

Segala puji bagi Tuhan Yang Mahaesa atas segala limpahan rizki dan rahmat-Nya sehinggakarya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah dengan judul Validasi Metode AnalisisCemaran Staphylococcus aureuspada Pupuk Hayati Ini disusun berdasarkan hasil penelitian dari

bulan Maret sampai September 2011.Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu

penyusunan karya ilmiah ini, terutama kepada Ibu Dr. Ir. Gayuh Rahayu dan Ibu Dr. NisaRachmania Mubarik, M.Si. selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan saranselama penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga disampaiakankepada

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikan koreksi dansaran-saran dalam perbaikan skripsi ini.

Terima kasih kepada Bapak, Ibu, Sugeng Widodo, Mulyani, Arief Nur Din Syah, YunusBudiawan serta Pemerintah Daerah (Pemda) Kabupaten Siak atas segala dukungan baik moril,

materil, serta doa selama penulis menempuh pendidikan hingga karya ilmiah ini terselesaikan.Terima kasih kepada laboran Laboratorium Mikologi, IPBCC dan Laboratorium

Mikrobiologi: Bu Emi, Bu Riana, Pak Kus, Bu Heni, Pak Jaka, Pak Aldian atas bantuannya, danteman-teman dari Sekolah Pascasarjana: Ibu Yuyun, Ibu Dini, Ibu Ade, Pak Yosi serta teman-

teman seperjuangan di laboratorium mikologi (IPBCC): Rahmah, Sepri, dan teman-teman Biologi44, terima kasih atas kerjasamanya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Desember 2011

Lestari


7/16

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ............................................................................................................. ............. viii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ........................ viii

PENDAHULUANLatar Belakang ........................................................ ............................................................... 1Tujuan ......................................................... .................................................................... ....... 2

BAHAN DAN METODEWaktu dan Tempat Penelitian ......................................................................... ....................... 2

Bahan dan Alat ....................................................................... ................................................ 2Metode ................................................................................................................... ................ 2

Persiapan Kultur Kerja ............................................................................ ...................... 2Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati ........................................................................ 2Pembuatan Cemaran (spike) dariCRM ......................................................................... 2

Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati ............................... ....................................... 2Pengolahan Data ............................................................................................................ 3

HASILKultur Kerja... .............................................................................................................. .......... 3Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati ................... ............................................................. 3Cemaran (spike) dariCRM .................................................................................................... 4

Uji Cemaran pada Sampel Pupuk Hayati .............................................................. ................. 4

PEMBAHASAN ............................................................................... ................................................ 4

SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 5

DAFTAR PUSTAKA .................................................................... ................................................... 6

LAMPIRAN ........................................................ ....................................................................... ....... 7


8/16

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Pertumbuhan Certified Reference Material(CRM) S. aureuspada media BPA... ........................ 3

2 Pertumbuhan bakteri yang terdapat pada pupuk hayati di media BPA... ....................................... 3

3 Hasil uji kontrol positif S. aureuspada pupuk hayati di media BPA ............................................ 4


9/16

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Di dalam sebuah pengujian diperlukanmetode dan peralatan yang absah. Hal inidilakukan agar metode dapat dijamin dansesuai untuk penggunaan yang dimaksuddengan hasil uji cukup handal (reliable).Evaluasi metode ini dikenal dengan istilah

validasi. Validasi adalah konfirmasi denganpengujian dan penyediaan bukti objektifbahwa persyaratan tertentu untuk suatumaksud khusus dipenuhi (ISO 2008). Metodeyang harus divalidasi yaitu metode yang tidakbaku, metode yang dikembangkanlaboratorium, metode baku yang digunakan

di luar lingkup dan metode baku yangdimodifikasi untuk mengkonfirmasi bahwa

metode itu sesuai untuk penggunaan yangdimaksud (ISO 2008).Validasi metode bermanfaat untuk

mengevaluasi unjuk kerja suatu metodeanalisis, menjamin prosedur analisis yang

akurat, menekan sekecil-kecilnya resikopenyimpangan yang timbul, dan menjaminkedapatulangan yang tepat. Suatu metodeanalisis dikatakan absah jika telah memenuhisyarat keberterimaan parameter validasi.Parameter yang dimaksud yaitu presisi dan

akurasi.Metode yang telah divalidasi eksternal

seperti Association Official of AnalyticalChemistry (AOAC) harus memenuhipersyaratan presisi dan akurasi. Presisi(keseksamaan) didefinisikan sebagai ukuranderajat kesesuaian antara hasil individual dari

rata-rata jika prosedur diterapkan secaraberulang pada sampel-sampel yang diambildari campuran yang homogen (Harmita2004). Presisi dapat dilihat dari simpanganbaku (SB) dan simpangan baku relatif (SBR)yang diperoleh dari pengukuran. Presisi yangbaik akan memberikan nilai median dari

ulangan di antara selang rata-rata SB

(Saefuddin et al. 2009) dan SBR kurang dari2/3 nilai Horwitz (AOAC 2005). MenurutISO, akurasi (kecermatan) didefinisikansebagai kesesuaian antara hasil analisisdengan nilai benar atau nilai acuan yang

dapat diterima. Kecermatan dinyatakansebagai persen perolehan kembali (recovery)dari mikrob cemaran yang ditambahkan.Persen perolehan kembali adalah angka yangmenunjukkan besarnya penambahan standaryang mampu diidentifikasi kembali dengansuatu metode. Nilai perolehan kembali

bergantung pada matriks sampel, prosedur

proses sampel, dan konsentrasi cemaran.

Batas penerimaan perolehan kembali menurutEPA (2005) ialah 48-291%.

Laboratorium IPB Culture Collection(IPBCC) saat ini sedang dalam proses

persiapan diri untuk akreditasi ISO/IEC

17025:2005. Salah satu persyaratan akreditasiialah implementasi metode uji yang sudahdivalidasi sesuai dengan ketentuan padaISO/IEC 17025:2005 butir 5.4 (BSN 2008a).

Metode analisis yang akan divalidasi

diadopsi dari metode standard yang valid.Untuk akreditasi IPBCC perlu melakukanvalidasi metode uji pada ruang lingkupparameter yang akan diakreditasi. Ruanglingkup IPBCC yang akan diakreditasi ialahpupuk hayati dengan parameter cemaranmikrob nonsimbiotik. Metode standard

sebagai rujukannya ialah metode Standard

Nasional Indonesia (SNI). Metode SNIbanyak merujuk pada buku AOAC. Metodeini akan digunakan untuk menguji mikrobpada pupuk hayati karena pupuk tersebutmengandung berbagai organisme hidup.

Pupuk hayati didefinisikan sebagai

inokulan berbahan aktif organisme hidupyang berfungsi untuk menambat hara tertentuatau memfasilitasi tersedianya hara dalamtanah bagi tanaman, misal pupuk hayatiRhiphosan mengandung bakteri Brady-rhizobium japonicum perangsang bintil akar

dan Aeromonas punctata untuk pelarutan

fosfat. Ketersediaan hara ini dapatberlangsung melalui peningkatan aksestanaman terhadap hara misalnya olehcendawan mikoriza arbuskuler, pelarutanoleh mikrob pelarut fosfat, maupunperombakan oleh aktinomiset (Simanungkalit

et al.2006). Pupuk hayati semacam itu harusdiuji bebas cemaran yaitu mikrob lain selainmikrob komposisi pada pupuk. Mikrob lainyang tumbuh dapat mengganggupertumbuhan mikrob komposisi. Hal inidapat menurunkan efektivitas pupuk hayati.

Dalam pengujian cemaran mikrob

digunakan mikrob indikator, karena selainmudah dideteksi juga dapat memberikangambaran tentang kondisi higienis dariproduk yang diuji (BPOM RI 2008). Mikrobindikator adalah golongan atau spesiesbakteri yang kehadirannya dalam jumlah di

atas batas (limit) tertentu, merupakanpertanda bahwa bahan telah terpapar dengankondisi-kondisi yang memungkinkan

berkembangbiaknya mikrob patogen (BPOMRI 2008). Mikrob indikator digunakan untukmenilai keamanan dan mutu mikrobiologibahan (BPOM RI 2008).


10/16

2

Pada saat ini metode standard uji

analisis cemaran mikrob pada pupuk hayati

belum tersedia. Oleh sebab itu, metode

standard untuk keperluan ini harus divalidasi.

Metode yang divalidasi ialah metode yangtelah valid akan tetapi diterapkan pada

sampel yang berbeda. Metode yang akan

divalidasi pada penelitian ini termasuk ke

dalam kategori metode baku yang digunakan

di luar lingkup yang dimaksud. Metode

analisis mikrobiologi dihitung secara

kuantitatif dengan metode angka lempeng

total (ALT). Angka lempeng total

dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah

mikrob yang terdapat dalam suatu produk

dengan cara menghitung koloni bakteri yang

ditumbuhkan pada media agar (BSN 2008b).

Validasi metode uji cemaran mikrob

sedikit berbeda dengan validasi metode ujikimia. Dalam cemaran mikrob sebagai CRM-nya digunakan makhluk hidup yang dikenalsebagai kultur murni bakteri. Metode rujukanyang digunakan dalam penelitian ini ialahmetode SNI 2332.9:2011 untuk mengujikeberadaan S. aureus (BSN 2011). Produk

makanan diganti dengan sampel pupukhayati.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan memvalidasimetode standard pengujian denganmengevaluasi kinerja metode, meliputi presisi

dan akurasi sebagai pembuktian kinerjametode uji cemaran mikrob Staphylococcusaureuspada pupuk hayati.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulanMaret 2011 sampai bulan September 2011 di

Laboratorium Analis Uji IPBCC, DepartemenBiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam

penelitian ini ialah pupuk hayati(Rhiphosant), dan mikrob rujukan

Staphylococcus aureus IPBCC 5.11.666(ATCC 6538) yang merupakan CertifiedReference Material (CRM). Baird ParkerAgar (BPA) dan Butterields Phosphate

Buffered (BPB) (Lampiran 1). Alat-alat

laboratorium yang digunakan ialah laminar,

autoklaf, inkubator, neraca analitik, pipetmikro, cawan petri, tabung reaksi,

Erlenmeyer, serta peralatan umum yangdigunakan di laboratorium.

Metode

Persiapan Kultur Kerja. Kultur

stok dari CRM dibiakkan kembali dandijadikan kultur kerja. Kultur kerja S. aureusdibuat dengan cara menggoreskan satu lupbiakan pada media NA cawan dan biakandiinkubasi pada kondisi ruang selama 48 jam.S. aureus yang telah tumbuh pada media NA

digores ke media selektif BPA untukpembanding.

Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk

Hayati. Sebanyak 10 gram pupuk hayatitanpa sterilisasi dicampur dalam 90 mL BPB

dan dihomogenkan di atas mesinpenggoyang. Sebanyak 0,1 mL disebarkanpada media BPA.

Pembuatan Cemaran (Spike) dari

CRM. Suspensi cemaran S. aureus dibuat

dengan cara sebanyak 2 lup biakandimasukkan ke dalam 100 mL BPB dalam

Erlenmeyer ukuran 1L. Bakteri yang beradadalam media cair tersebut diinkubasi selama24 jam pada suhu 35 C. Setelah masa

inkubasi berakhir, sebanyak 0,1 mL suspensibiakan disebar pada media BPA dandiinkubasi pada suhu 35 C. konsentrasi

bakteri dihitung dengan metode ALT. Setelahdianalisis, spike tersebut disimpan di lemaripendingin 10 C untuk dipergunakan sebagaisumber cemaran.

Uji Cemaran pada Sampel PupukHayati. Sampel yang dianalisis terbagi dalam2 kelompok perlakuan yaitu pupuk hayatiyang diberi cemaran (sampel positif) danpupuk hayati tanpa cemaran (sampel negatif).

Sampel positif merupakan matriksyang membawa cemaran pada konsentrasi

yang diketahui. Sebanyak 10 mL spike S.aureus (dengan konsentrasi terstandard)ditambahkan ke dalam masing-masing 10 gsampel pupuk hayati. Kemudian ke dalamcampuran tadi ditambahkan media BPBsehingga volume campuran mencapai 100mL. Kemudian campuran didiamkan selama2 menit dan dihomogenkan di atas mesin

penggoyang. Konsentrasi cemaran yang adapada sampel dihitung secara kuantitatifdengan metode ALT cawan sebar pada media

BPA. Sebelum dianalisis, suspensi sampel


11/16

3

dihomogenkan kemudian dicawankan.Sebanyak 0,1 mL disebarkan pada mediaBPA. BiakanS. aureusdiinkubasi pada suhu 35C selama 2-3 hari. Jumlah koloni yangtumbuh pada cawan dihitung dan dinyatakan

dalam colony formy unit (cfu) mL-1

.Pengenceran dengan kerapatan koloni 25-250

koloni/cawan (BSN 2008b) digunakan dalamperhitungan presisi dan akurasi.

Prosedur yang sama dilakukan untuksampel negatif yaitu sampel tanpa cemaran.Sampel tanpa cemaran adalah pupuk hayatiyang disterilisasi. Sterilisasi dilakukan untuk

lebih meyakinkan bahwa pupuk tersebutbebas dari cemaran yang akan diujikan.Sterilisasi pupuk juga dilakukan agar tidakada mikrob lain yang tumbuh sehinggamenghambat pertumbuhan cemaran di dalam

pupuk. Masing-masing perlakuan minimaldiulang sebanyak tujuh kali.

Pengolahan Data. Data diolah untukmendapatkan nilai presisi dan akurasi. Presisiditetapkan berdasarkan simpangan baku (SB)dan simpangan baku relatif (SBR) (Saefuddin

et al. 2009) dari ulangan. SB dan SBRdihitung dengan rumus berikut :

SB =

SBR = SB/

SB : simpangan bakuSBR : simpangan baku relatif

(koefisien keragaman)x : rata-rata dari ulangan

n : ulanganx1,x2,....xn: nilai konsentrasi ke-1.... n

Jika SBR kurang dari 2/3 nilai Horwitz(AOAC 2005) maka metode dapat diterima.Nilai Horwitz dihitung dengan persamaanberikut:

Nilai Horwitz = 2(1-0,5log Y)

Y: rata-rata konsentrasi cemaran

(kontrol positif)Akurasi diukur dengan persentase

perolehan kembali melalui uji komparatif.

Persentase perolehan kembali adalahbanyaknya cemaran yang dapat diisolasi

kembali dari sejumlah cemaran yangdimasukkan ke dalam sampel. Persenperolehan kembali (recovery) dihitungdengan rumus berikut:

% recovery(R) = [(A-B)/C] 100

A: sampel dengan cemaran (sampelpositif)

B: sampel tanpa cemaran (sampelnegatif)

C: cemaran tanpa sampel (kontrolpositif)

Tingkat akurasi metode ditetapkanberdasarkan perbandingannya terhadap nilai

perolehan kembali yang ditetapkan oleh EPA

(2005).Uji komparatif dilakukan untuk

membuktikan kekuatan dari metode ujimelalui uji beda nyata antara sampel positifdan kontrol positif. Uji komparatif dilakukan

dengan uji T dengan menghitung nilai PmenggunakansoftwareMinitab 14.

HASIL

Kultur Kerja

Kultur CRM S. aureus tumbuhpadamedia BPA dengan ciri koloni berwarna abu-

abu hingga kehitaman dan sekeliling tepikoloni bening (terbentuk halo). Koloni

berbentuk bundar, cembung, licin/halusdengan tepian rata, tumbuh setelah 48 jaminkubasi di media BPA (Gambar 1).

Gambar 1 Pertumbuhan Certified ReferenceMaterial (CRM) S. aureus padamedia BPA (a) S. aureus dari mediaNA (b) koloni tunggal S. aureussetelah diencerkan.

Uji Mikrobiologi Sampel Pupuk Hayati

Hasil analisis awal pupuk hayatimengandung bakteri pada media selektif BPA(Gambar 2). Bakteri yang tumbuh berwarnahitam akan tetapi tidak memiliki zona bening

setelah diinkubasi selama 2-3 hari. Analisis

ini dibandingkan terhadap CRM-nya yangmenunjukkan bahwa pupuk hayati yangdigunakan dinyatakan bebas dariS. aureus.

Gambar 2 Pertumbuhan bakteri yang terdapatpada pupuk hayati di media BPA.

a b


12/16

4

Cemaran (Spike) dari CRM

Konsentrasi sumber inokulum S.aureus sebagai spike kontrol positif yangtumbuh pada media BPA sebesar 315cfu.mL-1 (Gambar 3) (Tabel 1).

ulangan ke-3 (385) dan ke-4 (400). Padasampel positif terdapat dua data yang berbedanyata dengan uji T yaitu pada ulangan ke-2dan ke-3 (650).

Tabel 1 Presisi uji cemaran S. aureus

UlanganJumlah sel S. aureus(cfu mL-1)

KPa SP SNc

1 260 600 02 355 650 0

3 385 650 04 400 d 400 0

5 265 450 06 285 600 07 255 450 0

Rata-rata 315,00 542,86 0SB 62,92 105,79 -Median 285,00 600,00 -

Batas atas 377,92 648,64 -Batas bawah 252,08 437,07 -

SBR 0,20 0,19 -2/3 nilai Horwitz 0,84 0,78 -

Keterangan: a: Jumlah sel yang tumbuh dari 2 ulangan dikalikan faktor pengenceran 10x ; b: Jumlah sel yang

tumbuh dari 2 ulangan dikalikan faktor pengenceran 100x; c: Jumlah sel yang tumbuh daripupuk hayati yang disterilisasi;d: berbeda nyata dengan uji T pada taraf = 0,05.

Gambar 3 Hasil uji kontrol positif S. aureuspada pupuk hayati di media BPA.

Uji Cemaran pada Sampel Pupuk HayatiKonsentrasi S. aureus dari spikeyang

ditambahkan ke dalam pupuk hayati sebagai

sampel positifyang tumbuh pada media BPAsebesar 543 cfu.mL-1(Tabel 1). Nilai SB dan

SBR metode uji berturut-turut sebesar 62,92dan 0,20 pada kontrol positif serta 105,79 dan0,19 pada sampel positif (Tabel 1).

Data perolehan kembali cemaran S.aureus dan nilai P (software Minitab 14)berturut-turut yaitu sebesar 172,34 % dan P=

0,002. Nilai persen perolehan kembalimenunjukkan bahwa metode S. aureus

memiliki akurasi tinggi karena memenuhibatas penerimaan EPA (2005) yaitu 48-291%. Nilai P yang diperolehmenggambarkan penyimpangan kesalahandata (standard eror) yang fungsinya samadengan .

Dari ketujuh data kontrol positif padaS. aureus yang diperoleh terdapat dua datayang berbeda nyata dengan uji T yaitu pada

PEMBAHASAN

Pupuk hayati yang beredar di pasaran

sangat beragam diantaranya yaitu

Rhiphosant. Pupuk Rhiphosant mengandung

bakteri Bradyrhizobium japonicum

perangsang pembentukan bintil akar dan

Aeromonas punctata untuk pelarutan fosfat.

Sebelum dipasarkan pupuk hayatiharus melewati uji efektivitas dan ujimikrobiologi cemaran. Bakteri adalah jenis-jenis kontaminan biologi. akteri S. aureusmerupakan salah satu jenis bakteri yangumum ditemukan di tanah. Pupuk hayatiyang dianalisis tidak mengandung S. aureus

sehingga bakteri ini digunakan sebagaipencemar (spike). Menteri Pertanian RI

(2009) menetapkan persyaratan tekniscemaran pupuk hayati untuk kontaminanEscherichia coli dan Salmonellasp. minimalnol pada pengenceran 10-3. Pada penelitianini cemaran S. aureus pada pupuk hayatisebesar kurang dari 10 pada pengenceran

10-2

. Dengan demikian pada pengenceran 10-3

diduga tidak dijumpai lagi cemaran S. aureus.

Spike adalah cemaran sebagai kontrolpositif yang telah diketahui dengan pastijumlah koloni/ml. Cemaran S. aureusdipilihmenjadi bakteri pencemar karena bakteri ini

dapat diisolasi dari tanah rhizospher pada

gandum. Bakteri ini dapat dimanfaatkan


13/16

5

sebagai mikrob pendegradasi anilin di tanah(Ahmed 2010).

Dari kontrol positif diketahui bahwamikrob cemaran yang ditambahkan ke dalampupuk sebesar 315 cfu/mL. Konsentrasi ini

tidak menunjukkan jumlah yang samadengan konsentrasi sumber cemaran yang

ditambahkan pada sampel positif. Hal inimengindikasikan bahwa spike konsentrasicemaran pada saat diuji sukar dijaga untuktetap konstan jumlah selnya. Meskipun spike

yang sudah ditetapkan konsentrasinyadisimpan dalam lemari pendingin 10C. Pada

penelitian ini, dilakukan 7 kali ulangan danlebih besar dari jumlah ulangan yangdianjurkan oleh Harmita (2004) yaitu palingsedikit 6 kali. Keterulangan digunakan untukmeningkatkan ketelitian percobaan dan

mengendalikan ragam galat. Untuk bahanyang sudah terdeskripsi secara jelas sepertipupuk buatan maka diperlukan ulangan yangkecil.

Metode analisis cemaran S. aureuspada pupuk hayati memperlihatkan nilaisimpangan baku relatif yang telah memenuhi

kriteria yang ditetapkan oleh AOAC (2005)untuk dapat disebut sebagai metode yang

menghasilkan ketelitian cukup baik, yaitudengan nilai SBR (0,20 dan 0,19) < 2/3Horwitz (0,84 dan 0,78) (Tabel 1).

Presisi merupakan kedekatan di antara

beberapa individu hasil pengujian oleh analisyang sama pada kondisi sama dan dalam

interval waktu yang pendek (intraday)(Harmita 2004). Presisi untuk uji cemaranmikrob diukur dengan melihat kandungancemaran yang ada dalam sampel, membuat

cemaran dan memberi cemaran pada sampel.Setelah uji presisi maka dapat

dilanjutkan dengan uji akurasi. Metodeanalisis S. aureus memberikan persenperolehan kembali sebesar 172,34 %.Artinya, metode ALT yang digunakan untukmenghitung jumlah sel S. aureus dalam

kontrol positif dan sampel positif dapatmenunjukkan jumlah sel S. aureus denganketepatan rata-rata sebesar 172,34 % dari

jumlah sel terhitung pada kultur awal.Berdasarkan nilai perolehan kembali

ketetapan EPA (2005) yaitu 48-291% makametode analisis S. aureus telah memenuhi

batas penerimaan EPA. Hal ini dapatdikatakan bahwa metode analisis cemaran S.

aureuspada pupuk hayati dapat diterapkan dilaboratorium IPBCC berdasarkankeakuratannya. Menurut Harmita (2004)akurasi sangat tergantung pada sebaran galat

sistematik di dalam keseluruhan tahap

analisis. Oleh karena itu untuk mencapaikecermatan yang tinggi hanya dapatdilakukan dengan cara mengurangi galatsistematik tersebut seperti menggunakan

peralatan yang telah dikalibrasi,

menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik,pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yangcermat, taat asas sesuai prosedur. Padapenelitian ini metode pengambilanhomogenasi dengan pipet mikro terganggu

oleh partikel pupuk yang menggunakanbahan pembawa gambut yang tidak larut,sehingga mengganggu kecermatan.

Berdasarkan uji T diketahui bahwadari ketujuh data sampel positif S. aureusyang diperoleh, terdapat dua data yangberbeda nyata dengan uji T pada taraf =

0,05, yaitu pada ulangan ke-2 dan ke-3 yaitu

650 cfu mL-1. Hasil yang berbeda nyata inimenunjukkan bahwa metode ALT yang

digunakan untuk menghitung sel S. aureuspada pupuk hayati memiliki keragaman data

pada taraf = 0,05.Analisis beda nyata yang dilakukan

menunjukkan bahwa nilai P pada data hasilanalisis S. aureussebesar 0,002. Nilai P yangdiperoleh menunjukkan bahwa ketujuh dataanalisis yang didapat berbeda nyata pada

taraf sebesar 0,05. Keragaman data yangdimaksud adalah selisih jumlah sel padaulangan yang satu dengan ulangan yang

lainnya. Nilai simpangan baku (SB) yangdiperoleh akan menunjukkan keragaman datayang diperoleh. Nilai SB juga akan

membentuk selang data. Selang data yangterdiri atas batas bawah dan batas atas akan

menentukan data-data yang berbeda nyatapada taraf = 0,05.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Validasi metode analisisStaphylococcus aureus pada pupuk hayati

dengan menggunakan SNI 2332.9:2011 yaituCara Uji Mikrobiologi-Bagian 9: PenentuanStaphylococcus aureus pada produkperikanan dapat memenuhi kriteria presisi

dan akurasi yang memenuhi kriteria sebagaimetode uji sampel pupuk hayati. Metode inidapat diterapkan sebagai metode standard ujidi laboratorium IPB Culture Collection.

Saran

Penyimpanan spike pada kondisilingkunngan yang baik perlu dicari agar

jumlah mikrob dalam spike relatif konstan.

Uji ketertiruan untuk parameter ketelitian


14/16

6

perlu dilakukan agar dapat diketahuipengaruh dari kerja analis, kondisi instrumendan waktu analisis yang berbeda dalamlaboratorium yang sama maupun berbedaterhadap hasil akhir. Perlu juga dilakukan

pembuatan formulasi pupuk dengan cemaranterlebih dahulu sebelum dianalisis.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed S et al. 2010. Isolation andcharacterization of a bacteria strainfor aniline degradation. Afr J

Biotechnol9:1173-1179.

[AOAC] Association Official of AnalyticalChemistry. 2005. Official Method ofAnalysis. Washington DC: AOAC.

[BPOM RI] Badan Pengawas Obat danMakanan Republik Indonesia. 2008.Pengujian mikrobiologi pangan.Jakarta: Badan POM RI.

[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2008a.Pelatihan Audit Internal Sistim

Manajemen Mutu Laboratorium.Jakarta: BSN.

[BSN] Badan Standar Nasional. 2008b.

Metode pengujian cemaran mikrobdalam daging, telur dan susu, serta

hasil olahannya. Jakarta: BSN;(Standard Nasional Indonesia2897:2008).

[BSN] Badan Standardisasi Nasional. 2011.Cara uji mikrobiologi - bagian 9:

penentuan Staphylococcus aureuspada produk perikanan. Jakarta:BSN; (Standard Nasional Indonesia2332.9:2011).

[EPA] Environmental Protection Agency.2005. Manual for the Certificationof Laboratories Analyzing DrinkingWater: Criteria and Procedurer

Quality Assurance. Edke-5. Ohio:

US International Protection AgencyOffice of Water.

Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasimetode dan cara perhitungannya.Majal Ilm Kefarm 1:117-135.

[ISO] International Organization forStandardization. 2008. Persyaratanumum kompetensi laboratorium

pengujian dan laboratoriumkalibrasi. Jakarta: ISO; (SNIISO/IEC 17025:2008 (klausul

5.4.5.1 dan 5.4.5.2).

Menteri Pertanian Republik Indonesia. 2009.

Peraturan Menteri Pertanian28/Permentan/SR.130/5:2009Tentang Pupuk Organik, PupukHayati dan Pembenah Tanah.Jakarta: Menteri Pertanian RI.

Saefuddin A, Notodiputro KH, Alamudi A,

Sadik K. 2009. Statistika Dasar.Jakarta: PT Grasindo.

Simanungkalit RDM, Suriadikarta DA,

Saraswati R, Setyorini D, Hartatik

W. 2006.Pupuk Organik dan Pupuk

Hayati. Bogor: Balai Besar

Penelitian dan Pengembangan.


15/16

LAMPIRAN


16/16

8

Lampiran 1 Pembuatan Pereaksi Media BPA dan BPB

1. Larutan media baird parker agar(BPA) menurut SNI 2332.9:2011BPA sintetik 60 gAquades 1 L

Egg Yolk 50 mLLarutan BPA dan aquades tersebut dididihkan. Setelah itu disterilisasi pada suhu 121 C selama

15 menit. Media didinginkan hingga suhu 45 C kemudian ditambahkan egg yolk.

2. Larutan butterfields phosphate buffered (BPB)menurut SNI 2332.9:2011Larutan stok

KH2PO4 34 gAquades 500 mL

pH larutan diatur 7,2 dengan menggunakan 1 N NaOH. Volume larutan ditepatkan hingga1000 mL dengan penambahan aquades. Setelah itu disterilisasi pada suhu 121 C selama 15

menit. Larutan stok disimpan dalam refrigerator. Cara membuat larutan kerja yaitu sebanyak10 mL larutan stok diambil dan ditepatkan hingga 1000 mL dengan penambahan aqudes.

Kemudia larutan disterilisasi pada suhu 121 C selama 15 menit.

val. metode cemaran s. aureus

Documents