Uji Potensiasi KokainI.

PENDAHULUAN Uji toksiksitas merupakan bagian dari toksikologi, adapun toksikologi

sendiri didefinisikan sebagai ilmu yang mempelajari aksi berbahaya zat kimia atas sistem biologi (Loomis, 1978). Menurut Cassaret dan Doull (2001) mendifinisikan toksikologi sebagai ilmu yang mempelajari berbagai pengaruh zat kimia yang merugikan atas sistem biologi sedangkan menurut Loomis (1978), toksikologi didefinisikan toksikologi sebagai ilmu yang mempelajari interaksi zat kimia dan sistem biologi. Uji toksiksitas dapat digolongkan menjadi 2 golongan yaitu uji toksiksitas khas dan uji toksiksitas tidak khas. Uji toksiksitas tidak khas adalah uji toksiksitas yang dirancang untuk mengevaluasi keselurahan efek toksik suatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji. Dimana yang termasuk uji toksiksitas tidak khas adalah toksiksitas akut, toksiksitas subkronis, dan uji toksiksitas kronis. Sedangkan yang dimaksud dengan uji toksiksitas khas adalah uji yang dirancang untuk mengevaluasi secara rinci efek khas suatu senyawa pada aneka ragam hewan uji. Dimana yang termasuk uji toksiksitas khas adalah uji potensiasi, uji karsinogenik, uji kemutagenikan, uji keteratogenikan, uji reproduksi, uji kulit, dan uji perilaku (Donatus, 1990). Potensiasi hampir mirip dengan sinergis seperti memiliki efek toksik sama jika diberikan bersama. Ketika suatu senyawa diberikan ada suatu mekanisme senyawa suatu mengurangi efek dari senyawa yang lain (antagonis) ayau malah menambah efek dari senyawa yang lain ( agonis) (Timbrell, 2009) AIDS atau sindrom immunodefisiensi adalah gangguan

multisistem melibatkan sistem saraf pusat (SSP). Human immunodefi ciency virus tipe 1 (HIV-1) menginfeksi otak pusat sampai ke batas komplikasi neurodegenerative, sering disebut sebagai HAND. Kebanyakan bentuk sederhana HAND, HIV-associated dementia (HAD), merupakan karakteristik dari neuropatologi berubah yang termasuk astrositosi reaktifMakalah Uji Potensiasi Kokain 1

dan pembentukan mikroglial nodules dan sel multinukleat besar dalam pengaturan untuk meningkatkan replikasi virus dan/atau aktivasi seluler. Meskipun liposit CD4 dan mikroglia/makrophages mertupakan target utama sel untuk infeksi HIV-1, infeksi terbatas juga pada pengamatan daalm astrocytes (Yang, 2010) Melihat dari bukti yang menyatakan bahwa obat-penyalahgunaan seperti kokain dapat mempercepat kejadian dan meningkatkan HAD. Untuk contoh, penyalahgunaan obat HIV-1-positif individu memperlihatkan beberapa kerusakan kognitif sederhana dibandingkan

dengan non-obat. Dalam kenyataannya konsep menyatakan bahwa psikostimulan seperti kokain dapat memiliki efek mengantuk pada akseptibilitas pada sel neuronal HIV-1 virotoksik. Walupun demikian, apakah kokain juga dapat berpotensi berefek toksik pada HIV-1 gp 120 pada sisa astrocites yang tidak bersih (Yang, 2010) Dalam penelitian saat ini, kita menghipotesis bahwa meningkatnya kemajuan dan insiden HAD-associated astrocit sel mati dalam penyalahgunaan obat infeksi-HIV setipa individu dapat disebabkan oleh potensi dari kokain gp 120-induksi apoptosis (Yang, 2010)

II.

TUJUAN Tujuan dalam penelitian ini adalah membedah dan menemukan signal pathway yaitu c-jun N-terminal kinase (JNK), p38 dan ekstraseluler signal-regulated kinase (ERK)/ mitogen-aktivasi protein kinase (MAPK) pathway dan faktor transkripsi NF-Kb, menuntun kokain dan gp 120menegahi apoptosis pada astrocites.

Makalah Uji Potensiasi Kokain

2

III.

PRINSIP METODE PENGUJIAN Prinsip uji potensiasi kokain pada penelitian ini dengan menggunkan uji MTT, Immunositokimia, Pengujian Reactive Oxygen

Species (ROS), Analisis Depolarisasi Membrane Mitokondria, Western Blotting.

IV.

HEWAN UJI Tikus betina yang hamil tipe Sprague Dawley yang dibeli dari Charles

River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA). Semua hewan ditempatkan dalam kondisi suhu yang konstan dan kelembaban pada 12 jam cahaya, 12 jam siklus gelap, dengan lampu menyala pada 0700 h. Makanan dan air tersedia ad libitum. Semua prosedur hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Kelembagaan Perawatan Hewan dan Komite Penggunaan Universitas Nebraska Medical Center dan Institut Kesehatan Nasional.

V.

ALAT DAN BAHAN Alat : Inkubator, Fluorescence, Mikroscop fluorescence, Fluorescence plate reader, NIH Image J. Software, Alat gelas, Cawan petri, vortex, Seperangkat alat computer, Peralatan pendeteksi potensial membrane, Peralatan mamalian Cell lysiskir, Peralatan ekstraksi NEPER nuklear &Cytoplasma.

Bahan : Fosfat buffer saline (PBS), MAPK/ ERK Kinase (MEK)

1/2 inhibitor 126, P38 Inhibitor sb203580, JNK Inhibitor sp600 125, (NF)-kB inhibitor l-1-tosyllamide-2-phenylethyl chloromethyl ketone, 10% fetal bovin serum, 100 U/ml penicillin dan 100 mg/ml

Makalah Uji Potensiasi Kokain

3

streptomycin, Dimetil sulfoksida, 4% paraformal dehid, DCF DA, Potensial membran mitokondria, Gel poliakrilamid

VI.

DOSIS

Konsentrasi kokain (1, 10, 100 mM) dengan atau tanpa gp120 IIIB (200 ng /

ml) selama 48 jam Paparan sel untuk 1 mM kokain mengakibatkan pengurangan viabilitas sel sebesar 18%; sedangkan paparan sel dengan gp120 saja mengakibatkan penurunan viabilitas sel sebesar 20%, dan paparan sel dengan keduanya (gp120 dan kokain) bersama-sama menyebabkan penurunan signifikan secara statistik pada kelangsungan hidup sel sekitar 29%. Kokain (10 mM) dan / atau gp120 IIIB (200 ng / ml) selama 24 jam Kokain dan / atau gp120 selama 24 jam

Pengobatan astrosit dengan kokain atau gp120 saja mengakibatkan peningkatan produksi ROS intraseluler menjadi 161% dan menjadi 148% dengan menggunakan kokain dan gp120. Kokain dan / atau gp120 selama 18 jam

Diuji untuk potensial membran mitokondria dengan pewarnaan dengan JC1 pewarna. Pengobatan dengan cocain / gp120 mengakibatkan pengurangan agregasi dari JC-1 pewarna di dalam mitokondria (fluoresensi merah) dan penurunan rasio agregat (fluoresensi merah) untuk monomer JC-1 (hijau fluoresensi) dalam sel. Bar Skala menunjukkan 200 mm. Kuantifikasi Dym dinyatakan sebagai rasio dari J-agregat untuk JC-1 monomer (merah: hijau) fluoresensi intensitas.

Makalah Uji Potensiasi Kokain

4

Kokain (10 mM) dan / atau gp120 IIIB (200 ng / ml) atau panas tidak aktif

gp120 IIIB diperlakukan sel (15 menit)

VII.

PROSEDUR/TATA LAKSANA PENGUJIAN

Reagen virus Gp120, alasan untuk memilih gp120 IIIB didasarkan pada pemanfaatan CXCR4 co-reseptor pada astrosit. Kuantifikasi gp120 dalam SSP atau CSF sulit karena reaktivitas silang terbatas antigp120 Abs. Relevansinya menggunakan 200 ng / ml (atau 1670 pM) dari gp120 dalam penelitian ini didasarkan pada laporan bahwa nilai 796 ng / ml gp120 telah terdeteksi dalam HIV-infected selama infeksi awal dan selanjutnya , bahwa konsentrasi juga telah digunakan dalam laporan sebelumnya untuk toksisitas saraf oleh orang lain.

Kultur Primer astrosit. Astrosit primer tikus, jaringan dari seluruh otak postnatal (P1-P2) Sprague-Dawley tikus triturated dan sel yang dikultur pada poli-Dlisin pra berlapis termos kultur sel dalam medium Dulbecco yang dimodifikasi mengandung 10% bovin serum, 100 U / ml penisilin dan 100 g / ml streptomisin. Kultur dipertahankan pada 37uC dalam suasana lembab udara 5% CO2/95%. Setelah mencapai konfluen monolayer sel glial (10-14 hari), mikroglia dipisahkan dari astrosit dengan shaking off. Astrosit >96% positif untuk protein asam glial yang berhubung dengan urat saraf ketika dinilai dengan pewarnaan immunocytochemical.Makalah Uji Potensiasi Kokain 5

Uji MTT. Viabilitas sel diukur oleh metode MTT 3 - (4,5-dmethylthiazol-2il) -2,5-difenil tetrazolium bromida . Secara singkat, sel dikumpulkan dan dipilih di 96-well plate. Perbedaan kepadatan penyemaian dioptimalkan pada awal percobaan. Astrosit tikus utama yang terkena media segar yang mengandung berbagai konsentrasi kokain (1, 10, 100 M) dengan atau tanpa 200 ng / ml gp120. Setelah inkubasi selama 48 jam, 20 ml MTT tetrazolium garam dilarutkan dalam larutan garam yang seimbang pada konsentrasi akhir dari 5 mg / ml ditambahkan ke masing-masing baik dan diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 4 jam. Akhirnya, medianya sudah disedot dari setiap ml dengan baik dan 200 dari sulfoksida dimetil ditambahkan untuk melarutkan kristal formazan dan absorbansi baik masing-masing diperoleh menggunakan plat uji counter dan pada panjang gelombang masing-masing 570 nm dan 630 nm. Semua percobaan diulangi setidaknya empat kali.

Immunositokimia1.

Sel yang berada dalam 4% paraformaldehid, kemudian di dengan PBS (phosphate-buffered saline) yang

blocking

mengandung 10% serum normal kambing2. 3. 4.

Sel diinkubasi pada suhu 4oC selama satu malam Lalu lakukan pencucian Kemudian sel diinkubasi dengan kambing anti kelinci

sekunder Alexa Fluor 488 yang terkonjugasi dengan antibodi (1:500)

Makalah Uji Potensiasi Kokain

6

5.

Untuk kontrol negatif, diberi perlakuan yang sama seperti

diatas kecuali perlakuan terhadap antibodi primer6.

Semua percobaan diatas dilakukan kurang lebih 3x

Pengujian Reactive Oxygen Species (ROS)1.

Produksi intraseluler ROS diukur dengan menggunakan

oksidasi 29,79-diklorfluoresein diasetat (DCFH-DA).2.

Astrosit primer diberi kokain gp120 selama 1 jam dan

diinkubasi dengan DCFHDA pada 20 M selama 30 menit3.

Sel dicuci dengan PBS dan segera divisualisasi dengan

fluoresensi pada panjang gelombang 485 nm untuk eksitasi dan 530 nm untuk emisi menggunakan mikroskop fluoresensi balik4.

Total intensitas fluoresen hijau

dalam setiap sumuran

dihitung menggunakan perangkat lunak NIH Image J5.

Semua percobaan ini dilakukan kurang lebih 3x

Analisis Depolarisasi Membrane Mitokondria1.

Perubahan potensial membrane mitokondria pada astrosit

dimonitor menggunakan peralatan pendeteksi potensial membran mitokondria2.

Kultur astrosit tikus primer dibiakkan baik pada 24 sumuran

dan juga 96 sumuran lalu diberi gp120 dan kokain3. 4. 5.

Sel kemudian dibilas 1x dengan buffer Warna yang dihasilkan kemudian di uji Fluoresensi juga diukur menggunakan pembaca fluoresensi

sumur FL600 pada panjang gelombang eksitasi 485 nm dan 535 nmMakalah Uji Potensiasi Kokain 7

6.

Intensitas fluoresen dihitung menggunakan perangkat lunak

NIH Image J7.

Lakukan percobaan ini kurang lebih 3x

Western Blotting1.

Sel dilisis menggunakan peralatan Mammalian Cells Lysis,

NEPER Nuclear dan peralatan ekstraksi sitoplasma2.

Sejumlah

protein

yang

didapatkan

kemudian

dielektroforesis dalam gel poliakrilamid natrium deodesil sulfat3.

Noda kemudian diblok dengan 5% susu kering tanpa lemak

dalam PBS dan di-probe dengan antibodi yag dikenali4.

Lakukan

pendeteksian

sinyal

menggunakan

kemiluminesense

Analisis Statistik Data ditampilkan sebagai nilai rata-rata tengah SD. Perbedaan antar kontrol yang signifikan dan sampel yang diberi kokain ditentukan dengan uji ANNOVA. Nilai p