Marlia Singgih WibowoMarlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy ITBSchool of Pharmacy ITB

UJI EFEKTIVITAS UJI EFEKTIVITAS PENGAWET PENGAWET

ANTIMIKROBAANTIMIKROBA

DEFINISIDEFINISI

Pengawet Antimikroba: Zat yang ditambahkan pada sediaan obat untukmelindungi sediaan terhadap kontaminasimikrobaPengawet digunakan terutama padawadah dosis ganda untuk menghambatpertumbuhan mikroba yang dapat masuksecara tidak sengaja selama atau setelahproses produksi

• Zat antimikroba tidak boleh digunakansemata-mata untuk menurunkan jumlahmikroba viabel sebagai pengganti caraproduksi yang tidak baik

• Ada keadaan yang memerlukanpenggunaan pengawet untuk menekanperkembangbiakan mikroba

Setiap zat antimikroba dapat bersifatpengawet, meskipun demikian semua zatantimikroba adalah zat yang beracunUntuk melindungi konsumen secaramaksimum pada penggunaan harusdiusahakan agar pada kemasan akhir kadarpengawet yang masih efektif lebih rendahdari kadar yang dapat menimbulkankeracunan pada manusia

ContohContoh pengawetpengawet

Faktor Yang MempengaruhiAktivitas Pengawet

pHKeberadaan fasa non akuatik padasediaanAdsorpsi solid dalam suspensiAdsorpsi pada kemasan plastik

TujuanTujuan ujiuji efektivitasefektivitas pengawetpengawet

Menunjukkan efektivitas pengawetantimikroba yang ditambahkan padasediaan dosis ganda dengan dasar ataubahan pembawa air yang dicantumkanpada etiket.

Contoh: produk parenteral, tetestelinga, hidung, dan mata

SyaratSyarat pengujianpengujian

Pengujian dan Persyaratan hanyaberlaku pada produk di dalam wadahasli, belum dibuka, dan didistribusikanpada produsen

MIKROBA UJI

Candida albicans Dapat bersifat oportunistikmenyebabkan infeksi oral dan infeksi vagina padamanusia

Hidup sebagaimikroorganisme comensaldalam tubuh manusia

Candida albicans : mikroorganisme fungi golongan ragi (yeast)

ATCC No. 10231

MIKROBA UJI

Aspergillus niger

Aspergillus niger adalahfungi berfilamen

Bila sejumlah spora terhirupmasuk ke paru-paru, dapatmenyebabkan penyakit paru-paru aspergillosis

Penyebab otomycosis

ATCC No. 16404

MIKROBA UJI

Escherichia coli

Bakteri yang hidup dalamusus mamalia

bakteri aerob dan facultative anaerobic, non-spore-forming, Gram-negative, rod-shaped. Fermentasi laktose danmenghasilkan gas dalam waktu48 jam pada 35 °C (95 °F)

Penyebab infeksi salurankemih, dan diareATCC No 8739

MIKROBA UJI

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa adalahbakteri Gram-negative, aerob, rod-shaped dan bergerak unipolar

P. aeruginosa biasanyamenginfeksi saluran pernapasan, saluran kemih, luka bakar, danluka lainnya

ATCC No 9027

MIKROBA UJI

Staphylococcus aureus

S. aureus adalah bakterigram-positif merupakanbakteri yang berwarnakuning keemasan

Merupakan baktericommensal pada kulitmanusia, di dalam hidung, usus dan urin (kira-kira 25% dari populasi)

Menyebabkan penyakit kulit(Staphylococcal scalded skin syndrome )ATCC No 6538

Media yang Media yang digunakandigunakan

Soybean-Casein Digest Agar Medium (SCDA) dengan komposisi sbb :

Digesti pankreatik kasein P 15 gDigesti papain tepung kedele P 5 gNatrium klorida P 5 gAgar P 15 gAir ad 1000 mlpH setelah sterilisasi ~ 7,3

PembuatanPembuatan inokulainokula

Sebelum pengujian, inokulasi permukaanmedia agar bervolume sesuai denganbiakan persediaan segar mikroba yang digunakanInkubasi (bakteri : 30-35ºC 18-24 jam, Candida: 20-25ºC 48 jam, Aspergillus: 20-25ºC 1 minggu)

PanenPanen mikrobamikroba

Larutan NaCl steril 0,9%

cuci permukaanpertumbuhan

Hasil cucian dimasukkanke wadah yang sesuai

Encerkan dengan NaClsteril 0,9% sampai angka

mikroba ~100 juta/mL

Candida dan bakteri Aspergillus niger

NaCl 0,9% steril yang mengandung

polisorbat 80 P 0,05%

ALTERNATIF

Mikroba ditumbuhkan pada media cair yang sesuai

Panen sel dengansentrifugasi

Pelet dicuci dandisuspensikan kembali

dengan larutan NaCl 0,9% steril hingga mencapai

angka mikroba dan sporayang dikehendaki

TURBIDIMETRI

Suspensi Bakteri :

Keruh pada jumlah lebih dari

107 /mL

Suspensi Ragi dan kapang :

Keruh pada jumlah 10-100 kali lebih rendah dari bakteri

Cfu/ml x 10 8

OD pd 420 nm

Metode Lempeng

1mL (~30-300 koloni)

Pipet ke dalam 2 cawan petri steril

Tambahkan 15-20 mL media SCDA bersuhu ~45 oC, campurkan

Inkubasi 48-72 jam, amatipertumbuhan koloni

Tetapkan CFU (Jumlah Satuan Pembentuk Koloni)/mL dari setiapsuspensi, gunakan untuk menentukan banyaknya inokula yang

akan digunakan pada pengujian

Jika suspensi yang telah dibakukan tidak segera digunakan, suspensidipantau secara berkala dengan metode lempeng angka mikroba aerob

total untuk menetapkan penurunan viabilitas

Untuk memantau angka lempeng sediaan uji yang telahdiinokulasi gunakan media agar yang sama seperti media

biakan awal

Jika tersedia inaktivator pengawet yang khas tambahkansejumlah yang sesuai ke dalam lempeng agar

PROSEDUR UJI EFEKTIVITAS

Inokulasi dengan salah satumikroba uji (0,1 mL/20 mLsediaan)

Jumlah mikroba 105 -106 /mL

Tetapkan jumlah mikroba viabel dalamsetiap suspensi inokula, Hitung angka

awal /mL sediaan dengan metode lempeng

Inkubasi pada 20-25 ºC

Amati pada hari 7,14, 21, 28

Catat tiap perubahan dan tetapkan jumlah mikrobaviabel dengan metode lempeng

Hitung perubahan jumlah tiap mikroba dalam % selama pengujian

PENAFSIRAN HASIL

Suatu pengawet dinyatakan efektif apabila:

Jumlah bakteri viabel pada hari ke 14 berkurang hinggatidak lebih dari 0,1% dari jumlah awal

Jumlah kapang dan khamir viabel pada hari ke 14 berkuranghingga tidak lebih dari 0,1% dari jumlah awal

Jumlah tiap mikroba uji selama hari tersisa dari 28 hari pengujian adalahtetap atau kurang dari bilangan yang disebut di atas

KRITERIA EFIKASI ZAT PENGAWET

Keterbatasan Metode Uji

Masalah Praktis

Prosedur Alternative

Future Development

KASUS KHUSUS

Thimerosal dalam Vaksin : kasus Autisme

FDA pada tanggal 1 Juli 1999 merekomendasikan untuk mulai

menurunkan atau menghilangkanthimerosal dari vaksin

Vaksin yang mengandung thimerosal : Engerix (vaksin hepatitis B), HibTITER(vaksin konjugat Haemophilus influenzaetipe b)