1

LAPORAN AKHIR

HIBAH BERSAING

UJI AKTIVITAS ANTIATEROSKLEROSIS ISOLAT ANDROGRAFOLID

DAN EKSTRAK TERPURIFIKASI HERBA SAMBILOTO

(Andrographis paniculata (Burm.f) Ness)

Tahun kedua dari rencana dua tahun

Drs. I Nyoman Kadjeng Widjaja, M.Si., Apt 0014115102

Ni Kadek Warditiani, S.Farm., M.Sc., Apt 0030108303

Luh Putu Febryana Larasanty, S.Farm., M.Sc., Apt 0022028401

UNIVERSITAS UDAYANA

November 2014

3

Uji Aktivitas Antiaterosklerosis Isolat Andrografolid dan Ekstrak Terpurifikasi

Herba Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness)

Ringkasan

Aterosklerosis merupakan kondisi terjadinya penyempitan pembuluh darah akibat adanya penempelan plak-plak lemak. Terjadinya penempelan lemak ini salah satunya disebabkan karena terjadinya oksidasi LDL sehingga timbul plak yang akan mudah menempel di pembuluh darah, selain itu juga karena makanan yang dikonsumsi kaya kolesterol. Salah satu produk hasil oksidasi LDL adalah malondialdehid. Jika kadar malondialdehid meningkat maka kemungkinan aterosklerosis disebabkan oleh terjadinya oksidasi LDL. Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness) merupakan tanaman obat yang memiliki khasiat menurunkan kadar lemak darah secara praklinik pada tikus. Andrografolid (diterpen lakton) merupakan salah satu senyawa yang terkandung dalam sambiloto yang diketahui bertanggung jawab terhadap aktivitas sebagai antiaterosklerosis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui mekanisme kerja isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dalam menurunkan kadara malondialdehid dan memperbaiki profil lipid dalam darah hewan uji. Sehingga dilakukan pengukuran kadar LDL (low density lipoprotein), kolesterol total, trigliserida dan malondialdehid pada tikus yang diinduksi aterosklerosis. Berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui bahwa isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dapat memperbaiki profil lipid (menurunkan kadar kolesterol total, trigliserida dan LDL dalam darah serta meningkatkan kadar HDL dalam darah) dan dapat menurunkan kadar malondialdehid dalam darah. Jika output yang diperoleh menunjukkan hasil yang positif, maka penelitian ini akan dilanjutkan dengan pembuatan sediaan obat tradisional sehingga dapat menutupi rasa pahit dari sambiloto untuk dapat dilakukan uji klinik. Sehingga luaran dari penelitian ini akan mengetahui mekanisme kerja isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dalam mengatasi penyakit aterosklerosis.

Kata kunci: sambiloto, aterosklerosis, andrografolid, ekstrak terpurifikasi, malondialdehid

4

DAFTAR ISI

hal

Cover ..................................................................................................................................

Lembar Pengesahan ............................................................................................................

Ringkasan ...........................................................................................................................

Daftar Isi ............................................................................................................................

BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ....................................................................................................

1.2 Tujuan Khusus ....................................................................................................

1.3 Urgensi ................................................................................................................

1.4 Rumusan Masalah ..............................................................................................

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sambiloto ............................................................................................................

2.2 Andrografolid .....................................................................................................

2.3 Aterosklerosis .....................................................................................................

2.4 Malondialdehid ...................................................................................................

BAB III TUJUAN DAN MANFAAT

3.1 Tujuan Penelitian ................................................................................................

3.2 Manfaat Penelitian .............................................................................................

BAB IV METODE

4.1 Alat dan bahan ....................................................................................................

4.2 Metode ................................................................................................................

4.3 Analisis data ........................................................................................................

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Hasil .........................................................................................................

5.2 Pembahasan ..............................................................................................

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan .........................................................................................................

6.2 Saran ...................................................................................................................

Daftar Pustaka ............................................................................................................

1

2

3

4

5

6

7

7

8

8

9

10

11

11

14

14

18

19

23

25

25

26

5

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia merupakan negara dengan biodiversitas (keanekaragaman hayati) terbesar di

dunia setelah Brazil. Biodiversitas tersebut meliputi ekosistem, jenis maupun genetik. Oleh

karenanya perlu dimanfaatkan secara optimal, salah satunya dalam hal pemanfaatan obat

bahan alam. Proses penemuan obat dari tanaman bukan merupakan proses yang mudah dan

membutuhkan jangka waktu yang lama. Proses tersebut meliputi: studi etnofarmakologi,

kemotaksonomi, skrining senyawa bioaktif, kemungkinan upaya sintesis senyawa tunggal,

studi pre-klinik maupun klinik, hingga produksi hingga skala besar untuk tujuan medik. Salah

satu tanaman obat yang baru dieksplorasi untuk dikembangkan sebagai obat

antihiperlipidemia adalah sambiloto atau Andrographis paniculata (Burm.f) Ness.

Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness) merupakan salah satu tanaman

yang efektif digunakan sebagai tanaman obat di Indonesia yang dimanfaatkan untuk tujuan

tersebut. Tanaman ini berasal dari India dan tersebar luas sampai Asia Tenggara termasuk

Indonesia. Penggunaan herba sambiloto sebagai obat mengandung sebagian besar metabolit

sekunder berupa diterpen, glikosida diterpenoid, lakton, flavonoid dan glikosida flavonoid.

Andrografolid merupakan salah satu senyawa diterpen lakton yang paling banyak terdapat

dalam herba sambiloto (Sundowo dkk., 2002). Ekstrak terpurifikasi herba sambiloto

merupakan ekstrak herba sambiloto yang mengalami proses fraksinasi untuk mengurangi zat

ballast dan meningkatkan zat aktif tertentu dengan tujuan untuk mendapatkan peningkatan

aktivitas farmakologi (Cannel, 1998).

Ekstrak air sambiloto memiliki kemampuan sebagai inhibitor enzim beta-hidroksi-beta-

metilglutaril koenzim A (HMG Co-A) reduktase pada hewan uji tikus sehingga mampu

menghambat pembentukan kolesterol pada hewan uji tikus (Patel dkk., 2011) dan ekstrak air

sambiloto dapat menurunkan lipid darah pada hewan uji tikus yang dibuat mengalami

hiperlipidemia (Zuraini dkk, 2006). Selain itu penggunaan ekstrak terpurifikasi herba

sambiloto dan isolat andrografolid dapat menurunkan lipid darah hewan uji tikus DM tipe 2

resisten insulin yang mengalami hiperlipidemia (Warditiani, 2012). Andrografolid mampu

mencegah terjadinya aterosklerosis dengan cara menghambat aktivitas ERK1/2, p38MAPK

dan NK-κB akibat dari terjadinya oksidasi LDL pada sel busa makrofag yang dilakukan

secara in vitro (Li dan Li, 2011). Kandungan neoandrografolid dalam fraksi etil asetat

6

sambiloto mampu menangkal radikal superoksida, sehingga ekstrak ini mampu beraktivitas

sebagai antioksidan (Kamdem, dkk., 2002). Berdasarkan penelitian tahun pertama, bahwa

isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto memiliki aktivitas sebagai

antiaterosklerosis sehingga sekarang ingin dilakukan uji penurunan kadar kolesterol total,

LDL, trigliserida dan malondialdehid pada tikus yang diinduksi aterosklerosis. Penelitian

untuk mengetahui mekanisme kerja andrografolid dan ekstrak terpurifikasi untuk mengatasi

aterosklerosis secara in vivo belum banyak dilakukan hanya andrografolid mampu terjadinya

oksidasi LDL pada sel busa makrofag yang dilakukan secara in vitro.

Aterosklerosis merupakan kondisi patologis yang melatarbelakangi terjadinya penyakit

vaskuler seperti serangan jantung koroner, stroke dan penyakit vaskuler lainnya yang

biasanya akan dapat menyebabkan kematian pada penderitanya. Studi epidemiologi

menunjukkan bahwa pola hidup yang tidak sehat (kurang olah raga atau aktivitas fisik,

istirahat tidak teratur dan mengkonsumsi makanan kaya lemak) meningkatkan terjadinya

aterosklerosis (Tedgui dan Ziad, 2006). Sehingga kondisi aterosklerosis merupakan suatu

silent killer yang patut diwaspadai oleh penderita hiperlipidemia.

Dalam memanfaatkan tanaman herbal Indonesia sebagai tanaman obat, maka dilakukan

penelusuran aktivitas farmakologi dari ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dan isolat

andrografolid (yang merupakan senyawa yang paling banyak terkandung dalam tanaman

sambiloto). Pada penelitan ini menggunakan rancangan acak pola searah in vivo. Uji aktivitas

antiaterosklerosis akan menggunakan uji secara in vivo. Metode uji antiaterosklerosis

dilakukan pada hewan uji tikus yang diinduksi mengalami aterosklerosis dengan memberikan

makanan kaya lemak. Sampai sekarang belum terdapat penelitian yang melakukan uji

aktivitas isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto untuk mencegah atau

mengobati penyakit aterosklerosis pada tikus yang diinduksi aterosklerosis dengan makanan

kaya lemak.

Dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah di bidang kesehatan,

khususnya untuk dunia kefarmasian. Selain itu penelitian ini menawarkan senyawa alternatif

yang bisa dikembangkan sebagai obat antiaterosklerosis.

1.2 Tujuan Khusus

Penelitian ini bersifat eksploratif dengan tujuan mempelajari aktivitas isolat

andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f)

7

Ness) dalam menurunkan kadar malondialdehid sebagai salah satu mekanisme kerja

pencegah atau mengobati penyakit aterosklerosis.

1.3 Urgensi (Keutamaan) Penelitian (pentingnya penelitian diusulkan)

Tanaman sambiloto atau Andrographis paniculata (Burm.f) Ness merupakan salah satu

tanaman yang tersebar luas di Indonesia. Ekstrak air tanaman ini dilaporkan mampu

menghambat aktivitas enzim HMG co-A reduktase, sehingga jumlah kolesterol yang

terbentuk akan berkurang. Daun sambiloto mempunyai kandungan andrografolid tertinggi (>

2,39 %). Andrografolid merupakan komponen kimia dalam tanaman sambiloto yang paling

aktif. Untuk memperoleh senyawa tersebut maka perlu dikakukan ekstraksi bertingkat dengan

menggunakan pelarut etanol, n-heksan, kloroform dan metanol. Selanjutnya dilakukan

pemurnian secara rekristalisasi. Dari penelitian sebelumnya diketahui bahwa ekstrak

terpurifikasi herba sambiloto dan isolat andrografolid memiliki aktivitas antihiperlipidemia

pada tikus DM tipe 2 resistensi insulin, sedangkan pada penelitian lainnnya andrografolid

dapat menghambat aktivitas ERK1/2, p38MAPK dan NK-κB akibat dari terjadinya oksidasi

LDL pada sel busa makrofag yang dilakukan secara in vitro. Oleh karena itu, pada penelitian

ini akan diuji aktivitas isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi sambiloto yang

berpotensi untuk mencegah atau mengobati aterosklerosis pada tikus yang mengalami

aterosklerosis dengan memberikan makanan kaya lemak. Pemilihan model hewan uji ini

karena lebih dapat mencerminkan kondisi aterosklerosis pada manusia.

1.4 Rumusan masalah

1. Apakah isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dapat menurunkan

kadar malondialdehid pada tikus yang diindukis aterosklerosis?

2. Apakah isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dapat menurunkan

kadar LDL, kolesterol total dan trigliserida pada tikus yang diinduksi aterosklerosis?

8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sambiloto

Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness) merupakan tanaman obat yang

banyak ditemukan di daerah Asia Tenggara yang memiliki rasa sangat pahit dan biasanya

digunakan untuk mengobati gangguan hati, gangguan lambung yang terjadi pada nak-anak,

nyeri pada usus, demam dan infeksi saluran pernafasan atas (Zhang, 2004; Mishra et al.,

2007). Dalam herba sambiloto terkandung metabolit sekunder yaitu diterpenoid, flavonoid

dan polifenol yang merupakan kandungan bioaktif utama (Rao et al., 2007). Sambiloto yang

diekstraksi dengan pelarut etanol dan metanol mengandung sejumlah senyawa aktif meliputi

lebih dari 20 senyawa diterpenoid dan lebih dari sepuluh senyawa flavonoid (Khisore et al.,

2003).

Berdasarkan hasil penelitian bahwa sambiloto memiliki beberapa aktivitas farmakologi.

Zhang, dkk., melaporkan bahwa ekstrak air sambiloto dapat menurunkan tekanan darah

sistolik pada tikus sehingga dapat berperan sebagai antihipertensi (Zhang, dkk., 1996). Isolat

andrografolid dan isoandrografolid yang terkandung dalam ekstrak etanol 85% sambiloto

menunjukkan memiliki kemampuan sebagai antiproliferatif lebih tinggi pada sel leukemia

manusia HL-60 dibandingkan senyawa diterpenoid lainnya dengan nilai IC 50 sebesar 9,33

dan 6,30 μM (Chen, dkk., 2008). Pemberian ekstrak etanol sambiloto secara peroral mampu

menurunkan kadar glukosa darah tikus diabetes yang diinduksi dengan streptozotocin (STZ).

Ekstrak sambiloto juga mampu menurunkan kadar trigliserida serum dan aktivitas hepatik

glukosa 6-fosfatase (G-6-Pase) (Zhang dan Tan, 2000). Andrografolid mampu cegah

terjadinya aterosklerosi dengan cara menghambat aktivitas ERK1/2, p38MAPK dan NK-κB

akibat dari terjadinya oksidasi LDL pada sel busa makrofag (Li dan Li, 2011).

2.2 Andrografolid

Andrografolid (C20H30O5) merupakan senyawa diterpenoid lakton yang paling banyak

terkandung dalam tanaman sambiloto. Andrografolid terkandung 4% dalam ekstrak herba

sambiloto, 0,8-1,2 % terkandung dalam ekstrak batang sambiloto dan 0,5-6 % terkandung

dalam ekstrak daun sambiloto (Cheung, et al., 2001; Pholphana, et al., 2004). Senyawa

diterpenoid lainnya yang terkandung juga dalam sambiloto adalah deoksiandrografolid,

9

neoandrografolid, 14-deoksi-11,12-dehidroandrografolid dan isoandrografolid (Cheung, et

al., 2001; Reddy, et al., 2003).

2.3 Aterosklerosis

Aterosklerosis merupakan kondisi patologis yang melatarbelakangi terjadinya penyakit

vaskuler seperti serangan jantung koroner, stroke dan penyakit vaskuler lainnya yang

biasanya akan dapat menyebabkan kematian pada penderitanya (Tedgui dan Ziad, 2006).

Pembentukan plak aterosklerosis pada dinding pembuluh darah diawali oleh terjadinya

oksidasi LDL (oxLDL) oleh spesies oksigen reaktif (ROS / reactive oxygen species).

Penyerapan oxLDL oleh makrofag melalui reseptor seperti CD36 dan SR-A menyebabkan

terjadinya transformasi makrofag menjadi foam cells yang kaya lipid. Beberapa penelitian

menyatakan bahwa terdapat hubungan antara NF-ĸB dengan aterosklerosis. NF-ĸB tersebar

pada sel-sel otot polos, sel endotelial dan makrofag mononuklear pada bagian lesi

aterosklerosis. Sehingga NF-ĸB sebagai target aksi obat antiaterosklerosis (Brand dkk.,

1996).

Gambar 1. Histopatologi aorta yang telah diwarnai dengan pewarna hematocylin-eosin.

Perbesaran 400X (aorta normal) di bawah mikroskop. Keterangan: A. Sinus subkapsular; B. Kapsul; C. Tunika adventitia; D. Tunika media; E. Vena; F. Lumen besar; G. Endotelium; H. Sel adiposa; I. Kapilari

2.4 Malondialdehid

Malondialdehid merupakan salah satu penanda terjadinya peroksidasi lemak. Pada

kondisi hiperlipidemia akan mengalami kenaikan kadar malondialdehid dalam serum. Salah

10

satu mekanisme terjadinya pembentukan plak lemak pada pembuluh darah yaitu dengan

terjadinya reaksi oksidasi LDL sehingga terbentuk ox-LDL yang akan mudah menempel pada

dinding pembuluh darah sehingga terjadi penebalan pembuluh darah. Jika terjadi reaksi

oksidasi LDL maka kadar malondialdehid akan mengalami peningkatan juga dalam serum

(Yang dkk., 2006).

11

BAB III

TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN

3.1 Tujuan penelitian

1. Untuk mengetahui aktivitas isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto

untuk menurunkan kadar malondialdehid pada tikus yang diindukis aterosklerosis.

2. Untuk mengetahui aktivitas isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto

untuk menurunkan kadar LDL, kolesterol total dan trigliserida pada tikus yang diinduksi

aterosklerosis.

3.2 Manfaat penelitian

1. Dapat memberikan informasi bahwa isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba

sambiloto sebagai antiaterosklerosis dengan cara menurunkan kadar malondialdehid

yaitu dengan mencegah terjadinya oksidasi LDL.

2. Memberikan informasi kepada industrial kefarmasian untuk dapat dikembangkan

menjadi sebuah produk fitofarmaka yang dapat mengatasi penyakit ateroskelrosis, serat

penyakit vaskuler pada umumnya.

12

BAB IV

METODE PENELITIAN

Skema 1. Jalannya penelitian secara garis besar

Ilmiah

- Ekstrak air sambiloto ( Patel dkk., 2010) :

dapat menurunkan kadara lipid dalam

darah serta memiliki aktivitas

penghambatan enzim HMG co-A

- Ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dan

isolat andrografolid mampu menurunkan

kadar kolesterol, trigliserida dan LDL

darah pada tikus DM tipe 2 resistensi

insulin (Warditiani, 2012)

- andrografolid dapat menghambat

aktivitas ERK1/2, p38MAPK dan

NK-κB akibat dari terjadinya oksidasi

LDL pada sel busa makrofag yang

dilakukan secara in vitro (Li dan Li,

2011).

Senyawa kandungan :

andrografolid

Deoksiandrografolid,

neoandrografolid, 1,4-

deoksididehidroandrografolid,

dan homolog andrografolid

Andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto

sebagai antiaterosklerosis

Uji toksisitas ekstrak terpurifikasi sambiloto dan isolat andrografolid

Mekanisme kerja isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba

sambiloto dalam aktivitasnya sebagai antiaterosklerosis

Sudah dilakukan penelitian

Dilakukan pada tahun I

Dilakukan pada tahun II

Andrographis paniculata (Burm.f) Ness

Aktivitas antihipertensi isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi

herba sambiloto pada tikus aterosklerosis

13

Skema 2. Jalannya penelitian pada tahun kedua

Induksi tikus hewan uji menjadi aterosklerosis uji histopatologi

Determinasi herba sambiloto

Pembuatan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto

Isolasi andrografolid dari ekstrak terpurifikasi herba sambiloto

Pemberian ekstrak

terpurifikasi pada

aterosklerosis tikus

Pemberian isolat

andrografolid pada

aterosklerosis tikus

Pengambilan serum

Pengukuran kadar kolesterol total, trigliserida, LDL dan malondialdehid

Analisa hasil kesimpulan

14

4.1 Alat dan Bahan Penelitian

a. Alat penelitian:

Alat-alat yang digunakan adalah seperangkat alat isolasi senyawa tanaman meliputi:

kromatografi kolom, seperangkat alat KLT, lampu UV, HPLC (Shimadzu CLASS-

VP). Sedangkan untuk mengukur kadar glukosa dan lipid darah adalah: satu set

peralatan preparasi hewan uji (Surgical Suture, Bio-Dynamics, Germany), neraca

analitik elektrik (Chyo Jupiter C3-100 MD), stopwatch, komputer yang dilengkapi

piranti lunak Macbiophotonic image.

b. Bahan penelitian:

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba sambiloto yang diperoleh di

Desa Girimulyo, Kecamatan Nanggulan, Kabupaten Kulonprogo. Subjek uji

penelitian ini adalah tikus jantan Wistar dewasa (umur 4-6 minggu) dengan berat

badan 200-300 gram, diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi,

Fakultas Farmasi, Universitas Brawijaya.

Bahan penelitian yang digunakan meliputi alkohol 90%, kloroform p.a, metanol,

metanol p.a, n-heksan, etil asetat, matanol untuk HPLC, silika gel, karboksi metil

selulosa atau CMC-Na kualitas farmasetis, vitamin D (Daichi, Korea).

4.2 Metode penelitian

a. Determinasi tanaman

Determinasi herba sambiloto (A. paniculata (Burm.f) Ness) dilakukan di

Laboratorium Analisis Kandungan Tumbuhan Obat, Bagian Biologi Farmasi Fakultas

Farmasi UGM sesuai dengan buku Flora of Java (Backer dan van der Brink, 1965).

b. Pembuatan ekstrak terpurifikasi

Herba sambiloto dimaserasi dengan pelarut etanol 90% selama 1 hari, kemudian

dilakukan remaserasi selama 1 hari. Etanol 90% yang terdapat di dalam maserat

diuapkan untuk mendapatkan ekstrak kental etanolik. Kemuadian lakukan fraksinasi

dengan n-heksan untuk menghilangkan senyawa seperti lilin, klorofil yang terkandung

di dalam ekstrak etanolik. Bagian yang tidak larut dalam n-heksan difraksinasi

kembali dengan pelarut etil asetat. Bagian yang tidak larut dalam etil asetat

difraksinasi kembali dengan air panas. Bagian yang tidak larut dalam air panas,

dilarutkan kembali dengan etanol 90%. Kemudian uapkan pelarut etanol 90%

tersebut.

15

a. Isolasi andrografolid

Lakukan pemisahan secara kromatografi kolom pada esktrak terpurifikasi herba

sambiloto. Fase gerak yang digunakan adalah metanol p.a kemudian dilanjutkan

dengan menggunakan campuran kloroform:metanol (9:1). Fraksinasi dihentikan jika

fraksi yang diperoleh sudah berwarna hitam kecoklatan. Diamkan fraksi yang telah

diperoleh selama 24 jam dalam lemari pendingin hingga terbentuk kristal

andrografolid. Kristal andrografolid yang terbentuk masih mengandung senyawa

pengotor sehingga perlu dilakukan pencucian dengan menggunakan metanol p.a

dingin kemudian dilanjutkan dengan menggunakan n-heksan dingin.

Pemurnian isolat andrografolid terus dilakukan sampai mendapatkan kemurnian isolat

mencapai diatas 95%. Kemurnian isolat andrografolid dapat diketahui dengan

menguji menggunakan HPLC. Sedangkan untuk mengtahui kebenaran isolat

andrografolid, dapat diketahui dengan menggunakan alat FTIR, yang akan

membandingkan pola spektro IR standar andrografolid dan isolat yang diperoleh.

b. Pembuatan makanan kaya lemak

Hewan uji akan diberikan makanan kaya lemak untuk menaikkan kadar lemak dalam

darah. Makanan hewan uji akan dicampur dengan lemak babi (15%) dan kuning telur

bebek (5%). Jumlah kelompok hewan uji yang mendapatkan makanan kaya lemak

sebanyak 6 kelompok (kelompok kontrol positif, kelompok kontrol negatif, kelompok

isolat dosis I, kelompok isolat dosis II, kelompok ekstrak terpurifikasi dosis I,

kelompok ekstrak terpurifikasi dosis II). Masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor

tikus. Jumlah makanan yang dikonsumsi tikus akan diperhitungkan berdasarkan hasil

orientasi awal. Pembuatan pakan kaya lemak dilakukan setiap hari, karena pakan

dicampur dengan kuning telur bebek dan minyak babi, sehingga tidak tahan bila

dibuat untuk penggunaan lebih dari satu hari.

c. Pembuatan hewan uji menjadi aterosklerosis

Kondisi hewan uji yang diinginkan pada percobaan ini adalah menghasilkan hewan

uji (tikus) aterosklerosis yaitu terjadi penumpukan lemak pada dinding pembuluh

darah yang akan dilihat dengan uji histopatologi. Hewan uji dibuat mengalami

hiperlipidemia dan akhirnya mengalami ateroklerosis dengan cara induksi pemberian

pakan kaya lemak (lemak babi 15% dan kuning telur 5%) selama 60 hari yang

16

dikombinasikan dengan pemberian kalsium dan vitamin D3 dosis tinggi (Norman dan

Powell, 2005).

d. Pemeriksaan histopatologi organ aorta tikus

Organ tikus yang terdiri dari jantung dan aorta diambil pada hari terakhir perlakuan

untuk dibuat preparat histopatologi. Jantung dan aorta diambil dari jantung tikus

untuk pemeriksaan histopatologi. Jantung dan aorta tersebut difiksasi dalam larutan

formalin dan dikirim ke bagian Histopatologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah

Mada. Kemudian lakukan tahap pengambilan aorta dari jantung tikus, kemudian

diproses sesuai prosedur histopatologi yaitu dibuat dalam bahan blok, lalu dipotong

transversal ditengah dengan mikrotom setebal 5 mikron. Preparat dieltakkan di atas

gelas objek, diwarnai dengan haematocilin eosin (HE), ditutup dengan desk glass

kemudian ditutup dengan kanada balsem pada bagian tepinya. Preparat irisan aorta ini

siap untuk dilihat dengan mikroskop (Farmayuda, 2011).

e. Pengambilan serum

Sebelum diambil darahnya, tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 6-8 jam tetapi

tetap diberi minum. Darah tikus diambil sebanyak 2,0 mL melalui vena mata. Darah

disentrifugasi dengan kecepatan 4.000 rpm selama 5-10 menit. Kemudian diambil

bagian yang jernih dengan hati-hati untuk dianalisis selanjutnya.

f. Pengukuran kolesterol total, trigliserida, LDL dan malondialdehid

Pada tikus aterosklerosis, dilakukan juga pengukuran terhadap kadar trigliserida,

LDL, kolesterol dan malondiladehid pada hari ke 90. Pada penelitian ini akan

dilakukan pengukuran kadar LDL, trigliserida, kolesterol dan malondialdehid

berdasarkan nilai serapan yang diperoleh.

- Penetapan kadar kolesterol total

Ambil 10 μL serum sampel, kemudian ditambahkan dengan 1000 μL reagen

kolesterol. Kemudian dicampur dengan menggunakan vorteks. Setelah campur

dengan baik, inkubasi pada suhu kamar selama 20 menit. Absorbansinya dibaca

dengan spektrofotometer. Kadar kolesterol total dalam serum diperhitungkan dengan

membandingkan besarnya absorbansi sampel dan absorbansi standar dikalikan dengan

kadar standar kolesterol. Rumus yang digunakan untuk mencari kadar kolesterol total

dalam plasma adalah:

Kolesterol total (mg/dL) = ) = Absorbansi serum x kons. standar

Absorbansi standar

17

- Penetapan kadar trigliserida

Ambil 10 μL serum sampel, kemudian ditambahkan dengan 1000 μL reagen

trigliserida. pemudian dicampur dengan menggunakan vorteks. Setelah campur

dengan baik, inkubasi pada suhu kamar selama 20 menit. Absorbansinya dibaca

dengan spektrofotometer. Kadar trigliserida dalam serum diperhitungkan dengan

membandingkan besarnya absorbansi sampel dan absorbansi standar dikalikan dengan

kadar standar trigliserida. Rumus yang digunakan untuk mencari kadar trigliserida

dalam plasma adalah:

Trigliserida (mg/dL) = ) = Absorbansi serum x kons. standar

Absorbansi standar

- Penetapan kadar kolesterol LDL

100 μL serum sampel ditambahkan dengan 1000 μL reagen presipitan LDL, vorteks,

kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar, lalu disentrifus selama 20

menit dengan kecepatan 2500 rpm. Setelah selesai, ambil bagian atas sampel

sebanyak 100 μL, kemudian tambahkan reagen kolesterol 1000 μL. Absorbansinya

dibaca dengan spektrofotometer. Kadar kolesterol dalam supernatant serum

diperhitungkan dengan membandingkan absorbansi sampel terhadap absorbansi

standar kemudian dikalikan dengan kadar standar kolesterol. Rumus yang digunakan

untuk mencari kadar kolesterol dalam supernatan adalah:

Kolesterol total (mg/dL) = ) = Absorbansi serum x kons. standar

Absorbansi standar

Perhitungan untuk kolesterol LDL adalah dengan cara mengurangi kolesterol total

terhadap kolesterol dalam supernatan. Rumus yang digunakan untuk mencari kadar

kolesterol dalam supernatan adalah:

Kolesterol LDL = kolesterol total – kolesterol dalam supernatant

d. Penetapan kadar kolesterol Malondialdehid

Dilakukan pengambilan sampel serum sebanyak 100 µL, kemudian dimasukkan

kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 50 µL larutan TCA 10% dan 300 µL

akuadest lalu divorteks selama 1 menit. Selanjutnya larutan disentrifus pada

kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil

kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi lain dan ditambahkan1000 µL TBA

0,67%. Selanjutnya tabung dimasukkan kedalam penangas air pada suhu 95 - 100º

18

C selama 10 menit. Setelah itu tabung reaksi dikeluarkan dari penangas air dan

didinginkan. Hasil reaksi diambil kemudian diukur serapannya dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang maksimumnya 532 nm.

.

4.3 Analisis Penelitian

Pada penelitian ini, data yang dikumpulkan dalam bentuk serapan. Kemudian, nilai

serapan yang terkumpul diubah menjadi kadar lemak darah (mg/dl), dengan

menggunakan persamaan:

K = As/Ab x 100 mg%

Dimana: K = kadar senyawa yang diukur dalam darah (mg%);

As = serapan larutan sampel;

Ab = serapan larutan baku

Semua besaran yang digunakan pada analisis tersebut dinyatakan dengan X (rerata) ±

SEM (Standar Error of Means). Data yang diperoleh pada kelompok kontrol negatif dan

perlakuan (baik pada hewan uji kontrol positif dan hewan hiperlipidemia), dibandingkan

satu sama lain dengan menggunakan uji parametrik paired t test dan unpaired t test

dengan taraf kepercayaan 95%. Program statistik yang digunakan adalah perangkat lunak

SPSS (for Windows).

19

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Hasil

A. Ekstraksi Herba Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness)

Dilakukan ekstraksi herba sambiloto dengan menggunakan metode maserasi. 2 kg

serbuk herba sambiloto dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol 90% sebanyak 10 L

selama 2 hari. Selama proses maserasi, sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 2 hari proses

maserasi, dilakukan pemisahan maserat dengan ampasnya. Kemudian ampasnya diremaserasi

kembali selama 24 jam. Setelah 24 jam dilakukan pemisahan maserat dan ampasnya.

Kemudian dilakukan remaserasi kedua pada ampasnya selama 24 jam. Setelah 24 jam,

lakukan pemisahan maserat dan ampasnya. Kemudian dilakukan pengumpulan semua

maserat yang diperoleh sebanyak 15.200 mL. Ekstrak etanol herba sambiloto yang telah

diperoleh diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak

kental.

B. Pembuatan Ekstrak Terpurifikasi

Sebelum dibuat ekstrak terpurifikasi dalam jumlah banyak, perlu dilakukan penentuan

metode yang optimal untuk mendapatkan cara terbaik untuk mendapatkan ekstrak

terpurifikasi yang terbaik. Setelah diperoleh metode yang terbaik untuk mendapatkan ekstrak

terpurifikasi maka dilanjutkan dengan pembuatan ekstrak dalam jumlah yang besar. Ekstrak

etanolik yang sudah kental difraksinasi dengan pelarut n-heksan untuk mengurangi jumlah

klorofil dan lilin yang ikut teresktraksi dalam ekstrak etanolik. Fraksinasi dengan pelarut n-

heksan dihentikan setelah diperoleh fraksi n-heksan berwarna jernih. Fraksi yang tidak larut

n-heksan disisihkan dan dilanjutkan fraksinasi dengan pelarut etil asetat. Fraksi yang tidak

larut dalam etil asetat difraksinasi kembali dengan menggunakan air panas. Kemudian bagian

yang tidak larut dengan air panas disisihkan dan dilarutkan kemabil dengan etanol 90%,

inilah yang kita sebut dengan ekstrak terpurifikasi. Ekstrak terpurifikasi yang diperoleh

sejumlah 17,59 g.

C. Isolasi senyawa andrografolid

Berdasarkan hasil orientasi metode isolasi, maka diperoleh metode isolasi yang terbaik

yaitu dengan cara ekstraksi cair-cair dengan menggunakan pelarut etil asetat:n-heksan. Lalu

kristal yang diperoleh dilakukan rekristalisasi kembali dengan cara melarutkannya kedalam

pelarut metanol lalu didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC. kristal yang diperoleh

20

dipisahkan dari pelarut metanol untuk mendapatkan kristal yang bersih. Rendemen kristal

andrografolid yang diperoleh sebanyak 1%. Berdasarkan hasil pengukuran kemurnian isolat

andrografolid, diperoleh kandungan andrografolid dalam isolat andrografolid sebesar 89,7%.

Sedangkan untuk kandungan andrografolid dalam ekstrak terpurifikasi herba sambiloto

sebesar 31,6%.

D. Pemeliharaan Tikus Jantan Galur Wistar

Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan galus wistar.

Dilakukan pengkondisian tikus terlebih dahulu untuk menyesuaikan diri tikus terhadap

lingkungan yang baru. Pengkondisian lingkungan dilakukan selama seminggu. Selama

pengkondisian, tikus diberi pakan standar pellet.

E. Induksi Aterosklerosis pada Tikus Jantan Galur Wistar selama 75 hari

Setelah selesai dilakukan pengkondisian terhadap tikus. Untuk uji aktivitas kuratif

antiaterosklerosis esktrak terpurifikasi herba sambiloto dan isolat andrografolid, tikus dibagi

menjadi 7 kelompok yaitu kelompok normal, kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol

positif, kelompok ekstrak dosis 8 mg/kg BB, ekstrak dosis 24 mg/kg BB, isolat andrografolid

dosis 1,5 mg/kg BB dan isolat andrografolid dosis 4,5 mg/kg BB. Kelompok normal hanya

diberikan makanan biasa, sedangkan kelompok kontrol negatif, kontrol positif, ekstrak dosis

24 mg/kg BB, ekstrak dosis 72 mg/kg BB, isolat andrografolid dosis 6 mg/kg BB dan isolat

andrografolid dosis 18 mg/kg BB diberikan pakan kaya lemak (kuning telur 5% dan lemak

babi 15%) dan diberikan vitamin D3 (dosis 20.000 IU) dan kalsium. Induksi aterosklerosis

dilakukan dengan memberikan pakan kaya lemak selama 60 hari dan diberikan vitamin D3

dan kalsium setiap minggu sekali. Pemberian perlakuan (isolat andrografolid, ekstrak

terpurifikasi herba sambiloto dan atorvastatin) diberikan setelah 45 hari pemberian pakan

kaya lemak, vitamin D3 dan kalsium. Pemberian perlakuan dilakukan selama 30 hari.

Berdasarkan hasil pengamatan, diketahui bahwa induksi aterosklerosis selama 45 hari sudah

menunjukkan terjadinya perubahan (terdapatnya sel-sel busa dan adanya proliferasi otot polos

pada penampang aorta)

21

Berdasrkan gambar 2, terlihat adanya sel busa ( tanda ) dan adanya proliferasi otot

polos (tanda ). Hal ini menunjukkan bahwa sudah terjadinya perubahan bentuk pada

dinding aorta tikus karena adanya asupan pakan kaya lemak dan vitamin D3 dalam jumlah

berlebih. Timbulnya sel busa pada dinding aorta menunjukkan telah terjadinya oksidasi LDL.

Lambat laun sel busa akan berakumulasi dan menyebabkan terjadinya proliferasi otot polos.

Hal ini akan mengakibatkan terjadinya kekakuan dinding aorta yang menyebabkan elastisitas

pembuluh darah menurun. Pemberian kalsium juga akan menyebabkan teradinya kalsifikasi

pada dinding pembuluh darah. Hal ini juga akan memperburuk kejadian kekakuan pada

dinding pembuluh darah.

F. Pengukuran profil lipid dan malondialdehid dalam darah

Dilakukan pengukuran darah pada hari ke 45 setelah pemberian pakan kaya lemak,

vitamin D3 dan kalsium (hari ke 0 pemberian perlakuan); hari ke 60 pemberian pakan kaya

lemak, vitamin D3 dan kalsium (hari ke 15 setelah pemberian perlakuan) dan hari ke 75

pemberian pakan kaya lemak, vitamin D3 dan kalsium (hari ke 30 setelah pemberian

perlakuan). Dimana terjadi penurunan kadar malondialdehid setelah dilakukan pemberian

isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto. Terjadi penurunan kadar

kolesterol total dan trigliserida dalam darah serta terjadi peningkatan kadar HDL dalam

darah. Gambar 2 merupakan gambaran terjadinya penurunan kadar kolesterol total,

trigliserida dan peningkatan kadar HDL dalam darah.

Gambar 2. Histopat aorta tikus yang sudah diinduksi pakan kaya lemak, vitamin D3 dan

kalsium selama 45 hari

A B C

22

Gambar 3. Perubahan kadar kolesterol total, trigliserida dan HDL dalam darah dari hari ke-0,

ke-15 dan ke-30

Gambar 4. Perubahan kadar malondialdehid dalam darah dari hari ke-0, ke-15 dan ke-30

23

Gambar 5. Kadar lipid dalam darah kelompok tikus preventif

Berdasarkan gambar 5, bahwa isolat androgrfaolid dan ekstrak terpurifikasi herba

sambiloto dapat mencegah terjadinya kenaikan kadar lipid dalam darah dan kadar

malondialdehid dalam darah. Hal ini selaras dengan kemampuan andrografolid dalam

menurunkan kadar lipid pad tikus yang terlebih dahulu sudah diinduksi aterosklerosis.

5.2 Pembahasan

Pemberian pakan kaya lemak, vitamin D3 dan kalsium selama 45 hari telah mampu

menyebabkan perubahan kadar lipid dalam darah (kolesterol total, trigliserida) meningkat dan

HDL dalam darah menurun, serta kadar malondialdehid dalam darah meningkat. Terjadinya

peningkatan kadar malondialdehid menunjukkan telah terjadinya oksidasi lipid di dalam

darah. terjadinya oksidasi lipid di dalam darah juga akan menyebabkan timbulnya sel busa

yang dapat menempel atau berfiltrasi masuk ke dinding pembuluh darah sehingga

menyebabkan perubahan pada morfologi pembuluh darah. selain adanya sel busa, pemberian

pakan aterogenik tersebut dapat menyebabkan terjadinya proliferasi otot polos yang akan

mengakibatkan ulserasi pembuluh darah. kalsium yang diberikan juga akan mengakibatkan

terjadinya kalsifikasi aorta pada dinding pembuluh darah. berdasarkan gambar 2, telah

dijumpai sejumlah sel-sel busa dan telah terjadi proses proliferasi otot polos.

Berdasarkan hasil uji bahwa pemberian ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dan isolat

andrografolid dapat memperbaiki profil lipid dalam darah serta dapat menurunkan kadar

malondialdehid dalam darah. Hal ini dikarenakan adanya kandungan senyawa andrografolid.

24

Andrografolid memiliki aktivitas sebagai antioksidan, sehingga mampu mengurangi

terjadinya oksidasi lipid yang ditandai dengan terjadinya penurunan kadar MDA dalam darah

hewan uji. Dimana kadar MDA untuk kelompok perlakuan berbeda signifikan dengan

kelompok kontrol negatif. Sedangkan untuk masing-masing kelompok perlakuan tidak ada

perbedaan signifikan.

Berdasarkan pengamatan kadar lipid dalam darah kelompok tikus preventif, diketahui

bahwa isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dapat mencegah

terjadinya peningkatan kadar lipid dan kadar malondialdehid dalam darah. kemampuan ini

dikarenakan isolat andrografolid memiliki aktivitas sebagai antioksidan dan sebagai

antidislipidemia.

25

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

a. Isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi dapat memperbaiki profil lipid dalam

darah.

b. Isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi dapat menurunkan kadar

malondialdehid dalam darah.

6.2 Saran

a. Perlu dilakukan metode kristalisasi untuk mendapatkan kristal yang bersih.

26

DAFTAR PUSTAKA

Cannell, R.J.P., 1998, Natural Product Isolation, Glaxo Wellcome Research & Development,

Stevenage, Herb, UK

Cheung H.Y., Cheung C.S., and Kong C.K., 2001, Determination of bioactive diterpenoids

from Andrographis paniculata by micellar electrokinetic chromatography, J

Chromatogr A, 930(1-2):171-176

Chen L, Zhu H, Wang R, Zhou K, Jing Y, and Qiu F, 2008, ent-Labdane diterpenoid lactone

stereoisomers from Andrographis paniculata, J Nat Prod, 71:852-855

Farmayuda, F., 2011, Pengaruh pemberian berulang piperin dan fraksi dari ekstrak etanolik

buah cabe jawa (Piper retrofractum Vahl) terhadap kualitas spermatozoa tikus galur

wistar, Tesis, Program Pascasarjana Program Studi Ilmu Farmasi, Universitas Gadjah

Mada, Yogyakarta.

Hadjiisky P, Renais J, Scebat L. 1981. Myocyte aortique et calcification arte ´rielle calcife

´rolique. Etude ultrastructurale et histochimique. Par Art, 4(2):111–33.

Kamdem RE, Sang S, and Ho CT, 2002, Mechanism of the superoxide scavenging activity of

Neoandrographolide a natural product from Andrographis paniculata Nees. J Agric Food

Chem, 50:4662-4665

Kishore, P.H., reddy, M.V., Reddy, M.K., Gunasekar, D., Caux, C., and Bodo, B., 2003,

Flavonoids from Andrographis lineata, Phytochemistry, 63 (4): 457-461

Kim, Young Sook, Yun Mee Lee, Hyojun Kim, Junghyun Kim, Dae Sik Jang, Joo Hwan

Kim, Jin Sook Kim, 2010, Anti-obesity effect of Morus bombycis root extract: Anti-

lipase activity and lipolytic effect, J. Ethno., 130: 621-624

Li, F.X., and Li, S.S., 2011, Effects of andrographolide on the activation of mitogen activated

protein kinases and nuclear factor-κ B in mouse peritoneal macrophage-derived foam

cells, Chin J Integr Med., pubmed.

Mishra, S. K., Sangwan, N.S and Sangwan, R.S., 2007, Andrographis paniculata (Kalmegh):

A review, Pharmacog. Rev., 1, 283-298

Norman, P.E., and Powell, J.T., 2005, Vitamin D, Shedding Light on the Development of

Disease in Peripheral Arteries, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 25:39-46.

Pholphana N., Rangkadilok N., Thongnest S., Ruchirawat S., Ruchirawat M., Satayavivad J.,

2004, Determination and variation of three active diterpenoids in Andrographis

paniculata (Burm.f.) Nees., Phytochem Anal, 15(6):365-371

Rao, Y.K., Vimalamma, G., Rao, C.V., and Tzeng, Y., 2004, Flavonoids and

andrographolides from Andrographis paniculata, Phytochemistry, 65: 2317-2321

Reddy M.V.B., Kishore P.H., Rao C.V., Gunasekar D., Caux C., Bodo B., 2003, New 2'-

oxygenated flavonoids from Andrographis affinis, J Nat Prod, 66:295-297

Sundowo, S., Dewi, P., dan Kardono, 2002, Cara Mudah Isolasi Senyawa Andrografolid dari

Daun Sambiloto (Andrographis paniculata), Prosiding Seminar Tantangan Dunia

Kimia: 193-198, Serpong

Tedgui A. dan Ziad M., 2006, Cytokines in Atherosclerosis: Pathogenic and Regulatory

Pathways, Physiol Rev, 86: 515–581,

27

Warditiani, Ni Kadek, 2012, Uji Aktivitas Antihiperlipidemia dan Antiaterosklerosis Isolat

Andrografolid dan Ekstrak Terpurifikasi Herba Sambiloto (Andrographis paniculata

(Burm.f) Ness) pada Tikus Diabetes Mellitus tipe 2 Resisten Insulin, Tesis, Universitas

Gadjah Mada, Yogyakarta

Zhang, X., 2004, WHO monograph on selected medicinal plants, vol. 2, World Health

Organization, Genewa.

Zhang CY and Tan BK, 1996, Hypotensive activity of aqueous extract of Andrographis

paniculata in rats, Clin Exp Pharmacol Physiol, 23:675-678

Zhang XF and Tan BK, 2000, Anti-diabetic property of ethanolic extract of Andrographis

paniculata in streptozotocin-diabetic rats, Acta Pharmacol Sin, 21(12):1157-1164