Transformasi E. coli

Transformasi adalah proses yang terjadi ketika sel menerima DNA asing dari luar. Transformasi dapat terjadi di alam. Dalam biologi mikrobial, transformasi adalah bentuk artifisial dari reproduksi secara lab dengan membentuk pori pada membtan sel.

Persiapan competent cells- Gunakan cara aseptis- Pilih koloni bakteri dari agar plate. Tumbuhkan di dalam 500 ml LB cair di dalam

shaking inkubator selama semalam pada suhu 37ºC.- Ketika sel dalam pertumbuhan, buat larutan 0.1M CaCl2 dan 0.1M CaCl2 + 15%

gliserol kemudian sterilkan dalam autoclave dan biarkan dingin.- Hitung nilai absorban hingga 0.4-0.5 pada OD (λ600nm).- Pisahkan kultur sel bakteri ke dalam 2 tabung sentrifugasi besar dan putar pada

kecepatan 3000 rpm pada suhu 4ºC. - Buang supernatant dan resuspensi 100 ml 0.1M CaCl2 dingin. Kemudian inkubasi sel

dalam es selama 30 menit.- Ulangi proses ini minimal 1 kali.- Setelah pencucian akhir, resuspensi sel di dalam 50 ml 0.1 mol CaCl2 + 15% gliserol.- Penyimpanan : simpan di dalam tabung microfuge yang masing – masing berisi 50 µL

bakteri dan pada -80ºC.

Persiapan media- Sebelum memulai, bersihkan meja dengan alkohol agar steril. Selain itu, semua

peralatan juga sudah disterilkan.- Isi graduated cylinder dengan 250 ml air distilasi.- Masukkan 2.5 gr yeast extract, 5 gr tryptone, dan 5 gr NaCl. Aduk hingga campuran

merata menggunakan stire plate.- Tambahkan air distilasi hingga volume menjadi 500 ml.- Masukkan 7.5 gr agar. Aduk hingga merata menggunakan stire plate.- Panaskan dalam autoclave pada suhu 121°C selama 25 menit.- Setelah 25 menit, matikan autoclave dan tunggu hingga suhu menurun sebelum

dikeluarkan dari autoclave.- Sebelum ditambah ampisilin, panaskan agar LB hingga suhu 50-55°C menggunakan

penangas air.- Tambahkan antibiotik atau ampisilin 50 µL 500 mg/ml ampisilin (untuk 1 L agar LB).

Aduk perlahan hingga bercampur.- Simpan di pendingin pada suhu 4°C.- Sebelum memulai reaksi panas kejut, panaskan terlebih dahulu media hingga suhu

ruang dan antibiotik yang mengandung agar LB hingga 37ºC .

Transformasi E. coli- Ciarkan sel bakteri kompeten pada es.- Tambahkan 1-5uL 1ng/μL plasmid dingin ke dalam bakteri kompeten. Campur secara

perlahan. Kemudian kembalikan campuran ini ke dalam es selama 30 menit.- Kemudian panaskan campuran plamid dan bakteri tersebut di dalam penangas air pada

suhu 42ºC selama 30 detik.- Kemudian masukkan kembali ke dalam es. Lalu ditambahkan 450 µL media. - Inkubasi di dalam shaking incubator dengan kecepatan lebih dari 225 rpm pada suhu

37ºC selama 1 jam.

- Ambil 20-200 µL campuran plasmid dan bakteri tersebut kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang berisi agar LB. Ratakan dengan batang kaca penyebar.

- Kemudian inkubasi cawan petri tersebut selama semalam pada suhu 37ºC.- Hitung jumlah koloni yang terbentuk untuk menghitung efisiensi transformasi.

Tambahan :Reagents:LB Broth (1L):Tryptone - 10gYeast Extract - 5gSodium Chloride - 10gMix, add DI H2O, autoclave, cool and use or keep in sealed autoclaved containers until needed.

LB Agar (1L):Peptone -10gYeast Extract - 5gSodium Chloride - 10gAgar - 12gDissolve in DI H2O, autoclave, wait until cool to the touch, add proper concentration of antibiotic if needed, pour 10-20ml per plate, allow agar to cool and harden. Use, or seal and keep at +4 until needed

Protocol:1. Thaw cells and DNA on ice (15-20min).2. Mix DNA with cells, incubate on ice 15 min.3. Heat shock at 42° C for 2 min.4. Cool on ice for 3 min.5. add 100ul LB, shake for 1 hour at 37°C.6. Spread on plate7. Place in incubator overnight at 37°C

Langkah – langkah membuat LB agar :- Bersihkan tabung flask 1 L dengan 250 air distilasi- Masukkan ke dalam tabung flask 2.5 gr yeast extract, 5 gr tryptone, 5 gr NaCl, dan

7.5 gr agar.- Tambahkan 500 ml air distilasi.- Aduk hingga campuran merata.- Panaskan dalam autoclave selama 20 menit- Biarkan dingin hingga suhu 50-55°C.

Kultivasi

- Inokulasi strain E. coli pada 50 ml medium tes (20 gr glukosa, 4 gr sodium format, 4 gr Polypepton, 2 gr NaCl, 10 g (NH4)2SO4, 1 g KH2PO4, 0.5 g MgSO4.7H2O dan 14.7 mg CaCl2.2H2O per 1 liter air distilasi) dalam 250 ml baffled conical flask.

- Atur pH awal medium yaitu 8 dengan menggunakan NaOH dan CaCO3 (20 g/l)- Kemudian kultur ditumbuhkan pada suhu 37°C melalui shaker incubator 100 hingga

200 rpm.

Analisis

1. DCW (Dry Cell Weight)Pertumbuhan sel dihitung menggunakan OD 660 nm. Berat sel kering ditentukan dengan mencuci pellet setelah melarutkan CaCO3 dalam HCl encer, kemudian dihitung dengan mengkali nilai ODλ600 dengan 0,36

2. GlukosaKandungan uji kombinasi :

- 3 unit botol 1, masing–masing dengan 7.2 gr bubuk yang mengandung : triethanolamine buffer, pH 7.6; NADP, 110 mg; ATP, 260 mg; dan magnesium sulfate.

- 3 unit botol 2, masing-masing dengan 1.1 ml suspensi yang mengandung : hexokinase 320 U dan glucose-6-phosphate dehydrogenase 160 U.

- Botol 3 D-glucose assay control solution untuk assay control.

Persiapan larutan :- Larutkan 1 unit botol 1 dengan 45 ml air redistilasi.- Gunakan isi 1 unit botol 2 yg tidak dicairkan.

Stabilitas perekasi :- Isi botol 1 stabil pada suhu 2-8°C (lihat label kemasan). Larutan 1 stabil selama 4

minggu pada suhu 2-8°C dan 2 bulan pada suhu -15°C sampai -25°C. Tingkatkan suhu larutan 1 hingga 20-25°C sebelum penggunaan.

- Isi botol 2 stabil pada 2-8°C (lihat label kemasan).

Prosedur :Panjang gelombang : 340 nm, Hg 365 nm atau Hg 334 nm Cuvet : 1.00 cm light pathSuhu : 20-25ºCVolume akhir : 3.020 mlMembaca tanpa udara (tanpa kuvet di dalam light path) atau tanpa airLarutan sampel : 1-100 µg D-glukosa/assay (pada 0.100-2.000 ml volume

sampel).

Pipet ke dalam cuvet Blangko SampelLarutan 1 1.000 ml 1.000 mlLarutan sampel - 0.100 mlAir redist. 2.000 ml 1.900 mlCampurkan dan baca nilai absorbansi larutan (A1) setelah 3 menit. Reaksi dimulai dengan penambahan :Suspensi 2 0.020 ml 0.020 mlCampurkan, tunggu reaksi hingga berhenti (10-15 menit) dan baca nilai absorbansi (A2).Jika reaksi tidak berhenti setelah 15 menit, maka lanjutkan membaca nilai absorbansi pada interval 2 menit hingga nilai absorbansi konstan

Jika absorbansi A2 meningkat konstan, perkirakan absorbansi dengan waktu penambahan suspensi 2 (HK/G6P-DH).

Tentukan perbedaan absorbansi (A2 – A1) untuk keduanya, blangko dan sampel. Substrat perbedaan absorbansi blangko dari perbedaan absorbansi sampel :

ΔA = (A2 – A1)sampel - (A2 – A1)blangko

Pengukuran perbedaan absorbansi harus minimal 0.100. untuk mencapai hasil yang tepat.

Hitung nilai konsentrasi glukosa dengan persamaan berikut :

C = x ΔA (g/l)

V = volume akhir (ml)v = volume sampel (ml)MW = Bobot molekul (g/mol)d = light path (cm)ε = extinction coefficient NADPH pada :

340 nm = 6.3 (l x mmol-1 x cm-1) Hg 365 nm = 3.5 (l x mmol-1 x cm-1)

Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol-1 x cm-1)

Jika sampel sudah dilarutkan selama preparasi, hasilnya harus bervariasi dengan berbagai faktor pengenceran.

Ketika menganalisis sampel dalam bentuk padatan atau semi padatan dimana sampel preparasi lebih berat, maka hasilnya dihitung dari jumlah berat :

Instruction for performance of assay :Jumlah D-glukosa yang ada pada assay antara 2 µg dan 100 µg (diukur pada 365 nm)

atau 1 µg dan 50 µg (diukur pada 340, 334 nm). Agar didapatkan perbedaan absorbansi yang

V x MWε x d x v x 1000

cukup, larutan sampel dicairkan hingga hasil konsentrasi D-glucose di antara 0.15 dan 1.0 g/l atau 0.08 dan 0.5 g/l

Tabel pengenceran

Jika nilai perbedaan absorbansi (ΔA) terlalu kecil (< 0.100), larutan sampel harus disiapkan lagi (menimbang lebih banyak sampel atau melarutkan lebih kecil) atau sample yang dipipet ke kuvet dapat mencapai 2 ml. Volume air yang harus ditambahkan kemudian dikurangi seperti mendapatkan volume akhir dalam assay untuk sampel dan blangko. Volume sampel baru (v) harus diambil ke dalam perhitungan.

Sensitivity and detection limit :Membedakan absorbansi terkecil pada prosedur adalah 0,005. Korensponden ini untuk

volume sampel max = 2 ml dan menghitung pada 340 nm D-glukosa konsentrasi 0.2 mg/l larutan sampel (jika v = 0.100 ml, koresponden untuk 4 mg/l larutan sampel). Batas deteksi 0.4 mg/l berasal dari perbedaan absorbansi 0.010 (seperti perhitungan pada 340 nm) dan volume sampel max v = 2 ml.

3. EtanolThe test-combination contains :

- Botol 1 dengan 100 ml larutan yang mengandung potassium diphosphate buffer, pH 9- Botol 2 dengan 30 tablet, masing-masing tablet mengandung NAD 4 mg; aldehyde

dehydrogenase 0.8 U- Botol 3 dengan 1.6 suspensi yang mengandung ADH 7000 U- Botol 4 dengan etanol assay control solution untuk tujuan assay control

Persiapan larutan :- Gunakan isi botol 1 yang tidak dilarutkan- Larutkan 1 tablet botol 2 dengan 3 ml larutan botol 1 dalam tabung setrifugasi untuk

masing-masing blangko atau sampel, tergantung jumlah perhitungan. Gunakan penjepit untuk mengambil tablet dari botol 2. Hasilnya adalah campuran reaksi 2.

- Gunakan isi botol 3 yang tidak dicairkan

Stabilitas perekasi :- Larutan 1 stabil pada suhu 2-8°C (lihat label pada kemasan). Tingkatkan suhu larutan 1

hingga 20°C sebelum digunakan. - Kandungan botol 2 stabil pada suhu 2-8°C (lihat label pada kemasan). Campuran rekasi

2 stabil selama 1 hari pada suhu 2-8°C. Tingkatkan suhu campuran rekasi 2 hingga 20°C sebelum digunakan.

- Kandungan botol 3 stabil pada suhu 2-8°C (lihat label pada kemasan).

Prosedur :

Panjang gelombang : 340 nm, Hg 365 nm atau Hg 334 nm Cuvet : 1.00 cm light pathSuhu : 20ºCVolume akhir : 3.150 mlMembaca tanpa udara (tanpa cuvet di dalam light path), tanpa air atau tanpa blangko.Larutan sampel : 0.3-12 µg D-etanol/assay (pada 0.100-0.500 ml volume sampel).

Pipet ke dalam cuvet Blangko SampelReaksi campuran 2 3.000 ml 3.000 mlAir redist. 0.100 ml -Larutan sampel 0.100 mlCampurkan dan baca nilai absorbansi larutan (A1) setelah 3 menit. Reaksi dimulai dengan penambahan :Suspensi 3 0.050 ml 0.050 mlCampurkan, tunggu reaksi hingga berhenti (5-10menit) dan baca nilai absorbansi (A2)

Ini mutlak diperlukan untuk menghentikan kuvet, dengan parafilm, selama penghitungan agar mencegah campuran assay dari adsorpsi etanol dari udara.

Tentukan perbedaan absorbansi (A2 – A1) untuk keduanya, blangko dan sampel. Substrat perbedaan absorbansi blangko dari perbedaan absorbansi sampel :

ΔA = (A2 – A1)sampel - (A2 – A1)blangko

Pengukuran perbedaan absorbansi harus minimal 0.100 untuk mencapai hasil yang tepat.

Perhitngan nilai konsentrasi glukosa dengan persamaan berikut :

C = x ΔA (g/l)

V = volume akhir (ml)v = volume sampel (ml)MW = Bobot molekul (g/mol)d = light path (cm)ε = extinction coefficient NADH pada :

340 nm = 6.3 (l x mmol-1 x cm-1) Hg 365 nm = 3.4 (l x mmol-1 x cm-1)

Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol-1 x cm-1)

Jika sampel sudah dilarutkan selama preparasi, hasilnya harus bervariasi dengan berbagai faktor pengenceran.

Ketika menganalisis sampel dalam bentuk padatan atau semi padatan dimana sampel preparasi lebih berat, maka hasilnya dihitung dari jumlah berat :

V x MWε x d x v x 1000

Instruction for performance of assay :Jumlah etanol yang ada pada assay antara 0.5 µg dan 12 µg (diukur pada 365 nm) atau

0.3 µg dan 6 µg (diukur pada 340, 334 nm). Agar didapatkan perbedaan absorbansi yang cukup, larutan sampel dicairkan hingga hasil konsentrasi etanol di antara 0.02 dan 0.12 g/l atau 0.01 dan 0.06 g/l.

Tabel pengenceran

Karena sifat volatil pada etanol, pengenceran sampel seharusnya dilakukan mengikuti :- Isi flask volumetric hingga setengahnya dengan air (20°C) dan pipet sampel (20°C)

dengan enzim tes pipet atau suatu piston tipe pipet di bawah permukaan air. Isi hingga batas (tanda) dengan air (20°C) dan campur.

- Jika nilai perbedaan absorbansi (ΔA) terlalu kecil (<0.100), larutan sampel harus disiapkan lagi (menimbang lebih banyak sampel atau melarutkan lebih kecil) atau sample yang dipipet ke kuvet dapat mencapai 0.5 ml. Volume larutan 1 atau campuran reaksi 2 sama masing-masing sama (3 ml). Volume air yang dipipet ke dalam blangko assay kemudian harus ditingkatkan seperti mendapatkan volume akhir di dalam assay untuk sampel dan blangko. Volume sampel baru (v) dan volume akhir baru (V) harus dimasukkan dalam perhitungan.

Sensitivity and detection limitMembedakan absorbansi terkecil pada prosedur adalah 0,005. Korensponden ini untuk

volume sampel max v= 0.500 ml, volume assay V=3.550 ml dan dihitung pada 340 nm konsentrasi etanol 0.1 mg/l larutan sampel (jika v = 0.100 ml dan V= 3.150 ml, koresponden ini untuk 0.6 mg/l larutan sampel). Batas deteksi 0.5 mg/l berasal dari perbedaan absorbansi 0.020 (seperti perhitungan pada 340 nm), volume sampel max v = 0.500 ml dan volume assay V=3.550

4. Asam OrganikPengukuran asam organik menggunakan HPLC dengan Animex HPX-87H column pada suhu 55°C