Spektroskopi analitik

Spektroskopi analitik adalah ilmu mengenai penentuan jumlah senyawa yang terdapat di

dalam suatu sampel dengan cara mengukur secara ajurat/banyaknya cahaya yang diserap atau

diemisikan oleh atom-atom atau molekul-molekul yang terdaoat di dalam sampel tersebut.

Spektroskopi berbeda-beda, bergantung pada jenis atau panjang gelombang radiasi

elektromagnetik yang diserap atau diemisikan oleh atom atau molekul. Penjelasan rincian

mengenai smua jenis analisis instrumental modern berada di luar cakupan buku ini, akan

tetapi, kegunaan spektroskopi dalam analisis obat-obatan sangat penting dan akan dijelaskan.

Cahaya merupakan suatu bentuk radiasi elektromagnetik karena terdiri atas komponen

elektrik dan magnetik yang berosilasi dalam arah yang saling tegak lurus dan tegak lurus

terhadap arah perjalanan radiasi di sepanjang ruangan (lihat Gambar 7.1).

Gambar 7.1 Diagram radiasi elektromagnetik

Spektrum lengkap radiasi elektromagnetik ditunjukkan pada Gambar 7.2, dengan

kisaran mulai dari gelombang radio dan televisi berenergi rendah hingga sinar gamma yang

berenergi sangat tinggi. Bagian terkencil spectrum elektromagnetik yang dapat dideteksi

oleh mata manusia (kira-kira 400-700 nm) disebut spektrum tampak, dan spektroskopi

yang dilakukan pada panjang gelombang ini dinamakan spektroskopi tampak atau

“kolorimetri”. Bagian spektrum elektromagnetik yang melewati bagian ujung merah

spektrum tampak, disebut bagian infra merah, yang memiliki panjang gelombang lebih

panjang dan energi lebih rendah dari cahaya tampak. Sama halnya, bagian spektrum yang

melewati ujung violet, spektrum tampak, disebut bagian ultraviolet, yang memiliki yang

memiliki panjang gelombang lebih pendek dan energi lebih besar dari cahaya tampak.

1

Radiasi eloktromagnetik dapat dianggap sebagai suatu bentuk gelombang yang

mengitari ruangan, dan jenis radiasi yang digunakan pada suatu percobaan tertentu,

bergantung pada informasi yang dibutuhkan dari percobaan tersebut. Salah satu istlah pada

radiasi elektromagnetik yang sering digunakan adalah panjang gelombang cahaya. Panjang

gelombang didefinisikan jarak dari satu puncak gelombang ke puncak berikutnya (dari

palung ke palung). Dan biasanya dinyatakan nanometer (nm, 10-9 m) agar diperoleh bilangan

terukur yang masuk akal (Gambar 7.3). Simbol untuk panjang gelombang adalah λ, yang

berasal dari huruf Yunani ”lambda”. Energi yang terkandung dalam masing-masing kuantum

energi dari berkas radiasi pada panjang gelombang tertentu berbading terbalik dengan

panjang gelombang. Ini berarti gelombang radio dengan panjang gelombang beberapa ratus

meter memiliki energi yang rendah, sementara sinar gamma dan sinar -X adalah bentuk

radiasi dengan panjang gelombang pendek dan berenergi tinggi.

Gambar 7.3 Panjang gelombang cahaya.

Istilah lain yang sering digunakan dalam spektroskopi adalah bilangan gelombang dan

frekuensi. Bilangan gelombang didefinisikan sebagai jumlah gelombang per satuan panjang

(biasanya dinyatakan dalam satuan : “balikan sentimeter” (cm-1, 1 cm = 10-2 m) dan

merupakan balikan panjang gelombang dalam cm, yaitu 1/λ. Penggunaan bilangan

gelombang biasanya terbatas pada spektroskopi inframerah.

2

Frekuensi didefinisikan sebagai jumlah gelombang yang diemisikan dari sumber per

detik; satuan frekuensi adalah hertz (Hz; 1 Hz = 1 gelombang per detik ), dan simbol yang

digunakan adalah v (hurut Yunani “nu”).

Frekuensi dan panjang gelombang dihubungkan oleh suatu tetapan yang disebut

kecepatan cahaya dengan simbol c. Nilai ini (kira-kira 3 x 108 m/dtk) merupakan hasil kali

antara frekuensi dan panjang gelombang, yaitu :

Kecepatan cahaya = frekuensi x panjang gelombang

atau

c = v x λ

Karena frekuensi dan bilangan gelombang berbading terbalik dengan panjang gelombang,

energi foton berbanding lurus dengan keduanya.

Jika suatu atom molekul terpanjang dengan radiasi elektromagnetik, energy dapat

diserap melalui salah satu dari ketiga cara di bawah ini:

1. Energi dapat menaikkan elektron dari orbital ikatan menuju orbital antiikatan yang

berenergi lebih besar sehingga disebut transisi elektronik.

2. Energi dapat bekerja untuk meningkatkan getaran atau osilasi atom di sekitar ikatan

kimia. Ini diistilahkan sebagai transisi getaran.

3. Energi dapat menyebakan peningkatan putaran atom di sekitar ikatan kimia, yaitu

transisi putaran.

Perbedaan energi di antara efek-efek ini sangat besar, energi yang dibutuhkan untuk

menghasilkan transisi getaran kurang lebih 100 kali lebih besar dari yang dibutuhkan untuk

menghasilkan transisi putaran. Sama halnya, transisi elektronik memerlukan energi hampir

100 kali lipat lebih besar dari yang diperlukan untuk transisi getaran. Hal ini penting karena

dua alasan : pertama, tiap transisi elektronik harus dikaitkan dengan transisi getaran dan

putaran; kedua, karena transisi elektronik memerlukan energi yang sangat banyak, hanya

cahaya dengan panjang gelombang pendek yang memiliki energi yang cukup untuk dapat

melakukan transisi elektronik. Sebagai contoh, radiasi inframerah dapat mencapai getaran

dan putaran yang meningkat di sekitar ikatan kimia, tapi energi yang dimiliki tidak cukup

besar untuk menaikkan elektron ke orbital antiikatan dan menghasilkan transisi elektronik.

Ultraviolet atau cahaya tampak umumnya diperlukan untuk menghasilkan transisi elektronik.

3

Walaupun spektroskopi dapat dilaksanakan pada jenis senyawa yang berbeda-beda,

dengan konfigurasi elektronik yang berbeda-beda, kebanyakan dari pekerjaan kuantitatif (dan

semua contoh yang ada di dalam buku ini) akan melibatkan sistem elektron π (pi). Elektron π

(juga disebut “elektron gerak”) adalah elektron yang ditemukan dalam ikatan-ikatan rangkap.

Ikatan rangkap karbon-karbon terdiri atas satu ikatan σ (“sigma”) dan satu ikatan π,

sedangkan ikatan rangkap tiga terdiri atas satu ikatan σ dan dua ikatan π. Elektron-elektron π

ini dapat dieksitasi dan dinaikkan ke orbital antiikatan berenergi tinggi dengan mudah. Jika

elektron jatuh kembali keadaan dasar, energi ini dilepaskan dan dapat diukur dengan

spektrofotometer.

Bagian molekul yang bertanggung jawab terhadap penyerapan cahaya disebut kromofor

(lihat gambar 7.4), dan terdiri atas ikatan rangkap dua atau rangkap tiga, terutama jika ikatan

rangkap tersebut terkonjugasi (ikatan rangkap dan ikatan tunggal pada strukturnya berselang-

seling). Semakin panjang ikatan rangkap dua atau rangkap tiga terkonjugasi di dalam

molekul, molekul tersebut akan semakin mudah menyerap cahaya. Senyawa-senyawa

aromatik yang mengadung cincin benzen akan menyerap cahaya ultraviolet dengan panjang

gelombang 254 nm, dan sifat ini digunakan dalam berbagai analisis spektroskopik dan pada

detektor untuk sistem kromatografi. Jika kromofornya lebih luas, molekul akan tereksitasi

oleh cahaya berenergi rendah, hingga jika kromofornya sangat luas, energi yang berasl dari

cahaya tampak cukup kuat untuk mengeksitasi elektron kromofor dan senyawa tersebut akan

menyerap cahaya tampak.

Jenis molekul ini, yang menyerap cahaya pada bagian tampak dari spektrum

elektromagnetik, dikatakan berwarna karena mata kita akan mendeteksi cahaya yang

dipantulkan balik dari senyawa tersebut, yang akan menjadi warna komplementer terhadap

cahaya yang diserap. Ingat, cahaya putih berasal dari gabungan seluruh warna pelangi, dan

dapat terbagi menjadi warna-warna konstituennya oleh prisma atau tetesan air. Sebagai

contoh, jika molekul zat warna menyerap cahaya dengan panjang gelombang merah, jingga,

dan kuning, mata kita akan mendeteksi cahaya pantulan biru, hijau, dan ungu dan kuta akan

melihat zat warna tersebut berwarna biru. Sama halnya, zat warna berwarna merah akan

meyerap cahaya biru dengan panjang gelomban pendek dan memantulkan merah dan jingga

ke mata kita. Sifat-sifat ini dimanfaatkan pada penggunaan indikator untuk titrasi (lihat Bab

6) yang spektrum penyerapan (serta warna) indikatornya berubaha sesuai dengan pH larutan.

4

O

O

Benzen Antrakuinolon

O CH3

HO S N = N N

O CH3

Jingga metal

Gambar 7.4 Contoh-contoh kromoform

Efek pH terhadap spektrum

Jika suatu grafik tingkat penerapan cahaya (diukur sebagai yang diistilahkan dengan

“serapan”, akan didefinisikan pada halaman 162) diplotkan terhadap panjang gelombang,

akan diperoleh spektrum penyerapan lengkap suatu molekul (Gambar 7.5). Panjang

gelombang dengan serapan (A) terbesar disebut λmaks (dibaca “lambda maks”), dan

merupakan karakteristik kromofor. λmaks suatu senyawa terkadang digunakan dalam British

Pharmacopoeia untuk mengidentifikasi obat-obatan dan senyawa-senyawa yang belum

dikenal.

Gambar 7.5 Plot serapan cahaya vx λ

5

Panjang gelombang pada saat λmaks terjadi akan berupa suatu tetapan untuk tiap senyawa,

tapi seperti kebanyakan “tetapan” di dalam ilmu sains, λmaks dapat mengalami perubahan. Hal

ini tidak sepenuhnya berita buruk, karena banyak informasi yang berguna mengenai senyawa

dapat diperoleh hanya dengan mengamati geseran yang terjadi pada λmaks, contohnya, ketika

suatu senyawa mengalami ionisasi.

Geseran λmaks menuju panjang elombang yang lebih panjang dikenal sebagai geseran

batokromik atau geseran merah, karena merah adalah warna bagian ujung pada panjang

gelombang yang panjang, spektrum tampak. Geseran batokromik biasanya terjadi karena

kerja auksokrom. Auksokrom adalah gugus fungsi yang menempel pada kromofor yang tidak

menyerap energi cahayanya sendiri, tetapi memengaruhi panjang gelombang cahaya yang

diserap kromofor. Contoh auksokrom di antaranya adalah gugus –NH2, -OH, -SH. Gugus-

gugus fungsi ini memiliki pasangan elektron tidak terikat (non-bonded electron) yang dapat

berinteraksi dengan elektron π pada kromofor dan memungkinkan terjadinya penyerapan

cahaya yang memiliki panjang geombang yang lebih panjang. Contoh yang baik dari efek ini

adalah membandingkan nilai λmaka benzen dan anilin (juga disebut fenilamin atau

aminobenzen), ditunjukkan pada Gambar 7.6.

NH2

Benzen Anilin

Gambar 7.6 Strukur benzena dan anilin.

λmaks benzen adalah 204 nm, sedangkan λmaks anilin adalah 230 nm. Hal ini disebabkan

pasangan elektron menyendiri pada NH2 yang berinteraksi dengan elektron cincin untuk

meningkatkan densitas elektron di keseluruhan cincin, terutama pada posisi orto dan para dari

cincin, seperti yang ditunjukkan pada gambar 7.7.

6

∙∙ + + +

N NH2 NH2 NH2

-

-

Gambar 7.7 Efek + M analin

Efek mesomerik (atau M) ini terlihat jika anilin ditempatkan dalam larutan dengan pH 8-

14, yaitu ketika anilin basa tidak terion. Jika anilin ditempatkan di dalam larutan dengan pH

< 7 , λ maks kembali ke nilai sebenarnya yang diperoleh untuk benzen (203 nm). Dalam hal ini,

anilin di dalam larutan asam bereaksi dan membentuk garam anilinium. Pasangan elektron

menyendiri pada nitrogen kini terlibat dalam pembentukan ikatan dengan ion H+ dan tidak

lagi berfungsi sebagai auksokrom. Struktur anilin hidroklorida dutunjukkan pada Gambar 7.8.

+

NH3 Cl-

λ maks = 203 nm

Gambar 7.8 Struktur anilin hidroklorida dan nilai λ maks –nya.

Geseran λmaks menuju panjang gelombang yang lebih pendek disebut dengan efek hipsokromik atau geseran biru, dan biasanya terjadi jika senyawa dengan auksokrom basa terion, dan pasangan elektron menyendirinya tidak lagi dapat berinteraksi dengan elektron-elektron kromofor. Efek hipsokromik dapat juga terlihat jika spektrum digunakan pada pelarut-pelarut berbeda atau pada suhu elevasi. Jenis gesekan spektrum ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi obat-obatan yang menngandung gugus fungsi amin aromatic, misalnya anestetik benzokain lokal (lihat Gambar 7.9).

O

H2N C

O C2H5

7

Gambar 7.9 Struktur Benzokain.

Efek batokromik dan hipsokromik jarang terlihat dalam isolasi. Efek batokromik

biasanya terkait dengan adanya peningkatan intensitas cahaya yang diserap, sedangkan efek

hipsokromik biasanya terjadi dengan adanya penurunan serapan. Efek yang menyebabkan

terjadinya peningkatan serapan cahaya disebut efek hiperkromik, sedangkan efek yang

menyebabkan penurunan intensitas serapan cahaya disebut efek hipokromik. Mahasiswa

sering mengalami kebingungan dalam mengingat keempat kata yang digunakan untuk

menggambarkan geseran λ maks. Cara yang terbaik untuk mengingat istilah-istilah ini adalah

mungkin dengan mengingat hiper- berarti suatu peningkatan, hipo- suatu penurunan, dan

gesekan menuju panjang gelombang yang lebih panjang disebut geseran merah, sedangkan

geseran menuju panjang gelombang yang lebih pendek disebut geseran biru atau dengan

alternatif lain, yaitu dengan mengingat Gambar 7.10. Efek-efek hiperkromik digunakan

dalam penelitian obat-obatan antikanker untuk mengukur banyaknya obat yang diberikatan

dengan DNA. Jika larutan dupleks atau untai ganda, DNA, dipanaskan dengan hati-hati,

heliks ganda akan mulai terbuka. Sehingga memanjakan basa heterosiklik pada pusat

dupleks. Melalui percobaan dapat diamati bahwa jika serapan larutan DNA pada panjang

gelombang 260 nm maningkat, efek hiperkromik akan timbul. Obat-obatan yang terikat

dengan DNA menstabilkan molekul dan mengurangi tingkat hiperkromisitas yang teramati.

Gambar 7.10 Perubahan yang terjadi pada λmaks.

Obat-obatan yang mengandung gugus-gugus fenolik, misalnya perasetamol (lihat

Gambar 7.11), juga menunjukkan geseran spektrum pada ionisasi. Pada fenol, yang

merupakan suatu asam lemah dengan pKa kira-kira 10, ionisasi meningkat intensitas

penyerapan cahaya dan posisi λmaks bergerak menuju panjang gelombang yang lebih panjang.

Ini terjadi karena ionisasi dan hilangnya atom H dalam bentuk ion H+ menghasilkan muatan

negatif penuh pada oksigen (ion fenoksida) yang dapat berinteraksi dengan cincin secara

8

lebih efektif bila dibandingkan dengan pasangan elektron menyendiri yang terdapat pada

molekul yang tidak terion. Untuk fenol ditunjukkan pada Gambar 7.11.

O

H C N CH3

OH

Parasetamol

OH O-

+ H+

-

O O O O

- -

-

Gambar 7.11 Struktur parasetamol dan ionisasi fenol.

Peralatan

Alat yang digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang diserap oleh atom atau

molekul disebut spektrofotometer. Jenis spektrofotometer yang tersedia berbeda-beda,

bergantung pada cahaya yang digunakan, apakah berkas cahaya tunggal atau berkas cahaya

sampel dan pembanding secara terpisah, dan apakah pengukurannya dilakukan pada panjang

9

gelombang tetap atau memindai spektrum pada berbagai panjang gelombang. Seperti pada

sebagian besar alat analitik, akurasi, presisi, dan biayanya sangat bervariasi.

Secara umum, semua spektrofotometer memiliki gambaran serupa dengan yang

ditunjukkan pada Gambar 7.12

Sumber cahaya

Sumber cahaya atau lampu yang digunakan adalah dua lampu terpisah yang digunakan

secara bersama-sama, yang mencakup seluruh daerah tampak dan daerah ultraviolet spektrum

elektromagnetik. Untuk cahaya tampak putih, digunakan lampu tungsten. Lampu ini tidak

lebih canggih dibandingkan dengan lampu bola yang filamennya terbuat dari tungsten logam.

Anda munkin saja membaca buku ini dengan menggunakan cahaya dari salah satu lampu ini.

Lampu tungsten memancarkan cahaya dengan panjang gelombang 350 – 2000 nm dan

memadai untuk kolorimetetri.

Untuk senyawa yang menyerap pada daerah ultraviolet spektrum, diperlukan lampu

deuterium. Deuterium merupakan salah satu isotop berat hydrogen yang memiliki satu

neutron lebih banyak dari hidrogen biasa di dalam nukleusnya. Lampu deuterium merupakan

sumber berenergi besar yang mengemisikan cahaya dengan panjang gelombang kira-kira 200

– 370 nm dan digunakan pada semua spektroskopi di daerah ultraviolet spektrum.

Alat dengan panjang gelombang tetap, memungkinkan operator memilih lampu yang

diperlukan untuk suatu penetapan kadar, sedangkan alat pemindaian, yang menghasilkan

suatu plot seluruh spektrum penyerapan sampel, mengganti lampu secara otomatis.

10

Monokromator

Pada sebagian besar pengukuran kuantitatif, cahaya yang digunakan harus

monokromatik, yaitu cahaya dengan satu panjang gelombang tertentu. Cahaya mokromatik

ini didapatkan dengan melewatkan cahaya polikromatik (yaitu cahaya dengan berbagai

panjang gelombang) pada sebuah monokromator. Monokromator pada spektrofotometer

modern ada dua jenis, yaitu prisma atau kisi difraksi.

Prisma adalah suatu potongan kuarsa berbentuk segitiga, yang membiaska (atau

membelokkan) cahaya yang melaluinya. Tingkat pembiasan ini bergantung pada panjang

gelombang cahaya, sehingga seberaas cahaya putih dapat dipecah menjadi warna-warna

komponennya dengan melewati sebuah prisma. Prisma tersebut kemudian diputar untuk

memilih panjang gelombang tertentu yang diperlukan untuk penetapan kadar (Gambar 7.13).

Efek ini identik dengan pembentukan pelangi, saat cahaya dari matahari terpecah menjadi

tujuh komponen warna (merah, jingga, kuning, hijau, biru, nila dan ungu) melalui pembiasan

pada tetesan air hujan.

Gambar 7.13 Diagram sebuah prisma

Kisi difraksi adalah suatu potongan kecil gelas kaca yang di atasnya terdapat banyak

garis berjarak sama, telah dipotong-potong menjadi beberapa ribu per millimeter kisi, dan

menghasilkan suatu struktur yang tampak seperti sisir kecil. Jarak antara potongan-potongan

tersebut kurang lebih sama dengan panjang gelombang cahaya, sehingga seberkas cahaya

polikromatik akan dibiaskan menjadi panjang gelombang komponen-komponennya oleh kisi-

kisi tersebut. Kisi-kisi tersebut kemudian diputar untuk memilih panjang gelombang yang

penetapan kadar untuk pengujian (Gambar 7.14).

Gambar 7.14 Diagram kisi difraksi

11

Detektor

Setelah cahaya melewati sampel, penurunan intensitas yang terjadi karena penyerapan

diukur oleh detektor. Detektor biasanya berupa suatu alat elektronik yang pintar disebut

tabung fotopenggenda (photomultiplier tube) (lihat Gambar 7.15), yang mengubah intensitas

berkas cahaya menjadi sinyal elektrik yang dapat diukur dengan mudah, dan juga bertindak

sebagai amplifier (penguat) untuk meningkatkan kekuatan sinyal secara terus menerus.

Cahaya memasuki tabung dan meabrak katoda, sehingga melepaskan elektron yang bergerak

ke arah anoda yang berada di atasnya. Jika elektron menabrak anoda ini, elektron-elektron

tersebut melepaskan elektron lebih banyak lagi kemudian akan bergerak ke anoda yang

berada di atasnya, dan proses ini akan terulang kembali. Dengan cara inilah terbentuk

kaskade elektron dan sinyalnya diperkuat.

Gambar 7.15 Diagram tabung fotopengganda

Begitu meninggalkan tabung fotopengganda, sinyal elektrik segera dihubungkan dengan

suatu perekam jika diperlukan hasil cetakan, atau yang lebih umum, dihuungkan ke suatu

layar yang dapat menampilkan spektrum penyerapannya. Spektrofotometer modern saat ini

kebanyakan dihubungkan dengan computer pribadi (personal computer) agar dapat

menyimpan banyak data atau untuk menyediakan akses ke tempat kumpulan spektrum yang

tersimpan pada piranti keras computer tersebut. Ini memungkinkan pembandingan spektrum

yang tersimpan di piranti keras dengan spektrum yang dihasilkan melalui percobaan di

laboratorium dan membantu di dalam mengidentifikasi senyawa-senyawa tidak dikenal.

12

Pengukuran percobaan serapan

Tahapan pengukuran dengan spektrofotometer adalah sebagai berikut :

1. Monokromator diatur sesuai dengan panjang gelombang pengukuran, katupnya ditutup

untuk mencegah cahaya mencapai detektor, dan alat diatur untuk serapan yang tidak

terbatas. Ini sering dilakukan secara otomatis pada saat “pemanasan” oleh alat modern.

2. Katup dibuka, pelarut (atau “blangko”) ditempatkan pada jalan cahaya, dan alat diatur

sehingga serapan menjadi nol. Blangko biasanya hanya berupa pelarut yang digunakan

untuk penetapan kadar, tapi pada dasarnya, seharusnya semua komponen yang terdapat

di dalam matriks sampel kecuali sampel yang sedang ditentukan. Ini berarti dalam

penetapan kadar yang kompleks, larutan blangko harus dibuat tepat sesuai dengan

komposisi pelarut / medium sampel yang akan diujikan, dan harus diekstraksi atau

diperlakukan dengan cara yang sama persis dengan perlakuan terhadap sampel.

3. Larutan sampel (atau “uji”) ditempatkan pada jalan cahaya dan serapannya dibaca

langsung oleh alat.

Pengenceran

Bagian terpenting pada penetapan kadar spektroskopi bukanlah kinerja spektrofotometer

(walaupun akurasi alat diperiksa secara berkala), melainkan penyiapan larutan uji dan larutan

pengenceran yang akurat larutan stok dengan menggunakan peralatan gelas volumetrik, yang

diperkenalkan pada Bab 6, yaitu pipet dan labu ukur. Prosedur yang umum dilakukan adalah

menyiapkan serangkaian pengenceran untuk digunakan sebagai grafik kalibrasi seperti

contoh kerja di bawah ini.

Contoh kerja

Anda diberikan larutan stok yang mengandung larutan obat 50 μg/ml. siapkan 100 ml

larutan yang mengandung 5, 10, 20, dan 30 μg/ml obat.

Langkah pertama adalah menghitung volume larutan stok 50 μg/ml yang diperlukan

untuk masing-masing pengenceran. Ini dapat dilakukan dengan menggunakan hubungan di

bawah ini.

[Yang diperlukan]

x volume yang diperlukan

[Stok]

[ ] melambangkan konsentrasi obat. Hubungan ini akan lebih mudah diingat sebagai :

13

[Yang diinginkan]

x volume labu

[Yang dimiliki]

Dengan menggunakan hubungan ini, larutan 30 μg/ml disiapkan dari (30/50) x 100 = 60

ml larutan stok dan diencerkan dengan pelarut hingga mencapai volume 100 ml. Larutan 20

μg/ml disiapkan dari (20/50) x 100 = 40 ml larutan stok yang dengan pelarut diencerkan

hingga mencapai volume 100 ml, dan seterusnya untuk keseluruhan pengenceran.

Cara lain untuk menyiapkan pengenceran-pengenceran ini adalah dengan menyiapkan

masing-masing pengenceran dari larutan dengan konsentrasi terdekat. Cara ini dikenal

dengan pengenceran berseri dan dilaksanakan sebagai berikut. Larutan 30 μg/ml dan 20

μg/ml disiapkan seperti cara di atas. Larutan 10 μg/ml disiapkan dari larutan 20 μg/ml (50 ml

larutan 20 μg/ml diencerkan hingga 100 ml dengan pelarut) dan larutan 5 μg/ml disiapkan

dari larutan 10 μg/ml dengan cara yang sama. Pengenceran berseri ini mempunyai

keuntungan, yaitu penggunaan larutan stok yang lebih sedikit (100 ml dibandingkan dengan

130 ml yang dibutukan pada contoh ini), dan digunakan bilamana harga obat atau regen

mahal atau suplainya terbatas.

Aspek kuantitatif spektroskopi

Cahaya yang melewati suatu senyawa mengalami penurunan intensitas akibat tiga proses :

1. Pemantulan pada perbatasan fase (cairan/udara, kaca/cairan, dan lain-lain). Pemantulan

ini terjadi karena adanya perbedaan indeks bias pada bahan yang berbeda yang dilewati

cahaya.

2. Hamburan cahaya karena ketidakhomogenan sampel.

3. Serapan oleh atom atau molekul yang terdapat di dalam larutan.

Hilangnya intensitas karena nomor (1), dapat diatasi dengan menggunakan larutan

blangko yang tepat, karena efek perbatasan fase, pada larutan uji dan larutan blangko akan

sama.

Efek hambatan cahaya nomor (2) dapat diminimalkan dengan menyiapkan sampel secara

hati-hati, yaitu dengan memastikan bahwa sampel terlarut dengan sempurna di dalam pelarut

yang dipilih, yaitu tidak adanya gelembung udara yang menempel pada sel sampel, serta

tidak ada sidik jari, debu, maskara, ketombe, atau material yang tidak diinginkan lainnya

pada bagian luar sel yang akan memengaruhi keakuratan pengukuran serapan.

14

Kehilangan intensitas dengan alasan nomor (3) merupakan yang kita perhatikan dalam

pengukuran.

Hukum Beer dan Lambert

Aspek-aspek kuantitatif spektrofotometri didasarkan pada dua hukum yang sangat mirip.

Pertama adalah hukum Beer (Gambar 7.16), yang menyatakan bahwa “intensitas seberkas

cahaya monokromatik yang parallel menurun secara eksponensial dengan konsentrasi

molekul penyerap”. Hukum Beer dapat dinyatakan secara matematika sebagai :

I = I0e –kc

I0 adalah intensitas cahaya yang terdapat di dalam sampel, I adalah intensitas cahaya yang

ditransmisikan oleh sampel, k’ adalah suatu tetapan, dan c adalah konsentrasi sampel.

Gambar 7.16 Diagram hukum Beer

Dalam bentuk logaritma,

I0

Log = = k’c

I

Log (I0 / I) adalah kuantitas yang tidak berdimensi (logaritma perbandingan intensitas

cahaya), dan ditetapkan sebagai serapan. Serapan merupakan nilai yang diukur dan diplotkan

pada spektrofotometri.

Jadi Hukum Beer menyatakan bahwa serapan sebanding dengan konsentrasi.

Hubungan yang kedua adalah hukum Lambert, yang menyatakan bahwa “intensitas

seberkas cahaya monokromatik yang paralel menurun secara eksponensial pada saat melewati

cahaya ketebalan medium homogen”, secara metematika dinyatakan sebagai:

15

I = I0e –k”l (7.1)

I dan I0 sama dengan yang sebelumnya, l adalah ketebalan medium yang dilewati cahaya, dan

k” adalah tetapan (yang lain).

Dalam bentuk logaritma,

I0

Log = k”l (7.2)I

Serapan sebanding dengan ketebalan medium.

Kedua persamaan dasar ini sangat mirip sehingga dapat digabungkan menjadi satu, yaitu

hukum atau persamaan Beer – Lambert, yang dapat dinyatakan dengan:

I0

Serapan = Log = kcl (7.3) I

k disini adalah tetapan lainnya, nilainya bergantung pada satuan yang digunakan untuk

konsentrasi, c.

jika satuan knsentrasi adalah molaritas (yaitu jumlah mol per liter), tetapannya adalah ɛ

(huruf Yunani “epsilon”) dan dikenal dengan keterserapan molar. ɛ memiliki satuan L mol-1

cm-1, walaupun satuannya jarang digunakan. ɛ sama dengan serapan larutan 1 M di dalam sel

setebal 1 cm dan biasanya bernilai besar, yaitu kurang lebih 10.000 – 20.000. pada kasus ini,

persamaan Beer – Lambert dituliskan sebagai:

A = ɛcl (7.4)

Jika konsentrasi sampel dinyatakan dalam persen berat per volume (% b/v) (yaitu gr/100

ml), tetapan yang digunakan adalah A 1%, 1 cm, biasanya dituliskan sebagai A1 , dan disebut

serapan spesifik dengan satuan dl g-1 cm-1 walaupun nilai A1 biasanya juga dinyatakan tanpa

satuan. Nilai A1 sangat berguna dalam analisis farmasi dan farmaseutikal, untuk sampel yang

berat molekulnya mungkin sampel tiak diketahui (misalnya, ketika menganalisis suatu

makromolekul, seperti protein) atau suatu campuran beberapa komponene yang dianalisis di

dalam sampel yang sama. Hal ini menghasilkan bentuk persamaan Beer – Lambert yang

paling berguna :

A = A1 cl (7.5)

16

Dari persamaan diatas, nilai ɛ dan A1 saling berhubungan, dan salah satunya dapat

dihitung dari nilai lainnya dengan menggunakan persamaan (7.6) :

A1 x massa molekular relatifɛ = (7.6)

10

Seperti yang disebutkan diatas, serapan didefinisikan sebagai log I0 / I; buku teks lama

menggunakan istilah ekstingsi (punahan), sedangkan naskah lama menyebutkan rapatan

optis. Ketiga istilah tersebut memiliki arti yang sama, tapi “serapan” adalah istilah yang harus

digunakan dalam seluruh spektroskopi analisis.

Dua istilah lain untuk intensitas cahaya di dalam spektroskopi :

Transmitan, didefinisikan sebagai perbandingan I/I0

Persentase transmitan, merupakan perbandingan yang sama yang dinyatakan dalam

persentase, yaitu 100 I/I0

Penggunaan kedua istilah ini di dalam spektroskopi analitis terbatas untuk spektroskopi

inframerah karena tidak seperti serapan, kedua istilah ini tidak memberikan hubungan linear

jika diplotkan terhadap konsentrasi.

Metode penetapan kadar obat

Ada dua metode penggunaan pengukuran spektroskopik dalam analisis obat, yaitu metode

penerapan kadar absolut dan komparatif, dan metode mana yang digunakan bergantung pada

daerah mana di samudra atlantik anda melaksanakan analisis.

Di Inggris dan Eropa, persamaan Beer – Lambert cenderung digunakan pada metode

penetapan kadar absolut. Pada prosedur ini, serapan ditentukan melalui percobaan, dan

persamaan Beer – Lambert diselesaikan untuk mendapatkan nilai c, yaitu konsentrasi obat.

Dengan alasan ini, British Pharmacopoeia dan European Pharmacopoeia menggunakan

nilai A1 dalam monografi obat.

Pada US Pharmacopoiea, metode penetapan kadar komparatif lebih disukai. Pada jenis

penetapan kadar ini, larutan standar obat yang akan dianalisis disiapkan, serapan sampel dan

standar ditentukan pada kondisi yang sama, dan konsentrasi sampel dihitung dari hubungan.

Auji [uji]= (7.7)

Astd [standar]

17

[uji] adalah konsentrasi sampel dan [standar] adalah konsentrasi standar yang disiapkan.

Metode penetapan kadar komparatif memiliki keuntungan, yaitu tetap dapat digunakan

walaupun obat mengalami reaksi kimia selama penetapan kadar (misalnya, pembentkan

derivat berwarna agar dapat dilakukannya pengukuran di daerah tampak spektrum). Akan

tetapi, kekurangannya adalah harus tersedianya sampel asli obat untuk perbandingan.

Jika melakukan penetapan kadar obat secara spektroskopi, seringkali perlu dibuat sampel

standar analit dengan berbagai konsentrasi dan ditentukan serapan masing-masing sampel

larutan tersebut. Jika data-data ini diplotkan, akan diperoleh sebuah garis lurus dengan slop

positif yang melalui titik asal. Pembuatan grafik seperti ini tidak hanya menegaskan bahwa

hukum Beer – Lambert berlaku untuk penetapan kadar pada panjang gelombang pengukuran,

tetapi juga memungkinkan grafik tersebut untuk digunakan pada tujuan-tujuan kalibrasi.

Larutan dengan konsentrasi yang tidak diketahui, disiapkan dengan cara yang sama persis

dengan larutan standar. Kemudian serapannya dibaca dari grafik kalibrasi dan dihitung

konsentrasinya. Larutan standar yang disiapkan secara terpisah dari sampel dengan cara ini

dikenal sebagai standar eksternal.

Teknik yang lebih teliti melibatkan penggunaan standar internal. Standar internal adalah

senyawa yang memiliki struktur kimia dan sifat-sifat fisika yang sama dengan sampel yang

dianalisis. Standar internal harus ditambahkan ke dalam sampel yang akan dianalisis sebelum

ekstraksi atau penetapan kadar dimulai, dan kemudian berada di dalam matriks sampel

selama penetapan kadar berikutnya. Pada penetapan kadar sampel yang kompleks, biasanya

diperlukan beberapa perlakuan pendahuluan pada sampel dan pemulihan sampel dari proses

ekstraksi tidak dapat 100%. Jika digunakan standar internal, kehilangan sampel akan

tercermin dari kehilangan standar pada jumlah yang sama, dan perbandingan sampel terhadap

standar akan bernilai tetap. Standar internal digunakan terutama dalam analisis kromatografi

(terutama kromatografi gas dan kromatografi cair kinerja tinggi). Pada analisis kromatografi,

fluktuasi parameter-parameter instrumental (misalnya, laju alir fase gerak) berpengaruh pada

keakuratan.

Pada analisis spektroskopi tertentu, digunakan pendekatan yang sama terhadap

penggunaan standar internal, yaitu teknik penambahan standar. Pada teknik ini, dilakukan

penambahan larutan standar analit dengan volume meningkat ke dalam suatu sampel

bervolume tetap, dan pembuatan grafik kalibrasi. Grafik pada penetapan kadar penambahan

standar memiliki kemiringan positif, tetapi memotong sumbu y pada nilai serapan positif.

Jumlah obat di dalam sampel diperoleh melalui ekstrapolasi grafik kalibrasi ke titik

18

perpotongan antara garis dengan sumbu -x (yaitu ketika y = 0 didalam persamaan garis),

seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.17.

Gambar 7.17 Grafik kalibrasi yang menggunakan metode penambahan standar

Metode penambahan standar banyak digunakan dalam spektroskopi atom (misalnya,

penentuan ion-ion Ca2+ di dalam serum dengan menggunakan spektrofotometri emisi atom),

dank arena beberapa alikuot sampel dianalisis untuk menghasilkan grafik kalibrasi, akurasi

dan presisi penetapan kadar harus ditingkatkan.

Spektroskopi inframerah

Spektroskopi inframerah merupakan teknik yang sangat berguna untuk pengdentifikasian

senyawa-senyawa yang tidak dikenal, misalnya produk dari suatu sintesis atau metabolit

kemih dari seekor hewan percobaan, terutama ketika digunakan bersama-sama dengan teknik

elusidasi struktur lainnya, seperti resonans magnetik nuklir dan spektrometri massa.

Daerah inframerah spektrum elektromagnetik merupakan daerah cahaya dengan panjang

gelombang 2,5 – 15μm (yaitu 2,5 x 10-6 - 15 x 10-6 m) dan penyerapan cahaya ini oleh

molekul menyebabkan perubahan energi getaran molekul pada keadaan dasarnya. Seperti

yang telah dinyatakan sebelumnya, transisi getaran selalu terkait dengan perubahan pada

putaran atom di sekitar ikatan kimia. Ini analog dengan transisi elektronik pada penyerapan

energy ultraviolet yang juga menghasilkan transisi getaran dan putaran. Kegunaan inframerah

berdasarkan pada fakta bahwa masing-masing puncak pada spektrum dapat ditentukan

sebagai suatu ikatan atau gugus fungsi tertentu di dalam molekul. Ini sering berarti bahwa

spektrum inframerah adalah kompleks, dengan adanya kemungkinan sebanyak 20-30 puncak

berada pada satu spektrum. Akan tetapi, identifikasi senyawa-senyawa kimia yang tidak

dikenal dibuat menjadi mudah karena beberapa gugus fungsi selalu tampak pada daerah

spektrum inframerah yang sama.

Ikatan-ikatan tunggal (misalnya, O – H, N – H, C – H) menyerap pada bagian spektrum

berfrekuensi tinggi (kira-kira 4000 – 2100 cm-1). Ini disebabkan oleh rendahnya massa atom

hidrogen yang menyebabkan getaran terjadi pada frekuensi tinggi. Ikatan rangkap tiga

19

(misalnya, CN-) menyerap pada frekuensi kira-kira 2100 – 1900 cm-1 sementara ikatan

rangkap dua (misalnya C=O, C=C) menyerap pada frekuensi kira-kira 1900 – 1500 cm-1.

Deaerah spektrum inframerah memiliki bilangan gelombang kira-kira kurang dari 1500 cm -1

akibat peregangan molekul secara akurat. Daerah spektrum ini disebut daerah sidik jari,

karena pola puncak yang terjadi pada derah ini khas bagi senyawa yang diujikan dan tidak

ada senyawa lain yang memilikinya. Sifat-sifat ini digunakan di dalam British Farmacopoeia

yang menyatakan bahwa dua sampel akan dikatakn sama jika spektrum inframerah yang

diperoleh pada kondisi yang sama, serupa secara keseluruhan, yaitu puncak yang sama berada

pada posisi dan intensitas yang sama. Spektrum inframerah pembanding dari sampel otentik

sebuah obat dipublikasikan di dalam BP untuk pemeriksaan identitas sampel yang tidak

dikenal.

Analisis kuantitatif dengan menggunakan spektroskopi inframerah

Aturan Beer – Lambert yang diturunkan di atas (persamaan 7.3) berlaku juga pada

serapan radiasi inframerah obat molekul. Selain itu, spektrum penyerapan inframerah

memiliki kelebihan dibandingka dengan penyerapan ultraviolet yang lebih umum, yaitu

jumlah pita yang ada lebih banyak. Seringkali (dimungkinkan untuk) memilih pita

penyerapan untuk setiap komponen suatu campuran yang memiliki sedikit atau tidak

memiliki interferens di antara pita-pita tersebut. Karena alasan-alasan ini, spektroskopi

inframerah sering digunakan secara kuantitatif di laboratorium analitik untuk menentukan

konsentrasi obat di dalam larutan. Kurva kalibrasi untuk penetapan kadar dapat diperoleh

(dan berdasarkan hukum Beer) dengan mengubah spektrum yang tercetak menjadi I0 dan I

dengan menggunakan teknik garis dasar, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.18. Jarak

dari garis dasar ke bagian paling bawah halaman ditunjukkan dengan I0, yaitu cahaya yang

tersedia untuk penyerapan, sedangkan jarak dari puncak ke bagian paling bawah halaman

ditunjukkan sebagai I, yaitu cahaya yang ditransmisikan melalui sampel. Bentuk logaritma

(bilangan dasar 10) perbandingan I0 / I diperoleh sebagaimana sebelumnya untuk

mendapatkan nilai serapan. Perhatikan bahwa spektrum inframerah biasanya diplot “terbalik”

sehingga serapan nol berada di puncak spektrum (seperti yang biasanya ditunjukkan) dan

serapan 100% berada pada bagian dasar. Perlu diperhatikan juga bahwa spektroskopi

inframerah memiliki idiosinkrasi (keanehan) karena menggunakan bilangan gelombang

(“kebalikan sentimeter”, cm-1) dan bukan panjang gelombang sumbu x, dan persentase

transmitan (bukan serapan) pada sumbu y.

20

Gambar 7.18 Penerapan teknik garis dasar

Perbedaan utama antara spektroskopi inframerah dan ultraviolet terletak pada

konsentrasi yang diperlukan untuk penetapan kadar. Pada spektroskopi inframerah, harus

disiapkan larutan sampel 10% b/v. Ini berarti panjang lintasan sel yang digunakan dalam

inframerah sangat pendek., biasanya 0,025 – 0,1 mm (kalau tidak, nilai serapannya akan

terlalu besar). Masalah lain pada spektrum inframerah adalah pelarut yang digunakan dalam

penetapan kadar (biasanya kloroform atau diklorometan) juga memiliki ikatan kimia dan

akan menyerap radiasi inframerah pada beberapa bagian spektrum sehingga mengaburkan

penyerapan sampel pada panjang gelombang tersebut. Sampel disiapkan di dalam larutan,

mull atau pasta yang dibuat dengan paraffin cair (Nujol), atau di dalam cakram padat yang

dibuat melalui trituasi dengan kalium bromide kering dan kemudian dilanjutkan dengan

pengempaan dalam pengempa hidraulik.

Fluorimetri

Fluorimetri adalah suatu teknik analitik yang berdasarkan pada emisi energi elektromagnetik

oleh molekul. Kromoform molekul dapat menyerap cahaya (biasanya pada daerah ultraviolet

spektrum elektromagnetik) dan mengemisikannya kembali (biasanya pada daerah tampak

spektrum) untuk diukur dengan sebuah detektor. Untuk melakukan hal ini, kromofor

(terkadang disebut fluorofor) harus dilindungi dari proses normal yang dapat menyebabkan

hilangnya energi pada keadaan tereksitasi (misalnya, benturan antar molekul). Cahaya yang

diemisikan oleh sampel selalu memiliki panjang gelombang yang lebih panjang (berenergi

lebih rendah) dibandingkan dengan cahaya yang diserap oleh molekul. Hal ini dikarenakan

proses transfer energi yang terjadi di dalam keadaan tereksitasi molekul tidak efisien 100%.

Sebagian energi yang terserap hilang (misalnya, pada transisi getaran) sehingga cahaya yang

21

diemisikan sebagai fluoresensi memiliki energi yang lebih rendah dibandingkan cahaya yang

diserap.

Alat yang digunakan untuk mengukur fluoresensi, yaitu spektrofluorimeter, memerlukan

sumber cahaya berenergi besar (biasanya lampu busur xenon) untuk membebaskan energi

yang diperlukan untuk mengeksitasi molekul, dan detektor alat tersebut biasanya ditempatkan

pada posisi 90o terhadap sumber cahaya untuk meminimalkan deteksi cahaya langsung dari

sumber cahaya. Spektrofluorimeter juga memerlukan dua monokromator, satu monokromator

untuk memilih panjang gelombang cahaya eksitasi, dan yang lainnya untuk memilih panjang

gelombang cahaya yang diemisikan oleh sampel. Spektrofluorimeter analitik banyak

digunakan dalam analisis farmaseutikal, terutama untuk penetapan kadar obat yang sangat

potensi (highly potent drug) yang terdapat di dalam obat-obatan dalam jumlah yang sangat

sedikit.

Ada dua kelebihan utama penggunaan fluorimetri dibandingkan dengan spektroskopi

ultraviolet :

1. Keberadaan dua monokromator, dan fakta bahwa tidak semua molekul dengan kromofor

berfluoresensi, menunjukkan bahwa fluorometri lebih spesifik dibandingkan dengan

spektroskopi ultraviolet biasa. Ini memungkinkan obat yang berfluoresensi tetap dapat

ditentukan kadarnya walaupun terdapat senyawa-senyawa lain yang dapat mengganggu

apabila menggunakan penetapan kadar spektroskopi ultraviolet.

2. Fluorimetri kira-kira 100 kali lebih sensitive dibandingkan dengan spektroskopi

ultraviolet dan ideal untuk analisis obat-obat potensi dalam jumlah yang sangat kecil.

Contohnya adalah steroid digoksin di dalam Tablet Digoksin BP dan senyawa

kontrasepsi etinil estradiol yang memiliki kadar hanya 30 μg per tabletnya.

Pemadaman

Sesuai dengan namanya, fenomena ini merupakan penguraian intensitas cahaya yang

diemisikan selama fluoresensi. Pemadaman ini ada dua jenis, yaitu pemadaman sendiri dan

pemadaman oleh yang lain, yaitu senyawa non-fluoresensi.

22