soal praktikum 1 ibo-aussie ind

EXAMINATION # 1: Molecular Laboratory TASK 1

TEST PRAKTIKUM 1: LABORATORIUM MOLEKULER

Test praktikum ini terdisi dari dua tugas

Tugas 1 : Mengukur aktivitas enzim (bobot nilai =20, Waktu 45 menit)

Tugas 2: Memisahkan protein dengan kromatografi dan elektroforesis (bobot nilai =20,

Waktu 45 menit)

1

Country: Indonesia


TUGAS 1

PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM

PENDAHULUAN

Alkohol dehidrogenase (ADH) adalah enzim yang dapat mengoksidasi etanol menjadi asetaldehid menurut reaksi sebagai berikut:

Etanol + NAD+ asetaldehid + NADH + H+

Kofaktor nicotinamide adenin dinukleotida (NAD+) direduksi dalam reaksi ini. Perkembangan reaksi dapat dimonitor dengan mengukur konsentrasi NADH pada panjang gelombang 340nm.

Pada tugas praktek ini anda akan menggunakan spektrofotometer untuk mengukur aktivitas enzim pada berbagai konsentrasi etanol

BAHAN-BAHAN DAN ZAT KIMIA YANG DIPEROLEH SETIAP PESERTA

Zat Kimia

Larutan etanol :

0.5M, 0.25M, 0.125M, 0.063M

Bufer reaksi :2mM NAD+ dalam bufer 80mM sodium fosfatpH 7.4 yang mengandung 40mM KCl

Enzim:

0.04 mg/ml larutan alkohol dehydrogenase

Alat

Spektrofotometer yang telah diset dengan panjang gelombang 340nm

Pipet ukur: 1000L, 100L dan 20L, dengan tips

Wadah kuning untuk sampah tip (t or reverse)

Cuvet plastic 1 mL dan pemegangnya

Pengaduk cuvet plastic

Timer

Pen/tinta marker

2


Kacamata pelindung

Sarung tangan sekali pakai

Kertas grafik dengan sumbu yang telah di set

Penggaris

Pen hitam

PROSEDUR PERCOBAAN

Siapkan campuran reaksi duplo berikut dalam kuvet plastik 1 ml, seperti yang terlihat dalam tabel:

Reaksi No. Buffer Reaksi Larutan etanol

1a 0.9 mL 0.1ml of 0.063M

1b 0.9 mL 0.1ml of 0.063M

2a 0.9 mL 0.1ml of 0.125M

2b 0.9 mL 0.1ml of 0.125M

3a 0.9 mL 0.1ml of 0.250M

3b 0.9 mL 0.1ml of 0.250M

4a 0.9 mL 0.1ml of 0.500M

4b 0.9 mL 0.1ml of 0.500M

Masing-masing peserta diberi sebuah spektrofotometer. Terdapat dua model spektrofotometer, tetapi keduanya akan memberikan hasil yang sama.

Spektrofotometernya telah diatur agar mengukur pada panjang gelombang 340 nm. Lakukan langkah-langkah berikut untuk menyiapkan pengukuran aktivitas enzim.

Apabila Saudara menggunakan Spectrophotometer Hitachi U-1100 Letakkan kuvet yang berisi campuran reaksi untuk reaksi 1a pada posisi 1 (depan) dari tempat

kuvet. Tutup tutupnya. Untuk mengatur absorbans menjadi nol, tekan tombol 100%T/ 0 ABS (diberi label dengan

bulatan merah). Absorbans harus terbaca 0,000.

3


Apabila Saudara menggunakan Spectrophotometer Hitachi U-1800 Letakkan kuvet yang berisi campuran reaksi untuk reaksi 1a pada posisi 1 (depan) dari tempat

kuvet. Tutup tutupnya. Untuk mengatur absorbans menjadi nol, tekan tombol “AUTO ZERO” (diberu label dengan

bulatan merah). Absorbans harus terbaca 0,000.

Lakukan pengukuran aktivitas enzim satu per satu, dimulai dengan Reaksi no. 1a:

(a) Letakkan kuvet yang berisi campuran reaksi ke dalam spektrofotometer.

(b) Untuk memulai masing-masing reaksi, tambahkan 10 L “Enzim” ke dalam kuvet yang diletakkan dalam spektrofotometer.

(c) Segera , tetapi perlahan-lahan campur larutan dalam kuvet dengan pengaduk plastik putih, tutup spektrofotometer, atur absorbans menjadi nol DAN langsung nyalakan stopwatch.

(d) Catat nilai absorbans tepat satu menit kemudian. Ini merupakan nilai absorbans pada t = 1 menit. Nilai ini sama dengan laju reaksi enzim (disebut sebagai « V »), dinyatakan sebagai perubahan (∆) absorbans pada 340 nm dalam waktu 1 menit (∆A340 /min) dari t = 0 ke t = 1 menit. Masukkan nilai yang diperoleh pada Tabel hasil dalam kolom 1.

ANALISIS DAN INTERPRETASI DATA

Lengkapi tabel untuk menentukan ∆A340 /min untuk masing-masing pasangan reaksi. Masukkan nilai ini dalam kolom 2.

Untuk bagian grafik dari test praktek berikutnya, tentukan juga nilai dari 1/Vaverage dan masukkan ke dalam kolom pada tabel sebelah kanan. Nilai dari 1/S (satuan mM-1), dimana S = konsentrasi substrat (etanol) dalam mM, telah dimasukkan nilainya dalam kolom terakhir. Misalnya, untuk reaksi 4a dan 4b, konsentrasi etanol dalam reaksi sebenarnya adalah 50mM, sehingga 1/S = 0.02 mM-1.

Kolom

1

Kolom

2

Data untuk diplot dalam grafik

4


MASUKKAN NILAI-NILAI DARI KOLOM 2 KE LEMBAR JAWABAN

(bobot nilai 8 – masing-masing bobot nilai 2)

5


Apabila hasil-hasil yang Saudara peroleh ditampilkan sebagai laju enzim (V), dinyatakan dalam ∆A340 /menit, terhadap konsentrasi etanol (S), makan akan dihasilkan grafik dengan bentuk berikut ini. Ini menunjukkan bahwa laju reaksi enzim meningkat dengan peningkatan konsentrasi substrat hingga mencapai nilai laju maksimum (Vmax). Dari grafik ini, Km, nilai yang sama dengan konsentrasi substrat pada setengah laju maksimum, dapat ditentukan.

Cara yang lebih akurat untuk menentukan nilai Km adalah dengan menggunakan grafik 1/V terhadap 1/S. Titik dimana garis grafik memotong sumbu X sama dengan – 1/Km. Gunakan grafik dengan gambar axis yang telah disediakan untuk menggambarkan garis yang paling tepat dengan hasil-hasil percobaan Saudara.

Dari grafik ini tentukan Km

PERIKSA ULANG NILAI Km SAUDARA DAN SATUANNYA. (bobot nilai = 6 )

6

1/S

1/V

- 1/Km

Km = mM

S

V

Vmax

Km

Vmax/2


Asai alkohol dehidrogenase dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi etanol yang ditambahkan pada bahan bakar motor. Misalnya Saudara seorang peneliti pada lab uji, dan Saudara diberi 10 mL sampel bahan bakar untuk menguji konsentrasi etanol. Setelah ekstraksi sampel untuk menghilangkan sisa pelarut, Saudara memperoleh 100 mL sampel air yang mengandung etanol. Dengan menggunakan spektrofotometer seperti yang sebelumnya sudah dilakukani, Saudara diminta untuk menguji konsentrasi etanol dalam 0,1 mL larutan air ini. Laju reaksi enzim (V), dinyatakan dalam ∆A340 /menit, yang Saudara peroleh adalah 0,175. Saudara juga melakukan uji yang sama terhadap larutan etanol standar, dan Saudara memperoleh grafik seperti yang sudah disediakan. Gunakan grafik untuk menentukan konsentrasi molar dari etanol pada sampel bahan bakar semula. (bobot nilai =2)

Cara yang lebih umum untuk menyatakan konsentrasi etanol adalah dalam %, misalnya g/100mL. Tentukan % etanol dalam sampel bahan bakar awal, bila rumus kimia etanol adalah CH3CH2OH dan berat atomnya (g/mol): C = 12, H = 1, O = 16. (bobot nilai = 2)

Spektrum absorbsi cahaya dari NAD+ and NADH terlihat pada Gambar berikut ini

Pernyataan mana saja berikut ini (1-7) yang benar? Tentukan pilihan jawaban pada halaman berikutnya (bobot nilai = 2)

1. Puncak absorbsi terlihat pada 340 nm

2. Hanya NAD+ mengabsorbsi cahaya pada 340 nm

3. Hanya NADH mengabsorbsi cahaya pada 340 nm

4. NAD+ mengabsorbsi cahaya pada 260 nm dan 340 nm

5. NADH mengabsorbsi cahaya pada 260 nm dan 340 nm

6. Apabila alat spektrofotometer diatur menjadi 330 nm, dan bukan 340 nm, maka laju reaksi enzim (∆A/min) akan menjadi lebih rendah.

7. Apabila alat spektrofotometer diatur menjadi 350 nm, dan bukan 340 nm, maka laju reaksi enzim (∆A/min) akan menjadi lebih tinggi

7


Kombinasi dari semua pernyataan yang benar adalah:

A) 1, 2, 4, 6

B) 1, 2, 5, 7

C) 1, 3, 5, 6

D) 1, 2, 5, 6

E) 1, 3, 4, 7

F) 2, 4, 5, 6

G) 1, 2, 4, 7

H) Kombinasi di atas tidak ada yang benar

I) Semua kombinasi di atas benar

8


TUGAS 2

PEMISAHAN PROTEIN DENGAN METODE KROMATOGRAFI DAN ELEKTROFORESIS

PENTING: Tugas ini terdiri dari dua bagian

BAGIAN A

KROMATOGRAFI PERTUKARAN ION

PENDAHULUANKromatografi pertukaran ion adalah teknik untuk memisahkan protein berdasarkan muatan listrik keseluruhan. Pemisahan seperti ini bergantung kepada sifat asam-basa dari protein yang relevan dan muatan dari matriks kromatografi yang digunakan untuk memisahkannya. Karena muatan netto dari suatu protein bergantung kepada pH, maka kromatografi pertukaran ion hanya akan efektif dalam kondisi pH tertentu. Pada pH 8,0, matriks pertukaran kation, seperti Hi-Trap “SP” yang digunakan dalam tugas ini, membawa muatan negatif sehingga mengikat protein bermuatan positif. Ion dalam larutan yang memiliki muatan yang sama dengan protein akan bersaing dengan protein dalam mengikat matriks. Ion bersaing yang berlebih akan mencegah atau memutuskan pengikatan protein, sehingga ter-elusi dari matriks (tercuci ke luar dari kolom).

Pada percobaan ini, akan diberikan sampel protein yang mengandung dua protein, albumin dan sitokrom c. Albumin, protein penting dalam plasma darah, memiliki berat molekul 68.000 dalton (Da) dan terdiri dari suatu rantai tunggal asam amino. Sitokrom c berfungsi dalam transport elektron pada mitokondria dan terdiri dari suatu rantai tunggal asam amino yang terikat pada gugus heme yang mengandung besi dan mengabsorpsi sinar tampak pada panjang gelombang 410 nm. Sitokrom c memiliki berat molekul total 12.400 Da. Struktur ‘pita’ dari kedua protein tersebut ditunjukkan berikut ini: albumin (kiri), sitokrom c (kanan).

9


Pada sesi ini anda akan menggunakan kromatografi pertukaran ion untuk memisahkan albumin dan sitokrom c.

BAHAN DAN REAGEN YANG DISEDIAKAN BAGI SETIAP PESERTA

Bahan kimia

Sampel protein: 4 mg/mL albumin dan 4 mg/mL sitokrom c

Buffer 1: 50mM Tris-HCl, buffer pH 8,0.

Buffer 2: 50mM Tris-HCl, buffer pH 8,0 mengandung 0.5M NaCl

Reagen Uji Protein

Peralatan

Kolom mengandung matriks pertukaran kation (Hi-Trap SP)

Klem pemegang kolom

Syringe sekali-pakai 2 x 5mL (ditandai “Buffer 1” dan Buffer 2”)

1 x 1mL disposable syringe (ditandai “Protein sample” )

Pipet ukur dengan tips

Wadah kuning “sharp bin” untuk membuang tips

Pelat mikrotiter dgn. 96 sumur

Gelas beaker plastik

Kacamata pengaman

Sarung tangan sekali pakai

Pena untuk menandai

TATA KERJA

1. Kolom pertukaran ion telah diseimbangkan dengan Buffer 1 (50mM Tris-HCl, pH 8.0) dan siap untuk dipakai.

2. Pipetlah 5mL Buffer 1 ke dalam syringe plastik 5-mL yang telah ditandai “Buffer 1”.

3. Buka tutup putar hitam dari sumbat saluran keluar pada bagian bawah kolom

4. Masukkan syringe ke bagian atas kolom dengan cara menekan dengan kuat ke dalam adaptor hitam.

5. Masukkan 1 mL buffer ke dalam kolom dengan menekan syringe secara perlahan dan merata. Buang sisa ke dalam gelas beaker plastik.

6. Sekarang pipetlah 0.2mL sampel protein ke dalam syringe plastik 1 mL.

7. Masukkan sampel protein ke dalam kolom dengan menekan syringe secara perlahan dan merata. Pada saat memasukkan, mulailah mengoleksi setiap fraksi sebanyak 4 tetes kedalam setiap sumur pada Baris A dari pelat mikrotiter.

10


8. Setelah sampel selesai dimasukkan, ganti syringe dengan syringe yang mengandung 5mL Buffer 1.

9. Lanjutkan mengoleksi fraksi 4-tetes kedalam masing-masing sumur pelat mikrotiter pada Baris A.

10. Jika Baris A telah selesai (Fraksi 1-12), pasang kembali tutup dari lubang keluar kolom dan lepaskan syringe dari kolom.

11. Isi syringe baru dengan 5mL buffer 2 (Bufer 50mM Tris-HCl, pH 8.0 yang mengandung 0.5 M NaCl).

12. Pasang syringe baru tersebut ke dalam kolom, lepaskan tutup lubang keluar kolom, dan lanjutkan mengoleksi fraksi 4 tetes kedalam sumur-sumur pada Baris C dari pelat mikrotiter dengan.

13. Jika Baris C telah selesai (Fraksi 13-24), tutup kembali aliran keluar kolom (pasang tutup lubang keluar kolom).

14. Gunakan pipet ukur untuk memindahkan 20L dari sumur dari Baris A (Fraksi 1-12) ke dalam sumur yang sesuai pada Baris B

15. Demikian pula, pindahkan 20L dari setiap sumur dari Baris C (Fraksi13-24) ke dalam sumur Baris D.

16. Gunakan pipet ukur untuk menambahkan 200L Reagen Uji Protein ke setiap sumur mikrotiter pada Baris B dan D. Reagent ini akan bereaksi dengan protein dan menghasilkan warna biru sehingga dapat diukur dengan spektrofotometer pada 595 nm menggunakan alat pembaca pelat mikrotiter

17. Cek dan buanglah gelembung udara dalam sumur pelat mikrotiter anda (Kerjakan dengan hati-hati, gunakan tip bersih berwarna kuning).

18. Alat pembaca pelat akan mengukur absorbansi fraksi-fraksi pada panjang gelombang 595nm dan 410nm.

Pertanyaan

Q1. Fraksi mana (1-24) yang menghasilkan puncak pertama pada A595? (nilai 1)

Q2. Fraksi mana (1-24) yang menghasilkan puncak kedua A595? (nilai 1)

Q3. Fraksi mana (1-24) yang menghasilkan puncak A410 (nilai 1)

Q4. Kurangi hasil fraksi yang didapat pada jawaban Q1 dari fraksi yang didapat dari Q2 dan tuliskan hasilnya (nilai 1)

Q5. Pada fraksi yang mana (1-24) puncak dari sitokhrom c terelusi? (nilai 4)

Q6. Pada percobaan yang anda lakukan dapat anda catat bahwa satu protein langsung terelusi, sedangkan protein yang kedua memerlukan penambahan garam untuk dielusi. Jelaskan pernyataan tersebut berdasarkan pernyataan di bawah ini:

1. Garam menetralkan interaksi ionik antara matriks dan protein kedua yang terelusi

2. Protein yang terelusi pertama lebih memiliki muatan positif daripada protein yang terelusi dengan garam

3. Protein yang terelusi pertama lebih bermuatan negatif daripada protein yang dielusi dengan garam.

11


4. Protein yang terelusi pertama terelusi karena ukurannya lebih besar daripada protein yang dielusi dengan garam.

5. Protein yang terelusi pertama terelusi karena ukurannya lebih kecil daripada protein yang dielusi dengan garam.

Kombinasi yang mana dari pernyataan di atas yang benar? (nilai 2)

A. 1, 2

B. 1, 3

C. 2, 3, 4

D. 1, 3, 4

E. 2, 3, 4

F. 1, 3, 5

G. 2, 3, 5

Q7. Percobaan berikutnya, tambahkan protein ketiga (Protein X) ke dalam sampel protein yang mengandung albumin dan sitokhrom c dan lakukan pemisahan dengan kromatografi perpindahan ion seperti pada percobaan yang pertama dan deteksi secara tepat seperti yang sebelumnya. Susunan hasil yang diperoleh dari pembacaan pelat dapat dilihat pada grafik di bawah ini: Puncak elusi yang sesuai dengan Protein X diberi tanda X. Agar lebih memudahkan, dua protein lain diberi tanda “A” dan “B”.

Pertimbangkan pernyataan-pernyataan berikut ini:

1. Protein X memiliki muatan kurang positif dibandingkan protein B

2. Protein X memiliki muatan lebih positif dibandingkan protein B

3. Protein X mengandung komponen non-polypeptide

4. Protein X adalah 100% polypeptide

5. Protein X dielusi setelah protein A sebab lebih besar

6. Protein X dielusi setelah protein A sebab lebih kecil

Pilihlah kombinasi pernyataan di atas yang benar: (nilai 4)

12

Fraksi

1 12

A595

A410

X

13 24

BA


A. 1, 3

B. 2, 3

C. 1, 3, 5

D. 2, 3, 6

E. 2, 3, 5

F. 1, 3, 6

13


BAGIAN B

GEL ELECTROFORESIS DUA-DIMENSI

Diagram di bawah menunjukkan hasil percobaan dimana campuran dari albumin, sitokrom c dan lainnya, protein yang tidak diketahui, dipisahkan dengan gel elektroforesis dua dimensi. Pada teknik ini, protein dipisahkan pada dimensi pertama berdasarkan titik isoelektrik (pI) diikuti oleh pemisahan dimensi kedua berdasarkan massa molekul/berat molekul. Titik isoelektrik adalah pH dimana muatan total (positif dan negatif) pada protein adalah nol. Titik isoelektrik (pI) albumin 4.9 dan sitokrom c 10.7. Masing-masing protein kemudian dideteksi menggunakan pewarnaan protein. Setiap bercak protein diberikan identitas alfabet.

Jawablah pertanyaan berikut:

Q8. Bercak manakah yang merupakan albumin? (nilai 2)

Q9. Bercak manakah yang merupakan sitokhrom c? (nilai 2)

Q10. Fosforilasi merupakan modifikasi protein yang umum terjadi setelah protein tersebut disintesis. Protein-protein yang terfosforilasi dapat memiliki jumlah gugus fosfat bermuatan negatif yang bervariasi; hal ini juga sedikit meningkatkan berat molekulnya.

Q11. Dari data yang diperlihatkan di atas, pilihlah kelompok protein yang paling baik merepresentasikan keadaan dimana sebuah “induk” protein telah dimodifikasi untuk menghasilkan sejumlah protein terfosforilasi yang lebih sedikit. Urutkan protein-protein dari kelompok ini, dimulai dari induk protein yang tidak terfosforilasi berturut-turut ke protein yang paling terfosforilasinya. (nilai 2)

14

pH2 4 6 8 10 12

5,000

100,000

80,000

60,000

40,000

20,000

14

A B C

D E FG H

I

J K L

MNO

PQR

STU

V W X Y Z

Massa molekul (Da)

soal praktikum 1 ibo-aussie ind

Documents