seminar nasional perikanan indonesia 2010 02...

SEMINAR NASIONAL PERIKANAN INDONESIA 2010

02-03 Desember 2010, Sekolah Tinggi Perikanan

409

EKSTRAKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM KOLAGENASE DARI ORGAN DALAM IKAN TUNA (Thunnus sp.) 1

Tati Nurhayati2, Ella Salamah2, Riri Kumaila3 dan Rosita A.J. Lintang2)

ABSTRAK

Dewasa ini penggunaan enzim banyak dimanfaatkan dalam industri pangan maupun non-pangan. Sifat enzim yang alami, ekonomis, serta penggunaannya yang efektif dan efisien menimbulkan suatu pemikiran dalam mencari dan menemukan enzim baru yang memiliki karakteristik unik terutama yang bersumber dari hasil perairan. Salah satu hasil perairan yang memberikan kontribusi limbah cukup besar adalah ikan tuna. Organ dalam ikan tuna merupakan salah satu limbah industri yang masih bisa dimanfaatkan karena banyak mengandung protease, salah satunya adalah enzim kolagenase.

Penelitian ini terdiri dari tiga tahap, yaitu ekstraksi enzim kolagenase, pemurnian enzim kolagenase secara parsial dengan ammonium sulfat, serta karakteristisasi enzim kolagenase.

Ekstrak kasar enzim kolagenase mempunyai aktivitas spesifik 0,025 U/mg, setelah diendapkan dengan ammonium sulfat 70 % kejenuhan aktivitas spesifiknya meningkat menjadi 0,026 U/mg sehingga mempunyai kelipatan pemurnian 1,04 kali. Karakteristik enzim tersebut, yaitu bekerja optimum pada pH 8 dan suhu 60 oC, aktivitasnya meningkat dengan adanya ion Ca2+, EDTA, dan pepstatin, sebaliknya menurun dengan adanya ion Ba2+

dan PMSF. Kata kunci: Ikan tuna (Thunnus sp.), karakterisasi, kolagenase PENDAHULUAN

Dewasa ini penggunaan enzim banyak dimanfaatkan dalam industri pangan maupun non-pangan. Enzim sebagai biokatalisator alami dalam konsentrasi kecil sudah dapat bekerja terhadap substrat tanpa membentuk produk samping yang tidak diinginkan. Fungsi enzim dalam mempercepat reaksi memberikan keuntungan bagi industri, hal ini disebabkan oleh sifat kerja enzim yang selektif dan memiliki daya katalitik yang tinggi, sehingga dapat digunakan dalam jumlah yang sedikit, dengan demikian dapat menghemat waktu dan biaya. Sifat enzim yang alami, ekonomis serta penggunaannya yang efektif dan efisien menimbulkan suatu pemikiran dalam mencari dan menemukan enzim baru yang memiliki karakteristik unik terutama yang bersumber dari hasil perairan.

Hasil perairan yang banyak menghasilkan limbah antara lain adalah ikan tuna. Ikan tersebut memiliki produksi rata-rata sebesar 736.170 ton, dan pemanfaatannya sudah mencapai 78,97 % (Direktorat Pengolahan Hasil 2006). Pemanfaatan ikan tuna umumnya lebih terfokus pada daging putihnya, sedangkan bagian lainnya seperti organ dalam, kepala, dan tulang, yaitu sebesar 25-30% (Prasertsan et al. 1988), belum termanfaatkan secara optimal. Salah satu cara untuk mengatasi sisa olahan tersebut adalah dengan menkonversi limbah menjadi produk yang mempunyai nilai tambah sehingga memiliki nilai jual yang tinggi secara ekonomis. Klomklao et al. (2006) melaporkan bahwa organ dalam ikan tuna mempunyai potensi yang besar sebagai sumber enzim protease. Salah satunya adalah sebagai sumber enzim kolagenase.

Kolagenase secara umum didefinisikan sebagai enzim yang mampu mendegradasi ikatan polipeptida dari kolagen tetapi tidak mendenaturasi protein (Kim et al. 2002). Kolagenase merupakan jenis enzim hidrolisis yang mempunyai banyak kegunaan dan aplikasinya dalam industri, obat-obatan, dan riset. Enzim ini dalam pengolahan perikanan digunakan dalam penyamakan kulit ikan, penghilangan membran, dan hidrolisat protein (Bjarnason 2001). Kolagenase yang telah diisolasi diantaranya berasal dari pyloricaeca ikan yellowtail (Yoshinaka et al. 1977 diacu dalam Shahidi dan Botta 1994), dan mackerel (Pan et al. 1986 diacu dalam Shahidi dan Botta 1994), bagian pankreas catfish Parasilarus asotus, (Yoshinaka et al. 1986, 1987 diacu dalam Kim et al. 2002) serta bagian organ pencernaan yang terdapat pada 19 spesies ikan (Yoshinaka et al. 1978 diacu dalam Shahidi dan Botta 1994).

Tujuan umum penelitian ini adalah memanfaatkan organ dalam ikan tuna (Thunnus sp.) sebagai sumber enzim kolagenase. 1 Dipresentasikan pada Seminar Nasional Perikanan Indonesia 2010 di Sekolah Tinggi Perikanan, 2 – 3 Desember 2010 2 Departemen Teknologi Hasil Perairan, FPIK, IPB 3 PS Ilmu Kelautan, Jurusan Manajemen Sumberdaya Perairan, FPIK, Universitas Sam Ratulangi



410

METODOLOGI Bahan dan Alat Penelitian

Bahan utama yang digunakan adalah organ dalam ikan tuna (Thunnus sp.) yang terdiri dari bagian hepatopankreas, pyloric caeca, dan hati. Bahan untuk pembuatan kolagen adalah kulit ikan tuna dan asam asetat (teknis). Bahan-bahan untuk ekstraksi dan pengendapan enzim kolagenase, yaitu Triton-X 100 (Sigma), CaCl2 (Merck), buffer Tris-HCl (pH 8,0), dan amonium sulfat ((NH4)2SO4) (teknis). Bahan kimia yang digunakan untuk analisis aktivitas enzim kolagenase dan konsentrasi protein meliputi Tris-HCl (pH 7,5), kolagen, CaCl2 (Merck), trychloroacetic acid (TCA) (Merck), tirosin (Merck), ninhydrin (Applichem), 1-propanol (Ajax Finechem), dan pereaksi Bradford. Logam-logam yang digunakan untuk karakterisasi enzim kolagenase adalah NaCl (Merck), CaCl2 (Merck), BaCl2 (Merck), MnCl2 (Merck), dan CoCl2 (Merck), sedangkan inhibitor yang digunakan adalah phenyl methyl sulfonyl fluoride (PMSF) (Merck), ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) (Merck), dan pepstatin (Sigma.

Alat-alat yang digunakan meliputi spektrofotometer (Yamato), sentrifuse regrigerator (Kokusan), inkubator (Termoline), mikropipet (pipetman), alat-alat gelas, tip, eppendrof, tabung reaksi, timbangan analitik, homogenizer, hot plate (Yamato) dan oven (Yamato). Metode Penelitian

Penelitian ini terdiri dari tiga tahap, meliputi tahap (1), yaitu ekstraksi enzim kolagenase; tahap (2), yaitu melakukan pemurnian enzim kolagenase secara parsial dengan ammonium sulfat; dan tahap (3), yaitu karakterisasi enzim kolagenase. Ekstraksi enzim kolagenase dari organ dalam ikan tuna (Thunnus sp.) (Moore dan Stein (1954) diacu dalam Kim et al. (2002))

Organ dalam segar dicuci dengan air dingin, lalu ditambahkan dengan 100 mM buffer Tris-HCl (pH 8,0) yang terdiri dari 0,25 % Triton-X 100 dan 10 mM CaCl2, dengan perbandingan bahan baku : larutan buffer 1:5. Campuran larutan tersebut dihomogenkan, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 7.000 rpm selama 20 menit. Pelet yang diperoleh, disentrifugasi kembali dengan kecepatan 7000 rpm selama 20 menit menggunakan larutan buffer yang sama. Perbandingan antara bahan baku : larutan buffer sebesar 1:3. Supernatan yang dihasilkan ditambahkan dengan 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) yang terdiri dari 0,36 mM CaCl2, kemudian didiamkan pada suhu rendah (± 4 oC) selama 48 jam. Larutan yang dihasilkan merupakan ekstrak kasar kolagenase yang akan digunakan untuk pengujian selanjutnya. Pada tahap ini dilakukan analisis aktivitas enzim dengan metode Moore dan Stein (1954) diacu dalam Park et al. (2002). Pengendapan (presipitasi) enzim kolagenase (Moore dan Stein (1954) diacu dalam Kim et al. (2002))

Ekstrak kasar kolagenase yang terdapat pada supernatan dipekatkan dengan menambahkan amonium sulfat ((NH4)2SO4) dengan konsentrasi 30-80 % kejenuhan. Supernatan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 oC. Endapan yang terbentuk dilarutkan dengan 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) yang terdiri dari 0,36 mM CaCl2. Aktivitas enzim dianalisis dengan metode Moore dan Stein (1954) diacu dalam Park et al. (2002). Karakterisasi enzim kolagenase

Karakterisasi meliputi penentuan pH (4,0-9,0) dan suhu (30-70 oC) optimum, pengaruh kation Na+, Ca2+, Ba2+, Mn2+, Co2+ dalam bentuk klorida, serta pengaruh EDTA, PMSF, dan pepstatin (1 dan 5 mM). Pada tahap ini dilakukan pengukuran aktivitas enzim dengan metode Moore dan Stein (1954) diacu dalam Park et al. (2002). Analisis (1). Aktivitas enzim kolagenase (Moore dan Stein 1954 diacu dalam Park et al. 2002)

Substrat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kolagen yang dibuat menggunakan metode Lestari (1995) yang dimodifikasi. Aktivitas kolagenolitik diukur dengan metode Moore dan Stein (1954) yang telah dimodifikasi dengan cara mereaksikan 5 ml kolagen dengan 1 ml 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5) yang mengandung 5 mM CaCl2 dan 0,1 ml larutan enzim diinkubasi pada suhu 37 oC selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan penambahan 0,2 ml 50 % TCA. Setelah 10 menit pada suhu ruang, disaring menggunakan kertas saring. Supernatan (0,2 ml) dicampur dengan 1,0 ml larutan ninhydrin, diinkubasi pada suhu 100 oC selama 20 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar. Campuran tersebut diencerkan dengan 5 ml 50 % 1-propanol untuk pengukuran absorbsi dengan panjang gelombang 570 nm. Larutan buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5) yang



411

mengandung 5 mM CaCl2 digunakan sebagai pengganti larutan enzim sebagai kontrol, dan larutan tirosin digunakan sebagai larutan standar enzim kolagenase. Aktivitas enzim kolagenase dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut :

T1xPx

AAAA

UAblst

blsp

Dimana : UA Asp Abl Ast P T

= = = = = =

Jumlah enzim yang menyebabkan perubahan 1 µmol substrat per menit. Nilai absorbansi sampel Nilai absorbansi blanko Nilai absorbansi standar Faktor pengencer Waktu inkubasi (60 menit)

(2). Pengukuran konsentrasi protein (Metode Bradford) (Hamnond dan Krager 1988 diacu dalam Walker 1988)

Analisis dilakukan dengan terlebih dahulu membuat larutan bradford dan larutan standar bovine serum albumin (BSA). Larutan bradford dibuat dengan mereaksikan comassie brilian blue G-250 sebanyak 25 mg dengan 12,5 ml etanol 95 % (v/v). Setelah itu ditambahkan dengan 25 ml asam fosfat 85 % (w/v). Jika telah larut dengan sempurna maka diencerkan dengan akuades sampai 500 ml. Setelah itu larutan disaring dengan kertas saring Whatman no. 1 dan diencerkan lima kali sebelum dipakai untuk pengukuran absorbansi sampel.

Larutan standar dibuat dengan cara melarutkan 100 mg protein BSA kedalam 50 ml akuades, sebagai larutan stok dengan konsentrasi 2 mg/ml. Kemudian larutan stok diencerkan menjadi beberapa larutan dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,1-1,0 mg/ml.

Pengukuran konsentrasi protein ditentukan menggunakan metode Bradford yang dilakukan dengan cara mereaksikan 0,1 ml larutan sampel enzim, kemudian ditambahkan dengan 5 ml larutan Bradford. Larutan tersebut diinkubasi selama lima menit dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.

Nilai absorbansi yang didapat kemudian dimasukkan ke dalam kurva standar bradford untuk menentukan konsentrasi protein yang terkandung dalam sampel enzim. Analisis Data

Hasil yang diperoleh dari pengukuran aktivitas enzim kolagenase dan pengukuran konsentrasi protein dihitung nilai rata-ratanya. Nilai rata-rata tersebut dihitung menggunakan rumus berikut (Walpole 1992): X = Nilai rata-rata N = Jumlah data Xi = Nilai X ke-i HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstraksi dan Pemekatan Enzim dengan Pengendapan Amonium Sulfat

Proses ekstraksi enzim kolagenase dilakukan dengan cara homogenisasi, sentrifugasi, dan filtrasi. Enzim kolagenase yang dihasilkan masih berupa larutan encer dengan aktivitas enzimatik yang rendah serta masih mengandung banyak zat pengotor. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh ekstrak kasar enzim kolagenase dengan aktivitas sebesar 0,030 U/ml dan aktivitas spesifik sebesar 0,025 U/mg.

Ekstrak enzim dalam supernatan diendapkan dengan menambahkan garam. Garam yang digunakan untuk mengendapkan enzim kasar kolagenase adalah amonium sulfat (NH4)2SO4. Garam tersebut dapat menstabilkan protein dari proses denaturasi, proteolisis maupun kontaminasi bakteri. Presipitasi atau pengendapan protein dapat disebabkan oleh perubahan pH atau kekuatan ion, adanya penambahan pelarut organik atau senyawa lainnya sehingga molekul protein terkumpul.

Nilai aktivitas enzim dan konsentrasi protein enzim kolagenase yang telah ditambahkan amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi kejenuhan (30-80 %) disajikan pada Gambar 1.

n

XiX

n

i 1



412

(a) Aktivitas enzim pada berbagai (b).Konsentrasi protein pada berbagai konsentrasi amonium sulfat konsentrasi amonium sulfat Gambar 1. Nilai aktivitas enzim konsentrasi protein enzim kolagenase yang telah ditambahkan

amonium sulfat berbagai konsentrasi kejenuhan (30-80 %) Berdasarkan pada Gambar 1a. dapat dilihat bahwa nilai aktivitas enzim lebih besar terdapat

pada endapan dibandingkan dengan supernatannya. Pada penambahan amonium sulfat dengan konsentrasi 30 % kejenuhan, nilai aktivitas enzim dalam supernatan hasil pengendapan sebesar 0,028 U/ml dengan nilai konsentrasi protein sebesar 1,223 mg/ml (Gambar 1b.) dan aktivitas spesifik sebesar 0,023 U/mg. Kemudian dengan meningkatnya konsentrasi amonium sulfat yang ditambahkan, maka nilai aktivitas enzim dalam supernatan tersebut akan semakin meningkat hingga konsentrasi 70% kejenuhan dengan aktivitas 0,049 U/ml dengan konsentrasi protein telah terendapkan dengan sempurna sebesar 1,917 mg/ml dan nilai aktivitas spesifik sebesar 0,026 U/mg. Ketika konsentrasi ammnonium sulfat dinaikkan, aktivitas enzim menurun yakni sebesar 0,014 U/ml dengan nilai konsentrasi protein sebesar 0,962 mg/ml (Gambar 1b.) dan aktivitas spesifik sebesar 0,014 U/mg pada konsentrasi 80 % kejenuhan.

Rendahnya nilai aktivitas enzim pada supernatan tersebut menunjukkan bahwa sebagian besar protein, termasuk enzim kolagenase, telah mengendap dengan penambahan amonium sulfat, sehingga aktivitas kolagenase pada supernatannya menunjukkan nilai yang rendah.

Metode dalam memonitor pemurnian enzim adalah dengan mengukur nilai aktivitas spesifik enzim dari masing-masing tahap pemurnian. Tahap pemurnian yang berhasil akan memberikan nilai aktivitas spesifik enzim yang lebih tinggi daripada tahap sebelumnya. Beberapa parameter yang digunakan antara lain adalah derajat kemurnian (perbandingan aktivitas spesifik setelah suatu tahapan proses terhadap aktivitas spesifik pada persiapan awal). Secara lengkap, data aktivitas enzim dari setiap tahapan pemurnian disajikan pada Tabel 1. Tabel 1. Peningkatan aktivitas enzim kolagenase selama proses pemurnian

Tahapan Akt. Enzim (U/ml)

Kons. Protein (mg/ml)

Akt. Spesifik (U/mg)

Derajat Kemurnian

Ekstrak kasar Hasil pengendapan

0,030 0,049

1,179 1,917

0,025 0,026

1,00 1,04

Tabel 1 menunjukkan bahwa telah terjadi peningkatan aktivitas spesifik dari nilai derajat

kemurnian yang diperoleh. Hal ini menunjukkan efisiensi tahap presipitasi yang dilakukan. Apabila dibandingkan dengan hasil yang diperoleh oleh Kim et al. (2002), derajat kemurnian yang dihasilkan enzim kolagenase dari organ dalam ikan filefish (Novoden modestrus) yang diendapkan dengan amonium sulfat sebesar 1,27 kali, maka derajat kemurnian yang diperoleh pada presipitasi kali ini lebih kecil yakni sebesar 1,04 kali. Park et al. (2002) melaporkan bahwa enzim kolagenase dari organ dalam Scomber japonicus yang diendapkan dengan aseton memiliki derajat kemurnian yang lebih tinggi yaitu 2,6 kali lipat dari ekstrak kasarnya.

Pengendapan dengan garam amonium sulfat tersebut sangat dipengaruhi oleh adanya residu asam amino hidrofobik pada permukaan tersier protein (Harris dan Angal 1989). Penambahan garam menyebabkan molekul air yang mengelilingi protein terlepas dan terikat oleh garam, dan molekul-molekul protein akan saling berikatan satu sama lain, dan tampak membentuk gumpalan-gumpalan. Protein yang telah menggumpal dipisahkan dari supernatan dengan sentrifugasi atau filtrasi. Endapan yang dihasilkan merupakan protein (termasuk enzim) yang bebas dari kontaminan non-protein (Suhartono 1989). Amonium sulfat yang digunakan sebagai garam untuk

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

30 40 50 60 70 80

konsentrasi amonium sulfat (%)

Akt

ivita

s (U

/ml)

supernatan

endapan

0

0,5

1

1,5

2

2,5

30 40 50 60 70 80

konsentrasi amonium sulfat (%)

kons

entr

asi p

rote

in (m

g/m

l)

supernatanendapan



413

mengendapkan enzim kolagenase memiliki beberapa keuntungan diantaranya adalah memiliki kelarutan yang tinggi, harganya yang relatif murah, tidak bersifat toksik untuk kebanyakan enzim, dan memiliki efek stabil terhadap beberapa enzim karena tidak mempengaruhi struktur protein (Chaplin dan Bucke 1990). Karakterisasi Enzim

Enzim dapat bekerja secara maksimal dan efisien jika berada pada kondisi yang optimum. Kondisi optimal ini berbeda-beda pada setiap enzim (Lehninger 1993). Oleh karena itu, agar enzim dapat bekerja secara optimal, maka perlu diketahui karakteristik secara biokimiawi. Karakterisasi dilakukan pada enzim kolagenase hasil pengendapan dengan amonium sulfat yang meliputi pH dan suhu optimum, pengaruh inhibitor, dan pengaruh ion logam. Secara lengkap hasil pengujian aktivitas enzim terhadap enzim kolagenase hasil pengendapan dengan amonium sulfat disajikan pada Gambar 2. (a). Pengaruh pH terhadap aktivitas (b). Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim

enzim (c). Pengaruh beberapa ion logam (d). Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas Terhadap aktivitas relatif relatif Gambar 2. Nilai aktivitas enzim kolagenase pada berbagai parameter karakterisasi enzim

Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan aktivitas maksimal. Pada Gambar 2a. terlihat bahwa enzim kolagenase hasil pengendapan, memiliki aktivitas tertinggi hingga mencapai optimalnya pada pH 8, yaitu sebesar 0,024 U/ml dan pada pH 9 aktivitas enzim masih ditemukan walaupun kemampuan enzim untuk menghidrolisis mulai mengalami penurunan. Hal ini disebabkan oleh sifat enzim yang merupakan protein. Protein dalam kondisi terlarut cenderung mudah berinteraksi dengan pelarutnya, sehingga bila terjadi perubahan pH larutan di atas maupun di bawah pH optimumnya, maka akan langsung bersentuhan dengan sisi aktifnya, akibatnya terjadi penurunan aktivitas enzim yang cepat (Scope 1987). Kim et al. (2002) yang melaporkan bahwa enzim kolagenase yang dihasilkan dari organ dalam filefish (Novoden modestrus) memiliki pH optimum 7,0-8,0. Scomber japonicus dilaporkan sebagai pH optimumnya berada di pH 7,5 (Park et al. 2002).

Penentuan suhu optimum dilakukan dengan mereaksikan enzim paada pH optimalnya pada berbagai suhu. Seperti dapat dilihat pada Gambar 2b, aktivitas enzim kolagenase dapat bekerja secara optimal pada suhu 60 oC dengan aktivitas 0,038 U/ml, akan tetapi enzim kolagenase hasil pengendapan tersebut masih mempunyai aktivitas sampai suhu 70 oC meskipun aktivitasnya mulai mengalami penurunan. Aktivitas enzim akan semakin meningkat sejalan dengan kenaikan suhu sampai tingkat optimal, dan sesudahnya aktivitas enzim akan menurun karena enzim mengalami denaturasi sehingga kehilangan sebagian aktivitasnya (Palmer 1991). Park et al. (2002) melaporkan bahwa enzim kolagenase memiliki suhu optimal 55 oC. Suhu optimum ini lebih tinggi daripada suhu optimum yang berasal dari organ dalam atlantik cod (Codus morhua) dan Carcinus

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

4 5 6 7 8 9

pH

Aktiv

itas

(U/m

l)

00,005

0,01

0,015

0,020,025

0,03

0,035

0,040,045

30 37 50 60 70

suhuak

tivita

s (U

/ml)

0

50

100

150

200

250

Kontrol Na+ Ba2+ Ca2+ Co2+ Mn2+

Kation

Akt

ivita

s re

latif

(%)

0

20

40

6080

100

120

140160

180

Kontrol EDTA PMSF Pepstatin

Inhibitor

aktiv

itas

rela

tif (%

)

1 mM5 mM



414

maenas yakni pada suhu 30 oC, sedangkan suhu optimal yang dihasilkan dari organ dalam Novoden modestrus sebesar 60 oC (Kim et al. 2002).

Ion logam mempunyai peranan penting dalam menjaga kestabilan enzim (Harper 1979). Seperti yang terlihat pada Gambar 2c, beberapa ion logam seperti Na+, Ca2+, Co2+, dan Mn2+ dapat meningkatkan nilai aktivitas enzim. Aktivitas enzim tertinggi terdapat pada penambahan ion logam Ca2+ sebesar 233,93 %, sedangkan penghambatan yang cukup besar ditunjukkan oleh Ba2+, yaitu sebesar 53,72 %. Park et al. (2002) menyatakan bahwa ion logam yang dapat menghambat aktivitas enzim kolagenase yang berasal dari organ dalam Scomber japonicus adalah Zn2+, sedangkan ion logam yang dapat meningkatkan aktivitas enzim tersebut adalah Sn2+ dengan konsentrasi ion logam sebesar 1 mM. Kim et al. (2002) melaporkan bahwa enzim kolagenase yang diekstrak dari organ dalam Filefish, Novoden modestrus dapat dihambat aktivitasnya oleh ion logam Zn2+ dan aktivitas enzim dapat ditingkatkan dengan penambahan ion logam Ca2+ dengan konsentrasi ion logam tersebut sebesar 0,06 mM.

Penambahan PMSF 1 mM dan 5 mM menyebabkan penurunan aktivitas enzim sebesar 11,87 % pada penambahan PMSF 1 mM, sedangkan pada konsentrasi 5 mM penurunan aktivitas yang terjadi sebesar 23,64 % (Gambar 2d) apabila dibandingkan dengan kontrol. Penambahan senyawa EDTA dan pepstatin dalam penelitian ini, tidak menunjukkan adanya penghambatan terhadap aktivitas enzim kolagenase. Sebagai perbandingan, penelitian yang dilakukan oleh Park et al. (2002) menunjukkan bahwa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim kolagenase yang berasal dari organ dalam Scomber japonicus adalah PMSF (1,0 mM), soybean trypsin (0,01 mg/ml), chymostatin (0,1 mM), dan tosyl phenylalanyl chloromeythyl ketone (TLCK) (0,1mM) yang keseluruhan termasuk ke dalam kelompok inhibitor serin protease; sedangkan inhibitor jenis cystatin (0,01 mg/ml), EDTA (1,0 mM), dan 1,10-phenanthroline (1,0 mM) yang merupakan kelompok inhibitor metalloprotease, tidak dapat menghambat enzim tersebut. Kim et al. (2002) melaporkan bahwa enzim kolagenase yang diekstrak dari organ dalam Filefish, Novoden modestrus dapat dihambat aktivitasnya oleh inhibitor seperti soybean trypsin, DFP, dan TLCK dengan konsentrasi masing-masing sebesar 1,00; 0,50; dan 0,20 mM dan termasuk inhibitor serin protease. KESIMPULAN

Ekstrak kasar enzim kolagenase yang dihasilkan memiliki aktivitas spesifik enzim sebesar 0,025 U/mg, sedangkan enzim kolagenase yang telah dimurnikan secara parsial menggunakan amonium sulfat pada konsentrasi kejenuhan terbaik (70 %) memiliki aktivitas spesifik 0,026 U/mg.

Karakterisasi biokimia enzim kolagenase yang dihasilkan dari hasil pengendapan ammonium sulfat 70 % antara lain: enzim ini memiliki pH 8,0 sebagai nilai pH optimum; suhu optimum sebesar 60 oC; pengaruh ion logam yang dapat meningkatkan nilai aktivitas enzim adalah Na+, Ca2+, Co2+, dan Mn2+, sedangkan ion logam yang menghambat aktivitas enzim kolagenase hasil pengendapan adalah Ba2+; serta pengaruh inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim adalah PMSF 5 mM. DAFTAR PUSTAKA Bjarnason JB. 2001. Biotechnological applications of fish offal in Iceland. Science Institute.

University of Iceland. Island. Direktorat Pengolahan Hasil. 2006. Peningkatan Nilai Tambah Tuna Melalui Teknologi

Penanganan dan Pengolahan. Direktorat Jendral Pengolahan dan Pemasaran Hasil Perikanan. Departemen Kelautan dan Perikanan. Jakarta

Harris ELV, Angal S. 1989. Protein purification methods a practical approach. New York: IRL Press

Harper H, Rodwell VM dan PA Mayes. 1979. Biokimia. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Kim SK, Park PJ, Kim JB, Shahidi F. 2002. Purification and characterization of the collagenase

from the tissue of filefish, Novoden modestrus. Journal of Biochemistery and Molecular Biology. 35 (2) : 165-171.

Klomklao S, Benjakul S, Visessanguan W. 2004. Comparative studies on proteolytic activity of spleen extracts from three tuna species commonly used in Thailand. Journal of Food Biochemistry. 28:355-372.

Palmer T. 1991. Understanding Enzymes. Ellis Hormood Limited. England. West Sussex Park PJ, Lee SH, Byun HG, Kim SH, Kim SK. 2002. Purification and characteristization of a

collagenase from the Mackerel, Scomber japonicus. Journal of Biochemistery and Molecular Biology. 35 (6): 576-582.



415

Prasertsan P, Wuttjumnong P, Sophanodora P, Choorit W. Seafood processing industries within Songkhla-Hat region: the survey of basic data emphasis on waste, Songklanakarin. Journal of Sciences Technology. 10:447-451.

Lehninger AL. 1993. Dasar-dasar Biokimia. Maggy T, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Lestari SD. 2005. Analisis sifat fisika, kimiawi, dan rheologi gelatin kulit hiu gepeng (Alopis sp.)

dengan penambahan MgSO4, sukrosa dan gliserol. [skripsi]. Bogor: Program studi Teknologi Hasil Perikanan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.

Scopes RK. 1987. Protein Purification, Principle dan Practice,. New York, Heidenburg, Berlin : Springer-Verlag.

Shahidi F, Botta JR. 1994. Seafood : Chemistry, Processing Technology and Quality. Glasgow : Blackie academic and professional.

Suhartono MT. 1989. Enzim dan Bioteknologi. Dirjen Dikti, PAU Bioteknologi IPB. Bogor. Walker JM. 1988. Methods in Molecular Biology New protein Techniques. Volume III. New Jersey:

Humana Press.Walpole. 1992. Pengantar Statistik. Sumantri B, penerjemah. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama. Terjemahan dari: The Introduction of Statistics.

seminar nasional perikanan indonesia 2010 02...

Documents