1

1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pengawetan bahan makanan bermula dari penggunaan garam, asap, asam dan proses

fermentasi, untuk mengawetkan makanan. Seiring dengan berkembangnya teknologi di

bidang pangan, dikembangkan substansi antimikroba yang bertujuan menghambat

pertumbuhan mikroorganisme patogen pada bahan makanan.Penggunaan substansi

antimikroba yang tepat dapat memperpanjang umur simpan dan menjamin keamanan

makanan (Indriyati, 2010).

Salah satu substansi antimikroba yang dapat digunakan adalah bakteri asam laktat (BAL)

yang telah digunakan di banyak negara, sebagai pengawet makanan dan senyawa

antimikroba alami (Suardana et al., 2007), karena dapat mengambat bakteri pembusuk dan

bakteri patogen (Djafaar, 1996 dalam Sarkono et al., 2006).Bakteri asam laktat dapat

menghasilkan asam-asam organik, diasetil dan hidrogen peroksida sehingga mempunyai

aktivitas antimikroba.

Antimikroba primer yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat ialah asam laktat dan efek

penurunan pH, sedangkan senyawa lainnya yaitu hidrogen, karbon dioksida, diasetil dan

bakteriosin.Semua senyawa ini bersifat antagonis terhadap beberapa bakteri perusak dan

patogen dalam makanan (Erdogrul & Erbilir, 2006).Antimikroba yang dihasilkan oleh

bakteri asam laktat dapat menghambat dan menginaktivasi mikroorganisme pembusuk dan

mikroorganisme patogen (Tadesse et al., 2005).

Bakteri asam laktat sering ditemukan secara alami pada bahan makanan, contohnya pada

susu, daging, buah-buahan, sayur-sayuran dan pada makanan hasil fermentasi. Pada proses

fermentasi secara spontan BAL sering kali ditemukan sebagai bakteri dominan yang

ditemukan sebagai mikrobia dominan yang dapat menghambat bakteri pembusuk dan

patogen (Djafaar, 1996 dalam Sarkono et al., 2006).

2

Salah satu substrat bakteri asam laktat adalah sayur asin, yang merupakan salah satu bentuk

awetan sayur sawi, yang dibuat dari tanaman sawi pahit/sawi asin/sawi hijau yang

direndam dalam larutan air kelapa.Pada penelitian ini digunakan sayur asin dari sawi pahit.

Proses fermentasi berlangsung secara spontan/tanpa ada penambahan inokulum BAL.

Fermentasi sayuran memiliki beberapa kelebihan, baik dari segi kesehatan, sosial dan

ekonomi, antara lain mengawetkan bahan pangan, hemat energi, menghilangkan faktor

anti-nutrisi, misalnya menurunkan kadar sianida pada ketela,dan meningkatkan kandungan

vitamin, misalnya pada palm wine (makanan khas Afrika Selatan) yang memiliki vitamin

B12 lebih tinggi dari pada buah kelapa (Battcock & Azam-Ali, 1998).

Pada proses fermentasi ditambahkan garam untuk membentuk lingkungan yang sesuai bagi

bakteri asam laktat untuk tumbuh. Konsentrasi garam merupakan salah satu komponen

yang mendukung berhasilnya proses fermentasi, karena mempengaruhi jenis mikroba yang

berperan dalam proses fermentasi. Bila konsentrasi garam kurang dari 2,5%, maka bakteri

proteolitik dapat tumbuh sehingga menyebabkan peruraian protein yang ditandai adanya

aroma busuk. Sedangkan bila konsentrasi garam lebih dari 10% maka dapat menghambat

pertumbuhan bakteri asam laktat dan menumbuhkan bakteri halofilik sehingga proses

fermentasi menjadi gagal (Pradani & Hariastuti, 2009).Pada penambahan kadar garam

sebanyak 5% bakteri asam laktat akan menghasilkan asam laktat secara optimal (Hadiyanti

dan Wikandari, 2013).

1.2 Tinjauan Pustaka

1.2.1 Bakteri Asam Laktat (BAL) Perkembangan teknologi, mengakibatkan berkembangnya penggunaan mikroba dalam

dunia pangan. Hal ini dipengaruhi juga oleh mikroba cenderung mudah diperbanyak dan

dikendalikan, disamping itu substrat sebagai tempat tumbuhnya murah, selain itu bahan-

bahan pelengkap untuk proses fermentasi mudah didapat dan murah, bahkan dapat

3

didapatkan dari hasil limbah industri pertanian yang biasanya dibuang (Misgiyarta

&Widowati, 2002).

Pada dasarnya bakteri dibedakan menjadi 2 jenis, yaitu bakteri yang menguntungkan dan

bakteri yang merugikan. Salah satu golongan bakteri yang menguntungkan adalah bakteri

asam laktat. Bakteri asam laktat berguna sebagai pengawet makanan yang aman serta dapat

juga digunakan sebagai antimikroba alami karena dapat mencegah pertumbuhan bakteri

perusak dan bakteri patogen (Suardana et al., 2007).

Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang mampu menghambat pertumbuhan mikroba

lain. Penghambatan pertumbuhan mikroba disebabkan bakteri asam laktat menghasilkan

lingkungan asam, di mana hampir sebagian besar bakteri patogen dan bakteri perusak (food

spoilage bacteria) tidak dapat tumbuh di lingkungan asam.Ciri-ciri yang dimiliki bakteri

asam laktat antara lain: Grampositif, tidak membentuk spora,berbentuk cocciatau basil,

tidak bergerak (non-motil), menghasilkan asam laktat dari proses pemecahan karbohidrat

dan tidak mempunyai enzim katalase (Salminen et al., 2004; Rahayu & Margino, 1997).

Enzim katalase merupakan enzim yang mengkatalisasi penguraian hidrogen peroksida

menjadi air dan oksigen. Bakteri yang memproduksi enzim katalase akan bertahan hidup

dalam kondisi aerobik. Bakteri asam laktat hanya membutuhkan sedikit bahkan cenderung

tidak membutuhkan oksigen dalam proses fermentasi, sehingga bakteri ini tidak

memproduksi enzim katalase (Battcock & Azam-Ali, 1998).

Berdasarkan kemampuan menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir metabolisme,

bakteri asam laktat dapat digolongkan menjadi dua, yaitu bakteri homofermentatif dan

bakteri heterofermentatif. Bakteri homofermentatif memecah gula menjadi asam laktat,

sedangkan bakteri heterofermentatif mengubah gula menjadi asam laktat, asam asetat, dan

etanol (Battcock & Azam-Ali, 1998).

4

Bakteri homofermentatif dapat memecah glukosa menjadi asam laktat melalui jalur

Embden-Meyerhorf-Parnas (EMP) atau glikolisis. Enzim yang berperan dalam tahap

glikolisis adalah enzim aldolase dan heksosa isomerase. Bakteri homofermentatif dapat

menghasilkan energi sebesar dua kali energi yang dihasilkan oleh bakteri heterofermentatif

dari sejumlah substrat yang sama (Gambar 1) (Todar, 2008). Bakteri heterofermentatif

mampu memecah glukosa menjadi asam laktat, asam asetat, asam propionat dan etanol

melalui jalur oksidatif pentosa fosfat dengan bantuan enzim fosfoketolase. Bakteri

heterofermentatif tidak mempunyai enzim fruktosadifosfat aldolase, transaldolase dan

transketolase yang berperan dalam tahap glikolisis (Gambar 2) (Rattanachaikunsopoet al.,

2010).

5

Gambar 1. Proses biokimia pembentukan asam laktat pada bakteri homofermentatif.

GLUCOSE

Glucose-6-P

Fructose-6-P

Fructose-1,6-Di P

Glyceraldehyde-3-P Dihydroxyactone-P

aldolase

1,3-Diphosphoglycerate

3-Phosphoglycerate

2-Phosphoglycerate

Phosphoenolpyruvate

Pyruvate

2 LACTATE

Sumber: Todar (2008)

6

Gambar 2. Proses biokimia pembentukan asam laktat pada bakteri heterofermentatif.

GLUCOSE

Glucose-6-P

6-Phosphogluconate

Ribulose-5-phosphate

Glyceraldehyde-3-P Acetyl-phosphate

phosphoketolase

1,3-Diphosphoglycerate

3-Phosphoglycerate

2-Phosphoglycerate

Phosphoenolpyruvate

Pyruvate

LACTATE

Xylulose-5-phosphate

Acetyl-CoA

Acetaldehyde

ETHANOL

Sumber: Todar (2008)

7

Bakteri asam laktat akan mengubah karbohidrat menjadi asam laktat dalam kondisi anaerob

dan proses ini dapat dibagi menjadi tiga tahapan. Pada tahap awal, zat pati dari sumber

karbohidrat akan dihidrolisa menjadi maltosa oleh enzim dan amylase yang merupakan

enzim ekstraseluler pada mikroorganisme,kemudian molekul maltosa ini akan dipecah

menjadi glukosa oleh maltase dan pada tahap terakhir bakteri asam laktat akan mengubah

glukosa menjadi asam laktat dan sejumlah kecil bahan lain seperti asam asetat, asam

propionat dan etanol (Rattanachaikunsopoet al., 2010).

Bakteri asam laktat yang telah diketahui dan memiliki peranan penting dalam industri

pangan adalah genus Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus dan Streptococcus.Namun

berdasarkan pada revisi terbaru, genus yang saat ini termasuk dalam bakteri asam laktat

meliputi Aeroccous, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,

Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tertragenococcus atau

Pediococcus halophilus, Weisella, dan Vaganococcus (Rahayu & Margino, 1997).

Klasifikasi bakteri asam laktat dapat dilihat dari bentuk morfologi, kemampuan tumbuhnya

di berbagai temperatur, kemampuan tumbuh pada berbagai konsentrasi garam, serta

toleransinya terhadap asam atau basa (Salminen et al., 2004).

a. Genus Lactobacillus Genus Lactobacillus, merupakan jenis bakteri yang berbentuk batang, tidak membentuk

spora, fakultatif anaerob dan katalase negatif.Lactobacillus dapat ditemukan pada

tanaman dan sayuran, minuman fermentasi, produk sereal dan pada saluran pencernaan

manusia dan hewan.Lactobacillus dapat dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok

homofermentatif atau heterofermentatif (Hutkins, 2006).

Kelompok Lactobacillus homofermentatif dapat memecah glukosa terutama menjadi

asam laktat.Kelompok ini mampu tumbuh pada suhu 37oC atau lebih. Spesies dari

genus Lactobacillus yang tergolong ke dalam kelompok homofermentatif, antara lain:

L. lactis, L. acidophilus dan L. bulgaricus.Sedangkan kelompok Lactobacillus

heterofermentatif dapat memecah glukosa menjadi asam laktat, asam asetat, asam

8

propionat, dan etanol.Gas dan senyawa volatil yang terbentuk dari hasil fermentasi ini

berperan penting sebagai pembentuk cita rasa pada makanan fermentasi. Spesies dari

genus Lactobacillus yang tergolong ke dalam kelompok heterofermentatif, antara lain:

L. brevis dan L. fermentum.L. brevisdapat tahan pada kondisi asam hingga konsentrasi

2,4% dan suhu optimum pertumbuhannya berkisar pada 30oC (Buchanan dan Gibbons,

1975 dalam Candra, 2006).

b. Genus Streptococcus Genus Streptococcus merupakan kelompok bakteri Gram positif, sel berbentuk bulat

atau cocci, fakultatif anaerob, katalase negatif dan bersifat homofermentatif. Genus

Streptococcus dibagi menjadi 6kelompokbesar yaitu: Pyogenic Streptococci, Oral

Streptococci, Enterococci, Lactic Streptococci, Anaerobic Streptococci dan other

Streptococci. Namun sejak 1984, ada dua revisi terbaru dari genus Streptococcus.

Pertama yaitu spesies Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, dan Streptococcus

durans masuk dalam genus Enterococcus. Kemudian pada tahun 1985 spesies

Streptococcus lactic dan Streptococcus cremoris yang dimasukkan kedalam genus baru

yaitu Lactococcus(Hutkins, 2006).

c. Genus Leuconostoc Genus Leuconostocmemiliki perbedaan yang sangat mencolok dibandingkan dengan

genus Lactobacillus dan Streptococcus karena bersifat heterofermentatif yaitu

memfermentasi gula menjadi asam laktat, asam asetat, etanol, dan CO2. Karakteristik

lain genus Leuconostoc adalah Gram positif, tidak membentuk spora, non-motil,

fakultatif anaerob dan berbentuk bulat dan terkadang terlihat berbentuk batang

tergantung pada komposisi media dan bentuk media pertumbuhan (cair atau padat)

(Hutkins, 2006).

9

d. Genus Pediococcus Genus Pediococcus merupakan kelompok bakteri berbentuk bulat atau cocci dengan

susunan tetrad, kadang tampak berpasangan namun tidak membentuk rantai seperti

Lactococci, Streptococci dan Leuconostoc.Pediococcus mirip dengan bakteri asam

laktat lainnya yaitu bersifat fakultatif anaerob, tumbuh optimal pada suhu 250C-400C,

tapi beberapa spesies dapat tumbuh pada temperatur di atas 500C, dapat tumbuh pada

pH 4,2 dan media yang mengandung 6,5% NaCl (Hutkins, 2006).

Habitat alami Pediococcus terdapat pada tumbuhan, susu, urin hewan dan bir (Hutkins,

2006).Kisaran suhu pertumbuhannya adalah 7-45oC dengan suhu optimum 25-32oC.

Beberapa spesies yang cukup terkenal antara lainP. cerevisiae yang sering tumbuh pada

pikel dan menyebabkan kerusakan pada bir dengan memproduksi diasetil dalam jumlah

tinggi. Selain itu juga ada P. halophilus merupakan bakteri yang bersifat halofilik dan

dapat tumbuh baik pada medium dengan konsentrasi NaCl sebanyak 7 %(Rahayu &

Margino, 1997).

10

1.2.2 Sawi Pahit dan Sayur Asin Salah satu bahan makanan yang dapat menghasilkan bakteri asam laktat adalah sayur asin.

Sayur asin merupakan salah satu bentuk awetan sayur sawi, yang dibuat dari tanaman sawi

pahit/sawiasin/sawi hijau (Brassica juncea (L.) Czernjaew). Sawi pahit (familia

Brassicaceae)sangat kaya akan vitamin A, vitamin C dan zat besi.Komposisi nutrisi dalam

100 gram sawi pahit ditampilkan dalam Tabel 1.

Tabel 1.Komposisi Sawi Pahit (Brassica juncea (L.) Czernjaew) (per 100 g) Komponen Kandungan Kalori 24 kal Air 91,8 g Protein 2,4 g Lemak 0,4 g Karbohidrat total 4,3 g Serat 1 g Abu (ash) 1,1 g Kalsium 160 mg Fosfat 48 mg Besi 2,7 mg Natrium 24 mg Kalium 297 mg -karoten 1825 g Thiamin (vitamin B1) 0,06 mg Riboflavin (vitamin B2) 0,14 mg Niacin (asam nikotinat) 0,8 mg Asam askorbat 73 mg

Sumber:Duke(1983)

Kandungan air di dalam 100 gram sawi pahit sebesar91,8 gram (Tabel 1). Hal ini

menyebabkan sayuran sawi mudah rusak dan sering kali dibuang. Metode fermentasi sawi

merupakan salah satu metode pengawetan yangpaling umum digunakan untuk mengatasi

kerusakan sayuran sawi.Fermentasi sawi dikenal juga sebagai fermentasi asam laktat,

karena selama proses fermentasi bakteri/kultur yang ada menghasilkan asam laktat. Pada

proses fermentasi sayur asin, tidak perlu ditambahkan inokulum mikroba. Menurut Hansen

11

dalam Hui et al. (2004), inokulasi mikroba terkadang tidak diperlukan dalam suatu proses

fermentasi apabila mikroba yang diperlukan sudah ada pada bahan baku. Josephsen &

Jespersendalam Hui et al. (2004) menambahkan bahwa sebagian besar habitat natural

bakteri asam laktat, khamir, dan jamur adalah pada sayuran.

Untuk proses pembuatan sayur asin diperlukan sawi pahit, air kelapa atau air tajin, dan

garam. Penambahan air kelapa atau air tajin disebabkan kandungan karbohidratdalam sawi

pahit yang sedikit yaitu hanya sekitar 4,3 gram dalam 100 gram, sehingga perlu

ditambahkan sumber energi lainyang berasal dari air kelapa maupun air tajin. Komposisi

nutrisi dalam air kelapa adalah air (95%), karbohidrat (4 %), lemak (0,1 %), kalsium (0,02

%), fosfat (0,01 %), besi (0,5 %), dan berbagai asam amino, vitamin C, vitamin B kompleks

dan garam mineral lainnya (Helmi, 2008).

Pada proses fermentasi dilakukan penambahan garam untuk membentuk tekstur dan

menyediakan lingkungan hidup bagi bakteri asam laktat. Garam akan mengakibatkan

tekstur sawi menjadi lunak karena terjadinya pengeluaran cairan dari sawi (peristiwa

osmosis) (Battcock & Azam-Ali, 1998). Pada umumnya makin tinggi konsentrasi garam

yang digunakan maka makin lambat proses fermentasi. Pada fermentasi pendek sebaiknya

digunakan larutan garam 2,5-10% agar laju fermentasi berkisar antara sedang dan cepat.

Apabila konsentrasi melebihi 20% maka tidak dianjurkan, karena menghasilkan produk

yang keriput dan menyebabkan bakteri yang tumbuh adalah bakteri halofilik atau bahkan

fermentasi tidak berlangsung(Pradani & Hariastuti, 2009).

1.2.3 Senyawa Antimikroba Salah satu sifat penting dari bakteri asam laktat yang sering diaplikasikan dalam pembuatan

produk pangan adalah kemampuannya untuk memfermentasi gula menjadi asam laktat.

Produksi asam laktat yang dihasilkan tersebut akan mengakibatkan pertumbuhan mikroba

lain yang tidak diinginkan dapat terhambat(Salminen et al., 2004).Terhambatnya

pertumbuhan mikroba lain yang tidak diinginkan tersebut tidak hanya disebabkan oleh

penurunan pH karena produksi asam, namun juga karena hasil metabolit ekstraseluler.

12

Produk hasil metabolit ekstraseluler bakteri asam laktat antara lain asam-asam organik

(asam laktat, asam asetat dan asam format), hidrogen peroksida, diasetil dan bakteriosin

(Daeschel, 1989 dalam Sarkonoet al., 2006). Kemampuan tersebut menyebabkan bakteri

asam laktat dapat dikembangkan sebagai agensia pengawet makanan baik sebagai kultur

starter maupun dalam bentuk metabolit ekstraselulernya seperti bakteriosin (Yang & Ray,

1993 dalam Sarkono et al., 2006).

Escherichia colimerupakan salah satu kelompok bakteri patogen yang mampu dihambat

pertumbuhannya oleh bakteri asam laktat (Sarkono et al., 2006).E. coli merupakan

mikroorganisme normal yang ada di organ pencernaan manusia dan hewan mamalia

normal.E. coliyang termasuk dalam keluarga Enterobacteriaceae ini termasuk dalam

kelompok Gram negatif, tidak membentuk spora dan berbentuk batang.Meskipun

merupakan flora normal di usus, beberapa jenis E. coli dapat bersifat patogen, yaitu

serotipe-serotipe yang masuk dalam golongan Enteroroxigenic E. coli (ETEC),

Enteroinvasive E. coli (EIEC), Enteropathogenic E.coli (EPEC) dan Enterohaemorrhagic

E. coli (EHEC) (Adams & Moss, 2000).

Bakteri lain yang digunakan sebagai bakteri patogen uji adalah Staphylococcus aureus.

Staphylococcus merupakan bakteri penghasil enterotoksin berbentuk bulat yang termasuk

dalam kelompok Gram positif yang terdapat dalam bentuk tunggal, berpasangan, tetrad,

atau berkelompok seperti anggur. Kebanyakan galur Staphylococcus aureus bersifat

patogen. Bakteri ini membutuhkan nitrogen organik (asam amino) utnuk pertumbuhannya

dan bersifat anaerobik fakultatif.Bakteri ini sering ditemukan di kulit, kelenjar kulit dan

pada membran mukosa pada hewan dan pada kulit manusia (Adams & Moss, 2000).

13

1.3 Tujuan Penelitian

Untuk mengidentifikasi dan mengetahui kemampuan aktivitas antimikroba pada bakteri

asam laktat yang diisolasi dari sayur asin yang difermentasi dari sawi pahit (Brassica

juncea (L.) Czernjaew) pada kadar garam 5%.