A. Alat-alat gelas antara lain :- Ose Bulat digunakan untuk menanam mikroba dengan cara menggores permukaan medium

agar cawan atau agar miring.- Ose lurus digunakan untuk menanam mikroba dengan cara menusuk pada medium agar

tegak- Cawan petri digunakan sebagai tempat membiakkan mikroba yang akan diamati pada

medium padat.- Tabung reaksi berfungsi sebagai tempat untuk membiakkan bakteri atau menyimpan

medium yang berupa zat cair atau zat padat.- Tabung Durham berfungsi untuk menampung gas hasil fermentasi yang dihasilkan oleh

bakteri dengan cara diletakkan terbalik di dalam tabung reaksi yang didalamnya terdapat medium.

- Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk menstrerilkan alat-alat yang tidak tahan panas juga digunakan untuk mensterilkan medium, menggunakan uap air besuhu 121oC dengan selama 15-30 menit.Prinsip : Sterilisasi dengan menggunakan uap panas bertekanan yang akan mengkoagulasi atau mendenaturasi protein sel mikroba dengan tekanan 2 atm selama 15-30 menit.

- Spektrofotometer adalah alat untuk pendugaan jumlah mikroba yang didasarkan pada banyak cahaya (spektrum) yang mampu diserapnya.

- Colony Counter adalah alat untuk menghitung jumlah koloni mikroba yang tumbuh dalam cawan petri.

- Oven adalah alat untuk sterilisasi alat yang tahan terhadap suhu tinggi, menggunakan panas kering pada suhu 180 oC selama 2 jam.

Prinsip : Sterilisasi alat berdasarkan pemanasan, dimana udara yang terkurung didalam oven dipanaskan, sehingga alat-alat menjadi steril dari mikroba karena proteinnya terdeaturasi, sehingga terjadi kematian mikroba.

- Inkubator adalah alat untuk menginkubasi mikroba dengan suhu yang sesuai dengan suhu optimum pertumbuhan mikroba.Inkubator aerob menginkubasi mikroba yang membutuhkan oksigen dalam pertumbuhannya., sedangkan inkubator anaerob digunakan untuk menginkubasi mikroba yang tidak membutuhkan oksigen dalam pertumbuhannya.

D. Alat-alat tambahan antara lain :- Enkas adalah alat yang digunakan untuk kegiatan inokulasi dan isolasi agar berlangsung

secara aseptis. Prinsip :Pengerjaan secara aseptis berdasarkan peminimalan mikroorganisme dari udara luar.

- Laminar Air Flow (LAF)Fungsi dari LAF ini sama dengan enkas yakni uutk pengerjaan secara aseptis. Prinsip : pengerjaaan secara aseptis berdasarkan adanya aliran udara laminar dengan tekanan udara dalam sistem lebih besar dari luar sistem.

- Filter bakteri Filter bakteri berfungsi sebagai alat sterilisasi secara mekanik terhadap beberapa bahan yag akibat pemanasan tinggi ataupun tekanan tinggi akan mengalami perubahan ataupun penguraian

MEDIUM merupakan suatu tempat / substrat yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkkan mikroba ang sebelum diganakan harus dalam keadaan steril atau campuran substansi dari zat-zat makanan atau nutrisi yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba. Secara umum fungsi dari medium dapat dituliskan sebagai berikut : a) Media menumbuhkan mikrobab) Tempat mengisolasi dan memperbanyak mikroorganismec) Pengujian sifat-sifat fisiologi mikroorgaisme d) Untuk perhitungan jumlah mikroba.

Agar mikroba dapt tumbuh dan berkembang baik didalam media diperlukan persyaratan tertentu, yaitu : o Bahwa didalam media harus terkandung semua unsur hara yang diperlukan untuk

pertumbuhan dan perkembangbiakanmikrobao Bahwa media harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang

sesuai dengan kebutuhan mikroba.o Bahwa media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanami mikroba yang

dimaksud, tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan. o Tidak mengandung zat inhibitor.

Medium dapat dikelompokkan kedalam beberapa bagian berdasarkan : A) Susunan media / bahan yang digunakan, antaralain :

Medium alamiah atau substrat. medium-medium iini terdiri dari bahan-bahan alam seperti : sari buah, wortel, nasi, jagung, darah, dan bahan-bahan alamiah lainnya.

Medium semi alamiah. Medium ini terdiri dari bahan-bahan alamiah ditambah dengan senyawa-senyawa kimia, misalnya PDA, TEA, MEA, dll.

Medium buatan atau medium sintesis. Medium ini terdiri dari senyawa-senyawa kimia yang komposisi dan jumlahnya sudah ditentukan, misalnya: Czapek Dox Agar (CDA), Sabouraud Dextrosa Agar (SDA), dll.

B) Bentuknya : Medium Padat : Medium yang bentuknya padat karena mengandung agar yang

memadatkan medium. Medium Cair : Medium yang berbentuk cair karena tidak mengandung agar yang

memadatkan medium. Medium Semi padat : Medium yang bentuknya menyerupai medium padat dimana

penambahan zat pemadat hanya 50% atau kurang dari searusnya. C) Kegunaannya /sifatnya :

Medium Umum. Medium ini dapat ditumbuhi mikroorganisme secara umum, yaitu banyak jeis mikroorganisme yang dapat tumbuh pada medium tersebut, misalnya PDA, NA, TEA, dll.

Medium Selektif . Medium ini komposisinya disusun sedemikian rupa sehingga hanya jenis-jenis mikroorganisme tetentu saja yang dapat hidup.

Medium Differensial. Medium ini digunakan untuk membedaan jenis mikroorganisme satu dengan lainnya, disebabkan karean adanya reaksi atau ciri yang kha. Reaksi ini terjadi karena ikroorganisme mampu mengurai salah satu bahan dalam medium.

Medium diperkaya (enrichment medium), yaitu medium yang ditambahkan zat-zat tertentu untuk pertumbuhan bakteri tertentu

Medium penguji (assay medium), yaitu medium dengan susuna tertentu yang digunkan untuk pengujian vitamin-vitamin, asam-asam amino, dll.

Medium khusus, yaitu medium untuk menentukan pertumbuhan mikroba dan kemampuannya mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu

Medium untuk perhitungan jumlah mikroba, yaitu medium spesifik yang digunakan untuk perhitungna jumlah mikroba.

Untuk autoclave suhu , waktu, dan tekanan yang digunakan untuk mendenaturasi & mengkoagulasi protein mikroba agar suatu benda steril adalah masing-masing 121 0 C, 15 menit dan tekanan 2 atm, sedangkan pada oven digunakan suhu antara 170 0 C – 180 0 C selama 2 jam.

ISOLASI DAN INOKULASI

b. Air ledeng Maros Disiapkan alat dan bahan Dimasukkan sampel (air ledeng maros) ke dalam cawan petri lalu dituangkan medium

NA kedalam cawan petri secara aseptis. Lalu kemudian dihomogenkan. Medium dipadatkan pada suhu kamar lalu dibungkus kertas untuk kemudian diinkubasi

secara terbalik selama 24 jam Diamati pertumbuhan koloni mikrobanya.

c. Udara Bebas Disiapkan alat dan bahan. Diisi cawan petri dengan medium TEA seara aseptis. Medium dibiarkan memadat Tutup cawan petri dibuka ½ nya dan dibiarkan di tempat terbuka selama 15 menit. Cawan petri ditutup lalu dibungkus kertas untuk kemudian diinkubasi secara terbalik selama 24 jam. Diamati pertumbuhan koloni mikrobanya.

Inokulasi Mikroba ( Salmonella typhosa ) Pada media NA miringo Disiapkan alat dan bahan.o Diisi tabung reaksi dengan medium NA secara aseptis dan dibiarkan memadat dalam keadaan miringo Digoreskan bakteri secara aseptis dengan zigzagdengan menggunakan ose bulat. o Tabung reaksi dilewatkan di api. Tabung reaksi ditutup kapas lalu dibungkus kertas untuk kemudian di inkubasi selama 24 jam.o Diamati pertumbuhan mikrobanya.

Pada media NA Tegak o Disiapkan alat dan bahan.o Diisi tabung reaksi dengan medium NA secara aseptis dan dibiarkan memadat dalam keadaan tegako Dengan menggunakan ose lurus ditusukkan kedalam biakan bakteri secara aseptis.

o Kemudian ose lurus tersebut ditusukkan secara tegak lurs sedalam 2/3 bagian tabung yang terdapat medium NA. o Tabung reaksi dilewatkan di api. Tabung reaksi ditutup kapas lalu dibungkus kertas untuk kemudian di inkubasi selama 24 jam.o Diamati pertumbuhan mikrobanya.

M e d i u m 1. Nutrien Agar ( NA )

Pepton dari Daging : 5,0 g Ekstrak dari Daging : 3,0 g Agar : 15 gram Aquadest : 1 liter

2. Nutrien Broth ( NB ) Pepton dari Daging : 5,0 g Ekstrak dari Daging : 3,0 g Aquadest : 1 liter

3. Tauge Ekstrak Agar ( TEA ) Tauge : 100 g Sukrosa : 60 g Agar : 15 gram Aquadest : 1 liter

PERHITUNGANUntuk menghitung secara kuantitatif mikrobiologis suatu bahan dapat dilakukan atas

beberapa kelompok yaitu: 1. Perhitungan jumlah sel a. Hitungan mikroskopik b. Hitungan cawan c. MPN (Most Probable Number) 2. Perhitungan massa sel secara langsung a. Volumetrik b. Gravimetrik c. Kekeruhan (turbidimetri)

3. Perhitungan massa sel secara tidak langsung a. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP dan sebagainya) b. Analisis produk katabolisme (metabolit primer, sekunder atau panas).

c. Analisis konsumsi nutrien (karbon, nitrogrn, oksigen,asam amino, mineral dan sebagainya).

Metode Perhitungan CawanJumlah koliform dalam contoh dapat dihitung dengan metode hitungan cawan

menggunakan agar VRB (Violet Red Bile) atau agar DL (Desoxycholate Lactose). Dalam penggunaan medium ini, setelah agar membeku pada bagian atasnya diruangkan lagi medium yang sama sebanyak 4-5 ml per cawan berdiameter 10 cm, sehingga diperoleh lapisan tipis pada permukaan agar, dan koloni tumbuh di bawah permukaan agar (sub permukaan).(5;70)

Inkubasi cawan yang mengandung agar VRB atau agar DL harus dilakukan pada suhu 35o atau 37o selama 24 jam atau kurang. Pada inkubasi yang terlalu lama, bakteri gram

negatif lainnya mungkin tumbuh sehingga membingungkan dalam menghitung koloni yang spesifik koliform.(5;70)Prinsip Metode MPN

Berbeda dengan metode cawan di mana digunakan medium padat (agar), dalam metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi di mana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif , yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatn tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung Durham untuk mikroba pembentuk gas.(5;70)

Dalam metode MPN, pengenceran harus dilaksanakan sedemikian rupa sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mangandung satu sel mikroba, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel, sedangkan tabung lainnya tidak mengandung sel.(5;71)

Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. grup mikrobayang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan.(5;71)

Untuk menentukan jumlah bakteri dapat digunakan beberapa cara.1. Jumlah bakteri secara keseluruhah (total cell count). Pada cara ini dihitung semua bakteri

baik yang hidup maupun yang mati.2. Jumlah bakteri yang hidup (viable count). Cara ini hanya menggambarkan jumlah sel yang

hidup, sehingga labih tepat bila dibandingkan teknik pada butir 1.

Perhitungan Bakteri Secara Keseluruhan a. Menghitung Langsung Secara Mikroskopik

Pada cara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Untuk ini digunakan kaca objek khusus yang bergaris (Petroff-Hauser) berbentuk bujur sangkar. Jumlah cairan yang terdapat antara kaca objek dan kaca penutup mempunyai volume tertentu, sehingga satuan isi yang terdapat dalam bujur sangkar juga tertentu.(6;47)

b. Menghitung Dengan Cara KekeruhanCara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer. Dasar teknik ini adalah

banyaknya cahaya yang diabsorpsi sebanding dengan banyaknya banyaknya sel bakteri pada batas-batas tertentu.(6;47)

Perhitungan Jumlah Bakteri a. Teknik Agar Tuang-Standard Plate Count

Pada cara ini dilakukan pengenceran dengan menggunakan sejumlah botol pengencer yang diisi aquadestillata steril. Agar cair didinginkan sampai suhu sekitar 44o C dan baru kemudian dituangkan kle dalam cawan Petri. Setelah agar membeku cawan dieramkan selama 24-48 jam (37o C). lempengan yang dapat digunakan dalam perhitungan bakteri adalah lempengan yang mengandung 30-300 koloni. Jumlah bakteri permililiter ialah jumlah koloni dikalikan faktor pengenceran.

b. Perhitungan Agar Tuang-Plate Count c. Teknik Agar Sebar

Metode Kerapatan OptikJumlah mikroorganisme dalam suatu suspensi dapat ditentukan dengan menentukan

kerapatan optik (OD = optical density). Pengukuran kerapatan optik menggunakan olorimeter yang membiaskan cahaya engan gelombang tertentu. Gelombang cahaya melewati suspensi biakan dan banyaknya cahaya yang ditransmisikan setelah melewati suspensi diukur. Jumlah cahaya yang ditransmisikan setelah melewati suspensi akan berbanding terbalik dengan jumlah mikroorganisme dan jumlah cahaya yang diabsorpsi. Jumlah cahaya yang diabsorpsi tergantung pada bentuk dan besar sel.(6;52)Kerapatan optik dalam suatu suspensi tidak langsung menunjukkan jumlah sel dalam suatu populasi, namun menunjukkan jumlah cahaya yang disebarkan oleh populasi tersebut. untuk memperoleh jumlah mikroorganisme, maka nilai kerapatan optik harus disetarakan terlebih dahulu dengan jumlah mikroorganisme (CFU/ml). untuk memperoleh nilai ini dilakukan berbagai pengenceran sampel yang digunakan dalam OD. Jumlah mikroorganisme ditentukan dengan cara jumlah hitung mikroorganisme hidup (viable count). Setelah diperoleh nilai ini dibuat kurva kalibrasi dengan sumbu X sebagai jumlah hidup (viable count) dan sumbu Y sebagai nilai OD.(6;52)

RUMUS:1. Agar tuang (30-300 mikroorganisme)

ALT (Angka Lempeng Total) = Jumlah koloni x Faktor pengenceran2. MPN

Nilai MPN = Nilai tabel x 103. Turbidimetri

OD (Optical Density) = 2 – log TDimana T: Nilai transmitan