PRODUKSI, PEMURNIAN PARSIAL, DAN KARAKTERISASI L-ASPARAGINASE DARI BAKTERI TERMOFILIK

Bacillus licheniformis STRAIN HSA3-1a

PRODUCTION, PARTIAL PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF L-ASPARAGINASE FROM THE THERMOPHILIC

BACTERIA Bacillus licheniformis STRAIN HSA3-1a

Abdul Muis Patta1, Ahyar Ahmad2 dan Hasnah Natsir3

1Mahasiswa Program Magister Kimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar

2Biokimia dan Bioorganik, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar

3Biokimia, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar

Alamat Korespondensi:

Abdul Muis PattaJl. Tamalate 3 Stapak 51 No. 2Perumnas Makassar, 90222HP : 081342993996Email : muizulfattah@gmail.com

Abstrak

L-Asparaginase memberikan manfaat yang besar pada terapi kanker terutama pada leukemia limfoblastik akut. L-Asparaginase juga terbukti dapat menurunkan kandungan akrilamida di dalam makanan. Banyak penelitian dilakukan untuk menelusuri sumber potensial produksi L-Asparaginase dari bakteri termofilik untuk memperoleh L-Asparaginase dengan aktivitas dan stabilitas yang tinggi. Tujuan penelitian adalahmelakukan isolasi, pemurnian, dan karakterisasi L-Asparaginase yang diproduksi dari Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a. Penelitian ini diawali dengan menguji B. licheniformis HSA3-1a dalam medium skrining produksi L-Asparaginase. L-Asparaginase yang telah diisolasi dan dimurnikan lalu dilakukan uji aktivitas dan karakterisasi. Aktivitas L-Asparaginase ditentukan secara kolorimetri dengan mengukur jumlah amoniak yang dihasilkan dari katalisis asparaginase menggunakan reagen Nessler. Satuunit L-Asparaginase (IU) didefenisikan sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang mengkatalisis pembentukan satu µmol amoniak permenit pada kondisi pengujian. Hasil penelitian menunjukkan bahwa B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase ekstraseluler secara maksimum pada konsentrasi asam amino L-Asparagin 2% dalam medium fermentasi dan waktu inkubasi 48 jam. L-Asparaginase memiliki aktivitas yang optimum pada pH 8 suhu 50oC dengan aktivitas spesifik 616,26 IU/mg protein serta stabil pada suhu dan pH optimum selama 60 menit.

Kata Kunci : L-Asparaginase, Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a, aktivitas spesifik

Abstract

L-Asparaginase gives a great benefit in the cancer treatment, especially in acute lymphoblastic leukemia. L-Asparaginase is also proven to reduce the acrylamide content in the foods. The objective of this study was to perform the isolation, purification, and characterization L-Asparaginase produced from Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a. This study begins by examining B. licheniformis HSA3-1a in the medium screening L-Asparaginase production. L-asparaginase that has been isolated and purified and then tested the activity and characterization. L-Asparaginase activity is determined by the colorimetric method by measuring the amount of ammonia produced from L-Asparaginase catalysis using Nessler reagent. One unit of L-Asparaginase (IU) is defined as the amount of the L-Asparaginase enzyme that catalyzes the release of one μmol of ammonia per minute at the essay conditions. The results showed that B. licheniformis HSA3-1a can produce maximum extracellular L-Asparaginase enzyme with 2% L-Asparagine concentration in fermentation medium and 48 hours incubation. L-Asparaginase has optimum activity at pH 8 and 50oC temperature with a specific activity of 616.26 IU/mg protein. and stabilized at the optimum temperature and pH for 60 minutes.

Keywords : L-Asparaginase, Bacillus licheniformis Strain HSA3-1a, specific activity

PENDAHULUAN

L-Asparaginase memberikan manfaat yang besar pada terapi kanker, terutama

pada leukemia limfoblastik akut. Pemberian L-Asparaginase pada sel kanker dapat

menguraikan L-Asparagin sebagai salah satu komponen nutrisi sel kanker, sehingga

dapat menghambat pertumbuhan sel tersebut (E-Moharam dkk., 2010). L-Asparaginase

juga terbukti dapat menurunkan kandungan akrilamida di dalam makanan.

L-Asparaginase dapat mencegah pembentukan akrilamida dengan mengkonversi asam

amino L-Asparagin sebagai prekursornya menjadi bentuk asam amino lain yaitu asam

aspartat yang umum terdapat dalam makanan (Antara, 2009).

L-Asparaginase dapat dijumpai pada banyak jaringan hewan, bakteri, tanaman,

dan dalam serum tikus, namun tidak pada manusia. L-Asparaginase dihasilkan dengan

jumlah yang besar oleh beberapa mikroorganisme; E. coli, Erwinia cartova, Enterobacter

aerogenes, Corynebacterium glutamicum, Candida utilities, Bacillus sp, dan Pisum

sativum (El-Bessoumy dkk., 2004; E-Moharam dkk., 2010).

Produksi enzim dari bakteri termofilik semakin digemari untuk ditelaah lebih jauh

karena bakteri termofilik dapat menghasilkan enzim yang memiliki stabilitas pada suhu

tinggi. Bakteri termofil sering ditemukan pada lingkungan ekstrim sumber air panas suhu

60–80oC antara lain Thermus, Bacillus, Clostridium, Thermoanaerabacter, dan

Desulfomaculum (Tika dkk., 2007; Ahmed dkk., 2007). Bakteri Bacillus sp dapat

digunakan dalam produksi enzim L-Asparaginase telah dipublikasikan oleh E-Moharam

dkk., (2010). Salah satu Bakteri termofil yang diisolasi dari sumber air panas di Sulawesi

Selatan adalah Bacillus licheniformis (Natsir dkk., 2010).

Penelitian ini bertujuan menguji kemampuan B. licheniformis HSA3-1a

memproduksi L-Asparaginase, menentukan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin

dalam medium produksi dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a untuk memperoleh

aktivitas L-Asparaginase maksimum dan mengkarakterisasi L-Asparaginase dari bakteri

B. licheniformis HSA3-1a.

BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat Penelitian

Penelitian ini menggunakan beberapa bahan yaitu; B. licheniformis HSA3-1a

diperoleh dari Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA Universitas Hasanuddin Makassar

yeast ekstrak, pepton, NaCl, L-Asparagin p.a, KH2PO4 p.a, MgSO4.7H2O p.a,

CaCl2.2H2O, bakto agar, indikator fenol merah, (NH4)2SO4 p.a, NH4Cl, kantung selofan,

tris(hidroksimetil)-aminometan p.a, bovine serum albumin, KI, MgCl2 p.a , NaOHp.a,

folin-ciocalteus, Na2CO3, CuSO4.5H2O, natrium kalium tartart, trikloroasetat, karbon

aktif, kertas saring, akuades, dan akuabides.

Peralatan penelitian ini adalah spektrofotomer serapan UV-Vis (Spectronic 20D),

neraca digital analitik, sentripuge dingin, shaker inkubator, inkubator (Memmert),

autoclave (All American Model No. 1925X), cawan petri, tabung reaksi, ose, pipet

mikro, dan alat gelas lainnya yang umum di laboratorium.

Desain Penelitian dan Metode Pengumpulan Data

Penelitian ini diawali dengan pengujian kemampuan B. licheniformis HSA3-1a

memproduksi L-Asparaginase dalam medium pertumbuhan menggunakan indikator fenol

merah. Kemudian ditentukan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium

produksi dari bakteri B. licheniformis HSA3-1a untuk memperoleh aktivitas

L-Asparaginase maksimum. L-Asparaginase yang diproduksi kemudian diisolasi,

pemurnian parsial dan dikarakterisasi terhadap pengaruh pH, suhu, dan waktu pre

inkubasi terhadap stabilitas L-Asparaginase. Pengumpulan data penelitian berdasarkan

metode kuantitatif eksperimental laboratorium.

Pemurnian Bakteri Bacillus licheniformis

Peremajaan dilakukan dengan menumbuhkan stok bakteri B. licheniformis koleksi

Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia FMIPA Universitas Hasanuddin Makassar ke

dalam medium plate pertumbuhan. Koloni yang tumbuh kemudian dibiakkan dalam

medium skrining produksi L-Asparaginase. Komponen Medium yaitu Yeast Ekstrak

0,05%, Pepton 0,01%, NaCl 0,1%, KH2PO4 0,01%, MgSO4.7H2O 0,01%, L-Asparagin

1,0%, CaCl2 0,01% Amonium Sulfat 0,7%, Bakto Agar 1,5% dan Indikator Fenol Merah

0.005%. Larutan stok fenol merah dibuat 2,5% dalam etanol pH 7 kemudian disaring

dengan kertas saring selulosa 0,2 µm lalu ditambahkan ke dalam medium. L-Asparagin

digunakan sebagai sumber nitrogen. Bakteri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 50oC.

Produksi L-Asparaginase oleh bakteri akan melepaskan amoniak sehingga meningkatkan

pH medium pembiakan. Perubahan pH membentuk warna pink disekitar koloni yang

memproduksi L-Asparaginase. Koloni yang tumbuh kemudian diisolasi, dimurnikan, dan

dibiakkan dalam medium kultur produksi L-Asparaginase (Gulati dkk., 1997; Moorthy

dkk., 2010; Ghasemi dkk., 2008; Natsir dkk., 2010).

Penentuan Konsentrasi Substrat L-Asparagin dan Waktu Inkubasi Optimum Produksi L-Asparaginase

Penentuan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium produksi

L-Asparaginase dilakukan dengan menginokulasi koloni B. licheniformis HSA3-1a ke

dalam medium cair produksi enzim L-Asparaginase dengan variasi konsentrasi asam

amino L-Asparagin 0.75%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, dan 2.5% terhadap volume medium.

Kemudian diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 50oC. Setiap 24 jam dilakukan

sampling untuk mengukur aktivitas L-Asparaginase tiap variasi konsentrasi substrat

L-Asparagin.

Produksi L-Asparaginase

Produksi L-Asparaginase dilakukan dengan membiakkan isolat ke dalam 45 mL

medium produksi dalam labu Erlenmeyer 250 mL. Erlenmeyer diinkubasi pada suhu

50oC dalam inkubator berpenggoyang selama 24 jam 200 rpm. Kemudian 45 mL

inokulum dicampurkan dengan medium produksi steril 500 mL lalu diinkubasi selama

3x24 jam pada suhu 50oC. Komposisi medium produksi yaitu; Yeast Ekstrak 0,05%,

Pepton 0,01%, NaCl 0,1%, KH2PO4 0,01%, MgSO4.7H2O 0,01%, L-Asparagin 2,0%,

CaCl2 0,01% Amonium Sulfat 0,7%. (Gulati dkk., 1997; Moorthy dkk., 2010; Ghasemi

dkk., 2008; Natsir dkk., 2010)..

Isolasi dan Pemurnian L-Asparaginase

Cairan medium hasil kultur sel dipisahkan dari massa sel dengan cara penyaringan.

Filtrat yang mengandung enzim selanjutnya ditambahkan amonium sulfat sedikit demi

sedikit sambil diaduk berdasarkan tingkat kejenuhan amonium sulfat (0-20%, 20-40%,

40-60%, dan 60-80% setelah didiamkan semalam. Endapan yang terbentuk dipisahkan

dengan cara sentrifugasi pada 10000 rpm selama 30 menit suhu 4oC. Endapan yang

diperoleh dilarutkan dalam masing-masing 10 mL buffer Tris-HCl pH 8.

Larutan enzim hasil fraksinasi ammonium sulfat dimasukkan ke dalam kantung

selofan kemudian dicelupkan ke dalam suatu bejana yang berisi akuades secukupnya.

Bejana dialisis ditempatkan di atas pengaduk magnet yang dipasang dengan kecepatan

rendah. Dialisis dilakukan selama 48 jam dengan cara mengganti larutan beberapa kali

dengan larutan buffer tris-HCl pH 8 hingga menunjukkan tidak ada lagi amoniak dalam

larutan buffer hasil dialisis. Pengujian dilakukan pereaksi Nessler yang akan bereaksi

membentuk warna coklat jika terdapat amoniak dalam larutan buffer.

Penentuan Kadar Protein

Penentuan kadar protein dilakukan dengan menggunakan metode termodifikasi

Lowry, dengan menggunakan larutan standar Bovine Serum Albumin.

Uji Aktivitas Enzim L-Asparaginase

Aktivitas L-Asparaginase ditentukan secara kolorimetri berdasarkan metode

Wriston dkk. (1973) pada suhu 50oC menggunakan spektrofotometer UV-Visible dengan

mengukur jumlah amoniak yang dihasilkan dari katalisis L-asparaginase menggunakan

reagen nessler. Campuran reaksi terdiri atas 0,1 mL enzim, 0,2 mL buffer Tris-HCl 0,05

M pH 8,6 dan 1,7 mL L-Asparagin 0,01 M diinkubasi pada suhu optimum selama 10

menit. Reaksi dihentikan oleh penambahan 0,5 mL larutan trikloroasetat 1,5 M. Setelah

sentrifugasi 10.000 rpm, 0,5 mL supernatan diencerkan dengan 8,5 mL akuabides

kemudian ditambahkan 1 mL reagen Nessler. Amonia yang dilepaskan oleh hidrolisis

enzim L-Asparaginase bereaksi dengan reagen Nessler. Lalu ditentukan kadarnya

menggunakan standar ammonium klorida. 1 unit L-Asparaginase (IU) didefenisikan

sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang mengkatalisis pelepasan satu µmol amoniak

permenit pada kondisi pengujian.

Karakterisasi Pengaruh pH terhadap aktivitas Enzim L-Asparaginase

Aktivitas L-Asparaginase dievaluasi pada pH yang beragam. Enzim bebas dan

teramobilisasi masing-masing diinkubasi pada buffer 0,05 M dari pH 6-10. Pada setiap

kondisi, jumlah ammonia yang dilepaskan masing-masing diukur. Buffer yang digunakan

adalah kalium fosfat (pH 6,0-7,0). Tris HCl (pH 8,0-9,0) dan Glisin-NaOH (pH 10-11).

Karakteriasasi Pengaruh temperatur terhadap aktivitas Enzim L-Asparaginase

Aktivitas L-Asparaginase dievaluasi pada temperatur yang beragam pada pH

optimum. Enzim bebas dan teramobilisasi masing-masing diinkubasi pada temperatur

antara 37oC, 40-70oC dengan interval 10oC.

Karakterisasi Penentuan Stabilitas L-Asparaginase terhadap pH dan Suhu

Stabilitas pH dan suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase ditentukan dengan

melakukan pre inkubasi enzim dan buffer pada pH optimum. Pre inkubasi dilakukan

selama 2 jam dan diuji aktivitas L-Asparaginase setiap selang 30 menit pada suhu

optimum (E-Moharam dkk., 2010 dan Natsir dkk., 2010).

Analisis Data

Aktivitas Enzim (IU/mL) = ( ) .

. . (1)

Dimana :y = Absorbansia = slope b = InterseptV. Total = Volume enzim + substrat + buffer + TCA (2,5 mL)V. Analisis = Volume total yang dianalisis (0,5 mL)V. Enzim = Volume enzim yang dianalisis (0,1 mL)T. Inkubasi = 10 menit

Aktivitas Spesifik = Aktivitas Enzim (IU) (2) Kadar Protein (mg/mL)

Aktivitas L-Asparaginase Inkubasi “x” menitAktivitas Relatif = -------------------------------------------------------- x 100 % (3) Aktivitas L-Asparaginase Inkubasi 0 menit

HASIL

Pemurnian dan Skrining B. licheniformis untuk Produksi L-Asparaginase

B. licheniformis yang dibiakkan dalam medium skrining produksi

L-Asparaginase menunjukkan bahwa B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi

enzim L-Asparaginase ekstraseluler ditandai oleh pembentukan warna pink di sekitar

koloni yang memproduksi L-Asparaginase.

Penentuan Konsentrasi Substrat L-Asparagin dan Waktu Inkubasi Optimum Produksi L-Asparaginase

Aktivitas tertinggi L-Asparaginase 31.51 IU/mL pada konsentrasi substrat asam

amino L-Asparagin dalam medium fermentasi adalah 2,0% dengan waktu inkubasi 48

jam seperti yang tampak pada Gambar 1.

Penetapan Kadar Protein Tiap Fraksi Pengendapan Amonium Sulfat

Pengukuran kadar protein tiap fraksi tingkat kejenuhan amonium sulfat 0-20%,

20-40%, 40-60%, dan 60-80% masing-masing secara berurutan adalah; 0.0110 mg/mL,

0.075 mg/mL, 0.0070 mg/mL, dan 0.1140 mg/mL sedangkan kadar protein ekstrak kasar

adalah 0.027 mg/mL.

Penentuan Aktivitas L-Asparaginase Tiap Fraksi Pengendapan

Tiap fraksi pengendapan setelah dialisis ditentukan aktivitasnya. Aktivitas

tertinggi L-Asparaginase tiap fraksi pengendapan amonium sulfat setelah dialisis berada

pada tingkat kejenuhan amonium sulfat 20-40% memiliki aktivitas 42,95 IU/mL seperti

tampak pada Gambar 2.

Karakterisasi pengaruh pH terhadap aktivitas L-Asparaginase

Gambar 3 menunjukkan bahwa aktivitas L-Asparaginase meningkat seiring dengan

peningkatan pH hingga optimum pada pH 8. Aktivitas spesifik L-Asparaginase pada pH

6 adalah 345.8 IU/mg protein kemudian 506.64 IU/mg pada pH 7 dan optimum pada pH

8 dengan aktivitas spesifik 543.19 IU/mg protein yang selanjutnya menurun pada pH 9

dan 10.

Karakterisasi Pengaruh suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase

Gambar 4 menunjukkan aktivitas L-Asparaginase berbanding lurus dengan

meningkatnya suhu dari 30oC hingga optimum pada suhu 50oC yang kemudian menurun

pada suhu 60oC dan 70oC. Aktivitas spesifik L-Asparaginase pada suhu optimumnya

yakni 50oC adalah 616.26 IU/mg protein.

Karakterisasi Stabilitas L-Asparaginase terhadap pH dan suhu

Gambar 5 menunjukkan kestablilan L-Asparaginase terhadap pre inkubasi pada

pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50oC) dapat stabil hingga 60 menit dengan aktivitas

relatif hingga 82.9%. Aktivitas relatifnya kemudian terus menurun pada pre inkubasi 90

menit dan 120 menit secara berurutan yaitu 59,9% dan 45,32%.

PEMBAHASAN

B. licheniformis dibiakkan dalam medium skrining produksi L-Asparaginase

menunjukkan bahwa B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase

ekstraseluler. Hal ini ditunjukkan oleh terjadinya perubahan warna medium yang

mengandung indikator fenol merah dari coklat menjadi pink. Pembentukan warna pink

menunjukkan terbentuknya amoniak sebagai hasil hidrolisis subtrat L-Asparagin menjadi

asam aspartat dan melepaskan molekul amoniak. Amoniak yang bersifat basa akan

merubah pH medium menjadi basa sehingga terjadi perubahan warna medium dari coklat

menjadi pink (Gashemi dkk., 2008).

Produksi enzim oleh bakteri secara maksimum dipengaruhi oleh substrat sebagai

komponen medium pertumbuhan pada konsentrasi dan waktu inkubasi tertentu.

Penentuan konsentrasi optimum substrat L-Asparagin dalam medium produksi

L-Asparaginase dilakukan dengan menumbuhkan B. licheniformis dalam medium cair

produksi L-Asparaginase dengan variasi konsentrasi substrat asam amino L-Asparagin

0.75%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, dan 2.5% terhadap volume medium. Waktu inkubasi optimum

ditentukan dengan melakukan pengukuran aktivitas L-Asparaginase setiap 24 jam waktu

inkubasi. Hasil penelitian menunjukkan aktivitas tertinggi L-Asparaginase 31.51 IU/mL

pada konsentrasi substrat L-Asparagin dalam medium fermentasi adalah 2,0% dengan

waktu inkubasi 48 jam.

Tiap fraksi pengendapan amonium sulfat setelah dialisis, diukur kadar proteinnya

dan dibandingkan dengan kadar protein ekstrak kasar. Kadar protein ditentukan dengan

metode Lowry. Protein yang terkandung dalam tiap fraksi akan bereaksi dengan molekul

komponen reagen Lowry membentuk larutan berwarna biru. Kadar protein dihitung

berdasarkan nilai absorbansi yang sebanding dengan kadar protein pada panjang

gelombang optimum (680 nm) terhadap kurva standar bovine serum albumin. Hasil

pengukuran kadar protein tiap fraksi tingkat kejenuhan amonium sulfat 0-20%, 20-40%,

40-60%, dan 60-80% masing-masing secara berurutan adalah; 0.0110 mg/mL, 0.075

mg/mL, 0.0070 mg/mL, dan 0.1140 mg/mL sedangkan kadar protein ekstrak kasar adalah

0.027 mg/mL.

Aktivitas L-Asparaginase ditentukan dengan metode Nessler. Banyaknya amoniak

yang dihasilkan dari katalisis substrat asam amino L-Asparagin oleh enzim

L-Asparaginase dinyatakan sebagai aktivitasnya (Siddalingeshwara dkk., 2011). Amonia

yang dilepaskan oleh hidrolisis enzim L-Asparaginase bereaksi dengan reagen Nessler.

Lalu ditentukan kadarnya menggunakan standar ammonium klorida. Satu unit

L-Asparaginase (IU) didefenisikan sebagai jumlah enzim L-Asparaginase yang

mengkatalisis pembentukan satu µmol amoniak permenit pada kondisi pengujian (Basha

dkk., 2009). Tiap fraksi pengendapan setelah dialisis ditentukan aktivitasnya. Aktivitas

L-Asparaginase tertinggi berada pada tingkat kejenuhan amonium sulfat 20-40%

memiliki aktivitas 42,95 IU/mL.

Beberapa karakteristik enzim L-Asparaginase dalam bentuk bebas dan

teramobilisasi yang dipelajari dalam penelitian ini antara lain : pengaruh pH, suhu,

stabilitas pH dan stabilitas suhu enzim L-Asparaginase.

Enzim memiliki pH optimum yang khas, yaitu pH yang menyebabkan aktivitas

maksimal. Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH enzim pada saat gugus pemberi

dan penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada dalam tingat ionisasi

yang diinginkan. Aktivitas L-Asparaginase meningkat seiring dengan peningkatan pH

hingga optimum pada pH 8 dengan aktivitas spesifik 543.19 IU/mg protein.

Reaksi kimia termasuk reaksi katalisis enzim dapat dipengaruhi oleh suhu. Pada

suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi

reaksi berlangsung lebih cepat. Disamping itu, karena enzim adalah suatu protein, maka

kenaikan suhu dapat menyebabkan denaturasi yang merusak sisi aktif enzim dan

menurunkan aktivitasnya. Aktivitas L-Asparaginase berbanding lurus dengan

meningkatnya suhu dari 30oC hingga optimum pada suhu 50oC dengan aktivitas spesifik

616.26 IU/mg protein.

Kestabilan enzim terhadap pH dan suhu adalah kemampuan enzim menjaga

konformasinya, sehingga sisi aktif enzim sesuai dengan substrat dan mampu

mempertahankan aktivitasnya pada kondisi tertentu. Kestablilan L-Asparaginase terhadap

pre inkubasi pada pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50oC) pada pre inkubasi hingga 60

menit memiliki aktivitas relatif hingga 82.9%. Aktivitas relatifnya kemudian terus

menurun pada pre inkubasi 90 menit dan 120 menit secara berurutan yaitu 59,9% dan

45,32%. Hal ini menunjukkan bahwa L-Asparaginase dapat mempertahankan sisi aktif

enzim dan masih dapat bekerja dengan baik meskipun telah dilakukan penyimpanan

selama 1 jam pada suhu optimumnya

KESIMPULAN DAN SARAN

B. licheniformis HSA3-1a dapat memproduksi L-Asparaginase ekstraseluler

secara maksimum pada konsentrasi asam amino L-Asparagin 2% dalam medium

fermentasi dan waktu inkubasi 48 jam. L-Asparaginase memiliki aktivitas yang optimum

pada pH 8 suhu 50oC dengan aktivitas spesifik 616,26 IU/mg protein serta stabil pada

suhu dan pH optimum selama 60 menit. Pengembangan hasil penelitian ini penulis

sarankan untuk melakukan penelitian lanjutan tentang optimasi produksi L-Asparaginase

dari bakteri B. licheniformis dan pembuatan enzim amobil L-Asparaginase yang

menggunakan berbagai jenis karier pengamobilisasi.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmed, S.A., Shireen, A.S., dan Abdel-Fattah, A.F., (2007), Stabilization of Bacillus Licheniformis ATCC 21415 Alkaline Protease by Immobilization and Modification, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 1(3) 313-322.

Antara, N.S., (2009), Mengurangi Pembentukan Akrilamida dengan Menggunakan Enzim dan Mikroba pada Produk Pangan, FTP, UNUD.

Basha, N.S., Rekha, R., Komala, M., dan Ruby, S., (2009), Production of Extracellular Anti-Lukaeia Enzyme L-asparaginase from Marine Actinomycetes by Solid-State and Submerged Fermentation : Purification and Characterization, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 8(4) 353-360.

El-Bessoumy, A.A., Sarhan, M., dan Mansour, J., (2004), Pruduction, Isolaton, and Purification of L-Asparaginase from Pseudomonas Aeruginosa 50071 Using Solid-state Fermentation, Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 4(37)387-393.

E-Moharam, M., Gamal-Eldeen, A.M., dan El-Sayed, S.T., (2010), Production, Immobilization and Anti-Tumor Activity of L-Asparaginase of Bacillus sp R36, Journal of American Science, 6(8) 157-165.

Ghasemi, Y., Ebrahimi, A., Rasoul-Amini, S., Zarrini, G., dan Ghoshoon, MB., (2008), An Optimized Medium for Screening of L-Asparaginase Production by Escherichia coli, American Journal of Biochemistry an Biotechnology, 4(4) 422-424.

Gulati R., Saxena, R.K., dan Gupta, R., (1997), A Rapid Plate Assay for Screening L-Asparaginase, Producing Microorganisms, Lett. Appl Microbiol, 24, 23-26.

Moorthy, V., Ramalingam, A., Sumantha, A., dan Shankaranaya, R.T., (2010), Production, Purification, and Characterisation of Extacellular L-Asparaginase from a Soil isolate of Bacillus sp., African Journal of Microbiology Research,4(18) 1862-1867.

Natsir, H., Patong, A.R., Suhartono, M.T., dan Ahmad, A., (2010), Production and Characterization of Chitinase Enzymes from Sulili Hot Spring in South Sulawesi, Bacillus sp. HSA3-1a, Indo.J.Chem., 10(2) 263 - 267.

Siddalingeshwara, dan Lingappa, (2011), Production and Characterization of L-Asparaginase–A Tumour inhibitor, International Journal PharmTech Research, 1(3) 314-319.

Tika I.N., Redhana, I.W., dan Ristiati, N.P., (2007), Isolasi Enzim Lipase Termostabil dari bakteri Termofilik Isolat Air Panas Banyuwedang Kecamatan Gerobak, Buleleng Bali, Akta Kimia Indonesia, (2), 2, 109-112.

Wriston, J.C, dan Yellin, (1970), Asparaginase, Method Enzymol, 16, 732-742.

0

50

Ekstrak Kasar

12.83

Akt

ivita

s L-

Aspa

ragi

nase

(IU

/mL)

Ekstrak Kasar dan Fraksi Tiap Kejenuhan Amonium Sulfat (%)

Gambar 1. Aktivitas L-Asparaginase tiap variasi konsentrasi L-asparagin dalam medium

Gambar 2. Aktivitas L-Asparaginase tiap fraksi pengendapan kejenuhan sulfat setelah dialisis

Gambar 3. Pengaruh pH terhadap

0

100

200

300

400

500

600

4

Akt

ivit

as S

pesi

fik

(IU

/mg

Pro

tein

)

Ekstrak F.0-20 %

F.20-40 %F.40-60 %

F.60-80%

12.8324.28

42.95

22.4719.46

Ekstrak Kasar dan Fraksi Tiap Kejenuhan Amonium Sulfat (%)

Asparaginase tiap variasi konsentrasi substrat asam amino dalam medium

Asparaginase tiap fraksi pengendapan kejenuhan setelah dialisis

Pengaruh pH terhadap aktivitas L-Asparaginase

543.19

5 6 7 8 9 10 11pH

asam amino

Asparaginase tiap fraksi pengendapan kejenuhan amonium

Gambar 4. Pengaruh suhu terhadap aktivitas L-Asparaginase

Gambar 5. Pengaruh waktu pre inkubasi terhadap stabilitas L-Asparaginase pada pH dan suhu optimum (pH 8 dan 50°C)

616.26

0

100

200

300

400

500

600

700

20 30 40 50 60 70 80Akt

ivit

as S

pesi

fik

(IU

/mg

Pro

tein

)

Suhu (°C)

100 95.14

82.99

59.9

45.32

0

20

40

60

80

100

120

0 30 60 90 120 150

Akt

ivit

as R

elat

if (%

)

Waktu Pre Inkubasi L-Asparaginase (Menit)