produksi kolagenase dari isolat bacillus licheniformis f ... · penulis menyelesaikan pendidikan di...

PRODUKSI KOLAGENASE DARI ISOLAT Bacillus

licheniformis F-11.1 DAN F-11.4

CINDY THERESIA OCTIVIANTI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

ABSTRAK

CINDY THERESIA OCTIVIANTI. Produksi Kolagenase dari Isolat Bacillus licheniformis F-11.1

dan F-11.4. Dibimbing oleh SRI BUDIARTI dan MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO. Hidrolisis enzimatik dengan kolagenase berperan meningkatkan nutrisi dan fungsional protein

pangan. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi kolagenase dari Bacillus licheniformis F-11.1

dan F-11.4. Isolat B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 ditumbuhkan pada tiga macam media

produksi, yaitu media Luria Bertani (LB) yang mengandung 5% kolagen (LBC), media LB 50%

dengan 5% kolagen (LBHC), dan 5% kolagen (CLG). Aktivitas kolagenase, kadar protein, dan

turbiditas sel B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 diukur setiap selang waktu 5 jam selama 50 jam

waktu inkubasi. Hasil menunjukkan bahwa produksi kolagenase tertinggi isolat B. licheniformis F-

11.1 dicapai pada media LBC dan LBHC dengan aktivitas spesifik masing-masing sebesar 2,057

U/mg dan 2,037 U/mg. Produksi kolagenase tertinggi isolat B. licheniformis F-11.4 dicapai pada

media LBC dengan aktivitas spesifik sebesar 4,695 U/mg. Isolat F-11.4 pada media LBHC

memiliki aktivitas spesifik tertinggi sebesar 2,811 U/mg. Media CLG memberikan aktivitas

spesifik tertinggi untuk B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 masing-masing sebesar 0,807 U/mg dan

0,306 U/mg. Dari ketiga media percobaan disimpulkan bahwa media LBC dan LBHC merupakan

media terbaik untuk produksi kolagenase B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4.

Kata kunci: produksi, kolagenase, Bacillus licheniformis

ABSTRACT CINDY THERESIA OCTIVIANTI. Collagenase Production of Bacillus licheniformis isolate F-

11.1 and F-11.4. Supervised by SRI BUDIARTI and MAGGY THENAWIDJAJA SUHARTONO. Hydrolysis by collagenase enzyme could increase nutrition and function of food proteins. This

research was conducted to produce collagenase enzyme from Bacillus licheniformis F-11.1 and F-

11.4. B. licheniformis isolate F-11.1 and F-11.4 were cultured in three types of production media,

which is Luria Bertani (LB) media consisted of 5% collagen (LBC), 50% LB media consisted of

5% collagen (LBHC), and 5% collagen (CLG). The activity of collagenase, protein content, and

cell turbidity of B. licheniformis F-11.1 and F-11.4 were measured every 5 hours during 50 hours

incubation. The result showed that optimum collagenase production of B. licheniformis isolate F-

11.1 was reached in LBC and LBHC media with activity of 2,057 U/mg and 2,037 U/mg,

respectively. Optimum collagenase production of B. licheniformis isolate F-11.4 was reached in

LBC media with activity of 4,695 U/mg. Isolate F-11.4 in LBHC media possesed the optimum

collagenase activity of 2,811 U/mg. CLG media gave optimum collagenase activity of B.

licheniformis F-11.1 and F-11.4 at 0,807 U/mg and 0,306 U/mg respectively. These research

concluded that LBC and LBHC media was the best choice for collagenase production of B.

licheniformis F-11.1 and F-11.4.

Keywords: production, collagenase, Bacillus licheniformis

PRODUKSI KOLAGENASE DARI ISOLAT Bacillus

licheniformis F-11.1 DAN F-11.4

CINDY THERESIA OCTIVIANTI

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2012

Judul Skripsi : Produksi Kolagenase dari Isolat Bacillus licheniformis F-11.1 dan

F-11.4

Nama : Cindy Theresia Octivianti

NIM : G34080121

Disetujui,

Pembimbing I, Pembimbing II,

Dr. dr. Sri Budiarti Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono

NIP. 195813081993032001 NIP. 195305071977012001

Diketahui,

Ketua Departemen Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.

NIP. 196410021989031002

Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas karunia-Nya sehingga

laporan skripsi yang berjudul “Produksi Kolagenase dari Isolat Bacillus licheniformis F-11.1 dan

F-11.4” dapat diselesaikan tepat pada waktunya. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember

2011 hingga Mei 2012, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat

Pengembangan Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), Laboratorium Mikrobiologi dan

Laboratorium Mikologi, Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. dr. Sri Budiarti dan Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy

Thenawidjaja Suhartono selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan, saran, dan

motivasi selama pelaksanaan penelitian hingga penulisan karya ilmiah ini. Terima kasih kepada

Prof. Dr. Ir. Maggy Thenawidjaja Suhartono yang telah memberikan dana penelitian. Ucapan

terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Yohana Caecilia Sulistyaningsih, M.Si selaku

dosen penguji wakil komisi pendidikan yang telah bersedia menguji dan memberikan saran saat

ujian dan penulisan karya ilmiah.

Penulis mengucapkan terima kasih kepada kepala Pusat Pengembangan Sumberdaya Hayati

dan Bioteknologi (PPSHB)-IPB beserta seluruh staf Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia atas

sarana, prasarana, dan bantuan selama penulis melakukan penelitian. Terima kasih penulis

ucapkan pula kepada staf pengajar Bagian Mikrobiologi dan seluruh staf pengajar di Departemen

Biologi IPB yang telah memberikan saran dan bantuan atas terselesaikannya karya ilmiah ini.

Penulis juga menyampaikan ungkapan terima kasih kepada Mama, Papa, Adik, Rezki

Ariefianto, serta seluruh keluarga atas doa, kasih sayang, pengertian, dan dukungannya. Terima

kasih pula penulis ucapkan kepada ibu Ika, pak Ace, ibu Diana, pak Pras, pak Jaka, kak Wenny,

Isna, Olin, Goki, dan Malibu Crew yang selalu membantu selama penulis bekerja di laboratorium

dan senantiasa memberi semangat. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada teman-teman di

Laboratorium Mikrobiologi dan rekan-rekan “Biologi 45” atas bantuan dan dukungannya, serta

seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu atas doa dan dukungannya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat, bagi penulis maupun pembaca.

Bogor, Agustus 2012

Cindy Theresia Octivianti

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Semarang pada tanggal 20 Oktober 1990 dari pasangan ayah Anthony

Bernard Simanjuntak dan ibu Siti Zulfiah. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara.

Penulis menyelesaikan pendidikan di SMA Marsudirini Sedes Sapientiae Semarang pada tahun

2008. Pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Seleksi Penerimaan

Mahasiswa Baru pada Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama masa perkuliahan penulis menerima Beasiswa BBM (Bantuan Belajar Mahasiswa).

Penulis juga berpartisipasi dalam kegiatan yang diselenggarakan HIMABIO seperti Biology on

Experiment (2010) dan Grand Biodiversity dan Temu Alumni (2011). Pada tahun 2010, penulis

melaksanakan studi lapangan di Taman Wisata Alam dan Cagar Alam Pangandaran dengan judul

laporan “Bakteri Penghasil Agarase yang Berasosiasi dengan Alga” di bawah bimbingan Ibu Prof.

Dr. Anja Meryandini. Pada tahun 2011, penulis melaksanakan praktik lapangan di PT Nyonya

Meneer Semarang dengan judul laporan “Pengawasan Mutu Produk Jamu Di PT Nyonya Meneer

Semarang” di bawah bimbingan Ibu Dr. Nunik Sri Ariyanti, M.Si.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ..........................................................................................................................viii

DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................viii

PENDAHULUAN

Latar Belakang ............................................................................................................................. 1

Tujuan .......................................................................................................................................... 2

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................................................................... 2

Bahan ........................................................................................................................................... 2

Metode ......................................................................................................................................... 2

Penyiapan Kolagen Sebagai Substrat dan Media Pertumbuhan .......................................... 2

Peremajaan Isolat dan Pembuatan Inokulum ...................................................................... 2

Pengamatan Laju Pertumbuhan Sel dan Produksi Kolagenase ........................................... 2

Uji Aktivitas Kolagenase dan Penentuan Kadar Protein ..................................................... 2

HASIL

Laju Pertumbuhan Sel dan Produksi Kolagenase ........................................................................ 3

Perbandingan Aktivitas Kolagenase Terbaik B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4 pada Media

LBC, LBHC, dan CLG........................................................................................................ 4

PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 5

SIMPULAN ...................................................................................................................................... 6

SARAN ......................................................................................................................................... 6

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 6

LAMPIRAN ...................................................................................................................................... 9

DAFTAR TABEL Halaman

1 Aktivitas kolagenase terbaik isolat F-11.1 dan F-11.4 pada tiga media produksi ......................... 4

DAFTAR GAMBAR Halaman

1 Kurva tumbuh, aktivitas kolagenase, dan aktivitas spesifik enzim isolat F-11.1 pada

media LBC ............................................................................................................................. 3


media LBHC .................................................................................................................................. 3


media CLG ..................................................................................................................................... 3


media LBC ..................................................................................................................................... 4


media LBHC .................................................................................................................................. 4


media CLG ..................................................................................................................................... 4

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Metode pengukuran aktivitas kolagenase menurut Moore & Stein (1954) ................................. 10

2 Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976) .................................................................... 11

3 Kurva standar protein Bradford ................................................................................................... 12

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Enzim merupakan molekul polimer yang

dihasilkan oleh semua sel hidup dan memiliki

peranan penting sebagai biokatalisator pada

reaksi biokimia. Spesifitas, efisiensi, dan kerja

yang selektif membuat industri enzim

berkembang pesat dan menempati posisi

penting dalam dunia industri. Protease

merupakan salah satu enzim komersial yang

telah digunakan secara luas dalam bidang

industri. Berdasarkan aktivitasnya, protease

dibedakan menjadi proteinase (endopeptidase)

yang menghidrolisis molekul protein menjadi

polipeptida dan peptidase (eksopeptidase)

yang menghidrolisis polipeptida menjadi asam

amino (Rao et al. 1998).

Salah satu enzim golongan protease ialah

kolagenase. Kolagenase adalah endopeptidase

yang mampu mendegradasi ikatan polipeptida

kolagen (Kim et al. 2002). Kolagen

merupakan protein berbentuk serabut

penyusun tubuh makhluk hidup. Protein ini

merupakan struktur utama pada kulit dan

tulang hewan (Bama et al. 2010). Kolagen

terdiri atas tiga rantai polipeptida yang

berulang dan mengandung lebih dari 1000

residu asam amino. Asam amino yang

terkandung dalam kolagen antara lain, 35%

glisin, 11% alanin, serta 21% prolin dan

hidroksiprolin (Lehninger 1993).

Konformasi triple helix pada kolagen

menyebabkan protein ini resisten terhadap

sebagian besar proteinase. Namun, kolagenase

mampu memecah tripolipeptida ini. Pada

penelitian Chung et al. (2004), kolagenase

bekerja efektif dan dapat memecah protein

kolagen pada suhu tubuh 37oC. Menurut

Sternlicht & Werb (2001), degradasi

makromolekul kolagen oleh kolagenase

berperan dalam proses biologis pada tubuh

manusia seperti, embriogenesis, morfogenesis

organ, dan perbaikan jaringan.

Kolagen telah banyak diekstraksi dari

berbagai jenis ikan dan kulit hewan mamalia

seperti sapi. Jenis ikan yang telah dilaporkan

sebagai penghasil kolagen antara lain, ikan

sardin (Sardinops melanosticus), ikan red sea

bream (Pagrus major), dan ikan japanese sea

bass (Lateobrax japonicus). Kulit, tulang, dan

sisik merupakan bagian yang berpotensi

sebagai sumber kolagen (Nagai et al. 2004).

Pemanfaatan kolagen dari kulit ikan

mempunyai resiko lebih rendah

terkontaminasi patogen seperti bovine

spongiform enchepalopathy (BSE) daripada

kolagen dari kulit sapi. Selain itu, kolagen dari

kulit ikan juga relatif mudah diekstraksi dan

memberikan hasil yang lebih tinggi

dibandingkan kolagen dari kulit sapi (Yunoki

et al. 2003).

Kolagenase dapat digunakan dalam proses

pelunakan daging dan hidrolisis protein.

Hultmann & Rustad (2004) melaporkan

bahwa kolagenase endogen pada ikan salmon

mampu memisahkan ikatan antara serat-serat

daging dengan mycotoma sehingga daging

ikan menjadi lunak. Hidrolisis protein secara

enzimatik dapat meningkatkan kualitas

protein. Proses hidrolisis yang sempurna dapat

menghasilkan hidrolisat yang terdiri atas

campuran 18-20 macam asam amino. Pada

penelitian Kumaila (2008), hidrolisis protein

kerang hijau dengan kolagenase menghasilkan

kadar α-amino nitrogen bebas sebesar 0,184

g/100 g. Enzim kolagenase juga berperan

dalam proses penyembuhan luka (Riley &

Herman 2005) dan perbaikan jaringan pada

peradangan (Chung et al. 2004).

Kolagenase dihasilkan oleh beberapa

mikroorganisme seperti, Streptomyces sp.

strain 3B (Petrova et al. 2006), Clostridium

hystolyticum (Bond & Wart 1984), Bacillus

subtilis FS-2 (Nagano & To 1999), Bacillus

subtilis CN2 (Tran & Nagano 2002), Vibrio

alginolyticus (Reid et al. 1980),

Achromobacter iophagus (Reid et al. 1978),

Klebsiella pneumoniae CNL3, dan Bacillus

cereus CNA1 (Suphatharaprateep et al. 2011).

Kolagenase dilaporkan juga ditemukan di

organ dalam ikan makarel (Park et al. 2002)

dan organ dalam ikan filefish (Kim et al.

2002).

Sumber kolagenase yang digunakan dalam

penelitian ini ialah Bacillus licheniformis F-

11. Pada penelitian yang dilakukan Waldeck

et al (2006), bakteri ini termasuk termofil dan

digunakan untuk deproteinasi kulit udang

pada produksi kitin dengan suhu optimum

55oC. Waldeck et al (2006) melaporkan

bahwa bakteri ini dapat menggunakan kolagen

sebagai substrat pertumbuhan.

Bacillus licheniformis F-11 yang

digunakan dalam penelitian ini telah

mengalami perlakuan mutagenik pada operon

PGA (Asam Poliglutamat) dan Kitinase-AB

menjadi strain F-11.1 dan F-11.4 (Hoffmann

et al. 2010). Kedua strain tersebut berpotensi

menghasilkan kolagenase karena kemampuan

B. licheniformis F-11 menggunakan kolagen

sebagai substrat. Baehaki et al. (2012)

melaporkan bahwa kedua strain ini merupakan

penghasil kolagenase.

Protein memegang peranan penting pada

peningkatan kesehatan manusia karena nilai

2

gizinya yang tinggi. Hidrolisis secara

enzimatik berperan meningkatkan nutrisi dan

fungsional protein pangan (Suhartono 1989).

Hidrolisat protein, khususnya dari ikan telah

dilaporkan bersifat antioksidatif (Shahidi et al.

1995). Produksi enzim kolagenase diharapkan

dapat meningkatkan nilai tambah limbah hasil

perikanan untuk digunakan dalam proses

hidrolisis protein khususnya kolagen.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk

memproduksi kolagenase dari Bacillus

licheniformis F-11.1 dan F-11.4.

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan

Desember 2011 sampai Mei 2012 bertempat

di Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia

Pusat Pengembangan Sumberdaya Hayati dan

Bioteknologi (PPSHB) IPB, Laboratorium

Mikrobiologi, dan Laboratorium Mikologi,

Departemen Biologi, FMIPA, IPB.

Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian

ini ialah isolat Bacillus licheniformis F-11.1

dan F-11.4 yang merupakan koleksi dari

Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia

Pusat Pengembangan Sumberdaya Hayati dan

Bioteknologi (PPSHB) IPB.

Metode

Penyiapan Kolagen Sebagai Substrat dan

Media Pertumbuhan Pembuatan substrat kolagen menggunakan

metode Yuniarti (2010). Substrat kolagen

yang digunakan berasal dari kulit ikan

bandeng yang diperoleh dari pasar tradisional.

Kulit ikan bandeng dibersihkan dari sisa

daging, lemak, dan kotoran lainnya. Kulit

kemudian dipotong sebesar 3x3 cm dan

direndam dalam asam asetat 1,5% selama 24

jam dengan perbandingan (b/v) sebesar 1:2.

Selanjutnya, kulit dicuci dengan akuades

hingga pHnya mendekati netral (pH 7). Kulit

yang telah mengembang diekstraksi

menggunakan akuades dengan perbandingan

(b/v) sebesar 2:1. Ekstraksi dilakukan selama

3 jam pada suhu 40oC. Hasil ekstraksi disaring

dengan kertas saring menjadi larutan kolagen.

Peremajaan Isolat dan Pembuatan

Inokulum

Biakan bakteri disimpan dan diremajakan

pada media agar-agar miring Luria Bertani

(LB). Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada

suhu 50oC untuk isolat B. licheniformis F-11.1

dan 40oC untuk isolat F-11.4. Sebanyak 2 lup

isolat F-11.1 dan F-11.4 masing-masing

ditumbuhkan pada 75 ml media kaldu LB

sebagai inokulum. Inokulum diinkubasi

dengan kecepatan 110 rpm selama 24 jam

pada suhu 50oC untuk isolat F-11.1 dan 40

oC

untuk isolat F-11.4.

Pengamatan Laju Pertumbuhan Sel dan

Produksi Kolagenase

Sebanyak 10% inokulum (OD= 0,8 pada

λ= 620 nm) dimasukkan ke dalam erlenmeyer

yang berisi 200 ml media produksi dan

diinkubasi dengan kecepatan 110 rpm.

Produksi kolagenase dilakukan pada suhu

50oC untuk isolat F-11.1 dan 40

oC untuk

isolat F-11.4. Media produksi yang digunakan

antara lain, LB + 5% kolagen (LBC), LB 50%

+ kolagen 5% (LBHC), dan 5% kolagen

(CLG). Turbiditas sel diukur pada panjang

gelombang 620 nm dengan spektrofotometer

(Genesys 20) setiap selang waktu 5 jam

selama 50 jam. Pada masing-masing waktu

pengamatan diukur aktivitas enzim dan kadar

proteinnya.

Ekstraksi kolagenase dilakukan dengan

cara sentrifugasi media pertumbuhan bakteri

dengan alat Tomy MRX-152 dengan

kecepatan 4000 rpm suhu 4oC selama 20

menit. Supernatan yang mengandung ekstrak

kasar enzim dipisahkan dari endapannya dan

diuji aktivitasnya serta kadar protein.

Uji Aktivitas Kolagenase dan Penentuan

Kadar Protein

Aktivitas enzim kolagenase diuji dengan

metode Moore & Stein (1954) dimodifikasi

dalam jumlah dan pereaksi untuk pewarnaan

(Kim et al. 2002) (Lampiran 1). Sebanyak 0,1

ml larutan enzim ditambah dengan 5 ml

larutan kolagen 5% (b/v) dan 1 ml 50mM

bufer fosfat pH 9, campuran diinkubasi di

inkubator pada 37oC selama 1 jam. Reaksi

dihentikan dengan penambahan 0,2 ml 0,5%

asam trikloroasetat (TCA). Setelah 10 menit

pada suhu ruang, larutan disentrifugasi pada

5000 rpm selama 20 menit. Filtrat sebanyak

0,2 ml direaksikan dengan 1,0 ml larutan

ninhidrin dan diinkubasi pada 100oC selama

20 menit, lalu didinginkan pada suhu ruang.

Campuran kemudian dilarutkan dalam 5 ml

50% 1-propanol dan diukur serapannya

menggunakan spektrofotometer (Genesys 20)

pada panjang gelombang 570 nm. Blanko

sebagai faktor koreksi dan standar dibuat

dengan cara yang sama. Blanko menggunakan

3

akuades, sementara standar menggunakan L-

leusin 5mM. Satu unit aktivitas enzim

didefinisikan sebagai jumlah enzim yang

menghasilkan 1 μmol leusin per menit.

Aktivitas spesifik kolagenase (U/mg)

merupakan nisbah aktivitas kolagenase (U/ml)

terhadap kadar protein (mg/ml).

Penentuan kadar protein menggunakan

metode Bradford (1976) (Lampiran 2).

Sebanyak 100 µl enzim direaksikan dengan 5

ml larutan Bradford dan dikocok kuat. Larutan

diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang

dan dibaca pada panjang gelombang 595 nm

sebagai sampel. Bovin Serum Albumin (BSA)

digunakan sebagai standar dengan konsentrasi

0-0,5 mg/ml (Lampiran 3). Blanko

menggunakan 100 µl akuades dicampur

dengan 5 ml pereaksi Bradford, lalu dikocok

dan diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 595 nm. Pengukuran kadar protein

dan uji aktivitas enzim kolagenase masing-

masing dilakukan dengan tiga kali ulangan.

HASIL

Laju Pertumbuhan Sel dan Produksi

Kolagenase

Produksi kolagenase optimum selama

pertumbuhan diketahui dari kurva

pertumbuhan dan aktivitas spesifik enzim.

Pengamatan pertumbuhan bakteri

menggunakan metode turbidimetrik. Bakteri

yang tumbuh akan menghasilkan pertambahan

jumlah sel sehingga kurva pertumbuhannya

dapat dibuat berdasarkan kekeruhan sel dalam

media. B. licheniformis isolat F-11.1 dan F-

11.4 yang ditumbuhkan pada tiga macam

media yaitu, LBC, LBHC, dan CLG

menghasilkan aktivitas kolagenolitik yang

berbeda pada 50 jam waktu inkubasi.

Pertumbuhan isolat F-11.1 pada media

LBC menunjukkan bahwa selama waktu

inkubasi 50 jam terjadi peningkatan jumlah

sel dari jam ke-0 hingga jam ke-5, selanjutnya

relatif stabil hingga jam ke-30. Aktivitas

spesifik tertinggi terjadi pada jam ke-15 yaitu

sebesar 2,057 U/mg, kemudian mengalami

penurunan pada jam ke-20 (Gambar 1).

Aktivitas spesifik kolagenase tertinggi dicapai

saat fase stasioner.

Isolat F-11.1 di media LBHC mengalami

pertambahan jumlah sel mulai dari jam ke-0

hingga jam ke-10 lalu mengalami penurunan

pada jam ke-15. Peningkatan jumlah sel

seiring dengan peningkatan nilai aktivitas

spesifik kolagenase yang dihasilkan. Aktivitas

spesifik tertinggi di media ini terjadi pada jam

ke-10 yaitu sebesar 2,037 U/mg (Gambar 2).

Nilai tertinggi aktivitas spesifik ini dicapai

pada akhir fase eksponensial.

Berdasarkan kurva pertumbuhan, isolat F-

11.1 pada media CLG mengalami kenaikan

jumlah sel mulai jam ke-0 hingga jam ke-10

waktu inkubasi, kemudian memasuki fase

stasioner pada jam ke-15. Aktivitas spesifik

tertinggi pada media CLG dicapai pada akhir

fase eksponensial yaitu jam ke-10 dengan

nilai 0,807 U/mg (Gambar 3).

Waktu fermentasi (jam)

OD

62

0 n

m

Ak

tiv

ita

s S

pe

sif

ik (

U/m

g)

0 10 20 30 40 50 600.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

OD 620nm

Aktivitas Spesifik (U/mg)

Ak

tiv

ita

s K

ola

ge

na

se

(U

/ml)

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Aktivitas Kolagenase (U/ml)

Gambar 1 Kurva tumbuh, aktivitas

kolagenase, dan aktivitas spesifik

enzim isolat F-11.1 pada media

LBC.


OD

62

0 n

m

Ak

tiv

ita

s S

pe

sif

ik (

U/m

g)

0 10 20 30 40 50 600.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

OD 620 nm


Ak

tiv

ita

s K

ola

ge

na

se

(U

/ml)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5





LBHC.


OD

62

0 n

m

Ak

tiv

ita

s S

pe

sif

ik (

U/m

g)

0 10 20 30 40 50 600.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

OD 620 nm


Ak

tiv

ita

s K

ola

ge

na

se

(U

/ml)

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10





CLG.

4

Selama waktu inkubasi 50 jam, jumlah sel

isolat F-11.4 di media LBC mengalami

peningkatan yang signifikan hingga jam ke-

20, lalu relatif stabil pada jam ke-25 dan mulai

menurun pada jam ke-40. Pertambahan

jumlah sel ini diikuti pula dengan nilai

aktivitas spesifiknya. Aktivitas spesifik

tertinggi di media ini dicapai saat fase

stasioner pada jam ke-35 yaitu sebesar 4,695

U/mg (Gambar 4).

Berdasarkan kurva pertumbuhan isolat F-

11.4 di media LBHC terlihat bahwa isolat ini

mengalami pertambahan jumlah sel hingga

jam ke-10, lalu relatif stabil pada jam ke-15.

Aktivitas spesifik tertinggi di media ini terjadi

saat fase stasioner yaitu pada jam ke-25

dengan nilai sebesar 2,811 U/mg (Gambar 5).

Isolat F-11.4 yang tumbuh di media CLG

mengalami fase lag yang panjang hingga jam

ke-40, lalu memasuki fase eksponensial pada

jam ke-45. Aktivitas spesifik tertinggi di

media CLG dicapai saat fase adaptasi yaitu

pada jam ke-35 dengan nilai sebesar 0,306

U/mg (Gambar 6).


OD

62

0 n

m

Ak

tiv

ita

s S

pe

sif

ik (

U/m

g)

0 10 20 30 40 50 600.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

OD 620nm


Ak

tiv

ita

s K

ola

ge

na

se

(U

/ml)

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0





LBC.


OD

62

0 n

m

Ak

tiv

ita

s S

pe

sif

ik (

U/m

g)

0 10 20 30 40 50 600.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

OD 620 nm


Ak

tiv

ita

s K

ola

ge

na

se

(U

/ml)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5





LBHC.


OD

62

0 n

m

Ak

tiv

ita

s S

pe

sif

ik (

U/m

g)

0 10 20 30 40 50 600.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

OD 620 nm


Ak

tiv

ita

s K

ola

ge

na

se

(U

/ml)

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10





CLG.

Perbandingan Aktivitas Kolagenase

Terbaik B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4

pada Media LBC, LBHC, dan CLG

Dari ketiga media produksi yang

digunakan, media LBC dan LBHC lebih dapat

meningkatkan aktivitas spesifik kolagenase

pada isolat B. licheniformis F-11.1, sedangkan

untuk isolat B. licheniformis F-11.4 aktivitas

spesifiknya maksimum dicapai pada media

LBC (Tabel 1). Aktivitas spesifik kolagenase

kedua isolat B. licheniformis di media CLG

lebih rendah dibandingkan pada media LBC

dan LBHC.

Tabel 1 Aktivitas kolagenase terbaik isolat F-11.1 dan F-11.4 pada tiga media produksi.

Isolat Media

Produksi

Waktu

inkubasi (Jam)

Aktivitas

Kolagenase

(U/ml)

Kadar Protein

(mg/ml)

Aktivitas

Spesifik

(U/mg)

F-11.1 LBC 15 0,356 ± 0,039 0,173 ± 0,011 2,057 ± 0,092

LBHC 10 0,132 ± 0,028 0,065 ± 0,018 2,037 ± 0,124

CLG 10 0,063 ± 0,003 0,078 ± 0,007 0,807 ± 0,109

F-11.4 LBC 35 0,566 ± 0,024 0,121 ± 0,000 4,695 ± 0,206

LBHC 25 0,250 ± 0,043 0,089 ± 0,010 2,811 ± 0,179

CLG 35 0,026 ± 0,000 0,086 ± 0,001 0,306 ± 0,001

5

PEMBAHASAN

Media optimum untuk produksi enzim

perlu dicari untuk mengetahui pertumbuhan

terbaik dari bakteri dan aktivitas enzim

tertinggi dalam suatu media. Apabila sel

tumbuh baik dalam suatu media berarti media

tersebut cocok untuk pertumbuhannya dan sel

bakteri akan menghasilkan enzim-enzim

ekstraseluler selama fase pertumbuhannya.

Keadaan lingkungan yang baik bagi sintesis

enzim biasanya juga baik bagi pertumbuhan

bakteri (Suhartono 1992).

Pertumbuhan bakteri B. licheniformis F-

11.1 dan F-11.4 lebih baik pada media LBC

dibandingkan dengan media lain yaitu, media

LBHC dan media CLG. Rendahnya

pertumbuhan kedua isolat B. licheniformis

pada media LBHC dan CLG dapat disebabkan

karena nutrisi yang minim di kedua media

tersebut. Media LBHC terdiri atas LB 50%

dan 5% kolagen, sementara media CLG hanya

terdiri atas 5% kolagen. Suhartono (1989)

menyatakan bahwa mikrob memerlukan

nutrien dengan komposisi tertentu untuk

tumbuh dan membelah diri. Luria Bertani

(LB) yang terkandung pada media LBC dan

LBHC terdiri atas ekstrak khamir, tripton, dan

NaCl. Penambahan atau pengurangan ekstrak

khamir dalam medium dapat mempengaruhi

kualitas nutrisi medium karena ekstrak khamir

mengandung vitamin B dan substansi lain

yang menunjang pertumbuhan seperti nitrogen

organik dan senyawa karbon. Tripton

merupakan sumber utama nitrogen organik

(Pelczar & Chan 2007).

Bacillus licheniformis F-11.4 yang

ditumbuhkan di media CLG mengalami fase

lag dari jam ke-0 hingga jam ke-40. Hal

tersebut karena komposisi media produksi

berbeda dengan media inokulum sehingga

bakteri melakukan adaptasi untuk

menyesuaikan diri dengan kondisi lingkungan

yang baru. Pada fase adaptasi ini belum terjadi

pembelahan sel karena beberapa enzim belum

disintesis. Jumlah sel pada fase ini mungkin

tetap, namun kadang-kadang menurun.

Jumlah awal sel yang semakin tinggi akan

mempercepat fase adaptasi (Fardiaz 1992).

Kedua isolat B. licheniformis pada media

LBC dan LBHC tidak mengalami fase

adaptasi karena bakteri ditumbuhkan dalam

media dan lingkungan yang sama dengan

media inokulum. Selain jenis media, faktor

pH, suhu, aerasi, dan ketersediaan oksigen

juga mempengaruhi pertumbuhan bakteri

(Suhartono 1992).

Berdasarkan hubungan antara kurva

pertumbuhan dengan aktivitas spesifik

kolagenase, diketahui bahwa produksi

kolagenase B. licheniformis F-11.1 maksimum

dicapai pada media LBC dan LBHC. Produksi

kolagenase tertinggi di media LBC terjadi saat

fase stasioner pada jam ke-15 yaitu sebesar

2,057 U/mg. Isolat F-11.1 di media LBHC

mencapai produksi kolagenase tertinggi ketika

fase eksponensial pada jam ke-10 yaitu

sebesar 2,037 U/mg. Sementara, di media

CLG isolat F-11.1 mencapai produksi

kolagenase tertinggi saat sel berada dalam

fase eksponensial pada 10 jam inkubasi. B.

licheniformis F-11.1 di tiga media produksi

memiliki waktu optimum produksi kolagenase

yang hampir sama dengan Achromobacter

iophagus di medium pepton yaitu pada 10-12

jam inkubasi. Aktivitas kolagenase tertinggi

Achromobacter iophagus juga dicapai pada

fase stasioner sebesar 0,156 U/ml (Reid et al.

1978). Nilai aktivitas tersebut lebih kecil bila

dibandingkan dengan aktivitas kolagenase B.

licheniformis F-11.1 di media LBC dan

LBHC.

Produksi kolagenase Bacillus

licheniformis F-11.4 maksimum dicapai pada

media LBC. Aktivitas spesifik tertingginya

terjadi pada jam ke-35 saat fase stasioner yaitu

sebesar 4,695 U/mg. Umumnya enzim

dihasilkan dalam jumlah sedikit selama fase

pertumbuhan, tetapi terakumulasi dalam

jumlah besar selama fase stasioner (Brock &

Madigan 1991). Isolat F-11.4 yang tumbuh di

media LBHC, produksi kolagenase tertinggi

dicapai saat fase stasioner pada jam ke-25.

Isolat F-11.4 di media LBHC memiliki waktu

produksi optimum kolagenase yang sama

dengan Klebsiella pneumoniae CNL3 yaitu

pada 25 jam inkubasi (Suphatharaprateep et

al. 2011). Sementara isolat F-11.4 di media

CLG mencapai produksi kolagenase

maksimumnya saat fase adaptasi pada jam ke-

35. Produksi kolagenase maksimum saat fase

adaptasi diduga karena masih banyak dan

aktifnya enzim-enzim yang berasal dari

inokulum dan dari sel-sel bakteri yang

tumbuh. Kolagenase yang dihasilkan Bacillus

licheniformis F-11.4 di tiga media produksi

lebih kecil bila dibandingkan kolagenase dari

Klebsiella pneumoniae CNL3 dan Bacillus

cereus CNA1. Penelitian Suphatharaprateep et

al (2011) menghasilkan aktivitas kolagenase

sebesar 11 U/ml untuk Klebsiella pneumoniae

CNL3 dan sebesar 24 U/ml untuk Bacillus

cereus CNA1.

Produksi kolagenase kedua isolat B.

licheniformis pada tiga media produksi

6

mengalami penurunan setelah waktu optimum

tercapai. Hal tersebut karena substrat enzim

telah berkurang. Selain itu, tingginya

kandungan asam amino dalam media dapat

berperan sebagai represor sintesis enzim atau

terjadinya penguraian oleh enzim itu sendiri

(autolisis) karena tidak ada lagi protein yang

dapat digunakan sebagai substrat (Suhartono

1989).

Laju produksi enzim dapat dipengaruhi

oleh umur inokulum karena menyebabkan

lamanya fase lag. Fase lag terjadi karena

penumpukan bahan-bahan toksik dan

habisnya nutrien esensial di dalam sel selama

pertumbuhan sebelumnya (Hadiutomo 1988).

Kondisi tersebut dapat menghambat laju

produksi enzim. Hal ini dapat dihindarkan

dengan menggunakan inokulum yang berada

pada fase eksponensial.

Bakteri umumnya mensintesis protease

ekstraseluler untuk menghidrolisis substrat

protein (polipeptida) di lingkungannya

menjadi molekul yang lebih kecil (peptida

atau asam amino) sehingga dapat diserap oleh

sel. Penambahan kolagen 5% ke dalam media

produksi berfungsi untuk menginduksi sel

bakteri dalam mensintesis kolagenase.

Beberapa enzim ada yang bersifat inducible

enzyme (enzim yang terinduksikan). Enzim

jenis ini dihasilkan oleh sel sebagai tanggapan

terhadap adanya substrat (Pelczar & Chan

2007).


licheniformis yang ditumbuhkan di media

LBC dan LBHC lebih tinggi dibandingkan di

media CLG. Hal tersebut karena adanya

perbedaan faktor nutrisi. Tingginya aktivitas

spesifik kolagenase di media LBC dan LBHC

karena nutrisi yang terkandung di media

tersebut lebih besar dibandingkan pada media

CLG. Media Luria Bertani (LB) merupakan

salah satu media yang dapat meningkatkan

produksi protease. Hal ini didukung oleh

penelitian Joo et al. (2002) yang

menumbuhkan Bacillus horikoshii pada media

LB dan menghasilkan aktivitas protease

sebesar 29,8 U/ml pada jam ke-18 saat fase

eksponensial. Banerjee & Bhattacharya dalam

Anwar & Saleemuddin (1998) menyatakan

bahwa penambahan nitrogen organik pada

media tumbuh dapat meningkatkan produksi

protease. Pepton dan tripton sebagai sumber

nitrogen organik juga digunakan sebagai

induser untuk meningkatkan produksi

kolagenase dari Vibrio alginolyticus (Reid et

al. 1980).

SIMPULAN

Media LBC (Luria Bertani + 5% kolagen)

merupakan media optimum untuk

pertumbuhan sel Bacillus licheniformis F-11.1

dan F-11.4. B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4

menghasilkan kolagenase pada ketiga media

produksi yaitu, LBC, LBHC, dan CLG.

Produksi kolagenase isolat F-11.1 maksimum

dicapai pada media LBC dan LBHC, yaitu

masing-masing sebesar 2,057 U/mg dan 2,037

U/mg. Produksi kolagenase isolat F-11.4

maksimum dicapai pada media LBC dengan

aktivitas spesifik sebesar 4,695 U/mg.


licheniformis di media CLG lebih rendah

dibandingkan pada media LBC dan LBHC.

Media LBC dan LBHC merupakan media

terbaik untuk produksi kolagenase dari isolat

B. licheniformis F-11.1 dan F-11.4.

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk

menentukan kondisi optimum pertumbuhan

Bacillus licheniformis F-11.1 dan F-11.4 serta

produksi kolagenase pada berbagai pH, suhu,

dan kecepatan agitasi.

DAFTAR PUSTAKA

Anwar A, Saleemuddin M. 1998. Alkaline

proteases: A review. Bioresources Technol

64: 175-183.

Baehaki A, Suhartono MT, Sukarno, Syah D,

Sitanggang AB, Setyahadi S, Meinhardt F.

2012. Purification and characterization of

collagenase from Bacillus licheniformis

F11.4. Afr J Microbiol Res 6(10): 2373-

2379.

Bama P, Vijayalakshimi M, Jayasimman R,

Kalaichelvan PT, Deccaraman M,

Sankaranarayanan S. 2010. Extraction of

collagen from cat fish (Tachysurus maculatus)

by pepsin digestion and preparation and

characterization of collagen chitosan

sheet. Int J Pharm Pharm Sci 2(4): 133-

137.

Bond MD, Wart HE. 1984. Purification and

separation of individual collagenases of

Clostridium histolyticum using red dye

ligand chromatography. Biochem 23:

3077-3085.

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive

method for the quantitation of microgram

quantities of protein utilizing the principle

of protein-dye binding. Anal Biochem 72:

248-254.

7

Brock TD, Madigan MT. 1991. Biology of

Microorganisms. Ed ke-6. New Jersey:

Prentice Hall.

Chung L, Dinakarpandian D, Yoshida N,

Fields JL, Fields GB, Visse R, Nagase H.

2004. Collagenase unwinds triple helical

collagen proir to peptide bond hydrolysis.

J EMBO 23: 3020-3030.

Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1.

Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Hadiutomo RS. 1988. Metode-metode Untuk

Bakteriologi. Bogor: Pusat Antar

Universitas Bioteknologi, Institut

Pertanian Bogor.

Hoffmann K, Daum G, Koster M, Kulicke

WM. 2010. Genetic improvement of

Bacillus licheniformis strains for efficient

deproteinization of shrimp shells and

production of high molecular mass chitin

and chitosan. Appl Environ Microbiol

76(24): 8211-8221.

Hultmann L, Rustad T. 2004. Iced storage of

Atlantic salmon (Salmo salar) – effects on

endogenous enzymes and their impact on

muscle proteins and texture. Food Chem

87: 31-41.

Joo HS, Kumar CG, Park GC, Kim KT, Paik

SR, Chang CS. 2002. Optimization of the

production of an extracellular alkaline

protease from Bacillus horikoshii. Process

Biochem 38: 155-159.

Kim SK, Park PJ, Kim JB, Shahidi F. 2002.

Purification and characterization of

collagenase from the tissue of filefish,

Novoden modestrus. J Biochem Mol Biol

35(2): 165-171.

Kumaila R. 2008. Ekstraksi, karakterisasi, dan

aplikasi enzim kolagenase dan organ

dalam ikan tuna (Thunnus sp.) [skripsi].

Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu

Kelautan, Institut Pertanian Bogor.

Lehninger. 1993. Dasar-dasar Biokimia 1.

Suhartono MT, penerjemah. Jakarta:

Erlangga. Terjemahan dari: Principles of

Biochemistry.

Moore S, Stein WH. 1954. A modified

ninhydrin reagent for the photometric

determination of amino acids and related

compounds. J Biol Chem 211: 907-913.

Nagai T, Izumi M, Ishii M. 2004. Fish scale

collagen. Preparation and partial

characterization. Int J Food Sci Technol

39: 239-244.

Nagano H, To KA. 1999. Purification of

collagenase and specificity of its related

enzyme from Bacillus subtilis FS-2. Biosci

Biotechnol Biochem 63(7): 181-183.

Pelczar MJ, Chan ECS. 2007. Dasar-Dasar

Mikrobiologi 1. Hadioetomo RS, Imas T,

Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah.

Jakarta: UI Press. Terjemahan dari:

Elements of Microbiology.

Petrova D, Derekova A, Vlahov S. 2006.

Purification and properties of individual

collagenases from Streptomyces sp. strain

3B. Folia microbiol 51(2): 93-98.

Rao MB, Tanksale AM, Ghatge MS,

Deshpande VV. 1998. Molecular and

biotechnological aspects of microbial

proteases. Microbiol Mol Biol Rev 62(3):

597-635.

Reid GC, Woods DR, Robb FT. 1978.

Regulation of extracellular collagenase

production in Achromobacter iophagus. J

Gen Microbiol 109: 149-154.

. 1980. Peptone induction and

rifampin-insensitive collagenase

production by Vibrio alginolyticus. J

Bacteriol 142(2): 447-454.

Riley KN, Herman IM. 2005. Collagenase

promotes the cellular responses to injury

and wound healing in vivo. J Burns

Wound 4:112-124.

Shahidi F, Han XQ, Synowiecki J. 1995.

Production and characteristics of protein

hydrolysates from capelin (Mallotus

villosus). Food Chem 53: 285-293.

Sternlicht MD, Werb Z. 2001. How matrix

metalloproteinases regulate cell behavior.

Annu Rev Cell Dev Biol 17: 463–516.

Suhartono MT. 1989. Enzim dan

Bioteknologi. Bogor: Depdikbud, DIKTI,

Pusat Antar Universitas Bioteknologi,

Institut Pertanian Bogor.

Suhartono MT. 1992. Protease. Bogor:

Depdikbud, DIKTI, Pusat Antar

Universitas Bioteknologi, Institut

Pertanian Bogor.

Suphatharaprateep W, Cheirsilp B,

Jongjareonrak A. 2011. Production and

properties of two collagenases from

bacteria and their application for collagen

extraction. New Biotechnol 28(6): 649-

655.

Tran LH, Nagano H. 2002. Isolation and

characteristics of Bacillus subtilis CN2

and its collagenase production. J Food Sci

67: 1184-1187.

Waldeck J, Daum G, Bisping B, Meinhardt F.

2006. Isolation and molecular

characterization of chitinase-deficient

Bacillus licheniformis strains capable of

deproteinization of shrimp shell waste to

obtain highly viscous chitin. Appl Environ

Microbiol 72(12): 7879–7885.

8

Yuniarti T. 2010. Purifikasi dan karakterisasi

kolagenase dari organ dalam ikan bandeng

(Chanos chanos, Forskal) [tesis]. Bogor:

Program Pascasarjana, Institut Pertanian

Bogor.

Yunoki S, Suzuki T, Takai M. 2003.

Stabilization of low denaturation

temperature collagen from fish by physical

cross-linking methods. J Biosci Bioeng

96(6): 575-577.

LAMPIRAN

10

Lampiran 1 Metode pengukuran aktivitas kolagenase menurut Moore & Stein (1954)

Pereaksi Blanko (ml) Sampel (ml) Standar (ml)

Substrat kolagen 5% (b/v) 5,00 5,00 5,00

Bufer fosfat 50mM pH 9 1,00 1,00 1,00

Akuades 0,10 - -

L-leusin standar 5mM - - 0,10

Enzim - 0,10 -

Diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit

TCA 50% 0,20 0,20 0,20

Diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit, lalu disentrifugasi pada 5000 rpm selama 20 menit

Filtrat 0,20 0,20 0,20

Ninhidrin 0,1% 1,00 1,00 1,00

Diinkubasi pada suhu 1000C selama 20 menit

1-propanol 50% 5,00 5,00 5,00

Diukur dengan spektrofotometer pada λ=570 nm

Aktivitas enzim dihitung menurut rumus:

UA=

x P x

Keterangan: UA = Jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1 mikromol produk leusin per

menit (U/ml)

A = Absorbansi

P = Faktor pengenceran

T = Waktu inkubasi (menit)

11

Lampiran 2 Metode pengukuran kadar protein (Bradford 1976)

Komposisi pereaksi Bradford (Bradford 1976) lima kali terdiri atas:

Coomasie brilliant blue G-250 0,025 g

Etanol 95% 12,5 ml

Asam ortofosfat 25 ml

Akuades 250 ml

Sebelum digunakan untuk mengukur kadar protein, pereaksi diencerkan dengan akuades

(perbandingan 1:4) dan larutan stok BSA (bovin serum albumin) yang digunakan adalah dengan

konsentrasi akhir 1 mg/ml.

Kurva standar BSA dibuat dengan menambahkan 5 ml pereaksi Bradford ke dalam 0,1 ml

larutan BSA dengan konsentrasi 0,00 mg/ml – 0,50 mg/ml. Selanjutnya campuran tersebut

diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang

595 nm. Sedangkan blanko dibuat dengan mencampurkan 0,1 ml akuades dengan pereaksi

Bradford, kemudian dikocok dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm.

Sampel yang akan diukur kadar proteinnya diperlakukan sama. Sebanyak 5 ml pereaksi

Bradford ditambahkan ke dalam 0,1 ml sampel dan diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit.

Selanjutnya absorbansi dibaca pada panjang gelombang 595 nm.

12

Lampiran 3 Kurva standar protein Bradford

y = 0.759x + 0.288

R² = 0.988

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

OD

59

5 n

m

Konsentrasi standar (mg/ml)

produksi kolagenase dari isolat bacillus licheniformis f ... · penulis menyelesaikan pendidikan di...

Documents