Polymerase Chain Reactions (PCR)

Polymerase Chain Reactions (PCR)DISUSUN OLEHNUR INDAH EKA OKTAFIANI (093234013)

BAB IPENDAHULUANLatar belakang

PCR merupakan suatu teknik sangat kuat dan sangat sensitif dan dapat diaplikasikan dalam berbagai bidang seperti biologi molekuler, genetika populasi, dan analisis forensik. Teknik DNA rekombinan telah memberikan perubahan secara signifikan dalam ilmu genetika karena memungkinkan terjadinya isolasi dan karakteristik gen-gen, mempelajari secara rinci fungsi dan ekspresi selama proses perkembangan terjadi, sebagai respon terhadap lingkungan. Mengingat peningnya peranan teknik PCR ini terhadap perkembangan ilmu pengetahuan kedepan, maka dalam makalah ini akan dibahas tentang teknik PCR, prinsip-prinsip PCR, pertimbangan penggunaan PCR, dan manfaat PCR.

B. Rumusan masalah Dari latar belakang tersebut, maka dapat dicari beberapa rumusan masalah yang dapat dibahas, antara lain:Apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)?Apasaja tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)?Alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)?Apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR)?Apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?Apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR)?

C. TujuanDari rumusan masalah tersebut, maka beberapa tujuan yang ingin dicapai anatara lain:Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR).Untuk mengetahui apa yang dimaksud dengan Polymerase Chain Reaction (PCR).Untuk mengetahui alat dan bahan apa saja yang dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR).Untuk mengetahui apakah komponen-komponen yang dibutuhkan dalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR).Untuk mengetahui apa saja variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR).Untuk mengetahui apa saja manfaat dari Polymerase Chain Reaction (PCR).

D. ManfaatManfaat yang diperoleh dari penulisan makalah ini adalah bagi penulis dan pembaca dapat memperoleh pengetahuan tentang proses Polymerase Chain Reaction (PCR) serta manfaat dari PCR bagi manusia.

BAB IIPEMBAHASAN

Definisi Polymerase Chain Reaction (PCR)Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.B. Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)Penjelasan ringkas tentang setiap siklus reaksi PCR adalah sebagai berikut:Denaturasi Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. 2. Penempelan primerPada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer.3. Reaksi polimerisasi (Extension)Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.

Gambar 01. Proses Amplikasi Secara Eksponensial.

Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:Pra-denaturasi Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).2. Final elongasi Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70 oC -72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.

Gambar 02. Siklus Polymerase Chain Reactions (PCR)

C. Alat dan Bahan yang Dibutuhkan dalam Polymerase Chain Reaction (PCR)Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro antara lain (Mahmuddin, 2010):Pasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasiBuffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)Minyak mineral ringanAkrilamida (grade elektroforesis)N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)TEMED (N, N, NN Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)Peralatan khusus yang yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:Mighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)Perkin-Elmer/Cetus Thermal CyclerSterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)

D. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)Mahmuddin (2010), menyampaikan beberapa komponen-komponen PCR antara lain:1. Enzim DNA polymerase 2. Primer3. Reagen lainnya

E. Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR)1. Alel-spesifik PCR atau kloning teknik diagnostik2. Polymerase Cycling Assembly (PCA)3. Asymmetric PCR4. Amplifikasi tergantung helikase5. Hot Start PCR6. PCR spesifik Intersequence (ISSR)7. Inverse PCR8. Mediated PCR Ligasi9. PCR spesifik Metilasi (MSP)10. Miniprimer PCR11. Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA)12. Multiplex-PCR13. Nested PCR14. Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan tumpang tindih ekstensi (BUMN)15. Kuantitatif PCR (Q-PCR)16. RT reverse transcription PCR (RT-PCR)17. PCR Thermal asimetris interlaced ( TAIL-PCR )18. Touchdown PCR (Langkah-mundur PCR)

F. Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR) Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:Isolasi genDNA sequencingIdentifikasi forensikDiagnosa penyakit

BAB IIIPENUTUPSimpulanPolymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA.Tahapan-Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR), denaturasi DNA templat, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA.Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR), Enzim DNA Polymerase: enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi; Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA templat yang akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa; Reagen lainnya berupa dNTP untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2.Variasi dari Polymerase Chain Reaction (PCR) seperti: Alel-spesifik PCR, Polymerase Cycling Assembly, Asymmetric PCR, Hot Start PCR, PCR spesifik Intersequence, Inverse PCR, Mediated PCR Ligasi, dll.Manfaat Polymerase Chain Reaction (pcr), yaitu: amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi, bidang kedokteran forensik, melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan DNA finger print.