plagiat merupakan tindakan tidak terpuji · fakultas farmasi universitas sanata dharma yogyakarta...
TRANSCRIPT
OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN
JAMU
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Sugiarto Adji Soenarso
NIM: 108114020
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN
JAMU
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Sugiarto Adji Soenarso
NIM: 108114020
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
Persetujuan Pembimbing
OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN
JAMU
Skripsi yang diajukan oleh:
Sugiarto Adji Soenarso
NIM: 108114020
Telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama
Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. Tanggal…………………………..
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN
JAMU
Oleh:
Sugiarto Adji Soenarso
NIM: 108114020
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Pada tanggal…………………………….
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
Aris Widayati, M.Si., Apt. PhD.
Panitia Penguji Tanda tangan:
1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. ……………………
2. Jeffry Julianus, M.Si. ……………………
3. F. Dika Octa Riswanto, M.Sc. ……………………
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Jangan pernah menganggap belajar sebagai suatu
kewajiban, tetapi anggaplah ia sebagai suatu kesempatan
menyenangkan untuk membebaskan diri dalam mempelajari
alam dan kehidupan. Belajar adalah untuk kebahagiaanmu
sendiri dan akan memberikan keuntungan bagi masyarakat
tempatmu bekerja nanti – Albert Einstein
Kita hidup dalam dunia yang penuh dengan keindahan dan
petualangan. Tidak ada akhir dari petualangan-
petualangan yang dapat kita jalani hanya jika kita
mencari petualangan-petualangan baru dengan mata yang
terbuka – Jawaharlal Nehru
Orang-orang serius hanya punya ide-ide terbatas.
Orang-orang yang punya banyak ide tidak pernah serius
– Paul Vallery
Iman akan Allah tidak memberikan solusi instan atas
semua persoalan dan ketidakpastian hidup, tetapi
melengkapi kita untuk mengatasinya – Daniel Louw
Karya ini kudedikasikan untuk orang tuaku, adikku,
kekasihku, teman-temanku, dan almamaterku.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Penulis menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang ditulis ini
tidak memuat karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan
daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarism dalam naskah ini,
maka penulis bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 7 Januari 2015
Penulis
Sugiarto Adji Soenarso
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH UNTUK
KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertandatangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata
Dharma:
Nama : Sugiarto Adji Soenarso
NIM :108114020
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
OPTIMASI ISOLASI ALOPURINOL DALAM SEDIAAN TABLET DAN
JAMU
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,
mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikan di internet atau media lain
untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun
memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai
penulis.
Demikian pernyataan ini yang mana saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal:
Yang menyatakan
(Sugiarto Adji Soenarso)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Segala pujian dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan karena hanya
dengan anugerah, berkat, cinta, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis dapat
menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Optimasi
Isolasi Alopurinol Dalam Sediaan Tablet dan Jamu”. Skripsi ini disusun guna
memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Program
Studi Farmasi (S.Farm).
Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan
berbagai pihak, karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Aris Widayati, M.Si., Apt. PhD. selaku Dekan dan segenap staf serta
karyawan Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
2. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah
memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam
proses penyusunan skripsi ini.
3. Jeffry Julianus, M.Si. selaku Dosen Penguji skripsi yang telah memberikan
saran dan masukan demi kesempurnaan skripsi ini.
4. Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku Dosen Penguji skripsi yang
telah memberikan saran dan masukan demi kesempurnaan skripsi ini.
5. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.Si., Apt. atas bantuannya untuk membantu
penulis mendapatkan senyawa baku dan waktu yang diluangkan untuk
memberikan masukan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
6. PT IFARS Solo yang telah memberikan baku kepada penulis untuk penulis
dapat menyelesaikan skripsi ini.
7. Phebe Hendra, M.Si., Apt., Ph.D. selaku dosen pembimbing akademik atas
pendampingan dan perhatiannya terhadap perkembangan saya selama
perkuliahan ini.
8. Dewi Setyaningsih dan Sanjaya, M.Si. atas bantuan selama menghadapi
masalah dalam penelitian dan mau membagi ilmu yang tidak didapatkan
selama kuliah.
9. Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
atas ilmu, pengalaman, semangat, dan persahabatan yang telah dibagikan.
10. Mas Bimo, Mas Kunto, dan Pak Parlan yang telah banyak membantu selama
penelitian di laboratorium.
11. Keluarga tercinta Papa, Mama, dan Sugeng terima kasih atas dukungan doa
yang selalu tulus untukku yang membuatku berani bangkit lagi di kala
terpuruk.
12. Keluarga Papa dan Mama yang selalu mendoakan segala perjuanganku.
13. Ria Kusuma Dewi dan Meta Kartika Sari teman seperjuangkanku yang telah
dengan sabar menghadapi semua kemalasanku, mendukung dan
menyemangati aku selama masa-masa terpuruk di lab.
14. Kawan-kawan seperjuangan di lab: Bakti, Naomi, Kezia, Ita atas kerja sama
dan kebersamaan, dukungan dan keceriaan di lab selama penelitian ini.
15. Fr. B. Aris Ferdinan, SCJ yang selalu menyemangati penulis saat penulis
merasa terpuruk dalam menyelesaikan skripsi ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
16. Jo dan Nety atas bantuannya yang mau membantu aku saat aku bertanya
tentang skripsiku ini.
17. Agatha Herny Sekar Natalia untuk momen-momen kebersamaan kita dan
terima kasih buat dukungan dan doa serta semangat yang diberikan.
18. Teman-teman FST dan FKK 2010 yang selalu memberi bantuan, dukungan,
dan berbagi keceriaan untuk selesainya skripsi ini.
19. Teman-teman KKN terima kasih atas keluangan waktu untuk bersama pergi
sejenak dari penatnya skripsi.
20. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini baik
dalam bentuk doa, semangat yang menyertai penulis dari awal penelitian
sampai penyelesaian skripsi ini yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan
dan kelemahan karena keterbatasan pikiran, tenaga, dan waktu penulis. Untuk itu
penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir
kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ............................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ ii
HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................... v
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ vi
PRAKATA .............................................................................................. vii
DAFTAR ISI ........................................................................................... x
DAFTAR TABEL ................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xvii
INTISARI ................................................................................................ xix
ABSTRACT .............................................................................................. xx
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................ 1
A. Latar Belakang .................................................................................... 1
1. Permasalahan .................................................................................. 4
2. Keaslian penelitian.......................................................................... 5
3. Manfaat penelitian .......................................................................... 5
B. Tujuan ................................................................................................. 6
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ....................................................... 7
A. Obat Tradisional .................................................................................. 7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
B. Jamu.................................................................................................... 8
C. Asam Urat ........................................................................................... 9
D. Alopurinol ........................................................................................... 10
1. Sifat fisika kimia ............................................................................. 10
2. Dosis .............................................................................................. 10
3. Peringatan dan pencegahan ............................................................. 11
4. Efek samping .................................................................................. 11
5. Penetapan kadar ............................................................................. 11
E. Ekstraksi ............................................................................................. 12
F. Solid Phase Extraction (SPE) .............................................................. 12
1. Prosedur SPE .................................................................................. 12
2. Pengembangan metode ................................................................... 14
G. Spektrofotometri UV ........................................................................... 15
1. Transisi sigma–sigma star (σ → σ*) ................................................ 16
2. Transisi non bonding elektron–sigma star (n → σ*) ........................ 16
3. Transisi n → π* dan transisi π → π* ............................................... 17
H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ........................... 19
I. Landasan Teori .................................................................................... 26
J. Hipotesis ............................................................................................. 28
BAB III METODE PENELITIAN ........................................................... 29
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ........................................................... 29
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ....................................... 29
1. Variabel .......................................................................................... 29
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
2. Definisi operasional ........................................................................ 29
C. Bahan Penelitian.................................................................................. 30
D. Alat Penelitian ..................................................................................... 30
E. Tata Cara Penelitian ............................................................................ 31
1. Optimasi isolasi alopurinol dalam tablet dengan menggunakan
spektrofotometri UV ....................................................................... 31
2. Optimasi ekstraksi cair-cair tanpa SPE ............................................ 33
3. Optimasi isolasi alopurinol dalam jamu asam urat merek X ............ 34
4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan
HPLC ............................................................................................. 37
5. Validasi metode clean up SPE MCX ............................................... 40
6. Penggunaan kembali SPE MCX ...................................................... 42
F. Analisis Hasil ...................................................................................... 43
1. Analisis hasil optimasi penyaringan dengan spektrofotometri UV ... 43
2. Analisis hasil optimasi clean up yang dilanjutkan dengan HPLC .... 43
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 44
1. Optimasi isolasi alopurinol dalam tablet dengan menggunakan
spektrofotometri UV ....................................................................... 44
2. Optimasi ekstraksi cair-cair tanpa SPE ............................................ 50
3. Optimasi isolasi alopurinol dalam jamu asam urat merek X ............ 52
4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan
HPLC ............................................................................................. 66
5. Validasi metode clean up SPE MCX ............................................... 69
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
6. Penggunaan kembali SPE MCX ...................................................... 73
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................... 77
A. Kesimpulan ......................................................................................... 77
B. Saran ................................................................................................... 77
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 78
LAMPIRAN ............................................................................................ 82
BIOGRAFI PENULIS ............................................................................. 124
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Indeks polaritas dan karakteristik solvent selectivity
beberapa pelarut HPLC .......................................................... 22
Tabel II. Optimasi loading sampel dan volume eluen SPE MCX .......... 35
Tabel III. Pengulangan pencucian SPE .................................................. 42
Tabel IV. Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet .............................. 45
Tabel V. Hasil bobot alopurinol, SD, dan % CV ................................... 49
Tabel VI. Optimasi kapasitas kolom ...................................................... 56
Tabel VII. Optimasi volume eluen .......................................................... 60
Tabel VIII. Tabel tR dan AUC hasil ekstraksi cair-cair ............................ 65
Tabel IX. Perbandingan tR dan AUC blanko dan sampel adisi ............... 68
Tabel X. Hasil perolehan kembali dan CV ............................................ 71
Tabel XI. Perolehan kembali yang dapat diterima pada beberapa tingkat
konsentrasi analit ................................................................... 72
Tabel XII. CV yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi analit
berdasarkan AOAC PVM ...................................................... 72
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur alopurinol .............................................................. 10
Gambar 2. Proses skematik prosedur SPE ............................................. 13
Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik........................................ 16
Gambar 4. (A) Pengaruh pelarut polar terhadap transisi π → π*
(B) Transisi n → π* ............................................................. 18
Gambar 5. Dasar pemisahan kromatografi partisi .................................. 20
Gambar 6. Diagram sistem HPLC secara umum ................................... 20
Gambar 7. Skema sampler KCKT. (A) – posisi load, sampel diinjeksikan
dan terisolasi dari fase gerak. (B) – posisi inject, sampel
terbawa fase gerak dan memasuki kolom ............................ 24
Gambar 8. Reaksi antara kalium biftalat dengan NaOH ........................ 46
Gambar 9. Perubahan warna indicator fenolftalein dari bening menjadi
pink ..................................................................................... 46
Gambar 10. Hasil standarisasi NaOH dengan menggunakan kalium
biftalat ................................................................................. 47
Gambar 11. Kromatogram hasil ekstraksi cair-cair sampel blanko
(A) replikasi 1 (B) replikasi 2 .............................................. 51
Gambar 12. Interaksi antara alopurinol dengan fase diam SPE ................ 54
Gambar 13. Kromatogram alopurinol dalam fraksi asam asetat setelah
proses pencucian SPE .......................................................... 56
Gambar 14. Kurva hubungan volume loading ekstrak VS AUC .............. 57
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
Gambar 15. Kromatogram alopurinol pada optimasi kapasitas kolom
SPE MCX (A) 500 μL (B) 750 μL (C) 1000 μL (D) baku
alopurinol dengan fase gerak metanol : aquabidest/amonium
hidroksida 0,1% (10:90) ...................................................... 57
Gambar 16. Kurva hubungan volume eluen VS AUC ............................. 60
Gambar 17. Kromatogram alopurinol pada optimasi volume eluen
(A) 5 mL (B) 7.5 mL (C) 12.5 mL yang dilakukan dengan
mengelusi 10 mL (C1) dan dilanjutkan dengan elusi 2.5 mL (C2)
(D) baku alopurinol dengan fase gerak metanol :
aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90) ..................... 61
Gambar 18. Reaksi pembentukkan garam alopurinol .............................. 63
Gambar 19. Reaksi pembentukkan ion alopurinol ................................... 64
Gambar 20. Kromatogram alopurinol hasil ekstraksi cair-cair dengan variasi
pengulangan penambahan kloroform (A) 2x3 mL (B) 3x3 mL
(C) 4x3 mL dengan fase gerak HPLC metanol : aquabidest/
amonium hidroksida 0,1% (10:90) ....................................... 64
Gambar 21. Perbandingan puncak (A) puncak baku alopurinol (B1 dan B2)
puncak blanko dan sampel alopurinol yang sudah ditambahkan
dengan baku alopurinol dalam 3 level konsentrasi ............... 67
Gambar 22. Kromatogram alopurinol hasil clean up dengan menggunakan
SPE bekas yang sudah diuji (A) 1x (B) 2x (C) 3x dengan fase
gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90) 74
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Sertifikat analisis baku alopurinol ................................... 83
Lampiran 2. Sertifikat analisis SPE MCX ........................................... 84
Lampiran 3. Penimbangan keseragaman bobot tablet alopurinol ......... 85
Lampiran 4. Penimbangan sampel A tiap kemasan untuk perhitungan
keseragaman bobot ......................................................... 86
Lampiran 5. Penimbangan sampel B tiap kemasan untuk perhitungan
keseragaman bobot ......................................................... 87
Lampiran 6. Penimbangan sampel C tiap kemasan untuk perhitungan
keseragaman bobot ......................................................... 88
Lampiran 7. Penimbangan kalium biftalat ........................................... 89
Lampiran 8. Standarisasi NaOH 0.1 N ................................................ 89
Lampiran 9. Gambar hasil pembakuan NaOH 0.1 N ........................... 89
Lampiran 10. Perhitungan penimbangan sampel tablet alopurinol ......... 90
Lampiran 11. Penimbangan optimasi penyaringan ................................ 90
Lampiran 12. Bobot alopurinol, SD dan %CV hasil .............................. 91
Lampiran 13. Penimbangan sampel tanpa SPE...................................... 91
Lampiran 14. Kromatogram sampel tanpa SPE ..................................... 92
Lampiran 15. Penimbangan optimasi kapasitas kolom SPE ................... 93
Lampiran 16. Kromatogram optimasi kapasitas kolom SPE .................. 94
Lampiran 17. Tabel optimasi kapasitas kolom SPE ............................... 100
Lampiran 18. Penimbangan optimasi volume eluen SPE ....................... 100
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
Lampiran 19. Kromatogram optimasi volume eluen SPE ...................... 101
Lampiran 20. Tabel optimasi volume eluen SPE ................................... 105
Lampiran 21. Penimbangan optimasi volume kloroform ....................... 106
Lampiran 22. Kromatogram optimasi volume kloroform ...................... 107
Lampiran 23. Penimbangan baku untuk validasi SPE ............................ 110
Lampiran 24. Penimbangan sampel untuk validasi SPE ........................ 110
Lampiran 25. Kromatogram validasi SPE ............................................. 111
Lampiran 26. Hasil recovery dan % CV validasi SPE ........................... 119
Lampiran 27. Penimbangan baku untuk pencucian SPE ........................ 120
Lampiran 28. Kromatogram hasil pencucian SPE ................................. 120
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xix
INTISARI
Telah dilakukan penelitian tentang alopurinol dalam sampel obat, matriks
biologis dan penelitian BKO dalam sediaan jamu sebelumnya pernah dilakukan
dengan menggunakan sampel metampiron. Penelitian ini ingin mengetahui
optimasi isolasi alopurinol dalam sampel tablet dan jamu untuk mengurangi
berbagai matriks yang terdapat dalam sampel tablet dan jamu sehingga dapat
digunakan untuk determinasi alopurinol. Optimasi isolasi dilakukan dengan
optimasi penyaringan, ektraksi cair-cair dan Solid Phase Extraction (SPE).
Pada sampel tablet isolasi alopurinol dilakukan dengan penyaringan dan
dideterminasi dengan metode Spektrofotometri UV karena alopurinol memiliki
gugus kromofor dan auksokrom, sedangkan pada sampel jamu isolasi alopurinol
dilakukan dengan clean up yang meliputi ekstraksi cair-cair dan Solid Phase
Extraction (SPE) dan dideterminasi dengan metode High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).
Pada sampel tablet, volume penyaringan yang digunakan 10 mL x 2.
Pada sampel jamu, volume kloroform yang digunakan pada ekstraksi cair-cair
adalah 3x3 mL, pada SPE volume loading sampel yang digunakan adalah 1000
µL, volume eluen yang digunakan adalah 10 mL amonium hidroksida 5% dalam
metanol. Kondisi tersebut merupakan kondisi optimal dalam isolasi alopurinol
dari sampel tablet dan jamu.
Kata kunci : alopurinol, jamu, tablet, BKO, ekstraksi, clean up, SPE, HPLC,
Spektrofotometri UV.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xx
ABSTRACT
There had been research on allopurinol in drug samples, biological
matrix and BKO research in herbal preparations using sample methampyrone.
This research investigates the optimal isolation of allopurinol in tablet and herbal
samples to reduce the matrix contained in tablet and herbal samples, so later they
can be used for the determination of allopurinol. Isolation optimization is done
with filtration optimization, liquid-liquid extraction and Solid Phase Extraction
(SPE).
In tablet samples, allopurinol isolation was performed by filtration and
determined by UV spectrophotometry method because allopurinol has a
chromophore and auxochrome group, whereas the allopurinol isolation of herbal
samples performed with clean up that includes liquid-liquid extraction and Solid
Phase Extraction (SPE) and determined by the High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).
In tablet samples, the filtration volume used was 10 mL x 2. In herbal
samples, the volume of chloroform used in liquid-liquid extraction is 3x3 mL, at
SPE sample loading volume used was 1000 mL, while the volume of eluent used
was 10 mL ammonium hydroxide 5% in methanol. This condition is the optimal
condition in allopurinol isolation from tablet and herbal samples.
Keywords: allopurinol, herbal samples, tablets, BKO, extraction, clean-up, SPE,
HPLC, Spectrophotometry UV.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Akhir-akhir ini kesadaran masyarakat akan kesehatan semakin
meningkat, itu terlihat dari usaha masyarakat untuk mencegah penyakit baik
secara modern maupun tradisional. Pada sebagian masyarakat, usaha untuk
mencegah penyakit masih menggunakan cara tradisional. Selain itu
kecenderungan masyarakat untuk kembali ke alam (back to nature) yang dalam
beberapa hal lebih menguntungkan jika dibandingkan dengan pengobatan dengan
obat sintetik atau obat modern, membuat penggunaan obat tradisional semakin
meningkat. Selain itu, harga obat tradisional juga lebih terjangkau dibandingkan
dengan obat sintetik. Obat tradisional adalah bahan atau ramuan bahan yang
berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan sarian (galenik)
atau campuran dari bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan
untuk pengobatan, dan dapat diterapkan sesuai dengan norma yang berlaku di
masyarakat (PerMenKes, 2012).
Obat tradisional telah digunakan selama ribuan tahun dengan kontribusi
besar yang dibuat oleh praktisi kesehatan manusia, khususnya sebagai penyedia
perawatan kesehatan primer di tingkat masyarakat. TM (Traditional Medicine)
telah mempertahankan popularitasnya di seluruh dunia. Sejak tahun 1990-an
penggunaannya telah meningkat di banyak negara maju dan berkembang
(Anonimb, 2014).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
Produk obat tradisional yang telah banyak digunakan oleh masyarakat
adalah jamu. Banyak masyarakat minum jamu untuk mencegah penyakit tertentu
karena mudah penggunaannya dan harganyapun juga terjangkau oleh masyarakat.
Selama beberapa tahun terakhir, penggunaan obat tradisional di dunia semakin
meningkat. Menurut WHO, 65-80% populasi dunia menggunakan obat tradisional
sebagai perlindungan untuk kesehatan (Yee, 2003).
Namun banyak kendala yang terjadi pada produk sediaan jamu seperti,
pengolahan bahan baku yang belum terstandar terutama mutu dan kualitasnya,
serta industri jamu yang tidak jujur sering kali menambahkan bahan kimia obat
(BKO) ke dalam jamu sehingga menimbukan efek yang merugikan.
Karena tidak semua bahan baku untuk jamu dibudidayakan dengan baik
dan benar sehingga seringkali tanaman obat tertentu hilang di pasaran karena
ketidaktersediaan bahan baku yang dibutuhkan. Kurangnya penelitian ilmiah
mengenai keefektifan dari jamu dan juga efek samping yang ditimbulkan melalui
uji praklinis dan uji klinis oleh pihak terkait.
Dampak lain yang menyebabkan efek samping yang merugikan dari
penggunaan obat tradisional adalah penambahan bahan kimia obat (BKO) tanpa
takaran yang jelas sehingga dapat membahayakan bagi kesehatan konsumen
terlebih lagi apabila obat yang ditambahkan tergolong dalam obat keras yang
penggunaanya harus dengan resep dokter. Penggunaan BKO pada sediaan obat
tradisional sangat dilarang sesuai dengan Keputusan Kepala Badan POM No.
HK.00.05.41.1384 tahun 2005.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Menurut PerMenKes RI no. 007 tahun 2012 obat tradisional tidak boleh
mengandung bahan kimia obat atau hasil sintesis yang berkhasiat sebagai obat.
BKO yang biasanya ditambahkan dalam sediaan obat tradisional antara lain
parasetamol (menghilangkan rasa sakit), fenilbutazon (mengatasi rematik dan
menyegarkan tubuh), natrium diklofenak (mengatasi rematik), sildenafil sitrat
(mengatasi disfungsi ereksi dan meningkatkan libido), sibutramin HCl
(melangsingkan tubuh), dan alopurinol (menghilangkan asam urat).
Banyak masyarakat menggunakan obat modern untuk menyembuhkan
penyakit yang mana pada obat modern dosis obatnya sudah diketahui secara pasti
karena melihat bahaya jamu yang ditambahkan BKO. Salah satu penyakit yang
biasa dialami oleh sebagian masyarakat adalah asam urat, sehingga banyak
masyarakat menggunakan obat asam urat yaitu alopurinol untuk menyembuhkan
asam urat.
Menurut Depkes RI (1974), metode baku analisis alopurinol dilakukan
dalam sampel tablet dan diukur secara spektrofotometri UV. Pada sampel tablet
memiliki matriks yang lebih sederhana, oleh karena itu untuk dapat mengisolasi
alopurinol dari matriks dapat dilakukan dengan menggunakan penyaringan. Pada
penelitian ini dilakukan pengembangan metode analisis alopurinol dalam sampel
jamu.
Pada sampel jamu memiliki matriks yang lebih kompleks daripada dalam
sampel tablet, maka untuk mengisolasi alopurinol dari matriks jamu diperlukan
metode clean up yaitu dengan menggunakan ekstraksi cair-cair dan Solid Phase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Extraction (SPE) serta dilanjutkan dengan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC).
Metode clean up alopurinol dalam jamu dengan ekstraksi cair-cair dan
Solid Phase Extraction (SPE) diperlukan optimasi. Pada optimasi ekstraksi cair-
cair dilakukan dengan mengubah komposisi volume kloroform, sedangkan pada
optimasi SPE dilakukan dengan mengubah komposisi volume loading ekstrak dan
volume eluen.
Penelitian ini merupakan bagian dari serangkaian penelitian yang
meliputi “Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Alopurinol Dalam Matriks
Tablet Obat Secara Spektrofotometri UV dan Matriks Sampel Jamu Asam Urat
Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” dan “Validasi Metode Analisis
Alopurinol Dalam Matriks Tablet Secara Spektrofotometri dan Matriks Jamu
Asam Urat Secara KCKT Fase Terbalik serta Aplikasinya.”
Sejauh penelusuran literatur oleh penulis penelitian tentang penetapan
kadar alopurinol dalam jamu belum pernah dilakukan, sedangkan untuk penelitian
bahan BKO lain seperti parasetamol dan fenilbutason sudah banyak dilakukan dan
penelitian alopurinol dalam matriks biologis menggunakan metode cation
exchange chromatography sudah pernah dilakukan. Untuk penelitian alopurinol di
dalam tablet sudah pernah dilakukan.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang maka timbul permasalahan yaitu bagaimana
optimasi proses isolasi alopurinol dalam sediaan tablet secara spektrofotometri
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
UV dan isolasi alopurinol dalam sediaan jamu asam urat dengan menggunakan
SPE MCX yang dilanjutkan dengan HPLC fase terbalik?
2. Keaslian penelitian
Sejauh penelusuran literatur, penelitian terhadap alopurinol telah
dilakukan dalam suatu obat. Namun penelitian sejenis yaitu penetapan kadar
bahan kimia obat metampiron dalam jamu yang pernah dilakukan oleh
Mayasari (2009), penelitian tentang alopurinol dalam metabolit biologis
dengan cation exchange chromatography pernah dilakukan oleh Sweetman dan
Nyhan (1969), dan penelitian tentang alopurinol dalam tablet secara
spektrofotometer menggunakan CT Complex pernah dilakukan oleh Refat, dkk
(2010). Demikian, maka dapat dipastikan bahwa perbandingan optimasi
metode analisis secara HPLC dan Spektrofotometri UV alopurinol dalam jamu
asam urat dan dalam sediaan tablet belum pernah dilakukan sebelumnya.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi mengenai optimasi isolasi alopurinol dalam sediaan tablet secara
spektrofotometer UV dan isolasi alopurinol dalam jamu asam urat dengan
menggunakan SPE MCX yang dilanjutkan dengan HPLC.
b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
terkait komposisi volume penyaringan, komposisi volume ekstraksi,
komposisi loading sampel, komposisi eluen SPE yang terbaik untuk proses
isolasi alopurinol dalam sediaan tablet dan dalam jamu asam urat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui proses optimasi isolasi alopurinol
dalam sediaan tablet dan dalam jamu asam urat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Obat Tradisional
Obat tradisional adalah bahan atau ramuan yang berupa bahan tumbuhan,
bahan hewan, bahan mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan
tersebut yang secara turun-temurun telah digunakan untuk pengobatan dan dapat
diterapkan sesuai dengan norma yang berlaku di masyarakat (PerMenKes RI No.
007 Tahun 2012).
Sediaan obat tradisional ini perlu dilakukan berbagai jenis pengujian
untuk mengetahui mutu dari sediaan obat tradisional yang akan diproduksi. Jenis
pengujian ini meliputi pengujian mutu dan pengujian keamanan. Pengujian mutu
meliputi organoleptik, kemasan, makroskopis, kebenaran simplisia, kadar air dan
keseragaman bobot. Pengujian keamanan meliputi uji cemaran logam berat,
cemaran pestisida, cemaran mikroba, zat tambahan yang diizinkan seperti bahan
pengawet, cemaran aflatoksin dan penetapan ada tidaknya bahan kima obat yang
ditambahkan dalam sediaan obat tradisional (KepMenKes RI no
661/MENKES/SK/VII/1994).
Menurut Keputusan Badan POM RI No. 00.05.4.2411 tahun 2004,
berdasarkan cara pembuatan serta klaim penggunaan dan tingkat pembuktian
khasiat, Obat Bahan Alam Indonesia dikelompokkan menjadi 3 jenis yaitu:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
1. Jamu (obat tradisional warisan nenek moyang).
2. Obat Herbal Terstandar (telah dikembangkan berdasarkan bukti-bukti ilmiah,
uji praklinis dan standarisasi bahan baku).
3. Fitofarmaka (telah melewati uji klinis dan standariasasi bahan baku).
B. Jamu
Jamu merupakan obat tradisional warisan nenek moyang yang dapat
dibedakan menjadi 2 yaitu obat dalam dan obat luar. Obat dalam biasa dijumpai
dalam bentuk herbal kering siap rebus, dalam bentuk segar rebusan dalam bentuk
jamu gendong, dalam bentuk serbuk kering siap seduh. Obat luar bisa
dimanfaatkan dengan cara dioles, digosok, direndam atau ditempel (Harmita,
2006).
Menurut PerMenKes No. 003 Tahun 2010, jamu harus memenuhi
kriteria:
1. Aman sesuai dengan persyaratan yang ditetapkan.
2. Klaim khasiat dibuktikan berdasarkan data empiris.
3. Memenuhi persyaratan mutu yang berlaku.
Menurut Keputusan Kepala Badan POM No. HK.00.05.41.1384 tahun
2005 di dalam jamu dilarang digunakan:
1. Bahan kimia hasil isolasi atau sintetik yang berkhasiat obat.
2. Narkotika atau psikotropika.
3. Hewan atau tumbuhan yang dilindungi sesuai dengan ketentuan peraturan
perundang-undangan yang berlaku.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Persyaratan mengenai jamu belum begitu mantap dan tegas, namun
pemerintah telah mengeluarkan beberapa petunjuk yaitu:
1. Kadar air tidak lebih dari 10%. Ini untuk mencegah berkembangnya bakteri,
kapang, dan khamir.
2. Jumlah kapang dan khamir tidak lebih dari 10000
3. Jumlah bakteri non patogen tidak lebih dari 1 juta
4. Bebas dari bakteri patogen
5. Tidak boleh tercemar atau diselundupi bahan kimia berkhasiat (Harmita, 2006).
C. Asam Urat
Asam urat merupakan senyawa kimia hasil akhir dari metabolism nucleic
acid atau metabolisme purin dalam tubuh. Berdasarkan penyelidikan bahwa 90%
dari asam urat merupakan hasil katabolisme purin yang dibantu oleh enzim
guanase dan xanthine oksidase (Suhendi, Nurcahyanti, Muhtadi, Sutrisna, 2011).
Asam urat akan dibawa ke ginjal melalui aliran darah untuk dikeluarkan
bersama air seni. Ginjal akan mengatur kadar asam urat dalam darah agar selalu
dalam keadaan normal. Namun, asam urat yang berlebihan tidak akan tertampung
dan termetabolisme seluruhnya oleh tubuh, maka akan terjadi peningkatan kadar
asam urat dalam darah (Suhendi, Nurcahyanti, Muhtadi, Sutrisna, 2011).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
D. Alopurinol
Gambar 1. Struktur alopurinol (1H-Pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-ol)
(DepKesehatan RI, 1995)
1. Sifat fisika kimia
Alopurinol mengandung tidak kurang dari 98% dan tidak lebih dari
101,0% C5H4N4O dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Pemerian
berupa serbuk halus putih hingga hampir putih dan berbau lemah. Alopurinol
sangat sukar larut dalam air dan etanol, larut dalam larutan kalium dan natrium
hidroksida, praktis tidak larut dalam kloroform dan dalam eter (DepKes RI,
1995).
2. Dosis
Pada dewasa, dosis harian rata-rata adalah 2-10 mg/kgBB, 100-200 mg
untuk kondisi ringan, 300-600 mg untuk kondisi cukup parah dan 700-900 mg
untuk kondisi parah (Apotex NZ Ltd, 2011).
Pada anak-anak, dosis harian rata-rata adalah 10-20 mg/kgBB sampai
maksimal 400 mg per hari. Penggunaan pada anak-anak jarang diindikasikan
kecuali dalam kondisi tertentu dan gangguan enzim tertentu (Apotex NZ Ltd,
2011).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
3. Peringatan dan pencegahan
Hati-hati pemberian pada penderita yang hipersensitif dan wanita hamil.
Hindari penggunaan pada penderita dengan gagal ginjal atau penderita
hiperurisemia asimptometik. Hentikan pengobatan dengan alopurinol bila
timbul kulit kemerahan atau demam. Penggunaan jangka panjang dapat
menyebabkan katarak. Selama pengobatan dianjurkan melakukan pemeriksaan
mata secara berkala, hentikan pengobatan jika terjadi kerusakan lensa mata.
Penggunaan pada wanita hamil, hanya bila ada pertimbangan manfaat
dibandingkan resikonya. Alopurinol dapat meningkatkan frekuensi serangan
artritis gout akut sehingga sebaiknya obat antiinflamasi atau kolkisin diberikan
bersama pada awal terapi. Hati-hati bila diberikan bersama dengan vidarabin
(DechaCare, 2014).
4. Efek samping
Reaksi hipersensitifitas: ruam mokulopapular didahului pruritus,
urtikaria, eksofoliatif dan lesi pupura, dermatitis, nefritis, faskulitis dan
syndrome poliartrtis. Demam, eosinophilia, kegagalan hati dan ginjal, mual,
muntah, diare, rasa mengantuk, sakit kepala dan rasa logam (DechaCare,
2014).
5. Penetapan kadar
Alopurinol dapat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan
spektrofotometer UV dengan panjang gelombang kurang lebih 250 nm.
Alopuriol dilarutkan dalam NaOH 0,4% b/v dan HCl 1% v/v (DepKes RI
1974).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
E. Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu
campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent
(Harborne, 1987). Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat
dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung
simplisia (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986).
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat
aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang
tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan
(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995).
F. Solid Phase Extraction (SPE)
1. Prosedur SPE
Ada dua strategi untuk melakukan penyiapan sampel menggunakan SPE
ini. Strategi pertama adalah dengan melakukan pemilihan pelarut yang mampu
menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara
untuk senyawa - senyawa penganggu akan terelusi. Analit yang dituju (yang
tertahan pada penjerap ini) selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut
organik yang akan mengambil analit yang tertahan ini. Strategi ini beramanfaat
jika analit yang dituju berkadar rendah. Strategi lain adalah dengan
mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi), sementara untuk
senyawa penganggu tertahan pada penjerap (Gandjar dan Rohman, 2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Tahap pertama menggunakan SPE adalah dengan mengkondisikan
penjerap dengan pelarut yang sesuai. Penjerap nonpolar seperti C18 dan
penjerap penukar ion dikondisikan dengan mengalirinya menggunakan metanol
lalu dengan akuades. Pencucian yang berlebihan dengan air akan mengurangi
recovery analit. Penjerap - penjerap polar seperti diol, siano, amino, dan silika
harus dibilas dengan pelarut nonpolar seperti metilen klorida (Gandjar dan
Rohman, 2010).
Gambar 2. Proses skematik prosedur SPE (Wells, M.J.M., 2000)
Ada empat tahap dalam prosedur SPE, yaitu:
a. Pengkondisian
Kolom (cartridge) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi
permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga
perubahan-perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel
dimasukkan dapat dihindari.
Conditioning Loading Washing Elution
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
b. Retensi (tertahannya) sampel
Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang
diharapakan, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan
komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang diharapkan terelusi.
c. Pembilasan
Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak
tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.
d. Elusi
Tahap ini merupakan tahap terakhir untuk mengambil analit yang
dikehendaki jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Gandjar dan
Rohman, 2010).
2. Pengembangan metode
Pendekatan empirik untuk melakukan pengembangan metode SPE
melibatkan screening penjerap yang tersedia. Langkah pertama adalah
menetukan penjerap mana yang paling baik dalam hal menahan analit yang
dituju. Pertimbangan kedua adalah pelarut apa yang dibutuhkan untuk
mengelusi analit yang dituju. Langkah ketiga adalah menguji matriks sampel
blanko untuk mengevaluasi adanya pengganggu yang mungkin ada, dan
akhirnya (langkah keempat) adalah menentukan recovery dengan menambah
analit dalam jumlah tertentu harus dilakukan (Gandjar dan Rohman, 2010).
Polaritas pelarut yang meningkat dibutuhkan untuk mengelusi senyawa
yang tertahan dalam penjerap silika, sementara unutk senyawa yang tertahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
dalam penjerap nonpolar (seperti C18) digunakan pelarut nonpolar (Gandjar dan
Rohman, 2010).
G. Spektrofotometri UV
Spektrofotometeri UV merupakan salah satu teknik analisis spektroskopik
yang menggunakan radiasi elektromagnetik UV dekat dengan menggunakan alat
spektrofotometer (Skogg, West dan Holler, 1994). Radiasi elektromagnetik pada
daerah UV dan visibel biasanya ditulis dalam satuan nanometer. Ketika sampel
mengabsorbsi radiasi elektromagnetik (foton), terjadi perubahan energi pada
sampel tersebut. Energi yang diserap mempunyai hubungan terhadap Persamaan
Planck (Harvey, 2000).
Molekul yang dikenakan gelombang radiasi elektromagnetik pada
frekuensi yang sesuai dapat terjadi penyerapan/absorpsi, adanya serapan tersebut
menghasilkan perbedaan energi serapan. Selisih energi tersebut setara dengan
energi foton yang diserap. Energi yang melompat dari keadaan dasar (ground
state) ke keadaan tereksitasi (excited state) disebut dengan transisi.
Dimana, E1= energi pada keadaan dasar/lebih rendah
E2= energi pada keadaan tereksitasi/lebih tinggi
h = konstanta Planck
υ = frekuensi foton yang diabsorpsi/diserap
λ = panjang gelombang
c = kecepatan
(1)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Transisi yang terjadi antar molekul tidaklah sama, hal ini menyebabkan perbedaan
spektra absorpsinya. Dengan demikian, spektra dapat digunakan sebagai bahan
analisis kualitatif dan banyaknya molekul yang menyerap radiasi pada panjang
gelombang tertentu setara dengan sinar yang diabsorpsi sehingga spektra juga
dapat digunakan sebagai bahan analisis kuantitatif (Gandjar dan Rohman, 2010).
Pada analisis dengan spektrofometer, dilakukan pembacaan absorbansi
yang disebut sebagai absorban (A) yang tidak memiliki satuan (Mulja dan
Suharman, 1995). Spektrum absorpsi merupakan plot absorbansi analit yang
merupakan fungsi dari panjang gelombang (Skogg, West dan Holler, 1994).
Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik (Gandjar dan Rohman, 2010)
Penyerapan foton yang dialami molekul mengakibatkan terjadinya eksitasi
elektron-elektron ikatan. Transisi elektronik yang terjadi antara tingkat energi
suatu molekul ada empat, yakni:
1. Transisi sigma–sigma star (σ → σ*)
Energi pada transisi ini terletak pada daerah < 180nm atau terjadi pada
daerah UV vakum dan kurang begitu bermanfaat untuk analisis
spektrofotometri UV-VIS (Gandjar dan Rohman, 2010).
2. Transisi non bonding elektron–sigma star (n → σ*)
Energi yang diperlukan untuk jenis transisi ini lebih kecil dibandingkan
transisi σ → σ*, sehingga sinar yang diserap memiliki panjang gelombang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
yang lebih panjang (150–250nm). Kebanyakan transisi ini terjadi pada panjang
gelombang < 200nm (Gandjar dan Rohman, 2010).
3. Transisi n → π* dan transisi π → π*
Transisi ini terjadi pada molekul organik yang memiliki gugus fungsional
tidak jenuh, ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital phi yang
diperlukan. Transisi jenis ini paling cocok digunakan dalam analisis
menggunakan spektrofotometri UV–visibel karena berada diantara panjang
gelombang 200–700 nm (Gandjar dan Rohman, 2010).
Pelarut dapat memberikan pengaruh transisi n → π* dan π → π*, hal ini
berkaitan dengan adanya perbedaan kemampuan dari pelarut untuk mensolvasi
antara keadaan dasar dengan keadaan tereksitasi. Pada transisi π → π*, molekul
yang berada dalam keadaan dasar akan relatif non polar dan keadaan
tereksitasinya lebih polar dibandingkan dari keadaan dasar. Penggunaan pelarut
polar akan menyebabkan interaksi lebih kuat saat keadaan tereksitasi
dibandingkan keadaan dasar sehingga perbedaan energi transisi π → π* lebih
kecil. Akibat yang ditimbulkan atas peristiwa ini ialah pergeseran ke panjang
gelombang yang lebih besar dari semula. Berbeda dengan transisi n → π*, pada
keadaan dasar molekul relatif lebih polar dibandingkan keadaan tereksitasi.
Pelarut yang berinteraksi hidrogen akan berinteraksi secara lebih kuat dengan
pasangan elektron yang tak berpasangan pada keadaan dasar dibandingkan
molekul pada keadaan tereksitasi. Hal ini mengakibatkan transisi n → π* akan
mempunyai energi yang lebih besar sehingga panjang gelombang akan bergeser
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
lebih pendek dibandingkan semula akibat kemampuan membentuk interaksi
hidrogen (polaritas) pelarut meningkat (Gandjar dan Rohman, 2010).
Gambar 4. (A) Pengaruh pelarut polar terhadap transisi π → π* dan (B) Transisi n
→ π* (Gandjar dan Rohman, 2010)
Dalam memilih panjang gelombang terkait hubungan sifat optik cuplikan
dan pelarut. Penyerapan radiasi UV atau visibel terkait dari elektron terluar atau
elektron valensi dari molekul dan tergantung pula pada jenis ikatan kimia dalam
molekul, adanya ikatan kimia penyebab terjadinya serapan sinar UV-Vis disebut
kromofor (Johnson dan Stevenson, 1978). Sinar UV mempunyai panjang
gelombang 200-400 nm, sedangkan sinar visibel mempunyai panjang gelombang
400-750 nm (Gandjar dan Rohman, 2010).
(A)
(B)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Kromofor merupakan ikatan rangkap tak jenuh selang-seling yang
menyerap radiasi pada daerah UV dan visibel, sedangkan aukosokrom merupakan
gugus jenuh yang terikat pada kromofor dapat menyebabkan adanya perubahan
panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum. Ciri auksokrom adalah
gugusan heteroatom seperti –OCH3, -Cl, OH, dan NH2. Penambahan auksokrom
menyebabkan pergeseren batokromik. Pergeseran batokromik merupakan
pergeseran panjang gelombang ke arah yang lebih panjang akibat adanya subsitusi
gugus atau atom atau adanya pengaruh pelarut (Sastrohamidjojo, 2001).
H. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat-zat terlarut
terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, karena solut-solut ini melewati suatu
kolom kromatografi. Pemisahan ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak
dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2010).
HPLC dapat menghasilkan pemisahan yang cepat, dengan keunggulan
zat yang tidak menguap atau zat yang tidak tahan panas dapat dipisahkan tanpa
terurai atau tanpa perlu diderivatisasi. Pada kromatografi partisi digunakan fase
gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda. Jika fase gerak bersifat polar
dan fase diam bersifat nonpolar maka disebut sebagai kromatografi fase terbalik,
senyawa nonpolar yang larut dalam hidrokarbon dengan BM < 1000 dapat
dipisahkan berdasarkan atas afinitasnya terhadap fase diam (Departemen
Kesehatan Republik Indonesia, 1995).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Gambar 5. Dasar pemisahan kromatografi partisi (Lennan, 2010)
Kromatografi partisi merupakan metode pemisahan analit berdasarkan
kemampuan partisinya diantara fase diam dan fase gerak yang melewati fase
diam. Analit yang mempunyai afinitas lebih besar pada fase diam (gambar 3 -
bulatan merah) relatif lebih tertahan di fase diam daripada analit yang kurang
tertahan pada fase diam (gambar 3 - bulatan hijau) (Lennan, 2010).
Gambar 6. Diagram sistem HPLC secara umum (Harvey, 2000)
Secara umum instrument HPLC terdiri atas beberapa komponen, yaitu
wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, dan
suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar dan Rohman, 2010).
Wadah fase gerak harus bersih dan inert. Wadah ini biasanya mampu
menampung fase gerak antara 1-2 liter pelarut. Fase gerak harus di degasing
(penghilangan gas) dulu sebelum digunakan karena adanya gas akan berkumpul
dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis. Pada saat membuat fase gerak, maka sangat dianjurkan
untuk memilih fase gerak dengan kemurnian yang tinggi agar tingkat pengotor
rendah dan tidak merusak sistem HPLC (Gandjar dan Rohman, 2010).
Fase gerak pada HPLC biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur dan secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya
elusi dan resolusi ini ditentukan berdasarkan polaritas pelarut, polaritas fase diam
dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar
daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sedangkan untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase
gerak), kemampuan elusi akan menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut
(Gandjar dan Rohman, 2010).
Dasar pemilihan fase gerak dalam suatu metode pemisahan yaitu
berdasarkan pada indeks polaritas (P’) campuran fase gerak tersebut. Semakin
besar nilai indeks polaritas pelarut menyatakan semakin polar fase gerak yang
digunakan. Fase gerak yang sering digunakan merupakan kombinasi dari dua atau
lebih campuran pelarut yang saling bercampur secara keseluruhan. Campuran fase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
gerak tersebut akan menghasilkan nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks
polaritas fase gerak (Harvey, 2000).
𝑃′𝐴𝐵 Φ𝐴. 𝑃′𝐴 + Φ𝐵. 𝑃′𝐵 (2)
Dengan ΦA dan ΦB merupakan fraksi volume pelarut yang digunakan
pada pelarut A dan B, sedangkan P’A dan P’B merupakan indeks polaritas pelarut
yang digunakan pada pelarut A dan B (Harvey, 2000).
Tabel 1. Indeks polaritas dan karakteristik solvent selectivity beberapa pelarut HPLC
(Snyder, Kirkland dan Dolan, 2010)
Pompa yang digunakan untuk memompa fase gerak pada sistem HPLC
memiliki syarat seperti wadah pelarut yakni inert terhadap fase gerak. Pompa
yang digunakan sebaiknya memiliki kemampuan memberikan tekanan hingga
5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak hingga 3 mL/min. Penggunaan
pompa ialah untuk dapat menjamin proses penghantaran fase gerak yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
berlangsung dengan tepat, reprodusibel, konstan dan bebas gangguan (Gandjar
dan Rohman, 2010).
Metode pencampuran fase gerak dibedakan menjadi dua, yakni metode
isokratik dan metode gradien. Metode isokratik merupakan metode pencampuran
fase gerak secara manual dengan tangan dan saat memasuki sistem HPLC tidak
dibutuhkan adanya pencampuran fase gerak kembali dan dilakukan dengan satu
pompa. Metode gradien merupakan metode pencampuran fase gerak yang
dilakukan di dalam sistem HPLC, dimana beberapa pompa digunakan untuk
memompa pelarut ke dalam wadah pencampuran fase gerak dan hasil
pencampuran fase gerak tersebut yang dialirkan ke dalam kolom (Snyder,
Kirkland, dan Dolan, 2010).
Penyuntikan sampel pada HPLC dilakukan secara langsung ke dalam
fase gerak yang mengalir menuju kolom (Gandjar dan Rohman, 2010).
Pada sistem HPLC, penyuntikan sampel melalui loop injector yang dapat
menyimpan volume dari 0,5 μL - 2 mL. Pada posisi load, loop sampler terisolasi
dari fase gerak. Ketika katup dipindahkan ke posisi loading, injektor berpindah ke
posisi inject dan saat itu pula fase gerak mengaliri sampel dan terbawa memasuki
kolom (Harvey, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Gambar 7. Skema sampler KCKT. (A) – posisi load, sampel diinjeksikan dan terisolasi dari
fase gerak. (B) – posisi inject, sampel terbawa fase gerak dan memasuki kolom (Harvey,
2000)
Kolom pada HPLC memuat fase diam, kebanyakan merupakan silika
yang dimodifikasi secara kimiawi. Permukaan silika merupakan permukaan yang
polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Modifikasi
secara kimia akan menutupi gugus silanol dan menggantinya dengan gugus
fungsional lain. Hasil reaksi kimiawi tersebut akan menghasilkan silika yang
stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan siloksan (Si-O-Si) (Gandjar dan
Rohman, 2010).
Oktadesil silika (C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan dalam memisahkan senyawa dengan tingkat kepolaran rendah hingga
tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk analit yang
polar. Analit polar terutama yang bersifat basa akan memberikan puncak yang
mengekor (tailing peak), hal ini terjadi karena adanya interaksi dengan residu
silanol ataupun pengotor logam yang terdapat pada silika (Gandjar dan Rohman,
2010).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Deteksi pada KCKT dibagi menjadi empat secara umum, yakni bulk
property, sample specific, mobile-phase modification, dan hyphenated
techiniques.
a. Bulk property detector. Detektor ini dianggap sebagai detektor universal yang
dapat mengukur banyak komponen. Detektor ini memiliki keuntungan karena
dapat mendeteksi semua senyawa, sekaligus memiliki kelemahan karena semua
senyawa dari sampel yang terelusi akan terbaca sebagai sinyal. Secara umum,
detektor universal memiliki sensitivitas yang rendah (Snyder, Kirkland, dan
Dolan, 2010).
b. Sample specific detectors. Detektor ini merespon terhadap keunikan
karakteristik yang dimiliki suatu analit karena beberapa karakteristik sampel
mempunyai sifat unik yang mana tidak secara umum dimiliki oleh semua
analit. Detektor UV merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan
merespon analit yang mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang
tertentu. Selain detektor UV, terdapat detektor lain seperti fluoresen dan
detektor conduct electricity (Snyder, Kirkland, dan Dolan, 2010). Detektor
UV-VIS dapat mengukur analit yang memiliki struktur kromoforik pada daerah
panjang gelombang 190 – 800 nm. Detektor UV-VIS ini dapat berupa detektor
dengan panjang gelombang tetap ataupun bervariasi (Gandjar dan Rohman,
2010).
c. Mobile–phase modification detectors. Detektor ini mengubah fase gerak
setelah kolom HPLC menghasilkan pengubahan karakteristik analit, seperti
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
perubahan reaksi analit dan detektor spektrometrik masa (Snyder, Kirkland,
dan Dolan, 2010).
d. Hyphenated techniques. Teknik ini mengacu pada kopling dari analisis HPLC
yang dipadukan dengan teknik lain, seperti LC-MS dan LC-IR (Snyder,
Kirkland, dan Dolan, 2010).
Detektor pada HPLC idealnya memiliki beberapa karakteristik sebagai
berikut:
Respon terhadap analit cepat dan reprodusibel
Mampu mendeteksi analit hingga kadar yang sangat kecil
Stabil saat dioperasikan/digunakan
Memiliki sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita.
Sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran
luas/AUC
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Komputer atau integrator merupakan alat yang dihubungkan dengan
detektor unuk mengukur sinyal yang dihasilkan dan diplotkan sebagai suatu
kromatogram sehingga dapat dievaluasi oleh peneliti (Gandjar dan Rohman,
2010).
I. Landasan Teori
Jamu merupakan sediaan obat tradisional yang digunakan secara turun
temurun oleh masyarakat untuk mengobati suatu penyakit tertentu. Salah satu
jenis jamu yang sering digunakan adalah jamu asam urat. Regulasi mengenai jamu
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
belum diterapkan secara semestinya sehingga mendorong beberapa pihak yang
kurang bertanggung jawab untuk meningkatkan omsetnya dengan menambahkan
bahan-bahan kimia obat untuk dapat memperoleh efek terapi yang cepat.
Penyakit asam urat banyak dialami oleh banyak masyarakat, oleh karena
itu agar penyembuhannya cepat banyak masyarakat menggunakan obat. Obat
untuk menyembuhkan asam urat adalah alopurinol.
Pada sampel tablet, digunakan pengukuran secara spektrofotometri UV
untuk mengukur kadar alopurinol dalam matriks tablet. Sampel tablet disaring lalu
diencerkan dan diukur dengan spektrofotometer UV. Parameter pengukuran
dengan spektrofotometer UV, yaitu nilai presisi yang baik.
Sampel dipisahkan dengan cara ekstraksi cair-cair, dimana sampel jamu
dilarutkan dalam NaOH karena kelarutan alopurinol terbesar terdapat dalam
NaOH, kemudian diekstraksi dengan kloroform agar senyawa-senyawa organik
larut dalam klorofom tetapi tidak melarutkan analit karena perbedaan polaritas,
lalu dibuang fase organiknya kemudian dipisahkan lagi dengan Solid Phase
Extraction MCX (Mixed Cation Exchanger) karena analit akan berikatan dengan
SO3- dari fase diam SPE. Setelah analit berikatan dengan fase diam MCX, matriks
sampel dikeluarkan dengan mengaliri asam asetat dan metanol kemudian
dilakukan elusi dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol.
Optimasi clean up partisi dan SPE dilakukan untuk memperoleh analit
yang bersih dari senyawa lainnya (selain alopurinol) dan didapatkan kandungan
alopurinol terbanyak. Hasil ekstraksi diinjeksikan pada sistem HPLC fase terbalik
yang sudah teroptimasi dan dilihat kromatogramnya. Parameter pemisahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
dengan SPE yang menunjukkan hasil optimum yaitu berkurangnya puncak-
puncak senyawa selain alopurinol, Area Under Curve (AUC) alopurinol yang
terbesar, resolusi tercapai ≥ 1,5 pada kromatogram
J. Hipotesis
1. Isolasi alopurinol dalam sampel tablet dilakukan dengan ekstraksi berulang
dapat menghasilkan presisi yang baik.
2. Isolasi alopurinol dalam sampel jamu dilakukan dengan ekstraksi cair-cair dan
dilanjutkan dengan SPE MCX dapat memberikan efisiensi clean up yang baik
dengan berkurangnya puncak-puncak selain alopurinol, AUC terbesar, dan
nilai resolusi ≥ 1,5.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis dan rancangan penelitian ini adalah eksperimental karena terdapat
perlakuan terhadap subjek uji.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel
a. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah komposisi volume
kloroform, loading sampel, fase gerak (eluen), dan volume penyaringan.
b. Variabel tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah absorbansi alopurinol,
efisiensi clean up, nilai resolusi, dan AUC alopurinol.
c. Variabel pengacau terkendali
Kemurnian pelarut yang digunakan, dapat diatasi dengan mengunakan
pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi, sediaan tablet
alopurinol, dan sampel jamu asam urat.
2. Definisi operasional
a. Alopurinol yang dianalisis merupakan senyawa aktif yang berada dalam
sediaan tablet dan sampel jamu asam urat.
b. Optimasi penyaringan dilakukan secara kuantitatif dan tidak kuantitatif
kemudian diukur secara Spektrofotometri UV.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
c. Sistem SPE yang digunakan adalah seperangkat alat Solid Phase Extraction
(SPE) dengan fase diam Mixed Cation Exchanger (MCX).
d. Optimasi volume ekstraksi kloroform dilakukan dengan memvariasikan
volume kloroform, optimasi volume fase gerak dilakukan dengan mengubah
volume fase gerak (eluen) dan optimasi kapasitas kolom dilakukan dengan
mengubah volume (loading) sampel yang masuk ke dalam kolom SPE.
e. Parameter pemisahan komponen dengan metode SPE dilanjutkan dengan
HPLC fase terbalik adalah dengan jumlah impurities yang sedikit, bentuk
peak, retention time, nilai resolusi, nilai tailing factor, dan nilai AUC
alopurinol.
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku alopurinol yang diperoleh
dari PT IFARS Solo, metanol p.a (E, Merck), ammonium hidroksida p.a (E,
Merck), aquabides, aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmasi USD,
tablet alopurinol dan sampel jamu asam urat.
D. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (OHAUS
Carat Series PAJ 1003, max 60/120g, min 0,1 mg, d=0,01/0,1 mg, e = 1 mg),
seperangkat alat KCKT fase terbalik dengan sistem isokratik dengan detektor
ultraviolet, Shimadzu LC-2010C, kolom C-18 merek KNAUER C-18 (No.
25EE181KS (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm), seperangkat komputer (merk
Dell B6RDZIS Connexant System RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer
HP Deskjet D2566-000 625730), alat ultrasonifikasi (Retsch tipe T640 No.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
935922013), Spektrofotometer UV-Vis Mini Shimadzu, seperangkat catridge
Solid Phase Extraction (SPE) dengan fase diam Mixed Cation Exchanger (MCX)
merek Waters (60 mg, 3 cc, ukuran partikel 30 μm), desilator aquabidest merek
Thermo Scientific, organic and anorganic solvent membrane filter (Whatman)
dengan ukuran pori 0,45 μm, syringe, mikropipet Socorex, milipore filter, rotary
evaporator dan seperangkat alat-alat gelas (Pyrex).
E. Tata Cara Penelitian
1. Optimasi isolasi alopurinol dalam tablet dengan menggunakan
spektrofotometri UV
a. Penyiapan sampel tablet alopurinol
Menyiapkan 20 tablet alopurinol. Tablet kemudian ditimbang satu per
satu untuk menguji keseragaman bobot. Setelah dilakukan uji keseragaman bobot,
tablet alopurinol dihomogenkan dengan menggunakan mortir dan stamper. Serbuk
kemudian disimpan dalam wadah yang kering.
b. Pembuatan dan pembakuan larutan NaOH 0,1 N
Sejumlah 1 gram pelet NaOH dilarutkan dengan aquadest hingga
semua larut sempurna dan dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL lalu
diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas.
Ditimbang lebih kurang 400 mg kalium biftalat secara seksama yang
sebelumnya telah dihaluskan dan dikeringkan pada suhu 120oC selama 2 jam dan
larutkan dalam 75 mL air bebas CO2 lalu tambahkan 2 tetes indikator fenolftalein
dan titrasi dengan larutan natrium hidroksida hingga terjadi warna merah muda
mantap.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
N NaOH =
(DepKes RI, 1995)
c. Optimasi penyaringan alopurinol
1) Optimasi penyaringan dengan menggunakan baku alopurinol
Penyaringan tanpa pembilasan. Baku sejumlah 50,0 mg ditimbang,
dilarutkan dengan 20 mL NaOH lalu disaring dengan kertas saring dan
dimasukkan ke dalam labu 50 mL diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas.
Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke
dalam labu ukur 10 mL. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL
diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas.
Kemudian larutan ini disebut dengan larutan A.
Penyaringan diikuti dengan pembilasan. Baku sejumlah 50,0 mg
ditimbang, dilarutkan dengan 10 mL NaOH lalu disaring dengan kertas saring, di
dalam beaker glass dibilas lagi dengan 10 mL NaOH lalu disaring lagi dan
dimasukkan ke dalam labu 50 mL dan diencerkan dengan NaOH hingga tanda
batas. Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke
dalam labu ukur 10 mL. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL
diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas.
Kemudian larutan ini disebut dengan larutan B.
Absorbansi larutan A dan B dibandingkan untuk mengetahui pengaruh
perbedaan cara penyaringan larutan baku alopurinol.
2) Optimasi penyaringan dengan menggunakan tablet alopurinol
Penyaringan tanpa pembilasan. Sampel tablet sejumlah 77 mg
ditimbang, dilarutkan dengan 20 mL NaOH disaring dengan kertas saring dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
dimasukkan ke dalam labu 25 mL diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas.
Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke
dalam labu ukur 10 mL. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL
diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas.
Kemudian larutan ini disebut dengan larutan C.
Penyaringan diikuti dengan pembilasan. Sampel tablet sejumlah 77
mg ditimbang, dilarutkan dengan 10 mL NaOH lalu disaring dengan kertas saring,
di dalam beaker glass dibilas lagi dengan 10 mL NaOH, disaring lagi dan
dimasukkan ke dalam labu 25 mL dan diencerkan dengan NaOH hingga tanda
batas. Larutan hasil penyaringan diambil 1,0 mL lalu diencerkan dengan NaOH ke
dalam labu ukur 10 mL. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL
diencerkan dengan NaOH ke dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas.
Kemudian larutan ini disebut dengan larutan D.
Absorbansi larutan C dan D dibandingkan untuk mengetahui pengaruh
perbedaan cara penyaringan tablet alopurinol.
2. Optimasi ekstraksi cair-cair tanpa SPE
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh jumlah senyawa
pengotor yang terdapat dalam ekstrak cair-cair. Langkah kerja yang dilakukan
adalah menimbang sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X kemudian
dilarutkan ke dalam 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan
menggunakan pengulangan volume kloroform 3 x 3 mL, fase NaOH diambil dan
ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH menjadi 2.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk
menghilangkan pengotor yang masih ada. Volume sampel setelah disaring adalah
4 mL. Setelah disaring, sampel tidak dilewatkan pada SPE MCX. Sampel
dipekatkan seluruhnya lalu dilarutkan dengan amonium hidroksida 5% dalam
metanol sebanyak 10 mL, disaring dengan milipore dan diultrasonifikasi 15 menit.
Sampel diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18,
komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90),
kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm dan
volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Hasil kromatogram yang didapat
dibandingkan dengan kromatogram yang diperoleh pada langkah 3c.
3. Optimasi isolasi alopurinol dalam jamu asam urat merek X
a. Penyiapan sampel jamu asam urat merek X
Menyiapkan 20 bungkus jamu asam urat merek X. Serbuk jamu
kemudian ditimbang satu per satu untuk menguji keseragaman bobot. Setelah
dilakukan uji keseragaman bobot, serbuk jamu dihomogenkan dengan
menggunakan mortir dan stamper. Serbuk kemudian disimpan dalam wadah yang
kering.
b. Optimasi clean up SPE MCX
Pada penelitian ini dilakukan optimasi kapasitas kolom dan volume
eluen dengan menggunakan metode SPE penukar kation dengan fase diam MCX
(Mixed Cation Exchanger) (Waters).
Optimasi kapasitas kolom dilakukan dengan melakukan variasi
volume pengisian (loading) ekstrak sampel. Optimasi volume eluen dilakukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
dengan memvariasi volume eluen yang digunakan untuk mengelusi SPE MCX.
Kedua variasi tersebut dilakukan sesuai dengan Tabel II.
Langkah kerja yang dilakukan adalah menimbang sebanyak 0,5 g
sampel jamu asam urat merek X kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL NaOH 0,1
N. Sampel diekstraksi dengan menggunakan volume kloroform 3x3 mL, fase
NaOH diambil dan ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH menjadi 2.
Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk
menghilangkan pengotor yang masih ada. Volume sampel setelah disaring adalah
4 mL. SPE MCX disiapkan, dikondisikan (conditioning) dengan berturut-turut
mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL aquabidest ke dalam kolom SPE MCX
kemudian tetesan ditampung pada flakon.
Tabel II. Optimasi loading sampel dan volume eluen SPE MCX
Loading ekstrak sampel (μL) Volume eluen (mL)
500
5
7.5
10 + 2.5
750
5
7.5
10 + 2.5
1000
5
7.5
10 + 2.5
Diantara tahapan loading sampel dan elusi dilakukan pencucian SPE
dengan cara mengaliri berturut-turut dengan 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL
metanol p.a. melalui kolom SPE MCX, tetesan eluen ditampung pada flakon. Lalu
dilakukan pengelusian sesuai tabel II. Fraksi hasil elusi dipekatkan seluruhnya
lalu dilarutkan kembali dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak
10 mL, disaring dengan milipore dan diultrasonifikasi 15 menit.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Sampel hasil pengelusian diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik
dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium
hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan
panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).
Hasil kromatogram yang didapat, diamati bentuk peak dan nilai AUC untuk
mengetahui hasil yang optimal dari proses optimasi clean up SPE MCX.
c. Optimasi ekstraksi cair-cair
Pada penelitian ini dilakukan optimasi clean up cair-cair dengan
memvariasi pengulangan ekstraksi cair-cair dengan pelarut organik, yaitu 2x3 mL,
3x3 mL, dan 4x3 mL.
Langkah kerja yang dilakukan adalah menimbang sebanyak 0,5 g
sampel jamu asam urat merek X kemudian dilarutkan ke dalam 10 mL NaOH 0,1
N. Sampel diekstraksi dengan menggunakan jumlah pengulangan ekstraksi
dengan pelarut organik yang berbeda-beda, yaitu 2x3 mL, 3x3 mL, dan 4x3 mL,
fase NaOH diambil dan ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH menjadi 2.
Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk
menghilangkan pengotor yang masih ada. Volume sampel setelah disaring adalah
4 mL. Setelah disaring, sampel diloading ke dalam SPE dan dielusi sesuai dengan
hasil optimasi pada langkah 3b. Sampel dipekatkan seluruhnya lalu dilarutkan
dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mL, disaring dengan
milipore dan diultrasonifikasi 15 menit.
Sampel diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18,
komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90),
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm dan
volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Hasil kromatogram yang didapat,
diamati bentuk peak dan nilai AUC untuk mengetahui hasil yang optimal dari
proses optimasi ekstraksi cair-cair.
4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan HPLC
Pada penelitian ini dilakukan identifikasi alopurinol dalam sampel
jamu dengan menggunakan HPLC. Cara yang dilakukan adalah dengan cara
membandingan waktu retensi, bentuk puncak, dan nilai AUC antara baku
alopurinol, blanko sampel jamu, dan sampel jamu yang ditambah baku alopurinol
yang bertujuan untuk mengetahui apakah dalam sampel jamu terdapat alopurinol.
Langkah kerja yang dilakukan adalah
a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih
kurang 25 mg baku alopurinol, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan
dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga
tanda.
b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol. Larutan intermediet dibuat dengan
konsentrasi 500 g/mL dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari larutan
stok baku alopurinol, dimasukkan labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan
amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda.
c. Pembuatan larutan baku alopurinol dengan konsentrasi 30 μg/mL. Diambil
sejumlah 600 μL larutan intermediet alopurinol kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 10 mL. Labu ukur diencerkan dengan amonium hidroksida 5%
dalam metanol hingga tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 30 μg/mL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Larutan baku alopurinol diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan
kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida
0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang
gelombang 274 nm (Sari, 2014).
d. Penyiapan blanko sampel jamu
Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan
dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform 3 mL
sebanyak 3x. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air (bagian atas),
tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N hingga pH 2.
Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk menghilangkan
endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa sehingga hasil
penyaringan adalah 4 mL.
SPE dikondisikan dengan mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL
aquabidest, lalu dilakukan loading ekstrak sampel sebanyak 1000 μL ke dalam
kolom SPE. Kolom SPE MCX dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2%
dan 2 mL metanol. Selanjutnya dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida
5% dalam metanol. Fraksi hasil elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan
kembali dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mL lalu
disaring dengan menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15
menit. Diinjeksikan sebanyak 20 µl ke dalam HPLC fase terbalik dengan
kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida
0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang
gelombang 274 nm (Sari, 2014).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
e. Penyiapan sampel dalam matriks jamu
Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan
dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform 3 mL
sebanyak 3x. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air (bagian atas),
tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N hingga pH 2.
Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk menghilangkan
endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa sehingga hasil
penyaringan adalah 4 mL.
Sampel ditambah dengan seri larutan baku alopurinol sebanyak 200
μL pada konsentrasi 5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL dan 100 μL, 200 μL, dan
300 μL dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang
ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng. SPE dikondisikan dengan
mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL aquabidest, lalu dilakukan loading
ekstrak sampel sebanyak 1000 μL ke dalam kolom SPE. Kolom SPE MCX
dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL metanol. Selanjutnya
dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam metanol. Fraksi hasil
elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali dengan amonium hidroksida
5% dalam metanol sebanyak 10 mL lalu disaring dengan menggunakan
milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit. Sampel diinjeksikan ke
dalam HPLC fase terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol :
aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit,
detektor UV dengan panjang gelombang 274 nm (Sari, 2014).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Hasil kromatogram yang didapat dari langkah 4c, 4d, dan 4e, diamati waktu
retensi, bentuk peak, dan nilai AUC alopurinol lalu dibandingkan antara baku
alopurinol, blanko sampel jamu, dan sampel yang ditambah baku alopurinol.
5. Validasi metode clean up SPE MCX
Validasi dilakukan pada hasil optimasi kapasitas kolom dan volume
eluen. Proses validasi dilakukan dengan menghitung akurasi dan presisi. Akurasi
dinyatakan dengan % perolehan kembali. Sampel ditambah dengan baku sebanyak
200 µl pada 3 level konsentrasi yaitu 5 µg/mL, 15 µg/mL, 30 µg/mL, dan 100 μL,
200 μL, dan 300 μL dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol
yang ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng (dilakukan 5 kali
replikasi). % perolehan kembali dihitung dengan menggunakan rumus:
% perolehan kembali = ( ) ( )
x 100%
Presisi dinyatakan dengan % CV yang menunjukkan persentase
penyimpangan data yang terjadi. Koefisien variasi (CV) dihitung pada setiap
replikasi dengan rumus:
% CV =
x 100%
Langkah kerja yang dilakukan adalah
a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih
kurang 25 mg baku alopurinol, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL dan
dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga
tanda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol. Larutan intermediet dibuat dengan
konsentrasi 500 g/mL dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari larutan
stok baku alopurinol, dimasukkan labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan
amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda.
c. Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Diambil sejumlah 100 μL, 300 μL, dan
600 μL larutan intermediet alopurinol kemudian masing-masing dimasukkan
ke dalam labu ukur 10 mL. Masing-masing labu ukur diencerkan dengan
amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda, sehingga diperoleh
konsentrasi 5 μg/mL, 15 μg/mL, dan 30 μg/mL.
d. Penyiapan sampel dalam matriks jamu
Sebanyak 0,5 g sampel jamu asam urat merek X ditimbang dilarutkan
dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Sampel diekstraksi dengan kloroform hasil
optimasi ekstraksi cair-cair. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air
(bagian atas), tampung dalam beaker glass. Fase air ditambah HCl 0,1 N
hingga pH 2. Sampel disaring dengan menggunakan kertas saring untuk
menghilangkan endapan yang timbul saat penambahan HCl sedemikian rupa
sehingga hasil penyaringan adalah 4 mL.
Sampel ditambah dengan seri larutan baku alopurinol sebanyak 200
μL pada konsentrasi 5 μg/mL, 15 μg/mL, 30 μg/mL dan 100 μL, 200 μL, dan
300 μL dari larutan intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang
ditambahkan sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng. SPE dikondisikan dengan
mengaliri 1 mL metanol p.a. dan 1 mL aquabidest, lalu dilakukan loading
ekstrak sampel sesuai dengan hasil optimasi langkah 3b ke dalam kolom SPE.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
Kolom SPE MCX dicuci dengan mengaliri 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL
metanol. Selanjutnya dielusi dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam
metanol. Fraksi hasil elusi diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali dengan
amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mL lalu disaring dengan
menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit.
Diinjeksikan sebanyak 9 µl untuk adisi 5 µg/mL, 20 µl untuk adisi 15 µg/mL
dan 21 µl untuk adisi 30 µg/mL ke dalam HPLC fase terbalik dengan kolom
C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1%
(10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang
274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Hasil kromatogram
yang didapat, diamati nilai AUC lalu dihitung nilai akurasi dan presisi.
6. Penggunaan kembali SPE MCX
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah SPE yang telah
dipakai dapat digunakan kembali dengan cara melakukan pencucian SPE
bekas/yang sudah pernah dipakai kembali setelah dicuci menurut suatu siklus
pencucian. Pada penelitian ini digunakan variasi pengulangan pencucian SPE
seperti yang tertera pada tabel III.
Tabel III. Pengulangan pencucian SPE
Variasi
pengulangan
Urutan siklus pencucian
1x Dalam 1x siklus pencucian SPE dilakukan dengan cara
berturut-turut mengaliri SPE dengan metanol p.a.; aquabidest;
NaOH 0,1N; HCl 0,1N; aquabidest; dan metanol p.a.
2x
3x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Setelah pencucian SPE, SPE digunakan sesuai dengan tata cara
penelitian langkah 3b. Tahap loading ekstrak sampel dimasukkan 1000 μL larutan
baku alopurinol dengan konsentrasi 30 μg/mL yang akan dijelaskan berikutnya
pada langkah 4.
Fraksi hasil elusi diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan
kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1%
(10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang
274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).
Hasil kromatogram yang didapat pada pencucian SPE 1x, 2x, dan 3x
dibandingkan untuk mengetahui sampai berapa kali pencucian SPE dilakukan
agar SPE dapat dipakai kembali.
F. Analisis Hasil
1. Analisis hasil optimasi penyaringan dengan spektrofotometri UV
Data absorbansi yang diperoleh dari hasil optimasi penyaringan
ditetapkan nilai presisi dari penyaringan alopurinol dalam matriks tablet.
2. Analisis hasil optimasi clean up yang dilanjutkan dengan HPLC
Data kromatogram yang diperoleh dari hasil optimasi clean up
ditentukan untuk menetapkan pemisahan alopurinol dalam matriks jamu asam urat
yang dapat dilihat dari banyaknya puncak, waktu retensi baku alopurinol dengan
fraksi hasil elusi SPE, dan nilai resolusi yang dihasilkan. Dari hasil optimasi SPE
ditetapkan nilai akurasi dan presisi dari metode SPE untuk memisahkan alopurinol
dalam matriks jamu asam urat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Optimasi isolasi alopurinol dalam tablet dengan menggunakan
spektrofotometri UV
Penetapan kadar alopurinol dalam tablet (DepKes RI 1974) dilakukan
pengembangan metode dengan melarutkan alopurinol dalam NaOH 0,1 N dan
dilakukan pengenceran 2500 kali. Larutan intermediet disaring dan diukur pada
panjang gelombang maksimum secara spektrofotometri UV.
a. Penyiapan sampel tablet alopurinol
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah sediaan tablet
alopurinol yang banyak beredar di pasaran. Analit yang ingin dianalisis adalah
alopurinol yang terdapat dalam tablet. Pertama-tama menyiapkan 20 tablet
alopurinol, lalu kemudian sampel ditimbang satu per satu untuk uji keseragaman
bobot dimana fungsi dari uji keseragaman bobot adalah untuk memastikan bobot
tablet yang seragam karena dengan seragamnya bobot tablet maka dosis yang
terkandung juga seragam.
Menurut FI IV, penyimpangan bobot rata-rata yang harus dipenuhi
adalah tidak lebih dari 2 tablet yang bobotnya menyimpang sebesar 5% bobot
rata-rata dan tidak boleh 1 bobot tablet pun yang bobotnya menyimpang sebesar
10% dari bobot rata-rata. Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet dapat dilihat
pada tabel IV.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Hasil bobot rata-rata tablet alopurinol yang diperoleh adalah 306 mg
dengan nilai CV sebesar 0.9% (lampiran 3). Dari hasil yang diperoleh telah
memenuhi persyaratan karena tidak ada bobot tablet yang menyimpang sebesar
5% dan 10% dari bobot rata-rata.
Setelah diuji keseragaman bobot, tablet digerus. Tujuan dari digerus
ini adalah untuk menghomogenkan dan memperkecil ukuran partikel tablet
sehingga dengan homogennya sampel tablet dan kecilnya ukuran partikel akan
memperluas area kontak antara pelarut dengan sampel sehingga sampel dapat
larut pada pelarut yang digunakan.
b. Pembuatan dan pembakuan NaOH 0,1 N
Pembakuan NaOH bertujuan untuk menentukan konsentrasi larutan
NaOH secara teliti karena NaOH merupakan baku sekunder yang perlu dibakukan
menjadi baku primer. NaOH bersifat higroskopis yang dapat menyerap air dari
lingkungan sekitar yang dapat menyebabkan pengenceran sehingga mengalami
perubahan konsentrasi, oleh karena itu maka NaOH perlu dibakukan. Selain itu
juga NaOH dapat bereaksi dengan gas CO2 dari udara dengan reaksi sebagai
berikut (Mursyidi dan Rohman, 2008):
NaOH + CO2 Na2CO3 + H2O
Bobot rata-rata (mg) Penyimpangan bobot rata-rata
A B
25 atau kurang 15% 30%
26 sampai dengan 150 10% 20%
151 sampai dengan 300 7,5% 15%
Lebih dari 300 5% 10%
Tabel IV. Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet (DepKes RI, 1995)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Pembakuan NaOH dilakukan dengan menggunakan kalium biftalat
sebagai baku primer. Reaksi antara kalium biftalat dengan NaOH adalah sebagai
berikut (Mursyidi dan Rohman, 2008):
Indikator yang digunakan pada proses pembakuan NaOH adalah
fenolftalein yang memiliki trayek pH 8,2-10 (Jenkins, 1967) untuk mengetahui
terjadinya TAT (Titik Akhir Titrasi). Pada saat tercapai TAT telah terjadi
perubahan warna dari bening menjadi pink. Digunakan indikator fenolftalein
karena indikator fenolftalein memiliki trayek perubahan warna disekitar titik akhir
teoritis. Fenolftalein pada suasana basa akan memberikan warna merah muda.
Pada penelitian ini, terjadi perubahan warna dari bening menjadi pink
mantap. Warna pink tersebut terjadi karena telah melewati TAT (Titik Akhir
Gambar 9. Perubahan warna indikator fenolftalein dari bening menjadi pink
(Gandjar dan Rohman 2010)
Gambar 8. Reaksi antara kalium biftalat dengan NaOH (Mursyidi dan Rohman, 2008)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Titrasi). Volume titran yang diperoleh adalah 21.35 mL dan normalitas yang
diperoleh adalah 0.0917 N (lampiran 8).
c. Optimasi penyaringan alopurinol
Tujuan penelitian ini adalah untuk memisahkan alopurinol dari
matriks tablet. Langkah awal dilakukan penyaringan tanpa pembilasan. Baku
alopurinol ditimbang sebanyak 50,0 mg, dilarutkan dengan NaOH sebanyak 20
mL karena alopurinol mudah larut dalam NaOH dan disaring dengan kertas
saring. Larutan hasil penyaringan dimasukkan ke dalam labu 50 mL dan
diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Dari labu 50 mL tersebut diambil
1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga
tanda batas. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL, dimasukkan ke
dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Kemudian
larutan ini disebut dengan larutan A.
Langkah berikutnya dilakukan penyaringan yang diikuti dengan
pembilasan. Baku alopurinol ditimbang sebanyak 50,0 mg, dilarutkan dengan 10
mL NaOH terlebih dahulu kemudian disaring dengan kertras saring. Sisa
Gambar 10. Hasil standarisasi NaOH dengan menggunakan kalium biftalat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
alopurinol yang masih tertinggal di beaker glass dibilas lagi dengan NaOH 10 mL
dan disaring dengan kertas saring agar tidak ada sisa alopurinol dalam beaker
glass. Larutan hasil penyaringan dimasukkan ke dalam labu 50 mL dan
diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Dari labu 50 mL tersebut diambil
1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga
tanda batas. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL, dimasukkan ke
dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Kemudian
larutan ini disebut dengan larutan B.
Sampel tablet alopurinol ditimbang 77 mg. Langkah pertama
dilakukan penyaringan tanpa pembilasan. Sampel tablet alopurinol dilarutkan
dalam NaOH karena alopurinol mudah larut dalam NaOH sebanyak 20 mL,
disaring dengan kertas saring. Larutan hasil penyaringan dimasukkan ke dalam
labu 25 mL dan diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Dari labu 25 mL
tersebut diambil 1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan
NaOH hingga tanda batas. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL,
dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas.
Kemudian larutan ini disebut dengan larutan C.
Sampel tablet alopurinol ditimbang lagi sebanyak 77 mg, dilarutkan
dengan 10 mL NaOH terlebih dahulu kemudian disaring dengan kertras saring.
Sisa alopurinol yang masih tertinggal di beaker glass dibilas lagi dengan NaOH
10 mL dan disaring dengan kertas saring agar tidak ada sisa alopurinol dalam
beaker glass. Larutan hasil penyaringan dimasukkan ke dalam labu 25 mL dan
diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Dari labu 25 mL tersebut diambil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga
tanda batas. Dari labu 10 mL yang pertama diambil lagi 1,0 mL, dimasukkan ke
dalam labu 10 mL, diencerkan dengan NaOH hingga tanda batas. Kemudian
larutan ini disebut dengan larutan D.
Dari larutan A, B, C, D diukur dengan menggunakan spektrofotometer
UV pada panjang gelombang 257 nm. Hasil absorbansi yang didapatkan
kemudian dihitung dengan persamaan regresi linier kurva baku y = 0,05246x +
0,04479 (Dewi, 2014). Hasil yang didapatkan dapat dilihat pada tabel V.
Tabel V. Hasil bobot alopurinol, SD, dan % CV
Cara
Penyaringan
Replikasi Absorbansi
Bobot
Alopurinol (mg)
Rata-
rata
SD % CV
Baku
10 mL x 2
1 0.545 23.8
24.4 0.60 2.4 2 0.555 24.3
3 0.569 25.0
20 mL x 1
1 0.540 23.6
23.2 0.32 1.4 2 0.529 23.1
3 0.526 23.0
Sampel
10 mL x 2
1 0.502 21.8
21.8 0.20 0.9 2 0.499 21.6
3 0.505 22.0
20 mL x 1
1 0.491 21.3
21.2 0.06 0.3 2 0.490 21.2
3 0.490 21.2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
Dari tabel V diketahui nilai %CV dari ekstraksi berulang (2x) lebih
besar dari ekstraksi 1x, yang mana seharusnya presisi dari ekstraksi berulang lebih
baik daripada ekstraksi 1x. Penyebab terjadinya hasil tersebut belum diketahui
oleh peneliti.
Menurut Sari (2014), metode spektrofotometri UV kurang tepat
digunakan untuk determinasi alopurinol dalam jamu sehingga digunakan metode
HPLC untuk determinasi alopurinol dalam jamu karena pada metode
spektrofotometri UV kurang sensitif dibandingkan dengan metode HPLC dan
dalam sampel jamu juga terdapat matriks yang kompleks.
2. Optimasi ekstraksi cair-cair tanpa SPE
Untuk mengetahui bagaimana pengaruh proses clean up menggunakan
SPE MCX, maka dilakukan perbandingan kromatogram hasil ekstraksi cair-cair
dengan ekstraksi cair-cair yang dilanjutkan dengan ekstraksi cair padat. Tujuan
dilakukan cara ini adalah untuk mengetahui apakah SPE MCX mampu
mengurangi jumlah senyawa selain analit yang ikut terekstraksi (koekstraktan).
Koekstraktan bisa mengganggu proses determinasi suatu analit, oleh karena itu
sebisa mungkin jumlah koekstraktan dikurangi.
Pada penelitian, sampel diekstraksi cair-cair menggunakan volume
kloroform 3x3 mL, lalu dilakukan penambahan HCl sampai pH menjadi 2.
Sampel disaring menggunakan kertas saring untuk menahan pengotor yang timbul
saat dilakukan penambahan HCl, kemudian sampel disaring dengan milipore dan
diultrasonifikasi 15 menit. Sampel diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik
dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Gambar 11. Kromatogram hasil ekstraksi cair-cair sampel blanko (A) replikasi 1
(B) replikasi 2
hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan
panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).
Hasil kromatogram yang didapatkan ditunjukkan oleh gambar 11.
A
B
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
Dari gambar 11 terlihat bahwa terdapat banyak peak. Alopurinol
memiliki waktu retensi 4,9 menit, tetapi pada gambar tidak terlihat. Oleh karena
itu diperlukan SPE untuk mengurangi jumlah peak matriks dalam sampel jamu
agar peak alopurinol dapat terdeteksi dengan baik.
3. Optimasi isolasi alopurinol dalam jamu asam urat merek X
a. Penyiapan sampel jamu asam urat merek X
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah jamu asam urat
merek “X” yang banyak beredar di pasaran. Analit yang ingin dianalisis adalah
alopurinol yang terdapat dalam jamu asam urat. Pertama-tama menyiapkan 20
bungkus sampel jamu dengan nomor batch yang sama untuk mendapatkan kriteria
homogenitas karena sampel dengan nomor batch yang sama mengalami satu
proses produksi yang sama. Sampel ditimbang satu per satu untuk uji
keseragaman bobot dimana fungsi dari uji keseragaman bobot adalah untuk
memastikan bobot serbuk yang seragam karena dengan seragamnya bobot serbuk
maka dosis yang terkandung juga seragam.
Serbuk jamu diambil kemudian diekstraksi. Sebelum dilakukan
ekstraksi dengan metode ekstraksi cair-cair, serbuk jamu digerus dahulu. Tujuan
dari digerus ini adalah untuk menghomogenkan serbuk jamu karena dalam serbuk
jamu terlihat ada kristal. Setelah serbuk dihomogenkan, serbuk jamu disimpan
dalam wadah yang kering.
b. Optimasi clean up SPE MCX
Pada penelitian ini alopurinol diekstraksi kemudian diasamkan sampai
pH 2 sehingga membentuk ion yang bermuatan positif, karena itu digunakan clean
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
up dengan menggunakan Solid Phase Extraxtion (SPE) Mixed Cation Exchanger
(MCX). Untuk mengetahui sistem yang optimal dari SPE MCX, maka perlu
dilakukan optimasi. Optimasi dilakukan terhadap kapasitas loading ekstrak
sampel pada SPE MCX dan volume eluen yang digunakan untuk mengelusi
alopurinol dari fase diam SPE MCX.
Digunakan SPE MCX karena alopurinol merupakan senyawa basa
yang dapat membentuk ion positif saat ditambahkan senyawa asam berlebih
sehingga alopurinol terprotonasi. Oleh karena itu digunakan SPE MCX karena
spesifik untuk senyawa basa yang memiliki pKa antara 2-10 (nilai pKa alopurinol
9,4) dan kolom SPE MCX memiliki ion negatif (SO3-) sehingga spesifik untuk
menjerap analit yang memiliki ion positif.
Clean up dengan SPE MCX ini dilakukan dengan tujuan untuk
mengurangi senyawa-senyawa selain analit yang ikut terekstraksi (ko-ekstraktan)
selama proses ekstraksi cair-cair. Pentingnya proses clean up dilakukan karena
ko-ekstraktan dapat mengganggu proses determinasi analit, dalam hal ini
alopurinol.
Tahap-tahap yang dilakukan dalam SPE adalah pertama dilakukan
pengkondisian. Pengkondisian kolom ion exchange dilakukan dengan mengaliri
metanol lalu dengan aquabidest (Waters, 2008). Pada penelitian juga dilakukan
pengkondisian dengan mengaliri 1 mL metanol p.a. lalu dengan 1 mL aquabidest.
Tahapan selanjutnya adalah retensi sampel. Ekstrak air dalam HCl 0,1
N sampai pH 2 dilewatkan ke kolom SPE untuk dapat tertahan pada fase diam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
SPE, sementara komponen lain terelusi keluar. Interaksi antara analit dengan fase
diam SPE adalah sebagai berikut:
Gambar 12. Interaksi antara alopurinol dengan fase diam SPE
Dari gambar 12 terlihat bahwa adanya interaksi ionik antara
alopurinol dengan fase diam SPE yang mana nantinya saat dielusi dengan
amonium hidroksida 5% dalam metanol akan terjadi pertukaran ion dimana gugus
+NH3 akan berikatan dengan gugus SO3
- dari fase diam SPE sehingga alopurinol
dapat terelusi keluar.
Berikutnya pencucian kolom SPE, tahap ini penting untuk
menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan oleh fase diam selama
tahap retensi. Proses pencucian kolom SPE ini digunakan asam asetat dan
metanol p.a. untuk menghilangkan pengotor yang tidak tertahan oleh fase diam.
Tahap berikutnya adalah elusi dengan amonium hidroksida 5% dalam
metanol untuk mengambil analit yang tertahan pada fase diam karena alopurinol
dapat larut dalam amonium hidroksida 5% dalam metanol. Amonium hidroksida
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
5% dalam metanol (NH4+) dapat mengelusi alopurinol dari fase diam SPE MCX
karena dilihat dari nilai pKa antara alopurinol dengan ion NH4+, dimana
alopurinol memiliki nilai pKa 9,4 dan ion NH4+ memiliki nilai pKa 8,86 sehingga
ion NH4+ memiliki keasaman yang lebih kuat daripada alopurinol sehingga ion
SO3- dari fase diam SPE MCX akan lebih terikat dengan ion NH4
+ dan alopurinol
terelusi keluar.
Hasil dari elusi SPE kemudian dinjeksikan ke dalam HPLC fase
terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : akuabides/amonium
hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan
panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).
Yang dioptimasi adalah kapasitas kolom dan volume eluen SPE MCX.
1) Optimasi kapasitas kolom SPE MCX
Penentuan kapasitas kolom SPE bertujuan untuk mengetahui
kemampuan kolom SPE dalam menahan sampel dalam jumlah tertentu. Dalam hal
ini bertujuan untuk mencari batasan volume sampel yang boleh dimasukkan ke
dalam kolom SPE agar mampu tertahan di kolom. Penentuan kapasitas kolom ini
dilakukan dengan mengubah volume sampel yang dimasukkan ke dalam kolom
SPE dari 500 μL, 750 μL, dan 1000 μL. Sampel dibilas dengan asam asetat 2%,
dilanjutkan dengan metanol kemudian dielusi dengan amonium hidroksida 5%
dalam metanol sebanyak 10 mL.
Hasil dari elusi SPE kemudian dinjeksikan ke dalam HPLC fase
terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium
hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Tabel VI. Optimasi kapasitas kolom
panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Jika
muncul peak alopurinol (waktu retensi alopurinol sekitar menit 4,9) dalam fraksi
asam asetat maka menunjukkan bahwa kolom SPE tidak bisa menahan sampel.
Gambar 13 merupakan gambar kromatogram fraksi asam asetat hasil
pencucian SPE yang menunjukkan bahwa fraksi asam asetat tersebut tidak dapat
mengelusi analit. Hal ini ditunjukkan dengan tidak munculnya peak alopurinol
pada sekitar menit 4,9 sedangkan peak yang muncul adalah peak pengotor yang
terdeteksi pada menit 5,76. Asam asetat tidak mengelusi alopurinol dari kolom
SPE karena alopurinol lebih terikat pada kolom SPE. Hasil optimasi kapasitas
kolom dapat dilihat pada tabel VI dan gambar 14.
Volume loading ekstrak
+ 156 µg alopurinol
Volume
eluen Replikasi AUC AUC rata-rata
500 µl
10 mL
1 2790210 2802516
2 2814822
750 µl 1 2967215
2968156 2 2969097
1000 µl 1 3416997
3417248 2 3417498
Gambar 13. Kromatogram alopurinol dalam fraksi asam asetat setelah
proses pencucian SPE
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Dari tabel VI dan gambar 14 terlihat bahwa kolom SPE masih mampu
menahan alopurinol dalam ekstrak sampel hingga volume loading 1000 μL
bahkan diduga mampu menahan alopurinol lebih banyak. Hal ini ditunjukkan
dengan masih terjadinya peningkatan AUC seiring dengan meningkatnya
volume loading ekstrak. Perolehan kembali yang didapatkan sebesar 114.1%.
Dalam penelitian ini hanya dilakukan loading ekstrak hingga volume 1000 μL.
Adapun kromatogram hasil optimasi kapasitas kolom SPE adalah sebagai
berikut:
A
Gambar 14. Kurva hubungan volume loading ekstrak VS AUC
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
0 200 400 600 800 1000 1200
AU
C
Volume ekstrak HCl (µL)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
Gambar 15. Kromatogram alopurinol pada optimasi kapasitas kolom SPE MCX
(A) 500 μl (B) 750 μl (C) 1000 μl (D) baku alopurinol dengan fase gerak metanol :
aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90)
Dari hasil kromatogram di atas menunjukkan bahwa puncak
alopurinol sudah tampak dan tidak terganggu oleh matriks sampel. Resolusi antara
puncak alopurinol dengan matriks sampel sudah baik karena nilai resolusinya
lebih dari 1,5. Nilai resolusi dari gambar 15A, 15B, dan 15C berturut-turut adalah
3,2; 3,0; dan 3,1. Hasil resolusi menunjukkan bahwa alopurinol sudah terpisah
dengan baik dari matriks sampel.
B
C
D
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Dari kromatogram di atas juga menunjukkan bahwa eluen amonium
hidroksida 5% dalam metanol dapat mengelusi analit. Hal ini ditunjukkan dengan
munculnya peak pada sekitar menit 4,9 dimana puncak tersebut adalah puncak
alopurinol karena memiliki waktu retensi yang mirip dengan baku alopurinol
(gambar 15D). Amonium hidroksida 5% dalam metanol mampu mengelusi
alopurinol dari fase diam.
2) Optimasi volume eluen SPE MCX
Tujuan dilakukan optimasi volume eluen adalah untuk mendapatkan
berapa volume eluen (amonium hidroksida 5% dalam metanol) yang dibutuhkan
agar semua analit terelusi dari kolom SPE. Dengan mengetahui seberapa jumlah
volume amonium hidroksida 5% dalam metanol yang dibutuhkan maka
diharapkan mampu mengefisienkan penggunaan sejumlah amonium hidroksida
5% dalam metanol sebagai eluen.
Berdasarkan hasil optimasi kapasitas kolom, maka volume loading
ekstrak yang dimasukkan ke dalam kolom SPE adalah sebanyak 1000 µL. Kolom
kemudian dibilas dengan menggunakan asam asetat 2% lalu dilanjutkan dengan
metanol dan dielusi dengan amonium hidrosida 5% dalam metanol sejumlah 5
mL; 7,5 mL; dan 12,5 mL yang dielusi 10 mL dahulu lalu dilanjutkan dengan
elusi 2,5 mL untuk mengetahui apakah masih ada alopurinol yang tertahan di
dalam kolom SPE.
Hasil dari elusi SPE diuapkan seluruhnya lalu dilarutkan kembali
dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam metanol, disaring dengan milipore
dan diultrasonifikasi 15 menit. Kemudian dinjeksikan ke dalam HPLC fase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
terbalik dengan kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium
hidroksida 0,1% (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan
panjang gelombang 274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014).
Hasil optimasi kapasitas kolom dapat dilihat pada tabel VII dan gambar 16.
Dari tabel VII dan gambar 16 terlihat bahwa dengan kenaikan volume
eluen hingga 10 mL masih terjadi kenaikan AUC. Tabel VIII juga menunjukkan
Volume loading ekstrak
+ 156 µg alopurinol
Volume
eluen (mL) Replikasi AUC AUC rata-rata
1000 µl
5 1 3020511
3022990 2 3025468
7.5 1 3392390
3391966 2 3391542
12.5
10 1 3557676
3555910 2 3554143
2.5 1 0
0 2 0
Tabel VII. Optimasi volume eluen
Gambar 16. Kurva hubungan volume eluen VS AUC
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
0 2 4 6 8 10 12
AU
C
Volume eluen (mL)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
bahwa pada penambahan volume 2,5 mL setelah elusi 10 mL tidak terdapat
alopurinol. Perolehan kembali yang didapatkan sebesar 118.1%. Adapun
kromatogram hasil optimasi volume eluen adalah sebagai berikut:
A
B
C1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Gambar 17. Kromatogram alopurinol pada optimasi volume eluen (A) 5 mL (B) 7.5
mL (C) 12.5 mL yang dilakukan dengan mengelusi 10 mL (C1) dan dilanjutkan
dengan elusi 2.5 mL (C2) (D) baku alopurinol dengan fase gerak metanol :
aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90)
Dari hasil kromatogram di atas menunjukkan bahwa resolusi antara
puncak alopurinol dengan matriks sampel sudah baik karena nilai resolusinya
lebih dari 1,5. Nilai resolusi dari gambar 17A, 17B, dan 17C1 berturut-turut
adalah 1,8; 3,2; dan 3,3. Hasil resolusi menunjukkan bahwa alopurinol sudah
terpisah dengan baik dari matriks sampel.
c. Optimasi ekstraksi cair-cair
Metode cair-cair yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstraksi
cair-cair. Ekstraksi cair-cair adalah suatu metode untuk praperlakuan sampel
untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks yang mungkin
mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Selain itu, ekstraksi pelarut
C2
D
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada dalam sampel dengan jumlah
kecil sehingga tidak memungkinkan atau menyulitkan untuk deteksi atau
kuantifikasinya. Sistem partisi yang digunakan untuk pemilihan pelarut adalah
pelarut yang memiliki kelarutan rendah dalam air (<10%) dan dapat menguap
sehingga memudahkan penguapan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi.
Pada penelitian, pertama-tama sampel jamu dilarutkan dahulu dalam
pelarut yang sesuai. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel serbuk
adalah NaOH karena alopurinol mudah larut dalam NaOH. Reaksinya adalah:
Gambar 18. Reaksi pembentukkan garam alopurinol
Setelah terbentuk garam alopurinol, sampel diekstraksi dengan menggunakan
pelarut organik yang tidak melarutkan alopurinol. Menurut Farmakope Indonesia
IV, alopurinol praktis tidak larut dalam kloroform sehingga pelarut yang
digunakan untuk melakukan proses ekstraksi adalah kloroform.
Proses optimasi ekstraksi menggunakan kloroform untuk mengetahui
efisiensi ekstraksi dengan variasi pengulangan ekstraksi 2x3 mL, 3x3 mL, dan
4x3 mL. Pada proses ekstraksi terbentuk 2 fase yaitu fase air yang bersifat alkalis
dan fase organik dimana fase yang diambil adalah fase air yang bersifat alkalis
yang berada di lapisan atas dan fase organiknya dibuang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
Fase air hasil ekstraksi cair-cair yang didapat, ditambahkan HCl
hingga pH menjadi 2 dengan tujuan untuk mengubah analit (alopurinol) menjadi
bentuk ion positif yang dapat dijerap pada fase diam SPE MCX. Berikut reaksi
pembentukkan ion alopurinol:
Gambar 19. Reaksi pembentukkan ion alopurinol
Setelah ditambahkan HCl, timbul endapan lalu disaring dengan kertas saring agar
endapan yang tidak larut dapat tertahan dalam kertas saring. Hasil penyaringan
dilanjutkan proses clean up dengan SPE MCX yang telah teroptimasi.
Adapun hasil kromatogram yang didapat adalah sebagai berikut:
A
B
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Adapun data tR dan AUC dari masing-masing kromatogram ditunjukkan pada
Tabel VIII.
Tujuan ekstraksi cair-cair adalah untuk mengurangi jumlah matriks
pada sampel atau jumlah matriks sesedikit mungkin. Pada hasil yang didapatkan
terlihat bahwa pada volume kloroform yang 2x3 mL masih banyak terdapat peak,
berbeda dengan ekstraksi yang menggunakan volume kloroform 3x3 mL dan 4x3
mL. Pada ekstraksi yang menggunakan volume kloroform 3x3 mL dan 4x3 mL
jumlah peak berkurang.
Volume
Kloroform
tR
(menit) AUC
2 x 3mL
2.695 3808
3.630 2324611
5.524 2867009
6.728 28814
6.822 69803
7.616 8529
3 x 3mL 4.965 3567388
7.147 44048
4 x 3mL 4.964 3558201
7.161 37100
Gambar 20. Kromatogram alopurinol hasil ekstraksi cair-cair dengan variasi
pengulangan penambahan kloroform (A) 2x3 mL (B) 3x3 mL (C) 4x3 mL dengan
fase gerak HPLC metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1% (10:90)
Tabel VIII. Tabel tR dan AUC hasil ekstraksi cair-cair
C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Menurut Gandjar dan Rohman (2010), efisiensi proses ekstraksi
tergantung pada nilai distribusinya dan juga tergantung pada volume relatif kedua
fase. Pada analit dengan nilai distribusi yang kecil, adanya ekstraksi berulang
akan meningkatkan efisiensi ekstraksi yang dapat dihitung dengan rumus:
(Caq)n = Caq[
]
n (3)
Keterangan: (Caq)n = banyaknya analit dalam fase air mula-mula
Caq = banyaknya analit dalam fase air setelah n kali ekstraksi
Vaq = banyaknya volume fase air (fase NaOH)
Vorg = banyaknya volume fase organik (fase CHCl3)
n = banyaknya (frekuensi) ekstraksi
Berdasarkan rumus diatas, semakin banyak dilakukan pengulangan ekstraksi
maka konsentrasi matriks pada fase air akan semakin sedikit. Pada penelitian,
sampel yang digunakan adalah ekstrak air yang mengandung analit dan matriks,
matriks dalam ekstrak air tersebut ingin diambil dengan kloroform. Dengan
semakin banyak pengulangan ekstraksi dengan kloroform, maka konsentrasi
matriks dalam ekstrak air akan semakin sedikit sehingga aman digunakan untuk
ekstraksi alopurinol, hasil ini sesuai dengan persamaan (3).
4. Identifikasi alopurinol dalam sampel jamu dengan menggunakan HPLC
Penetapan kadar alopurinol dalam jamu tidak dapat diukur dengan
menggunakan metode spektrofotometri UV karena metode spektrofotometer UV
kurang sensitif dibandingkan dengan metode HPLC dan dalam sampel jamu juga
terdapat matriks yang kompleks (Sari, 2014). Pada pengukuran dengan
menggunakan metode HPLC diperlukan ekstrak sampel yang bersih dari matriks
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Blanko
sampel agar tidak mengganggu pengukuran, oleh karena itu diperlukan clean up
sampel dengan menggunakan Solid Phase Extraction (SPE).
Pada penelitian ini dilakukan identifikasi alopurinol untuk mengetahui
apakah dalam sampel jamu terdapat alopurinol atau tidak. Identifikasi alopurinol
dalam sampel jamu pada penelitian ini dilakukan dengan menambahkan massa
alopurinol sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng yang bertujuan untuk
menentukkan puncak blanko dan sampel yang telah ditambahkan dengan baku
alopurinol yang dibandingkan dengan puncak baku alopurinol. Hal tersebut
ditunjukkan pada gambar 21.
A
B1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Dari gambar 21 terlihat bentuk puncak, waktu retensi, dan kenaikan
AUC yang mirip pada puncak yang diduga alopurinol sehingga diketahui bahwa
puncak tersebut adalah puncak alopurinol. Dari hasil penambahan baku alopurinol
ke dalam sampel, dibandingkan juga nilai AUC antara blanko dengan sampel
adisi. Pada tabel VI, blanko sampel terdapat alopurinol sehingga diketahui nilai
AUC blanko dan pada sampel adisi terjadi peningkatan AUC dengan jumlah yang
sesuai pada standar adisi alopurinol yang ditambahkan. Tabel perbandingan waktu
retensi dan AUC, tertera pada tabel IX.
Dari waktu retensi yang dibandingkan antara blanko dan sampel
dengan adisi (tabel IX) diketahui bahwa pada blanko ditemukan alopurinol karena
tR
(menit) AUC
Blanko 4,895 17983
Sampel adisi 5 µg/mL 4,968 272522
Sampel adisi 15 µg/mL 4,995 1595477
Sampel adisi 30 µg/mL 4,997 3564357
Tabel IX. Perbandingan tR dan AUC blanko dan sampel adisi
B2
Gambar 21. Perbandingan puncak (A) puncak baku alopurinol (B1 dan B2) puncak blanko
dan sampel alopurinol yang sudah ditambahkan dengan baku alopurinol dalam 3 level
konsentrasi
Adisi 156 ng
Adisi 103 ng
Adisi 51 ng
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
muncul puncak pada waktu retensi sekitar 4.8 menit, sedangkan pada sampel
dengan adisi memiliki waktu retensi yang hampir sama dimana berkisar antara
4.968-4.997 menit. Pergeseran waktu retensi ini terjadi akibat dari pengaruh
matriks yang terdapat pada sampel (Snyder, Kirkland, and Dolan, 2010).
Seharusnya pada blanko sampel tidak terdapat alopurinol, tetapi dari
hasil penelitian menunjukkan bahwa pada blanko sampel jamu asam urat merek X
muncul puncak yang mirip dengan puncak baku alopurinol. Sehingga dapat
disimpulkan bahwa pada jamu asam urat merek X mengandung BKO yaitu
alopurinol yang seharusnya tidak boleh ada BKO dalam jamu menurut Keputusan
Kepala Badan POM No. HK.00.05.41.1384 tahun 2005.
5. Validasi metode clean up SPE MCX
Validasi metode analisis merupakan suatu prosedur penjaminan
bahwa metode analisis yang digunakan dapat diterima dan terpercaya sehingga
dapat digunakan untuk tujuan analisis tertentu. Pada penelitian ini, proses validasi
yang dilakukan adalah dengan menambahkan baku alopurinol ke dalam sampel
(standar adisi). Fungsi penambahan baku alopurinol di sini adalah untuk
mengetahui jumlah analit dalam matriks sampel karena dalam matriks sampel
terdapat berbagai macam senyawa yang tidak diketahui secara pasti sehingga
tidak dapat ditetapkan secara langsung.
Parameter validasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah akurasi
dan presisi. Akurasi merupakan suatu parameter validasi metode analisis yang
menyatakan kaitan antara kedekatan suatu data yang diperoleh melalui penelitian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
yang dilakukan dengan data sebenarnya (data teoritis) (Ahuja and Rasmussen,
2007).
Parameter akurasi pada penelitian ini dilihat dari nilai % perolehan
kembali sampel yang ditambahkan dengan baku alopurinol lalu dibandingkan
dengan kadar sebenarnya yang diperoleh dari hasil penelitian. Presisi merupakan
parameter validasi yang menerangkan kedekatan antara suatu hasil yang didapat
dalam beberapa kali seri pengukuran dalam satu sampel homogen (Ahuja and
Rasmussen, 2007).
Validasi metode pada penelitian ini dilakukan dengan menambahkan
massa alopurinol sebanyak 51 ng, 103 ng, dan 156 ng dengan masing-masing
direplikasi 5 kali. Nilai AUC yang diperoleh kemudian dihitung dengan
persamaan regresi linier kurva baku y = 43683,7x – 470009,5 (Dewi, 2014). Hasil
perhitungan perolehan kembali dapat dilihat pada tabel X.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Replikasi
Jumlah loading
alopurinol
dalam ekstrak
sampel (ng)
AUC
Bobot
alopurinol
(ng)
%
Recovery
Rata-rata
%
Recovery
SD %
CV
1
-
17983 11.17
- - - -
2 18710 11.19
3 18677 11.19
4 - 10.76
5 - 10.76
Rata-rata 11.01
1
11.5
274265 17.04 52.39
51.93 0.57 1.09
2 272643 17.00 52.07
3 272522 17.00 52.04
4 266917 16.87 50.93
5 272972 17.01 52.13
1
51.5
1585120 47.05 69.97
70.31 0.19 0.28
2 1594483 47.26 70.38
3 1595477 47.28 70.43
4 1595455 47.28 70.43
5 1593767 47.24 70.35
1
81.9
3566872 92.41 99.39
99.36 0.07 0.07
2 3562306 92.31 99.26
3 3564357 92.35 99.32
4 3567888 92.43 99.42
5 3568361 92.45 99.43
Tabel X. Hasil perolehan kembali dan CV
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
Menurut Gonzalez dan Herrador tahun 2007, % recovery untuk
konsentrasi 100 ppb adalah 80% – 110%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa
pada level konsentrasi tinggi memenuhi persyaratan dan pada level konsentrasi
rendah dan sedang tidak memenuhi persyaratan karena pada konsentrasi yang
kecil lebih sulit mendapatkan nilai perolehan kembali daripada konsentrasi analit
yang lebih besar.
Tabel XI. Perolehan kembali yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi
analit menurut Gonzales & Herrador (2007)
Tabel XII. CV yang dapat diterima pada beberapa tingkat konsentrasi analit
berdasarkan AOAC PVM (cit., Gonzales & Herrador, 2007)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Menurut AOAC PVM (Peer Verified Method) untuk konsentrasi 100
ppb adalah 15%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai CV yang diperoleh
memenuhi persyaratan pada semua level konsentrasi.
Hasil perolehan kembali yang didapatkan dengan metode SPE MCX
rendah kemungkinan disebabkan karena kemungkinan kekuatan interaksi antara
alopurinol dengan fase diam SPE MCX yang terlalu kuat atau terlalu lemah. Jika
interaksi alopurinol dengan fase diam SPE MCX kuat, menyebabkan tidak semua
alopurinol dapat keluar atau terelusi dari fase diam SPE MCX, sedangkan jika
interaksi antara alopurinol dengan fase diam SPE MCX lemah, dapat
menyebabkan alopurinol keluar saat proses loading ekstrak yang tidak terdeteksi
pada HPLC. Kemungkinan lain yang menyebabkan hasil perolehan kembali
rendah adalah pengaruh matriks dari sampel jamu yang menutupi sisi aktif fase
diam SPE MCX sehingga alopurinol tidak terikat dengan sisi aktif fase diam SPE
MCX dan keluar dari kolom saat proses loading ekstrak.
6. Penggunaan kembali SPE MCX
Tujuan dilakukan pencucian SPE MCX yang digunakan adalah untuk
mengetahui apakah SPE MCX yang digunakan dapat dipakai berulang kali atau
hanya satu kali pakai saja. Apabila SPE dapat digunakan berulang kali, maka
diharapkan mampu mengefisienkan penggunaan jumlah SPE yang digunakan
untuk clean up.
SPE yang telah digunakan dikondisikan dengan dialiri metanol p.a.
dan aquabidest. Ditambah NaOH 0,1 N untuk mengeluarkan pengotor-pengotor
yang masih terikat pada fase diam, dilanjutkan dengan penambahan HCl 0,1 N
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
untuk mengikat NaOH yang masih ada pada fase diam dengan membentuk garam
yang larut dalam air. Kolom SPE dibilas dengan aquabidest untuk menghilangkan
garam yang terbentuk dan dialiri metanol p.a. agar mikroba tidak dapat tumbuh
pada fase diam serta menjaga kondisi fase diam agar tetap baik.
SPE bekas yang telah dicuci, diuji apakah masih dapat digunakan atau
tidak. SPE dikondisikan dengan mengaliri metanol p.a. dan aquabidest. Loading
sampel menggunakan baku alopurinol dengan konsentrasi 30 µg/mL sebanyak
1000 µL. Kolom SPE dicuci dengan mengaliri asam asetat 2% dan metanol lalu
dielusi dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol.
Hasil elusi SPE dinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan
kolom C18, komposisi fase gerak metanol : aquabidest/amonium hidroksida 0,1%
(10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit, detektor UV dengan panjang gelombang
274 nm dan volume injeksi sebanyak 20 μL (Sari, 2014). Kromatogram alopurinol
hasil clean up ditunjukkan oleh gambar 22.
A
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Gambar 22 menunjukkan bahwa pada kromatogram eluat hasil clean
up dengan menggunakan SPE bekas yang telah dicuci dengan 3x siklus pencucian
terdapat peak alopurinol, sedangkan SPE bekas yang hanya dicuci 1x dan 2x
siklus pencucian tidak terdapat peak alopurinol. Hal ini kemungkinan karena pada
pencucian dengan 1x dan 2x siklus, fase diam masih kotor sehingga alopurinol
tidak terikat pada fase diam dan langsung keluar dari SPE pada tahap loading dan
pencucian dengan asam asetat serta metanol p.a, sehingga pada saat elusi dengan
amonium hidroksida 5% dalam metanol sudah tidak ada lagi alopurinol dalam
fraksi ini.
Gambar 22. Kromatogram alopurinol hasil clean up dengan menggunakan SPE bekas
yang sudah diuji (A) 1x (B) 2x (C) 3x dengan fase gerak metanol : aquabidest/amonium
hidroksida 0,1% (10:90)
B
C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Pada SPE bekas yang sudah dicuci dengan 3x siklus pencucian
muncul peak alopurinol, hal ini disebabkan karena pengotor yang terdapat pada
fase diam telah hilang sehingga alopurinol dapat terikat pada fase diam dan saat
elusi dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol alopurinol ikut terelusi
keluar.
Pada gambar 22 terlihat bahwa pada pencucian 1x, 2x, dan 3x selalu
muncul peak pada sekitar waktu 6,7 menit. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan
bahwa metode pencucian hanya mampu mengelusi alopurinol dari fase diam SPE
tapi tidak mampu mengelusi pengotor dari fase diam. Oleh karena itu, peneliti
merekomendasikan untuk menggunakan SPE satu kali pakai saja.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Optimasi isolasi alopurinol dari tablet dan jamu asam urat adalah sebagai
berikut: volume penyaringan dengan ekstraksi 1x (20 mL) dapat memberikan
presisi yang baik. Volume kloroform pada ekstraksi cair-cair yang baik untuk
memisahkan analit dari matriks adalah 3x3 mL, pada SPE MCX volume loading
sampel 1000 µl dan volume eluen amonium hidroksida 5% dalam metanol 10 mL
merupakan metode optimum untuk ekstraksi dan clean up sampel jamu
B. Saran
Perlu dilakukan otomatisasi untuk mengurangi human error (kesalahan
peneliti) pada penelitian.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
DAFTAR PUSTAKA
Ahuja, S. dan Rasmussen, H., 2007, HPLC Method Developments for
Pharmaceutical, Elsevier Academic Press, Italy, pp.14,15,472.
Anonima, 2013, Allopurinol, http://www.chemicalize.org/structure/#!mol=allopuri
nol&source=fp, diakses tanggal 25 November 2013.
Anonimb, 2014, Traditional Medicine, http://www.who.int/topics/traditional_medi
cine/en/, diakses tanggal 8 April 2014.
Apotex NZ Ltd, 2011, APO-Allopurinol, Apotex NZ Ltd, New Zealand.
DechaCare, 2014, Allopurinol, http://www.dechacare.com/Allopurinol-
P630.htmL, diakses tanggal 8 April 2014.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1979, Farmakope Indonesia, jilid III,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 73, 299, 1010.
Dewi, R.K., 2014, Validasi Metode Analisis Alopurinol Dalam Tablet Secara
Spektrofotometri Dan Jamu Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase
Terbalik Serta Aplikasinya, Skripsi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986, Sediaan Galenik,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26.
Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2010, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta, hal. 53-55, 137, 379-400.
Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan¸ ITB, Bandung, hal. 7-8
Harmita, 2006, Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi,
Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia, Depok, pp. 157-165.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Harvey, D., 2000, Modern Analytical Chemistry, McGraw Hill Companies, USA,
pp. 578-586.
Jenkins, G.L., 1967, Quantitative Chemical Analysis 2nd
, W.H. Freeman and
Company, New York.
Johnson, E.L., Stevenson,R., 1978, Basic Liquid Chromatography, diterjemahkan
oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp. 22-24, 99.
Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No 661/MENKES/SK/
VII/1994, Tentang Persyaratan Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI,
Jakarta.
Lennan, A.G.M., 2010, Practical Biochemistry for Medical Student, Rapid
analytical techniques for diagnosing and managing diabetes: Theory,
http://www.liv.ac.uk/~agmclen/Medpracs/practical_4/theory_4.htmL, diakses
tanggal 25 November 2013.
Martindale, 1999, The Complete Drug Reference, Pharmaceutical Press, USA, pp.
390-392.
Mayasari, 2009, Analisis Kandungan Metampiron di Kota Medan Tahun 2009,
Skripsi, Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Sumatra Utara.
Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,
Surabaya, hal. 26.
Mursyidi, A. dan Rohman, A., 2008, Pengantar Kimia Analisis Farmasi
Volumetri dan Gravimetri, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, hal
108-109.
Pengawas Obat dan Makanan (POM), 2004, Tentang Ketentuan Pokok
Pengelompokan dan Penandaan Obat Bahan Alam Indonesia, Departemen
Kesehatan RI, Jakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
Pengawas Obat dan Makanan (POM), 2005, Kriteria dan Tata Laksana
Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan Fitofarmaka,
Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 003 Tahun 2010, Tentang
Saintifikasi Jamu Dalam Penelitian Berbasis Pelayanan Kesehatan,
Departemen Kesehatan RI, Jakarta
Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 007 tahun 2012, Tentang
Registrasi Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI, Jakarta
Refat, M.S., Mohamed, G.G., and Fathi, A., 2010, Spectrophotometric
Determination of Allopurinol Drug in Tablets: Spectroscopic
Characterization of the Solid CT Complexes, Bull Korean Chem Soc, 31(6),
1535-1542.
Rouessac F. dan Rouessac A., 2007, Chemical Analysis Modern Instrumentation
Methods and Techniques, 2nd
ed, John Wiley & Sons, Canada, pp. 18
Sari, M.K., 2014, Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Alopurinol Dalam
Matriks Tablet Obat Secara Spektrofotometri UV dan Matriks Sampel Jamu
Asam Urat Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Skripsi, Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
Sastrohamidjojo, 2001, Dasar-Dasar Spektroskopi, Cetakan II, Penerbit Liberty,
Yogyakarta, pp. 22-23.
Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., 1994, Analytical Chemistry, Sixth edition,
Saunders College Publishing, USA, pp. 383.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Dolan, J.W., 2010, Introduction of Modern Liquid
Chromatography, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. Xl.
25, 28, 33, 40-42, 51-52, 71, 109, 151-152, 316, 327, 331.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
Suhendi, A., Nurcahyanti, Muhtadi, Sutrisna EM., 2011, Aktivitas
Antihiperurisemia Ekstrak Air Jinten Hitam (Coleus ambonicus Lour) Pada
Mencit Jantan Galur Balb-C dan Standarisasinya, Majalah Farmasi
Indonesia 22(2), 78.
Sweetman L. and Nyhan W.L., 1969, Quantitation Of Oxypurines & Alopurinol
Metabolites In Biological Fluids By Cation Exchange Chromatography,
University of Miami School of Medicine.
Waters, 2008, OASIS SAMPLE PREPARATION, Waters Corporation, USA, pp. 7.
Yee, S.K., 2003, Regulatory Control Of Chinese Propretary Medicines in
Singapore, J.Healthy Policy, 15(2) pp. 71, 133-149.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
Lampiran 1. Sertifikat analisis baku alopurinol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
Lampiran 2. Sertifikat analisis SPE MCX
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Lampiran 3. Penimbangan keseragaman bobot tablet alopurinol
No. Bobot tablet (mg) No. Bobot tablet (mg)
1. 307,9 11. 307,1
2. 310,1 12. 303,9
3. 311,4 13. 305,9
4. 306,4 14. 310,0
5. 307,5 15. 302,0
6. 305,6 16. 302,0
7. 306,0 17. 302,7
8. 309,2 18. 304,1
9. 305,6 19. 303.2
10. 304,4 20. 304,8
= 6119.8 SD = 2,74
= 306 CV = 0,9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Lampiran 4. Penimbangan sampel A tiap kemasan untuk perhitungan
keseragaman bobot
No. Bobot Sampel
Terukur (g)
Bobot Sampel Pada
Kemasan (g)
Selisih Bobot
Sampel (g)
1. 7.1548 7 0.1548
2. 7.0398 7 0.0398
3. 7.1258 7 0.1258
4. 7.2351 7 0.2351
5. 7.1984 7 0.1984
6. 6.9781 7 0.0219
7. 7.0983 7 0.0983
8. 7.1763 7 0.1763
9. 7.2063 7 0.2063
10. 6.9857 7 0.0143
11. 7.1049 7 0.1049
12. 6.9143 7 0.0857
13. 7.0936 7 0.0936
14. 7.0143 7 0.0143
15. 7.1254 7 0.1254
16. 7.0989 7 0.0989
17. 7.1259 7 0.1259
18. 6.9897 7 0.0103
19. 7.1560 7 0.1560
20. 7.1589 7 0.1589
7.0990 7 0.1122
SD = 0.0865
CV = 1.2184%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Lampiran 5. Penimbangan sampel B tiap kemasan untuk perhitungan
keseragaman bobot
No. Bobot Sampel
Terukur (g)
Bobot Sampel Pada
Kemasan (g)
Selisih Bobot
Sampel (g)
1. 7.1125 7 0.1125
2. 6.9402 7 0.0598
3. 7.1235 7 0.1235
4. 7.1987 7 0.1987
5. 6.9817 7 0.0183
6. 7.1994 7 0.1994
7. 7.0329 7 0.0329
8. 7.0104 7 0.0104
9. 6.9307 7 0.0693
10. 7.0129 7 0.0129
11. 7.0187 7 0.0187
12. 7.0998 7 0.0998
13. 7.0178 7 0.0178
14. 6.9109 7 0.0891
15. 7.1368 7 0.1368
16. 7.0954 7 0.0954
17. 7.1336 7 0.1336
18. 7.1824 7 0.1824
19. 6.9749 7 0.0251
20. 7.1992 7 0.1992
7.0656 7 0.0917
SD = 0.0942
CV = 1.3332%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
Lampiran 6. Penimbangan sampel C tiap kemasan untuk perhitungan
keseragaman bobot
No. Bobot Sampel
Terukur (g)
Bobot Sampel Pada
Kemasan (g)
Selisih Bobot
Sampel (g)
1. 7.1874 7 0.1874
2. 7.0298 7 0.0298
3. 7.1477 7 0.1477
4. 7.1939 7 0.1939
5. 6.9912 7 0.0088
6. 7.1478 7 0.1478
7. 6.9069 7 0.0931
8. 7.0495 7 0.0495
9. 7.1556 7 0.1556
10. 7.0474 7 0.0474
11. 7.1593 7 0.1593
12. 7.0814 7 0.0814
13. 6.9743 7 0.0257
14. 7.1141 7 0.1141
15. 7.1355 7 0.1355
16. 7.1302 7 0.1302
17. 7.1007 7 0.1007
18. 6.9148 7 0.0852
19. 7.0832 7 0.0832
20. 7.1959 7 0.1959
7.0873 7 0.1086
SD = 0.0876
CV = 1.2360%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Lampiran 7. Penimbangan kalium biftalat
Penimbangan Kalium biftalat (g)
Berat kertas 0.4374
Berat kertas + zat 0.8375
Berat kertas + sisa 0.4377
Berat zat 0.3998
Lampiran 8. Standarisasi NaOH 0.1 N
Diketahui: bobot kalium biftalat : 0.3998 g = 399.8 mg
BM kalium biftalat : 204.2
Valensi kalium biftalat : 1
Volume NaOH : 21.35 mL
Rumus: N NaOH =
=
= 0.0917 N
Lampiran 9. Gambar hasil pembakuan NaOH 0.1 N
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Lampiran 10. Perhitungan penimbangan sampel tablet alopurinol
Diketahui : Bobot rata-rata 20 tablet = 306 mg
Dosis obat = 100 mg
Penimbangan alopurinol setara 25 mg
Cara perhitungan:
= 77 mg
Lampiran 11. Penimbangan optimasi penyaringan
1. Baku untuk volume 10 mL x 2
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Berat kertas 0.3945 0.4011 0.3998
Berat kertas + zat 0.4451 0.4514 0.4502
Berat kertas + sisa 0.3949 0.4016 0.4003
Berat zat 0.0502 0.0498 0.0499
2. Baku untuk volume 20 mL x 1
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Berat kertas 0.4128 0.4229 0.4173
Berat kertas + zat 0.4630 0.4733 0.4675
Berat kertas + sisa 0.4132 0.4232 0.4176
Berat zat 0.0498 0.0501 0.0499
3. Sampel untuk volume 10 mL x 2
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Berat kertas 0.4211 0.4321 0.4403
Berat kertas + zat 0.4978 0.5089 0.5169
Berat kertas + sisa 0.4215 0.4324 0.4405
Berat zat 0.0763 0.0765 0.0764
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
4. Sampel untuk volume 20 mL x 1
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Berat kertas 0.4322 0.4215 0.4347
Berat kertas + zat 0.5091 0.4981 0.5114
Berat kertas + sisa 0.4326 0.4217 0.4349
Berat zat 0.0765 0.0764 0.0765
Lampiran 12. Bobot alopurinol, SD dan %CV
Cara
Penyaringan Replikasi Absorbansi
Bobot
Alopurinol (mg)
Rata-
rata SD % CV
Baku
10 mL x 2
1 0.545 23.8
24.4 0.60 2.4 2 0.555 24.3
3 0.569 25.0
20 mL x 1
1 0.540 23.6
23.2 0.32 1.4 2 0.529 23.1
3 0.526 23.0
Sampel
10 mL x 2
1 0.502 21.8
21.8 0.20 0.9 2 0.499 21.6
3 0.505 22.0
20 mL x 1
1 0.491 21.3
21.2 0.06 0.3 2 0.490 21.2
3 0.490 21.2
Lampiran 13. Penimbangan sampel tanpa SPE
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2891 0.2825
Berat kertas + zat 0.7896 0.7835
Berat kertas + sisa 0.2893 0.2831
Berat zat 0.5003 0.5004
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
Lampiran 14. Kromatogram sampel tanpa SPE
1. Replikasi 1
2. Replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
Lampiran 15. Penimbangan optimasi kapasitas kolom SPE
1. Kapasitas kolom 500 µl
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2713 0.2537
Berat kertas + zat 0.7725 0.7547
Berat kertas + sisa 0.2718 0.2543
Berat zat 0.5007 0.5004
2. Kapasitas kolom 750 µl
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2681 0.2782
Berat kertas + zat 0.7689 0.7791
Berat kertas + sisa 0.2684 0.2787
Berat zat 0.5005 0.5004
3. Kapasitas kolom 1000 µl
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2655 0.2893
Berat kertas + zat 0.7662 0.7899
Berat kertas + sisa 0.2658 0.2896
Berat zat 0.5004 0.5003
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
Lampiran 16. Kromatogram optimasi kapasitas kolom SPE
1. Fraksi asam asetat pada 500 μL sampel replikasi 1
2. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 500 μL sampel replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
3. Fraksi asam asetat pada 500 μL sampel replikasi 2
4. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 500 μL sampel replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
5. Fraksi asam asetat pada 750 μL sampel replikasi 1
6. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 750 μL sampel replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
7. Fraksi asam asetat pada 750 μL sampel replikasi 2
8. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 750 μL sampel replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
9. Fraksi asam asetat pada 1000 μL sampel replikasi 1
10. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 1000 μL sampel replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
11. Fraksi asam asetat pada 1000 μL sampel replikasi 2
12. Fraksi amonia 5% dalam metanol pada 1000 μL sampel replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
Lampiran 17. Tabel optimasi kapasitas kolom SPE
Volume loading ekstrak
+ 156 µg alopurinol
Volume
eluen Replikasi AUC AUC rata-rata
500 µl
10 mL
1 2790210 2802516
2 2814822
750 µl 1 2967215
2968156 2 2969097
1000 µl 1 3416997
3417248 2 3417498
Lampiran 18. Penimbangan optimasi volume eluen SPE
1. Volume eluen 5 mL
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2643 0.2752
Berat kertas + zat 0.7651 0.7759
Berat kertas + sisa 0.2646 0.2755
Berat zat 0.5005 0.5004
2. Volume eluen 7.5 mL
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2786 0.2714
Berat kertas + zat 0.7792 0.7719
Berat kertas + sisa 0.2788 0.2716
Berat zat 0.5004 0.5003
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
3. Volume eluen 12.5 mL
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2739 0.2817
Berat kertas + zat 0.7745 0.7826
Berat kertas + sisa 0.2741 0.2822
Berat zat 0.5004 0.5004
Lampiran 19. Kromatogram optimasi volume eluen SPE
1. Volume eluen 5 mL amonia 5% dalam metanol
a. Replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
102
b. Replikasi 2
2. Volume eluen 7,5 mL amonia 5% dalam metanol
a. Replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
103
b. Replikasi 2
3. Volume eluen 12.5 mL amonia 5% dalam metanol
a. Replikasi 1 (10 mL)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
104
b. Replikasi 1 (2.5 mL)
c. Replikasi 2 (10 mL)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
105
d. Replikasi 2 (2.5 mL)
Lampiran 20. Tabel optimasi volume eluen SPE
Volume loading ekstrak
+ 156 µg alopurinol
Volume
eluen (mL) Replikasi AUC AUC rata-rata
1000 µl
5 1 3020511
3022990 2 3025468
7.5 1 3392390
3391966 2 3391542
12.5
10 1 3557676
3555910 2 3554143
2.5 1 0
0 2 0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
106
Lampiran 21. Penimbangan optimasi volume kloroform
1. Sampel 2 x 3 mL
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2874 0.2983
Berat kertas + zat 0.7886 0.7989
Berat kertas + sisa 0.2879 0.2985
Berat zat 0.5007 0.5004
2. Sampel 3 x 3 mL
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2637 0.2589
Berat kertas + zat 0.7654 0.7595
Berat kertas + sisa 0.2645 0.2593
Berat zat 0.5009 0.5002
3. Sampel 4 x 3 mL
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g)
Berat kertas 0.2766 0.2541
Berat kertas + zat 0.7771 0.7548
Berat kertas + sisa 0.2769 0.2545
Berat zat 0.5002 0.5003
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
107
Lampiran 22. Kromatogram optimasi volume kloroform
1. Kloroform 2 x 3 mL
a. Replikasi 1
b. Replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
108
2. Kloroform 3 x 3 mL
a. Replikasi 1
b. Replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
109
3. Kloroform 4 x 3 mL
a. Replikasi 1
b. Replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
110
Lampiran 23. Penimbangan baku untuk validasi SPE
Penimbangan
Rep
lik
asi
1
(g)
Rep
lik
asi
2
(g)
Rep
lik
asi
3
(g)
Rep
lik
asi
4
(g)
Rep
lik
asi
5
(g)
Berat kertas 0.2874 0.2769 0.2813 0.2798 0.2886
Berat kertas + zat 0.3124 0.3019 0.3063 0.3048 0.3136
Berat kertas + sisa 0.2874 0.2769 0.2813 0.2798 0.2886
Berat zat 0.0250 0.0250 0.0250 0.0250 0.0250
Lampiran 24. Penimbangan sampel untuk validasi SPE
Penimbangan
Rep
lik
asi
1
(g)
Rep
lik
asi
2
(g)
Rep
lik
asi
3
(g)
Rep
lik
asi
4
(g)
Rep
lik
asi
5
(g)
Berat kertas 0.2938 0.2897 0.2911 0.2931 0.2908
Berat kertas + zat 0.7945 0.7904 0.7919 0.7939 0.7915
Berat kertas + sisa 0.2941 0.2899 0.2916 0.2934 0.2912
Berat zat 0.5004 0.5005 0.5003 0.5005 0.5003
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
111
Lampiran 25. Kromatogram validasi SPE
1. Konsentrasi 5 ppm replikasi 1
2. Konsentrasi 5 ppm replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
112
3. Konsentrasi 5 ppm replikasi 3
4. Konsentrasi 5 ppm replikasi 4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
113
5. Konsentrasi 5 ppm replikasi 5
6. Konsentrasi 15 ppm replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
114
7. Konsentrasi 15 ppm replikasi 2
8. Konsentrasi 15 ppm replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
115
9. Konsentrasi 15 ppm replikasi 4
10. Konsentrasi 15 ppm replikasi 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
116
11. Konsentrasi 30 ppm replikasi 1
12. Konsentrasi 30 ppm replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
117
13. Konsentrasi 30 ppm replikasi 3
14. Konsentrasi 30 ppm replikasi 4
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
118
15. Konsentrasi 30 ppm replikasi 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
119
Lampiran 26. Hasil recovery dan % CV validasi SPE
Replikasi
Jumlah loading
alopurinol
dalam ekstrak
sampel (ng)
AUC
Bobot
alopurinol
(ng)
%
Recovery
Rata-rata
%
Recovery
SD %
CV
1
-
17983 11.17
- - - -
2 18710 11.19
3 18677 11.19
4 - 10.76
5 - 10.76
Rata-rata 11.01
1
11.5
274265 17.04 52.39
51.91 0.57 1.09
2 272643 17.00 52.07
3 272522 17.00 52.04
4 266917 16.87 50.93
5 272972 17.01 52.13
1
51.5
1585120 47.05 69.97
70.31 0.19 0.28
2 1594483 47.26 70.38
3 1595477 47.28 70.43
4 1595455 47.28 70.43
5 1593767 47.24 70.35
1
81.9
3566872 92.41 99.39
99.36 0.07 0.07
2 3562306 92.31 99.26
3 3564357 92.35 99.32
4 3567888 92.43 99.42
5 3568361 92.45 99.43
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
120
Lampiran 27. Penimbangan baku untuk pencucian SPE
Penimbangan Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)
Berat kertas 0.2741 0.2822 0.2796
Berat kertas + zat 0.2993 0.3075 0.3049
Berat kertas + sisa 0.2743 0.2825 0.2799
Berat zat 0.0250 0.0250 0.0250
Lampiran 28. Kromatogram hasil pencucian SPE
1. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 1 elusi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
121
2. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 1 elusi 2
3. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 2 elusi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
122
4. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 2 elusi 2
5. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 3 elusi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
123
6. Fraksi amonia 5% dalam metanol pencucian 3 elusi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
124
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi berjudul Optimasi Isolasi Alopurinol
Dalam Sediaan Tablet dan Jamu memiliki nama lengkap
Sugiarto Adji Soenarso. Penulis dilahirkan di Jakarta
pada tanggal 20 Februari 1992 sebagai anak pertama
dari dua bersaudara, dari pasangan Paulus Heru Adji
Soenarso dan Lucia Leni. Pendidikan formal yang
pernah ditempuh penulis adalah menyelesaikan
pendidikannya di SDK Triana II Bekasi (1998-2004),
SMP Marsudirini Marganingsih Muntilan (2004-2007),
SMA Marsudirini Muntilan (2007-2010). Penulis
melanjutkan pendidikannya di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2010. Selama menempuh
pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma penulis aktif dalam
berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas
(BEMF) Farmasi sebagai koordinator divisi Teknologi Informasi (TI) tahun 2011-
2012, Ketua Expo Paingan Festival 2011, Pelepasan Wisuda sebagai seksi
dokumentasi tahun 2011 dan ketua panitia tahun 2013, Panitia Seminar Nasional
sebagai koordinator seksi perlengkapan tahun 2011, Panitia Photo Exhibition
sebagai seksi perlengkapan tahun 2010. Di bidang non akademik, penulis pernah
mengikuti perlombaan basket. Di bidang akademik, penulis pernah menjadi
asisten dosen praktikum Kimia Analisis (2013 dan 2014), Analisis Farmasi
(2014), Validasi Metode Analisis (2014), dan Pharmaceutical Analysis (2014).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI