plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · sodium phenobarbital in pulveresform for...

OPTIMASI PEMISAHAN DAN PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL DAN NATRIUM FENOBARBITAL DENGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Marischa Novita Lissanta

NIM : 048114044

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii



SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :


NIM : 048114044

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008


iii

Skripsi berjudul

PEMISAHAN DAN PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL

DAN NATRIUM FENOBARBITAL DENGAN METODE KROMATOGRAFI

CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

Oleh :


NIM : 048114044

Telah disetujui oleh :

Pembimbing

Christine Patramurti, S.Si., Apt., M.Si. Tanggal 30 Mei 2008


iv


v

Untuk yang terCINTA…

Keluargaku karena cinta dan dukungan kalian yang begitu besar

Sahabat-sahabatku, yang

membuat hidupku lebih berarti

Almamaterku


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Marischa Novita Lissanta

Nomor Mahasiswa : 048114044

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:

“OPTIMASI PEMISAHAN DAN PENETAPAN KADAR CAMPURAN PARASETAMOL DAN NATRIUM FENOBARBITAL DENGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK”

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,

mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media

lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun

memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya:

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal 24 April 2008

Yang menyatakan



vii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Bapa YAHWEH di Sorga, karena

hanya karena hikmat, kekuatan, mukjizat serta penyertaanNYA maka skripsi yang

berjudul ”Optimasi Pemisahan dan Penetapan Kadar Campuran Parasetamol dan

Natrium Fenobarbital dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase

Terbalik” ini dapat diselesaikan oleh penulis. Skripsi ini disusun untuk memenuhi

salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Selama penyusunan skripsi ini, banyak pihak yang telah begitu luar

biasanya membantu penulis, maka pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima

kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Ibu Rita Suhadi M,Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta dan ketua penelitian payung yang penulis ikuti. Terima

kasih banyak atas bantuan dan semangatnya.

2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku pembimbing yang telah begitu sabar

membimbing penulis, memberikan masukan, arahan, kritikan dan dukungan

selama penyusunan skripsi ini.

3. Bapak Drs. Sulasmono, Apt. dan Ibu Lucia Wiwid Wijayanti, M.Si. selaku dosen

penguji yang telah banyak memberikan kritik dan saran untuk skripsi ini.


viii

4. Papa dan Mamaku yang telah luar biasa memberi dukungan moral dan material,

kasih sayang, doa, dukungan dan semua yang penulis butuhkan. Tanpa kalian,

Novi tidak akan jadi seperti ini.

5. Bapak Yohanes Dwiatmaka, S.Si., M.Si. yang telah membantu penulis

membelikan alat yang pecah.

6. Seluruh staf laboratorium di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta : Pak Mukmin, Pak Prapto, Pak Parlan, Mas Sarwanto, Mas Kunto,

Mas Otok, Mas Heru yang telah banyak membantu penulis selama penelitian di

laboratorium dan mendukung kelancarannya.

7. Ai, ishakku, yang telah begitu banyak memberikan kasih sayang, perhatian,

dukungan yang luar biasa, semangat, doa, berkat, nasehat, kritik sebelum, selama

dan sesudah penyusunan skripsi ini (IDLU4E!)

8. Tika, Rissa dan Nur sebagai teman dan sahabat sejak penulis memasuki Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, terima kasih atas semua

dukungan, semangat dan doanya.

9. Rian dan Tika terima kasih untuk semua dukungan, semangat, bantuan dan solusi

masalah yang dihadapi selama penyusunan skripsi ini.

10. A-Cu dan Reni, terima kasih atas team work yang solid, terima kasih untuk

membantu kerja di lab sampai malam, dukungan doa dan semangatnya.

11. Lidia terima kasih untuk semua bantuan dan dukungannya.


ix

12. Semua saudara seiman di GAIN Alfa Omega Yogyakarta, Tante dan Om,

Yosafat, Viktor, Pak dan Bu Joko, Komang, Diana, Doni atas semua dukungan

doa dan berkatnya. YAHWEH berkati.

13. Teman-teman FST yang luar biasa kekompakannya, kalian memberi warna di

hidupku.

14. Setiap orang yang mungkin tidak dapat disebutkan satu per satu, terima kasih

karena baik atau buruk kalian telah membentukku menjadi pribadi yang seperti

ini. Lanjutkan hidup kalian.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan.

Maka penulis sangat terbuka terhadap kritik dan saran yang akan membantu penulis

dalam perkembangan selanjutnya. Akhir kata, semoga skripsi ini berguna bagi

kemajuan ilmu pengetahuan.

Penulis


x

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya, atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, Mei 2008

Penulis



xi



INTISARI

Saat ini, karena terbatasnya bentuk sediaan dan kombinasi zat aktif yang tersedia di pasaran, maka tenaga medis di Rumah Sakit X mengombinasikan parasetamol dan natrium fenobarbital dalam bentuk pulveres untuk pasien anak-anak. Pulveres dibuat dengan mengubah sediaan tablet menjadi pulveres dan dilakukan dalam jumlah besar. Maka untuk menjamin patient safety, diperlukan kontrol kualitas terhadap pulveres tersebut. Salah satu metode yang pernah digunakan untuk menetapkan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui akurasi, presisi, linearitas, LOD dan LOQ dari metode KCKT fase terbalik untuk menetapkan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital. Jenis penelitan ini adalah noneksperimental deskriptif. Sistem KCKT menggunakan kolom C18 (30 cm); perbandingan fase gerak metanol:buffer fosfat pH 3,2 yang dioptimasi 30:70 dan 10:90; kecepatan alir yang dioptimasi 1 dan 1,5 ml/menit; detektor UV pada ? pengamatan 236 nm.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa metode KCKT fase terbalik dengan kondisi optimum komposisi fase gerak 90:10 dan kecepatan alir 1,5 ml/menit memiliki akurasi, presisi dan linearitas yang baik untuk menetapkan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital. Dengan LOD dan LOQ untuk parasetamol berturut-turut 0,006 mg/ml dan 0,02 mg/ml sedangkan untuk natrium fenobarbital berturut-turut 0,124 mg/ml dan 0,414 mg/ml.

Kata kunci : parasetamol, natrium fenobarbital, KCKT fase terbalik, parameter

validitas


xii

OPTIMATION OF SEPARATION AND QUANTITATIVE ANALYSIS THE MIXTURE OF PARACETAMOL AND SODIUM PHENOBARBITAL WITH

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD REVERSED PHASE

ABSTRACT

Nowadays, because of dossage form and combination of active ingredient in market are limited, then the medical staff in hospital X combines paracetamol and sodium phenobarbital in pulveres form for pediatri. Pulveres made by changing tablet form into pulveres, in a large quantity. So in order to guarantee patient safety, quality control is needed towards those pulveres. One of the methods that ever used to determine the amount of paracetamol and sodium phenobarbital is reversed phase High Performance Liquid Chromatoraphy (HPLC).

This research’s aims are to know the accuracy, precision, linearity, LOD and LOQ from reversed phase HPLC to determine the amount of paracetamol and sodium phenobarbital in combination. Kind of this research is descriptive nonexperimental. HPLC system uses C18 column (30 cm); combination of mobile phase methanol:phosphat buffer pH 3.2 that have been optimated are 30:70 and 10:90; flow rate that have been optimated are 1 and 1.5 ml/minutes; UV detector in observative ? 236 nm.

The result shows that HPLC method reversed phase with optimum condition of mobile phase composition 90:10 and flow rate 1.5 ml/minutes has good accuracy, precision and linearity to determine the amount of paracetamol and sodium phenobarbital. With LOD and LOQ for paracetamol are 0.006 mg/ml and 0.02 mg/ml, while LOD and LOQ for sodium phenobarbital are 0.124 mg/ml and 0.414 mg/ml.

Keywords : paracetamol, sodium phenobarbital, reversed phase HPLC, validity

parameters


xiii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL.............................................................................................. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING..................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN.................................................................................iv

HALAMAN PERSEMBAHAN..............................................................................v

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...................................................vi

PRAKATA..............................................................................................................vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA................................................................. x

INTISARI............................................................................................................... xi

ABSTRACT..............................................................................................................xii

DAFTAR ISI...........................................................................................................xiii

DAFTAR TABEL...................................................................................................xvii

DAFTAR GAMBAR.............................................................................................. xviii

DAFTAR LAMPIRAN...........................................................................................xx

BAB I. PENGANTAR............................................................................................ 1

A. Latar Belakang.................................................................................................. 1

1. Permasalahan.............................................................................................. 3

2. Keaslian Penelitian..................................................................................... 3

3. Manfaat Penelitian...................................................................................... 4

B. Tujuan Penelitian.............................................................................................. 4


xiv

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA.................................................................... 5

A. Parasetamol....................................................................................................... 5

B. Natrium fenobarbital......................................................................................... 6

C. Buffer................................................................................................................ 7

D. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif.................................................................... 8

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.................................................................... 9

1. Definisi dan instrumentasi.......................................................................... 9

2. Pembagian jenis kromatografi.................................................................... 15

3. Kromatografi partisi.................................................................................... 16

4. Pemisahan puncak dalam kromatografi...................................................... 18

F. Spektrofotometri Ultraviolet............................................................................. 21

G. Kesahihan Metode Analisis Instrumental......................................................... 24

H. Keterangan Empiris.......................................................................................... 27

BAB III. METODE PENELITIAN........................................................................ 28

A. Jenis Penelitian................................................................................................. 28

B. Definisi Operasional......................................................................................... 28

C. Bahan Penelitian............................................................................................... 28

D. Alat penelitian................................................................................................... 29

E. Tata Cara Penelitian.......................................................................................... 30

1. Pembuatan fase gerak................................................................................. 30

2. Pembuatan larutan baku parasetamol dan natrium fenobarbital…………. 31

3. Pengamatan panjang gelombang pengamatan parasetamol dan natrium

fenobarbital dengan spektrofotometer UV………………………………..32


xv

4. Optimasi pemisahan parasetamol dan natrium fenobarbital dalam

campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dengan perbandingan

11:1 dengan KCKT fase terbalik………………………………………… 33

5. Optimasi penetapan kadar parasetamol dan natrium fenobarbital dalam

campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dengan perbandingan 11

: 1 dengan KCKT fase terbalik…………………………………………... 35

6. Validasi metode penetapan kadar parasetamol dan natrium fenobarbital

dalam campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dengan

perbandingan 11 : 1 dengan KCKT fase terbalik…………………………36

F. Analisis Hasil.................................................................................................... 38

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................... 39

A. Penyiapan Fase Gerak....................................................................................... 39

B. Pembuatan Larutan Baku.................................................................................. 40

C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Parasetamol dan Natrium

Fenobarbital dengan Spektrofotometer UV………………………………….. 41

D. Optimasi Pemisahan Parasetamol dan Natrium Fenobarbital dengan KCKT

Fase Terbalik………………………………………………………………….46

E. Optimasi Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium Fenobarbital dengan

KCKT Fase Terbalik…………………………………………………………. 56

F. Validasi Metode Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium Fenobarbital

dalam Campuran dengan Perbandingan 11 : 1 dengan KCKT Fase

Terbalik………………………………………………………………………. 61


xvi

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN.................................................................65

A. Kesimpulan....................................................................................................... 65

B. Saran................................................................................................................. 66

DAFTAR PUSTAKA............................................................................................. 67

LAMPIRAN............................................................................................................70

BIOGRAFI PENULIS............................................................................................ 107


xvii

DAFTAR TABEL

Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut............................................................. 13

Tabel II. Rentang rata-rata persen perolehan kembali yang dapat diterima

(Anonimc, 2004).................................................................................25

Tabel III. Presisi yang dapat diterima (Anonimc, 2004).................................... 26

Tabel IV. Resolusi pemisahan parasetamol 0,21 mg/ml dan asam

fenobarbiturat 1,5 mg/ml pada KCKT............................................... 55

Tabel V. Data kurva baku parasetamol............................................................. 57

Tabel VI. Data kurva baku natrium fenobarbital............................................... 57

Tabel VII. Data waktu retensi (tR) masing-masing senyawa baku dan sampel... 59

Tabel VIII. Data kadar parasetamol dan na trium fenobarbital dalam sampel...... 61

Tabel IX. Data % recovery parasetamol dan natrium fenobarbital.................... 62


xviii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur Parasetamol.......................................................................... 5

Gambar 2. Struktur Natrium Fenobarbital........................................................... 6

Gambar 3. Peralatan KCKT................................................................................. 11

Gambar 4. Detektor ultraviolet untuk KCKT...................................................... 15

Gambar 5. Reaksi silanisasi................................................................................. 17

Gambar 6. Gugus kromofor dan auksokrom parasetamol................................... 43

Gambar 7. Gugus kromofor dan auksokrom natrium fenobarbital......................43

Gambar 8. Spektrum serapan parasetamol (?maks = 245 nm)............................... 44

Gambar 9. Spektrum serapan natrium fenobarbital (?maks = 236 nm).................. 45

Gambar 10. Gabungan spektrum serapan parasetamol konsentrasi 0,009 mg/ml

dan natrium fenobarbital konsentrasi 0,09 mg/ml............................. 46

Gambar 11. Reaksi antara natrium fenobarbital dengan asam fosfat........ ........... 47

Gambar 12. Gugus nonpolar dari parasetamol dan asam fenobarbiturat yang

berinteraksi dengan fase diam............................................................48

Gambar 13. Puncak parasetamol dan asam fenobarbiturat dengan fase gerak

buffer fosfat pH 3,2 : metanol (70 : 30), fase diam oktadesilsilan,

kecepatan alir 1 ml/menit, deteksi UV 236 nm..................................50



kecepatan alir 1,5 ml/menit, deteksi UV 236 nm...............................51


xix



kecepatan alir 1 ml/menit, deteksi UV 236 nm..................................52



kecepatan alir 1,5 ml/menit, deteksi UV 236 nm...............................53

Gambar 17. Kromatogram sampel asam fenobarbiturat replikasi 3...................... 59

Gambar 18. Kromatogram sampel parasetamol replikasi 3...................................60


xx

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis parasetamol............................................................70

Lampiran 2. Sertifikat analisis natrium fenobarbital.............................................. 71

Lampiran 3. Data penimbangan bahan................................................................... 72

Lampiran 4. Spektra panjang gelombang serapan maksimum parasetamol...........73

Lampiran 5. Spektra panjang gelombang serapan maksimum natrium

fenobarbital........................................................................................ 75

Lampiran 6. Kromatogram baku parasetamol........................................................ 77

Lampiran 7. Kromatogram baku natrium fenobarbital...........................................82

Lampiran 8. Kromatogram sampel parasetamol dan natrium fenobarbital ........... 87

Lampiran 9. Contoh perhitungan kadar larutan baku parasetamol.........................99

Lampiran 10. Contoh perhitungan kadar larutan baku natrium fenobarbital........... 101

Lampiran 11. Perhitungan CV parasetamol dan natrium fenobarbital dalam

sampel................................................................................................ 103

Lampiran 12. Perhitungan LOD dan LOQ parasetamol dan natrium fenobarbital.. 104


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Saat ini terbatasnya bentuk sediaan dan kombinasi zat aktif yang tersedia di

pasaran seringkali menyulitkan proses terapi untuk pasien anak-anak. Maka cara

yang dapat dilakukan adalah mengombinasikan beberapa zat aktif untuk mencapai

tujuan terapi tertentu seperti yang dilakukan tenaga medis di Rumah Sakit X. Salah

satunya adalah kombinasi parasetamol dan natrium fenobarbital. Parasetamol

digunakan sebagai penghilang nyeri dan penurun panas sedangkan natrium

fenobarbital yang memiliki khasiat antiepilepsi dimanfaatkan efek sampingnya untuk

menenangkan pasien anak-anak yang terkena demam.

Kombinasi parasetamol dan natrium fenobarbital dibuat dalam bentuk

sediaan pulveres yang dapat diterima oleh anak-anak karena pasien anak pada

umumnya sulit menerima obat dalam bentuk sediaan tablet. Selain itu, keterbatasan

sediaan tablet adalah dosisnya ditujukan untuk pasien dewasa sehingga perlu

dilakukan pengubahan bentuk sediaan tablet menjadi bentuk sediaan pulveres dengan

tujuan membagi dosis supaya sesuai untuk anak-anak. Pulveres adalah serbuk yang

dibagi dalam bobot yang lebih kurang sama, dibungkus dengan kertas perkamen atau

bahan pengemas lain yang cocok (Anief, 2000).

Pulveres campuran parasetamol dan natrium fenobarbital tersebut dibuat

berlebih untuk persediaan, tetapi tidak melalui pemeriksaan baik kualitatif maupun


2

kuantitatif sehingga tidak ada jaminan keseragaman zat aktif, keamanan, dan khasiat

penggunaannya. Sedangkan obat jadi adalah produk final artinya tidak layak

direformulasikan apalagi dicampurkan dengan sediaan jadi lainnya.

Bagi apoteker yang lebih mengutamakan pasien, patient safety merupakan

isu kritis dan harus ditangani dengan tepat karena menyangkut keselamatan pasien.

Maka salah satu upaya yang dapat dilakukan adalah dengan melakukan kontrol

kualitas baik secara kualitatif maupun kuantitatif terhadap pulveres yang telah dibuat.

Hal ini penting sebab proses pengubahan bentuk sediaan dapat mengakibatkan

perubahan sifat obat, yang dapat membahayakan pasien seperti beberapa kasus yang

terjadi di Indonesia.

Untuk dapat melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif diperlukan suatu

metode yang tepat. Akan tetapi karena kombinasi zat aktif dalam sediaan pulveres

yang dibuat merupakan obat-obat yang diresepkan oleh dokter, maka metode

penetapan kadar yang ada saat ini belum ada yang telah tervalidasi. Untuk itu,

peneliti hendak melakukan penelitian mengenai optimasi dan validasi metode untuk

menetapkan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital.

Metode yang dipilih adalah kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase

terbalik karena metode ini pernah digunakan untuk menetapkan kadar parasetamol

dan natrium fenobarbital dalam sampel biologis (Lunn dan Schmuff, 1997). Oleh

karena itu pada penelitian ini dilakukan optimasi dan validasi metode KCKT untuk

penetapan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sediaan

pulveres.


3

Parasetamol dan natrium fenobarbital yang telah diubah menjadi bentuk

asamnya, memiliki gugus polar dan nonpolar yang berbeda sehingga dapat

berinteraksi dengan fase diam dan fase gerak pada KCKT. Selain itu metode KCKT

merupakan metode yang cocok untuk analisis kualitatif dan kuantitatif campuran dua

senyawa atau lebih (multikomponen) tanpa perlu melakukan pemisahan senyawa-

senyawa tersebut terlebih dahulu (Johnson dan Stevenson, 1978).

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang tersebut, permasalahan yang muncul.

a. Bagaimana kondisi optimum untuk melakukan pemisahan parasetamol dan

natrium fenobarbital menggunakan metode KCKT fase terbalik?

b. Bagaimana validitas metode KCKT fase terbalik untuk menetapkan kadar

campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sediaan pulveres?

2. Keaslian penelitian

Metode KCKT telah banyak digunakan untuk menetapkan kadar obat

dalam bentuk campuran. Tetapi penetapan kadar campuran parasetamol dan natrium

fenobarbital dalam sediaan obat secara kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)

belum pernah dilakukan sebelumnya.


4

3. Manfaat penelitian

Penelitian ini dapat memberikan manfaat.

a. Manfaat teoritis. Diharapkan penelitian ini dapat memberikan sumbangan

terhadap ilmu pengetahuan tentang metode KCKT yang dapat digunakan untuk

menetapkan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sediaan

obat.

b. Manfaat metodologis. Diharapkan hasil penelitian ini dapat digunakan

sebagai dasar untuk melakukan analisis kualitatif maupun kuantitatif terhadap

campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dalam resep racikan pulveres di

Rumah Sakit X.

c. Manfaat praktis. Diharapkan penelitian ini dapat meningkatkan kualitas

pelayanan kefarmasian di Rumah Sakit X dan menjamin patient safety.

B. Tujuan Penelitian

Maka berdasarkan latar belakang dan permasalahan tersebut, tujuan

dilakukannya penelitian ini.

1. Untuk mengetahui bagaimana kondisi yang optimum untuk memisahkan

parasetamol dan natrium fenobarbital dengan metode KCKT fase terbalik.

2. Untuk mengetahui bagaimana validitas metode KCKT fase terbalik untuk

menetapkan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sediaan

pulveres.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Parasetamol

Parasetamol atau 4’-hidroksiasetanilida dengan bobot molekul 151,16

mengandung tidak kurang dari 98,0 % dan tidak lebih dari 101,0 % C8H9NO2,

dihitung terhadap zat anhidrat. Parasetamol merupakan serbuk hablur putih, tidak

berbau, dengan rasa sedikit pahit (Anonima, 1995). Rumus bangun parasetamol dapat

dilihat pada gambar 1.

OH

HNC

O

CH3

Gambar 1. Struktur Parasetamol (Anonima, 1995)

Satu bagian parasetamol larut dalam 70 bagian air, 7-10 bagian etanol dan

13 bagian aseton, agak sukar larut dalam kloroform, praktis tidak larut dalam eter

(Clarke, 1986). Larut dalam natrium hidroksida 1 N (Anonima, 1995).

Parasetamol memiliki pKa 9,5. Serapan maksimum parasetamol pada

daerah ultraviolet di larutan asam adalah 245 nm (A 1%, 1 cm = 668) dan dalam

larutan basa adalah 257 nm (A 1%, 1 cm = 715) (Clarke, 1986). A 1%, 1 cm atau


6

serapan jenis adalah serapan dari larutan 1% zat terlarut dalam sel dengan ketebalan

1 cm (Anonima, 1995).

Parasetamol diindikasikan untuk sakit kepala, nyeri muskoloskeletal

sementara, dismenore dan demam. Parasetamol tidak memiliki aktivitas antiinflamasi

yang berarti dan kurang mengiritasi lambung dibanding dengan asetosal (Anonimb,

2000).

B. Natrium Fenobarbital

Natrium fenobarbital dengan BM 254,22 mengandung tidak kurang dari 98

% dan tidak lebih dari 101,0 % C12H11N2NaO3, dihitung terhadap zat yang telah

dikeringkan (Anonima, 1995). Rumus bangun natrium fenobarbital dapat dilihat pada

gambar 2.

NH

HN O

Na

O

O

C2H5

Gambar 2. Struktur Natrium Fenobarbital (Anonima, 1995)

Merupakan hablur berlapis atau hablur berbentuk granul, putih atau serbuk

putih, higroskopik, tidak berbau, dengan rasa pahit. Larutan bersifat basa terhadap

fenolftalein dan terurai bila dibiarkan (Anonima, 1995).


7

Sangat mudah larut dalam air, larut dalam etanol, praktis tidak larut dalam

eter dan dalam kloroform (Anonima, 1995).

Asam fenobarbiturat memiliki nilai pKa 7,4. Serapan maksimumnya pada

daerah ultraviolet dalam NaOH pH 13 adalah 254 nm (A 1%, 1 cm = 342) (Clarke,

1986).

Fenobarbital diindikasikan untuk mengobati semua jenis epilepsi kecuali

petit mal. Efek sampingnya mengantuk, depresi mental, resah dan bingung

(Anonimb, 2000).

C. Buffer

Buffer merupakan larutan yang dapat mempertahankan pH saat sejumlah

kecil asam atau basa ditambahkan, atau jika larutan diencerkan. Larutan buffer

merupakan campuran antara asam lemah dan basa konjugasinya atau basa lemah

dengan asam konjugasinya dalam perbandingan atau konsentrasi tertentu (Christian,

2004).

Mekanisme pendaparan campuran asam lemah dan garamnya dapat

dijelaskan sebagai berikut. Nilai pH merupakan logaritma dari rasio antara garam

dan asam :

[ ]HAA

pKapH−

+= log (1)

Jika buffer dilarutkan, rasio tersebut akan tetap konstan sehingga pH tidak berubah.

Pada penambahan asam kuat, H+ akan bereaksi dengan A- membentuk HA dan


8

mencapai kesetimbangan HA H+ + A - sesuai dengan asas Le Châtelier, di

mana reaksi akan bergeser ke kiri. Karena perubahan rasio [ ] [ ]HAA− kecil, maka

perubahan pH yang terjadi juga kecil (Christian, 2004).

Kapasitas, atau kemampuan buffer untuk mempertahankan pH saat larutan

dimasuki asam/basa dengan pH berlainan, mencapai 100% saat pH buffer sama

dengan pKa asamnya. Maka supaya fase gerak memiliki kontrol pH yang baik, range

pH yang dapat digunakan adalah + 1 unit pH dari nilai pKa asam lemah. Untuk

buffer fosfat kapasitas buffer yang paling baik adalah pada pH 2,1 + 1; pH 7,2 + 1;

dan pH 12,3 + 1 (Heyrman dan Henry, 2006).

D. Analisis kualitatif dan kuantitatif

Dua langkah utama yang dilakukan dalam analisis adalah identifikasi dan

estimasi komponen-komponen suatu senyawa. Langkah identifikasi dikenal sebagai

analisis kualitatif sedangkan langkah estimasinya adalah analisis kuantitatif. Analisis

kuantitatif dapat diklasifikasikan dengan dasar perbedaan metode analisis atau

diklasifikasikan dengan dasar skala analisisnya (Khopkar, 1990).

Analisis kimiawi menetapkan komposisi kualitatif dan kuantitatif suatu

materi. Konstituen-konstituen yang akan dideteksi ataupun ditentukan jumlahnya

dapat berupa unsur, radikal, gugusan fungsi, senyawaan atau fase. Metode analisis

kuantitatif dapat diklasifikasikan sebagai makro, semimikro dan mikro tergantung

pada banyak sedikitnya sampel. Suatu sampel makro adalah sampel yang beratnya


9

lebih besar dari 0,100 gram, semimikro antara 0,100-0,001 gram, sedangkan yang

kurang dari 0,001 gram adalah sampel mikro (Khopkar, 1990).

Konsentrasi analit merupakan hal yang penting karena kesulitan dalam

metode analisis seringkali berkaitan dengan rentang konsentrasinya. Pada penentuan

kadar rendah, derau dan alunan yang disebabkan oleh pencemaran-pelarut, naik-

turunnya suhu maupun keragaman aliran dapat mengurangi ketepatan dibanding

dengan penetapan kadar tinggi (Johnson dan Stevenson, 1978).

Metode yang paling umum digunakan untuk menetapkan konsentrasi suatu

senyawa dalam suatu sampel adalah dengan menggunakan kurva kalibrasi

menggunakan baku eksternal. Disebut sebagai baku eksternal karena disiapkan dan

dianalisis secara terpisah dengan senyawa yang ada dalam sampel. Selanjutnya,

sampel yang akan ditetapkan konsentrasinya dianalisis dengan cara yang sama.

Konsentrasi senyawa kemudian ditentukan dengan metode grafik dari kurva kalibrasi

secara numerik (Rohman dan Gandjar, 2007).

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1. Definisi dan instrumentasi KCKT

Kromatografi adalah teknik pemisahan fisik suatu campuran zat-zat kimia

yang berdasar pada perbedaan migrasi dari masing-masing komponen campuran

yang terpisah pada fase diam di bawah pengaruh pergerakan fase yang bergerak.

Kromatografi sendiri bertujuan untuk memisahkan komponen dari matriks sampel


10

dan tetap dibiarkan dalam fase diam kemudian ditentukan untuk analisis (Mulja dan

Suharman, 1995).

Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi dan

detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair

menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode

ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi (Anonima, 1995). Kromatografi

Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode kromatografi cair yang

fase geraknya dialirkan secara cepat dengan bantuan tekanan dan hasilnya dideteksi

dengan instrument. Tidak seperti kromatografi gas, KCKT tidak dibatasi oleh

volatilitas analit atau ketahanan analit terhadap panas. KCKT memiliki fase diam

yang lebih banyak jenisnya sehingga memungkinkan lebih banyak interaksi spesifik

untuk terjadinya pemisahan senyawa (Willard, Merrit, Dean, dan Settle, 1988).

KCKT merupakan teknik pemisahan analitik yang paling banyak

digunakan, karena sensitivitas dari metode ini menghasilkan determinasi kuantitatif

yang akurat (Skoog, Holler, dan Nieman, 1985). Maksud dan tujuan analisis dengan

KCKT hanya ada dua hal yaitu memperoleh pemisahan yang baik dalam proses yang

relatif singkat (Mulja dan Suharman, 1995). Keterbatasan metode KCKT adalah

untuk mengidentifikasi senyawa kecuali jika KCKT dihubungkan dengan

spektrometer massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah jika analit yang akan

dianalisis sangat kompleks maka resolusi yang baik sulit diperoleh (Rohman dan

Gandjar, 2007). Peralatan KCKT dapat dilihat pada gambar 3.


11

Gambar 3. Peralatan KCKT (Kazakevich dan Nair, 1996)

Tiga variabel utama yang harus diperhatikan untuk proses pemisahan dan

analisis menggunakan KCKT, yaitu :

a. Fase gerak

Pemisahan dengan fase gerak tunggal disebut elusi isokratik, sedangkan

elusi gradien menggunakan dua fase gerak dengan berbagai perubahan komposisi.

Suatu KCKT yang baik seharusnya mempunyai lebih dari dua penampung fase

gerak. Fase gerak dialirkan ke botol penyampur pada berbagai laju aliran. Sebagian

besar pompa KCKT mempunyai keluaran tekanan 70-400 atm, dan mampu

menghasilkan aliran sampai 20 ml/menit. Sampel dimasukkan dalam sistem injeksi

dengan penyuntik hiperdermik. Sampel sejumlah 2-100 µl dapat ditampung dalam

sistem injeksinya (Khopkar, 1990).

Fase gerak untuk analisis secara KCKT harus murni untuk mencegah

adanya peak pengganggu yang dapat tumpang tindih dengan peak analit, tidak

bereaksi atau mempengaruhi kolom, dapat melarutkan analit, memiliki titik didih 20-

50oC di atas temperatur kolom, viskositasnya rendah (tidak lebih dari 50 cP) dan


12

memungkinkan untuk memperoleh kembali analit dengan mudah (jika diperlukan),

tidak mudah terbakar dan toksisitasnya rendah, memiliki harga yang wajar (Skoog,

Holler, dan Nieman, 1985). Fase gerak KCKT juga harus bebas dari gas yang terlarut

karena dapat mempengaruhi respon detektor sehingga memuculkan sinyal palsu dan

akan mempengaruhi kolom (Gritter, Bobbit, Schwarting, 1985). Maka peralatan

degassing diperlukan untuk menghilangkan gas yang terlarut di dalam fase gerak

(Dean, 1995).

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase

terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan

asetonitril (Rohman dan Gandjar, 2007).

Variasi retensi analit untuk pemisahan yang optimum dicapai dengan

mengubah komposisi fase gerak. Snyder mendefinisikan parameter solvent strength,

eo, sebagai energi adsorbsi per unit area dari adsorbent. Kenaikan nilai eo berbanding

lurus dengan kenaikan nilai log k’. Semakin besar solvent strength maka kekuatan

fase gerak untuk mengelusi semakin besar dan menyebabkan semakin kecilnya nilai

k’ (faktor pemisahan) untuk kurva analit. Dengan demikian, fase gerak dapat dipilih

dengan mencocokkan polaritas relatif dari fase gerak dengan komponen sampel

(Willard, Merrit, Dean, dan Settle, 1988).

Kepolaran pelarut merupakan ukuran kekuatan pelarut untuk mengelusi

suatu senyawa. Kepolaran pelarut dinyatakan dalam bentuk P’ (indeks polaritas).

Besarnya polaritas campuran pelarut dapat dihitung dengan persamaan berikut.


13

nn

n

icamp PPPPP '.....'''' 2211

1

Φ+Φ+Φ=Φ= ∑=

(2)

dengan F merupakan fraksi pelarut dalam campuran dan n adalah jenis pelarut yang

digunakan (Skoog et al., 1985).

Berikut ini merupakan beberapa nilai indeks polaritas dari beberapa pelarut

yang sering digunakan.

Tabel I. Nilai indeks polaritas pelarut Nilai Eluotropik Solvent Indeks

Polaritas Alumina C18 Silika UV Cut off

(nm) Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195

Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200 Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284

Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212 Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256

Aseton 5,1 0,56 8,8 0,53 330 Metanol 5,1 0,95 1,0 0,7 205

Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190 Dimetilformamida 6,4 - 7,6 - 268 Dimetilsulfoksida 7,2 0,62 - - 268

Air 10,2 - - - 190 (Snyder, Kirkland dan Glajh, 1997).

Tabel di atas menunjukkan bahwa semakin besar nilai eluotropik dari suatu

pelarut maka semakin mudah untuk mengelusi analit. Sedangkan semakin besar

indeks polaritas pelarut maka semakin polar pelarut tersebut (Snyder et al., 1997).


14

b. Fase diam

Kolom pada KCKT dapat berupa gelas atau baja tidak berkarat. Kolom

gelas dapat menahan tekanan sampai 50 atm. Panjang kolom bervariasi antara 15-

150 cm. pengisi kolom biasanya adalah silika gel, alumina dan elit (Khopkar, 1990).

Diameter kolom dibuat 3-5 mm dengan tujuan supaya kepekaannya lebih

teliti, menghemat fase gerak, memperluas kemampuan detektor, dan mengurangi

jumlah sampel yang dianalisis. Untuk mendapatkan fase yang nonpolar silika gel

direaksikan dengan klorosilan Cl-Si-(R)n (Mulja dan Suharman, 1995). Oktadesil

silika (ODS) merupakan fase diam yang paling banyak dipakai karena mampu

memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun

tinggi (Rohman dan Gandjar, 2007).

Analit yang polar, terutama yang bersifat basa atau memiliki gugus amin

akan memberikan puncak yang mengekor (tailing peak) pada penggunaan fase diam

silika fase terikat. Hal ini disebabkan oleh adanya interaksi adsorbsi antara gugus

amin pada analit dengan residu silanol dan pengotor logam yang terdapat pada silika.

Hal ini dapat diatasi dengan end-capping yakni suatu proses menutup residu silano l

dengan gugus trimetilsilil dan menggunakan silika dengan kemurnian tinggi

(kandungan logam < 1 ppm) (Rohman dan Gandjar, 2007).

c. Detektor

Persyaratan detektor KCKT adalah sensitivitasnya harus sangat tinggi (10-8-

10-15 g analit/detik); kestabilan dan reprodusibilitas yang baik; memberikan respon


15

yang linier terhadap konsentrasi analit; dapat bekerja pada temperatur kamar sampai

400oC; tidak terpengaruh oleh perubahan temperatur dan kecepatan fase gerak;

mudah didapat dan mudah dioperasikan; selektif terhadap berbagai macam analit di

dalam fase gerak; tidak merusak analit; dapat menghilangkan ”zone broadening”

dengan adanya pengaruh minimal internal volume (Mulja dan Suharman, 1995).

Detektor UV umumnya digunakan untuk analisis bahan organik bergugus

fungsi (Khopkar, 1990). Detektor ini didasarkan pada adanya penyerapan radiasi

ultraviolet oleh spesies analit yang mempunyai struktur atau gugus kromoforik.

Detektor dengan panjang gelombang yang bervariasi lebih berguna karena seorang

analis dapat memilih panjang gelombang dengan sensitifitas yang paling tinggi

(Rohman dan Gandjar, 2007). Diagram skematik detektor UV tampak pada gambar

di bawah ini.

Gambar 4. Detektor ultraviolet untuk KCKT (Skoog et al., 1985).

2. Pembagian jenis kromatografi

Pada prinsipnya semua cara pemisahan kromatografi mengalami proses

yang sama yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fase diam dan fase


16

gerak dengan memanfaatkan perbedaan kecil sifat-sifat fisik komponen-komponen

yang yang hendak dipisahkan (Mulja dan Suharman, 1995).

Kromatografi dapat dibagi menjadi lima jenis berdasarkan mekanisme

pemisahannya yaitu kromatografi partisi, kromatografi adsorbsi, kromatografi

pertukaran ion, kromatografi pasangan ion, kromatografi eksklusi dan kromatografi

afinitas (Harris, 1999).

3. Kromatografi Partisi

Prinsip kromatografi partisi didasarkan pada partisi analit di antara dua fase

yang tidak saling campur, karena adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-

masing senyawa (Johnson dan Stevenson, 1978). Sebagai fase gerak adalah

campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan buffer. Untuk

analit yang bersifat asam atau basa lemah, peranan pH sangat penting karena jika pH

fase gerak tidak diatur maka analit akan mengalami ionisasi. Terbentuknya spesies

yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lemah

dibanding jika analit dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi, karena spesies yang

terionisasi akan terelusi lebih cepat (Rohman dan Gandjar, 2007).

Kecepatan migrasi analit dalam fase diam ditentukan oleh perbandingan

distribusinya (D) yang bergantung pada afinitas relatif analit pada fase diam dan fase

gerak. Dalam kromatografi, D didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi analit

dalam fase diam (Cs) dan dalam fase gerak (Cm) (Rohman dan Gandjar, 2007).


17

m

s

CC

D = (3)

Penggunaan temperatur kolom hanya beberapa derajat di bawah temperatur

kamar akan meningkatkan reprodusibilitas waktu retensi dan meningkatkan presisi

analisis kuantitatif. Permukaan silika pada kolom memiliki gugus silanol (Si-OH)

sampai 8 µmol per meter persegi. Gugus silanol akan mengalami disosiasi menjadi

bermuatan negatif Si-O- pada pH di atas 3. Gugus Si-O- akan mengikat gugus amin

terprotonasi secara kuat dan menyebabkan tailing. Kromatografi partisi

menggunakan fase diam silika yang ditempeli gugus secara kovalen pada

permukaannya (Harris, 1999). Gugus yang ditempelkan pada silanol tersebut pada

umumnya adalah hidrokarbon rantai panjang sehingga fase gerak umumnya lebih

polar dari fase diam (Skoog et al., 1988). Reaksi yang terjadi secara umum adalah

sebagai berikut :

Si OH + ClSi

CH3

CH3

R- HCl

Si O Si

CH3

CH3

R

Gambar 5. Reaksi silanisasi (Harris, 1999)

Pada pembuatan kolom oktadesilsilan –R merupakan rantai (CH2)17-CH3

(gugus oktadesil) (Harris, 1999). Hasil reaksi yang diperoleh disebut dengan silika

fase terikat yang stabil terhadap hidrolisis karena terbentuk ikatan-ikatan siloksan

(Si-O-Si) (Rohman dan Gandjar, 2007).


18

4. Pemisahan puncak dalam kromatografi

a. Efisiensi kolom

Berdasarkan teori lempeng, jumlah lempeng (N) yang didasarkan pada

konsep lempeng teoritis pada distilasi kolom digunakan sebagai ukuran efisiensi

kolom. N didefinisikan sebagai berikut.

2

2

54,5

=

h

R

Wt

N (4)

Dimana 2

hW merupakan lebar setengah puncak kromatogram (Rohman dan Gandjar,

2007).

Suatu ukuran alternatif yang tergantung pada panjang kolom kromatografi

adalah tinggi lempeng (H) atau yang biasa disebut dengan tinggi setara pelat teori

(HETP = Height Equivalent Theoritical Plate). Hubungan antara HETP dan jumlah

lempeng (N) serta panjang kolom (L) dapat dirumuskan dengan :

NL

H = (5)

Kolom yang memberikan jumlah lempeng (N) yang besar dan nilai HETP yang kecil

akan mampu memisahkan komponen-komponen dalam suatu campuran, yang berarti

efisiens i kolom adalah besar (Rohman dan Gandjar, 2007).

Sedangkan menurut teori laju, efisiensi kolom dinyatakan dengan

persamaan Van Deemter. Luas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi

oleh tiga proses perpindahan massa yaitu Difusi Eddy, difusi longitudinal dan


19

transfer massa tidak seimbang. Sedangkan parameter-parameter yang menentukan

berlangsungnya proses-proses tersebut adalah : laju aliran, ukuran partikel, laju difusi

dan ketebalan stasioner. Van Deemter menghubungkan ketiga proses di atas dengan

efisiensi kolom dalam suatu persamaan. Menurut Van Deemter hubungan antara laju

aliran (µ) dengan tinggi piringan dapat dinyatakan dengan : H = A +µB

+ C. µ

(Khopkar, 1990).

Persamaan Van Deemter dapat juga dituliskan sebagai berikut.

( )µ

πµγ

λcairan

M

DkdfkD

dpH 22

2

'1'82

2+

++= (6)

Di mana ? = tetapan ukuran ketidakteraturan kemasan

dp = diameter rata-rata partikel penyangga

DM = kedifusian analit dalam fase gerak

k’ = faktor kapasitas

µ = kecepatan alir

? = faktor koreksi kelikuan saluran dalam kolom

(Willard et.al., 1988)

Persamaan ini memberikan jawaban bagaimana meningkatkan peranan

kolom kromatografi. µ adalah kecepatan linier gas (atau kelajuan aliran) melalui

kolom. Besaran-besaran A, B dan C penyebab utama terjadinya pelebaran puncak

(Sastrohamidjojoa, 2002). A suatu variabel yang berasal dari difusi Eddy, B variabel

yang berhubungan dengan difusi longitudinal, C menyangkut transfer massa tidak


20

setimbang. Hubungan antara diameter partikel rata-rata dengan difusi Eddy (A)

adalah A = 2?dp. Dimana ? adalah faktor penjejalan kolom. Sedangkan difusi

longitudinal (B) ditimbulkan sebagai akibat dari kecenderungan molekul untuk

berpindah dari bagian tengah penampang piringan kolom yang konsentrasinya lebih

tinggi, ke bagian tepi piringan yang konsentrasinya lebih rendah. Besarnya difusi

longitudinal adalah B = 2?DM, dimana ? adalah faktor yang merupakan ukuran

rentangan suatu molekul bebas untuk berdifusi, sedangkan DM adalah koefisien

difusi zat terlarut dalam fase bergerak. Transfer massa tidak setimbang (C) akan

melebarkan puncak akibat gerakan fase bergerak yang tinggi (Khopkar, 1990).

b. Waktu tambat (tR) dan resolusi

Waktu tambat atau waktu retensi (retention time) adalah selang waktu yang

diperlukan oleh analit mulai saat injeksi sampai keluar dari kolom dan sinyalnya

ditangkap detektor, dinyatakan sebagai tR (Mulja dan Suharman, 1995).

Di samping waktu tambat untuk analit, dikenal pula waktu tambat untuk

pelarut pengembang atau pengembang campur yang dinyatakan sebagai tM (Mulja

dan Suharman, 1995).

Waktu tambat analit dikurangi waktu tambat pelarut pengembang atau

pelarut pengembang campur disebut sebagai waktu tambat yang terkoreksi yang

dinyatakan sebagai tR’ (Mulja dan Suharman, 1995). Jika harga D (perbandingan

distribusi) kecil maka analit akan lebih banyak di dalam fase gerak atau (Cm>Cs)


21

yang berarti analit akan lebih lama tinggal di dalam fase gerak dan memiliki waktu

retensi lebih cepat (Mulja dan Suharman, 1995).

Faktor resolusi (R) adalah ukuran pemisahan dari dua puncak berdekatan

yang dapat diukur dengan persamaan :

2121

12 2)(2

1)(

wwt

wwtt

R RR

+∆

=+

−= (7)

Harga tR1 dan tR2 merupakan waktu retensi senyawa yang diukur pada titik

maksimum puncak, harga w1 dan w2 merupakan lebar alas puncak (Johnson dan

Stevenson, 1978). Untuk pemisahan yang baik R harus > 1,5 karena berarti

pemisahan kedua senyawa > 99,7% (Sastrohamidjojoa, 2002).

F. Spektofotometri Ultraviolet

Teknik spektroskopik merupakan salah satu teknik analisis fisiko-kimia

yang mengamati interaksi atom atau molekul dengan suatu radiasi elektromagnetik

(REM). Spektrofotometri ultraviolet adalah anggota teknik analisis spektroskopik

yang menggunakan sumber radiasi elektromanetik ultraviolet dekat (190-380 nm)

dengan menggunakan instrumen spektrofotometer. Radiasi ultraviolet jauh (100-190

nm) tidak dipakai, sebab pada daerah tersebut REM diabsorbsi oleh udara (Mulja dan

Suharman, 1995).

Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah spektrum ultraviolet dan terlihat

tergantung pada struktur elektronik molekul (Sastrohamidjojob, 2002). Apabila suatu

molekul dikenai REM maka akan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi


22

yang dikenal sebagai orbital elektron antiikatan. Ada empat tipe transisi elektronik

yang mungkin terjadi yaitu σ → σ*, π → π*, n → π*, dan n → σ*. Eksitasi elektron

(σ → σ*) memberikan energi yang terbesar dan terjadi pada daerah ultraviolet jauh

yang diberikan oleh ikatan tungal, misalnya alkana. Eksitasi elektron (π → π*)

diberikan oleh ikatan rangkap dua dan rangkap tiga, juga terjadi pada daerah

ultraviolet jauh. Sedangkan eksitasi elektron (n → σ*) terjadi pada gugus karbonil

yang terjadi pada ultraviolet jauh (Mulja dan Suharman, 1995).

Dalam praktek spektrofotometri ultraviolet digunakan terbatas pada sistem

terkonjugasi. Meskipun demikian terdapat keuntungan yang selektif dari serapan

ultraviolet. Yaitu gugus-gugus karakteristik dapat dikenal dalam molekul yang

sangat kompleks (Sastrohamidjojob, 2002).

Suatu molekul dapat menyerap radiasi elektromagnetik jika memiliki

kromofor, yaitu gugus tak jenuh kovalen sebaga i penyerap dalam molekul. Pada

senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus yang tidak menyerap

radiasi namun bila terikat bersama kromofor dapat meningkatkan penyerapan oleh

kromofor atau mengubah panjang gelombang serapan maksimum (Christian, 2004).

Auksokrom merupakan heteroatom yang langsung terikat pada kromofor, misalnya

gugus -OCH3, -Cl, -OH dan -NH2 (Sastrohamidjojob, 2002).

Ikatan terkonjugasi merupakan ikatan rangkap yang berselang-seling

dengan satu ikatan tunggal. Dalam orbital molekul, elektron p mengalami

delokalisasi lanjut dengan adanya ikatan terkonjugasi. Adanya efek delokalisasi ini


23

akan menyebabkan penurunan tingkat energi p* dan memberikan pengurangan

karakter antiikatan. Sebagai konsekuensinya, panjang gelombang molekul yang

mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi akan mengalami pergeseran batokromik

(Rohman dan Gandjar, 2007).

Spektrofotometri ultraviolet melibatkan energi elektronik yang cukup besar

pada molekul yang dianalisis sehingga spektrofotometri ultraviolet lebih banyak

digunakan untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Analisis kuantitatif

dengan spektrofotometri ultraviolet selalu melibatkan pembacaan absorbansi REM

oleh molekul (A) atau REM yang diteruskan (%T). Bouguer, Lambert dan Beer

membuat formula secara matematik hubungan antara transmitan atau absorban

terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang

mengabsorbsi sebagai berikut.


24

bc

o

t

II

T ..10 ε−== (8)

bcT

A ..1

log ε== (9)

Di mana T = persen trasmitan

Io = intensitas radiasi yang datang

It = intensitas radiasi yang diteruskan

e = daya serap molar (Liter.mol-1.cm-1)

c = konsentrasi (mol.Liter-1)

b = tebal larutan (cm)

A= serapan

(Mulja dan Suharman, 1995).

G. Kesahihan Metode Analisis Instrumental

Kesahihan metode analisis merupakan suatu prosedur untuk membuktikan

bahwa metode analisis yang digunakan dapat memberikan hasil seperti yang

diharapkan, dengan kecermatan dan ketelitian yang memadai sesuai dengan standar

yang berlaku (Mulja dan Suharman, 1995).

Pedoman kesahihan metode analisis didukung oleh parameter-parameter di

bawah ini :


25

1. Akurasi

Akurasi suatu metode merupakan keterdekatan nilai pengukuran dengan

nilai sebenarnya dari analit dalam sampel (Mulja dan Hanwar, 2003). Penentuan

akurasi metode analisis biasanya dinyatakan dengan persen perolehan kembali

terhadap analit yang kadarnya telah diketahui dengan pasti (Mulja dan Suharman,

1995).

Persen perolehan kembali yang dapat diterima bergantung pada matriks

analit, prosedur pengolahan analit dan konsentrasi analit (Anonimc, 2004). Rentang

rata-rata perolehan kembali yang dapat diterima, harus memenuhi ketentuan dalam

tabel II berikut.

Tabel II. Rentang rata-rata persen perolehan kembali yang dapat

diterima (Anonimc, 2004)

Kandungan zat aktif (%b/v)

Rentang rata-rata persen perolehan kembali yang

diterima > 10 > 1

0,1-1 < 1

98 – 102% 90 – 110% 80 – 120% 75 – 125%

2. Presisi

Presisi suatu metode analisis merupakan derajat pencaran hasil yang

diperoleh dari analisis berulangkali pada suatu sampel homogen. Biasanya

dinyatakan dalam Koefisien Variasi (KV) dan Standar Deviasi (SD) (Mulja dan


26

Hanwar, 2003). Suatu metode dinyatakan memenuhi syarat presisi jika memenuhi

kriteria pada tabel III berikut.

Tabel III. Presisi yang dapat diterima (Anonimc, 2004)

Kandungan zat aktif

(%b/v) Presisi

> 10 1 - 10 0,1 -1 < 0,1

= 2 % = 5 % = 10 % = 20 %

3. Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-

hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran

yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva

kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). Sebelum

dilakukan perhitungan analisis menggunakan kurva kalibrasi terlebih dahulu

ditentukan apakah ada korelasi yang bermakna antara kedua besaran yang diukur.

Untuk itu perlu dihitung besarnya koefisien korelasi (rhitung) dan dibandingkan

dengan rtabel. Jika rhitung lebih besar daripada rtabel berarti ada korelasi yang signifikan

dan besaran yang dicari dapat dihitung dengan persamaan regresi yang ada (Rohman

dan Gandjar, 2007). Suatu kurva kalibrasi dinyatakan linier jika r > 0,99 (Anonimc,

2004).


27

4. Limit kuantifikasi (LOQ) dan limit deteksi (LOD)

Sensitivitas suatu metode analisis harus diketahui batas kadar terkecil yang

masih dapat ditentukan untuk analisis kuantitatif yang dikenal sebagai LOD (Limit of

Detection). LOD merupakan suatu parameter untuk penetuan suatu analit dengan

kadar yang terkecil tetapi masih memberikan tanggap detektor yang berbeda dengan

pembanding (tanpa analit) (Mulja dan Suharman, 1995). Batas deteksi yang umum

digunakan dalam kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit

yang memberian respon sebesar respon blangko (Yb) ditambah dengan 3 simpangan

baku blangko (3 Sb) (Rohman dan Gandjar, 2007).

Sedangkan LOQ (Limit of Quantification) adalah kadar terkecil dari suatu

analit yang masih dapat dianalisis dengan hasil yang tetap memenuhi syarat akurasi

dan presisi (Mulja dan Suharman, 1995). LOQ ditentukan dengan rasio signal to

noise 10 : 1 (Rohman dan Gandjar, 2007).

H. Keterangan Empiris

Komposisi dan kecepatan alir fase gerak yang optimal pada kolom

oktadesilsilan dapat memisahkan parasetamol dan natrium fenobarbital, serta metode

ini memiliki validitas (akurasi, presisi dan linearitas) yang baik untuk dapat

digunakan dalam penetapan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital

dalam sediaan pulveres.


28

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian dalam “Optimasi Pemisahan dan Penetapan Kadar

Campuran Parasetamol dan Natrium Fenobarbital dengan Metode Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi Fase Terbalik” adalah penelitian noneksperimental deskriptif.

B. Definisi Operasional

1. Campuran parasetamol dan natrium fenobarbital adalah campuran antara

parasetamol dan natrium fenobarbital dengan perbandingan 11 : 1

2. Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik yang digunakan

adalah seperangkat alat KCKT dengan fase diam kolom reversed phase C18 dengan

fase gerak campuran metanol : buffer fosfat pH 3,2 dengan perbandingan optimum

3. Kadar parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel ditetapkan dalam

satuan mg/ml

4. Parameter kesahihan metode analisis yang digunakan yaitu akurasi, presisi, LOD,

LOQ dan linearitas

C. Bahan Penelitian

Parasetamol kualitas working standard (Brataco), natrium fenobarbital

kualitas working standard, metanol pro analisis (E. Merck), air (aqua bidestilata)


29

dari destilasi aquadest (laboratorium Kimia Organik, Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma), dinatrium hidroksi fosfat, dan asam asetat glassial p.a (E.Merck).

D. Alat Penelitian

1. Spektrofotometer UV/Vis merk Genessis UV 10.

2. Sistem KCKT, yang terdiri dari :

a. Pompa merk Shimadzu model LC-10 AD No.C20293309457 J2.

b. Detektor UV-Vis merk Shimadzu model SPD-10 AV No. C20343502697

KG.

c. Injektor jenis katup suntik, model 7725i.

d. Kolom oktadesilsilan, merk Waters BondapacTM C18 (panjang 30 cm;

P61271B02 P/N 27324; diameter 5-10 mm).

e. CBM-101 merk Shimadzu, Cat No.223-03750-94, serial No.

C50363502311 SA.

f. Seperangkat komputer merk COMPAQ.

3. Syringe No. 046-00038-01, jarum syringe No. 228-18216-91.

4. Alat degassing merk Retsch, Tipe T 460 No. V935922013 EY.

5. Vakum merk Gast, Model DOA-P104-BN.

6. Penyaring Whatman

a. Organic Solvent Membrane Filter dengan ukuran pori 0,5 µm, diameter 47

mm, Cat. No. 7585 004.


30

b. Anorganic Solvent Membrane Filter dengan ukuran pori 0,45 µm, diameter

47 mm, Cat. No. 7184 004.

7. Membrane Filter Holder merk Whatman dengan kapasitas 300 ml, Cat. No. 1960

004.

8. Potensiometer

9. Penyaring Milipore

10. Mikropipet Socorex ukuran 200-1000 µl dan 100-500 µl

11. Neraca analitik merk Scaltec SBC 22 max 60/210 g; d = 0,01/0,1 mg; e = 1 mg

12. Seperangkat alat-alat gelas merk Pyrex.

E. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan fase gerak

Fase gerak yang digunakan dalam penelitian menggunakan menggunakan

campuran metanol dan buffer fosfat pH 3,2 dengan perbandingan 30 : 70 dan 10 : 90.

Buffer dibuat dengan melarutkan lebih kurang 7,5 gram Na2HPO4 dalam 500,0 mL

aquabidest kemudian pH dibuat sampai 3,20 dengan asam asetat glassial p.a

menggunakan alat potensiometer kemudian ditambah aquabidest sampai 1000,0 ml.

Masing-masing perbandingan fase gerak dibuat dalam labu takar 1000,0 ml

kemudian digojog dan disaring dengan penyaring Whatman anorganik dengan

bantuan pompa vakum. Fase gerak kemudian didegassing selama 15 menit.


31

2. Pembuatan larutan baku parasetamol dan natrium fenobarbital

a. Pembuatan larutan stok parasetamol. Menimbang seksama lebih kurang 50

mg serbuk parasetamol dan dilarutkan dengan 3,0 ml metanol p.a kemudian

ditambah buffer fosfat pH 3,2 dalam labu ukur 10,00 ml sampai tanda.

b. Pembuatan larutan intermediet parasetamol. Mengambil 5,0 ml larutan stok

dimasukkan dalam labu ukur 10,00 ml kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH

3,2 sampai tanda.

c. Pembuatan larutan stok natrium fenobarbital. Menimbang seksama lebih

kurang 55 mg serbuk natrium fenobarbital dan dilarutkan dengan 5,0 ml metanol p.a

kemudian ditambah dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu ukur 25,0 ml sampai

tanda.

d. Pembuatan seri kurva baku parasetamol. Memipet sebanyak 0,280 ml dan

0,560 ml larutan intermediet parasetamol, dan memipet sebanyak 0,420; 0,560; dan

0,700 ml larutan stok parasetamol. Masing-masing larutan tersebut kemudian

diencerkan dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar 10,00 ml sampai tanda.

Hingga diperoleh lima seri larutan baku parasetamol (0,07; 0,14; 0,21; 0,28 dan 0,35

mg/ml). Disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Replikasi

dilakukan sebanyak 3 kali.

e. Pembuatan seri kurva baku natrium fenobarbital. Memipet sebanyak 2,30;

2,80; 3,40; 4,00 ml larutan stok natrium fenobarbital, dan larutan stok fenobarbital

digunakan sebagai seri ke-5. Masing-masing larutan tersebut kemudian diencerkan

dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar 5,00 ml sampai tanda. Hingga


32

diperoleh lima seri larutan baku natrium fenobarbital (1; 1,25; 1,5; 1,75 dan 2,2

mg/ml). Disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Replikasi


f. Pembuatan campuran parasetamol dan natrium fenobarbital untuk

penetapan kadar. Menimbang seksama lebih kurang 15 mg natrium fenobarbital dan

dicampur homogen dengan 166,7 mg parasetamol (ditimbang seksama lebih kurang),

dilarutkan dengan 3 ml metanol kemudian ditambah buffer fosfat pH 3,2 dalam labu

takar 10,00 ml sampai tanda.

3. Pengamatan panjang gelombang pengamatan parasetamol dan natrium

fenobarbital dengan spektrofotometer UV

Menimbang seksama lebih kurang 10 mg parasetamol, dilarutkan dengan

3,0 ml metanol kemudian ditambah dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar

10,00 ml sampai tanda. Memipet sebanyak 50,0; 70,0 dan 90,0 µl larutan stok

kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar 10,00 ml sampai

tanda. Larutan ini dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 200-300 nm

dengan spektrofotometer UV. Kemudian diperoleh kurva hubungan panjang

gelombang dan absorbansi parasetamol.

Menimbang seksama lebih kurang 10 mg natrium fenobarbital, dilarutkan

dengan 3,0 ml metanol ditambah dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar 10,00

ml sampai tanda. Memipet sebanyak 500,0; 700,0 dan 900,0 µl larutan stok

kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar 10,00 ml sampai


33

tanda. Larutan ini dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 200-300 nm

dengan spektrofotometer UV. Kemudian diperoleh kurva hubungan panjang

gelombang dan absorbansi natrium fenobarbital.

Selanjutnya dari kurva parasetamol dan natrium fenobarbital tersebut,

spektra ditumpangtindihkan untuk mengetahui panjang gelombang pengamatan pada

deteksi dengan KCKT fase terbalik.

4. Optimasi pemisahan parasetamol dan natrium fenobarbital dalam

campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dengan perbandingan 11 : 1

dengan KCKT fase terbalik

a. Pengamatan waktu retensi parasetamol. Mengambil 0,420 ml larutan stok

parasetamol kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar

10,00 ml sampai tanda, hingga mencapai konsentrasi 0,21 mg/ml. Disaring dengan

milipore dan didegassing selama 15 menit. Kemudian sebanyak 50,0 µl larutan

disuntikkan ke dalam sistem KCKT dengan kolom ODS (5 mm x 30 cm). Optimasi

dilakukan pada panjang gelombang pengamatan. Perbandingan fase gerak dan

kecepatan alir pada sistem KCKT diubah-ubah hingga waktu retensi parasetamol dan

natrium fenobarbital berbeda jauh. Perbandingan fase gerak buffer fosfat pH 3,2 :

metanol yang digunakan adalah 70 : 30 dan 90 : 10 (point 1). Kecepatan alir yang

digunakan adalah 1 dan 1,5 ml/menit.

b. Pengamatan waktu retensi natrium fenobarbital. Mengambil sejumlah 3,40

ml larutan stok natrium fenobarbital kemudian diencerkan dengan buffer fosfat pH


34

3,2 dalam labu takar 10,00 ml sampai tanda, hingga mencapai konsentrasi 1,5 mg/ml.

Disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Kemudian sebanyak

50,0 µl larutan disuntikkan ke dalam sistem KCKT dengan kolom ODS (5 mm x 30

cm). Optimasi dilakukan pada panjang gelombang pengamatan. Perbandingan fase

gerak dan kecepatan alir pada sistem KCKT diubah-ubah hingga waktu retensi

natrium fenobarbital berbeda jauh dengan parasetamol. Perbandingan fase gerak

buffer fosfat pH 3,2 : metanol yang digunakan adalah 70 : 30 dan 90 : 10 (point 1).

Kecepatan alir yang digunakan adalah 1 dan 1,5 ml/menit. Kemudian berdasarkan

kromatogram 2 senyawa, harga tR dari masing-masing kromatogram dibandingkan

untuk melihat pemisahan puncak parasetamol dan natrium fenobarbital. Replikasi


c. Pemisahan campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sistem

KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi. Menimbang seksama lebih kurang 15 mg

natrium fenobarbital dan dicampur homogen dengan 166,7 mg parasetamol

(ditimbang seksama lebih kurang), kemudian dilarutkan dengan buffer fosfat pH 3,2

dalam labu takar 10,00 ml, hingga menghasilkan perbandingan tertentu parasetamol

dan natrium fenobarbital (11 : 1). Disaring dengan milipore dan didegassing selama

15 menit. Kemudian sebanyak 50,0 µl larutan disuntikkan ke dalam sistem KCKT

dengan kolom ODS (5 mm x 30 cm) menggunakan fase gerak dan kecepatan alir

hasil optimasi. Kemudian mengamati kromatogram natrium fenobarbital yang terjadi

pada panjang gelombang pengamatan. Mengambil sebanyak 0,125 ml larutan

campuran tersebut kemudian dilarutkan dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar


35

10,00 ml. Disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Kemudian

sebanyak 50,0 µl larutan disuntikkan ke dalam sistem KCKT dengan kolom ODS (5

mm x 30 cm). Menggunakan fase gerak dan kecepatan alir hasil optimasi, kemudian

mengamati kromatogram parasetamol yang terjadi pada panjang gelombang

pengamatan. Melakukan penghitungan nilai resolusi dari pemisahan campuran

parasetamol dan natrium fenobarbital.

5. Optimasi penetapan kadar parasetamol dan natrium fenobarbital dalam

campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dengan perbandingan 11 : 1

dengan KCKT fase terbalik

a. Pembuatan persamaan kurva baku parasetamol. Sebanyak 50,0 µl masing-

masing seri larutan baku disuntikkan ke dalam sistem KCKT dengan kolom ODS (5

mm x 30 cm), menggunakan perbandingan fase gerak dan kecepatan alir yang sudah

dioptimasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali dan dipilih persamaan kurva baku

untuk parasetamol yang paling baik.

b. Pembuatan persamaan kurva baku natrium fenobarbital. Sebanyak 50,0 µl

masing-masing seri larutan baku disuntikkan ke dalam sistem KCKT dengan kolom

ODS (5 mm x 30 cm), menggunakan perbandingan fase gerak dan kecepatan alir

yang sudah dioptimasi. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali dan dipilih persamaan

kurva baku untuk natrium fenobarbital yang paling baik.

c. Penetapan kadar parasetamol dan natrium fenobarbital dalam campuran

parasetamol dan natrium fenobarbital dengan KCKT. Larutan campuran parasetamol


36

dan natrium fenobarbital dengan perbandingan 11 : 1 untuk penetapan kadar (point

2.e). Disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Kemudian


mm x 30 cm) menggunakan fase gerak dan kecepatan alir hasil optimasi.

Menghitung kadar natrium fenobarbital yang ada dalam campuran dengan

menggunakan persamaan kurva baku. Mengambil sebanyak 0,125 ml larutan

campuran tersebut kemudian dilarutkan dengan buffer fosfat pH 3,2 dalam labu takar

10 ml. Disaring dengan milipore dan didegassing selama 15 menit. Kemudian


mm x 30 cm) menggunakan fase gerak dan kecepatan alir hasil optimasi.

Menghitung kadar parasetamol yang ada dalam campuran dengan menggunakan

persamaan kurva baku. Replikasi dilakukan sebanyak 6 kali.

6. Validasi metode penetapan kadar parasetamol dan natrium fenobarbital

dalam campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dengan perbandingan

11 : 1 dengan KCKT fase terbalik

Kesahihan dari metode yang digunakan dalam penetapan kadar parasetamol

dan natrium fenobarbital dalam campuran secara KCKT fase terbalik dapat

ditentukan berdasarkan parameter berikut.


37

a. Akurasi

Akurasi metode analisis dinyatakan dengan recovery.

100% diketahuikadar

kurkadar terucov% xeryre = (10)

Jika nilai % recovery dari 6 kali replikasi parasetamol berada pada rentang

90-110 %, dan nilai % recovery dari 6 kali replikasi natrium fenobarbital berada pada

rentang 80-120 % maka metode ini dinilai memiliki akurasi yang baik (Anonimc,

2004).

b. Presisi

Presisi metode analisis dinyatakan dengan % koefisien variasi (KV).

100% kurkadar teru rerata

SE=KV% x (11)

Jika nilai % koefisien variasi parasetamol kurang dari sama dengan 5 %,

dan % koefisien variasi natrium fenobarbital kurang dari sama dengan 10 %, maka

metode ini dinilai memiliki presisi yang baik (Anonimc, 2004).

c. Limit of Detection (LOD)

Jumlah terkecil analit dalam sampel yang masih dapat terdeteksi, tetapi

tidak perlu terkuantifikasi secara tepat dinyatakan dalam LOD. Nilainya dapat


38

ditentukan dengan mengukur Ys yaitu kadar analit yang memberikan respon sebesar

respon blangko (Yb) ditambah dengan 3 simpangan baku blangko (3Sb). Kemudian

LOD merupakan nilai x dengan memasukkan Ys sebagai AUC.

d. Limit of Quantification (LOQ)

Jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat terkuantifikasi dan

memenuhi standar presisi di bawah kondisi penelitian yang ditentukan, dapat

dinyatakan dalam LOQ. Nilainya ditentukan dengan mengukur Ys yaitu kadar analit

yang memberikan respon sebesar respon blangko (Yb) ditambah dengan 10

simpangan baku blangko (10Sb). Kemudian LOQ merupakan nilai x dengan

memasukkan Ys sebagai AUC.

F. Analisis Hasil

1. Luas area kromatogram (AUC = Area Under The Curve) dari berbagai seri baku

digunakan untuk membuat kurva baku menggunakan persamaan regresi linear y

= bx + a yang merupakan hubungan antara kadar dengan luas area yang

dihasilkan.

2. Penetapan kadar parasetamol dan natrium fenobarbital menggunakan persamaan

kurva baku yang diperoleh, dengan memasukkan AUC yang diperoleh sebagai y.


39

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penyiapan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan pada penelitian ini mengacu pada metode Lunn

dan Schmuff (1997) yang menggunakan metode KCKT untuk analisis farmasetik

parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel biologis. Fase gerak yang

digunakan pada metode tersebut adalah campuran asetonitril dan buffer fosfat pH 3,2

dengan menggunakan sistem elusi gradien perbandingan 5 : 95 sampai 22 : 78

selama 24 menit. Pada penelitian ini, fase gerak asetonitril diganti dengan metanol

dengan perbandingan metanol dan buffer fosfat pH 3,2 yang akan dioptimasi adalah

10 : 90 dan 30 : 70. Komposisi pelarut organik pada penelitian ini lebih banyak

dibanding metode Lunn dan Schmuff (1997) supaya kepolaran campuran fase gerak

mirip dengan kepolaran campuran fase gerak yang digunakan oleh Lunn dan

Schmuff (1997), karena kepolaran metanol lebih rendah dibanding asetonitril.

Sedangkan optimasi dilakukan untuk mengetahui komposisi mana yang optimum

digunakan pada KCKT dengan sistem elusi isokratik.

Pada penelitian ini buffer fosfat merupakan campuran garam dinatrium

hidrogen fosfat (pKa 9) dengan asam asetat, pH diatur hingga mencapai 3,2

menggunakan alat potensiometer yang telah dikalibrasi. Larutan buffer sanga t mudah

ditumbuhi mikroba, maka harus disimpan dalam lemari pendingin dan pembuatannya

selalu baru. Alasan penggunaan buffer fosfat dengan pH 3,2 adalah supaya buffer


40

memiliki tingkat keasaman yang cukup untuk mengubah natrium fenobarbital

menjadi asam fenobarbiturat, sesuai dengan metode yang telah dilakukan Lunn dan

Schmuff (1997).

Metanol digunakan sebagai salah satu campuran fase gerak pada penelitian

ini karena kelarutan parasetamol dan natrium fenobarbital yang baik dalam metanol,

selain itu metanol memiliki viskositas yang rendah 0,54 cP, sehingga penggunaan

metanol dapat mengurangi tekanan pada kolom dan meningkatkan efisiensi kolom

untuk memisahkan parasetamol dan natrium fenobarbital.

Campuran fase gerak metanol dan buffer fosfat pH 3,2 bersifat polar,

sedangkan fase diam yang digunakan adalah kolom oktadesilsilan (C18) yang bersifat

nonpolar sehingga sistem kromatografi yang digunakan adalah kromatografi partisi

fase terbalik.

B. Pembuatan Larutan Baku

Larutan baku dibuat dalam konsentrasi tertentu dengan menggunakan

pelarut campuran metanol p.a dan buffer fosfat pH 3,2. Pelarut tersebut memenuhi

syarat pelarut yang dapat digunakan dalam sistem KCKT yaitu memiliki kemurnian

yang tinggi, dapat bercampur dengan fase gerak serta mudah terelusi.

Parasetamol dan natrium fenobarbital sulit larut dalam buffer fosfat pH 3,2

maka sejumlah tertentu parasetamol dan natrium fenobarbital dilarutkan terlebih

dahulu dengan metanol p.a didasarkan pada kelarutan kedua senyawa tersebut dalam

metanol.


41

Larutan baku parasetamol dan natrium fenobarbital dibuat dalam 5 seri

konsentrasi. Untuk parasetamol konsentrasinya 0,07 mg/ml, 0,14 mg/ml, 0,21 mg/ml,

0,28 mg/ml dan 0,35 mg/ml. Sedangkan untuk natrium fenobarbital konsentrasinya 1

mg/ml, 1,25 mg/ml, 1,5 mg/ml, 1,75 mg/ml dan 2,2 mg/ml.

Pemilihan seri larutan baku ini didasarkan pada perbandingan konsentrasi

parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel yaitu 11 : 1 (16,67 mg/ml : 1,5

mg/ml). Secara teoritis probabilitas transisi elektron parasetamol lebih besar

dibanding asam fenobarbiturat. Dengan demikian parasetamol akan memiliki daya

serap molar yang lebih besar dibanding natrium fenobarbital. Berdasarkan alasan

tersebut maka dilakukan pengenceran sebanyak + 80 kali terhadap konsentrasi

parasetamol 16,67 mg/ml dalam sampel hingga mencapai konsentrasi 0,21 mg/ml

supaya respon absorbansinya tidak jauh berbeda dengan natrium fenobarbital.

Dengan demikian masing-masing konsentrasi sampel merupakan

konsentrasi tengah dari kurva baku, hal ini bertujuan supaya persamaan kurva baku

yang diperoleh nantinya dapat digunakan untuk menetapkan kadar sampel.

C. Optimasi Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Parasetamol dan

Natrium Fenobarbital dengan Spektrofotometer UV

Penentuan panjang gelombang pengamatan bertujuan untuk menge tahui

panjang gelombang di mana parasetamol dan natrium fenobarbital sama-sama

memberikan serapan yang optimal untuk dibaca pada KCKT. Untuk menentukan

panjang gelombang pengamatan, perlu dilakukan scanning ?maks parasetamol dan


42

natrium fenobarbital menggunakan spektrofotometer UV, yang bertujuan untuk

mengetahui panjang gelombang di mana parasetamol dan natrium fenobarbital dalam

pelarut metanol dan buffer fosfat pH 3,2 memberikan serapan yang maksimum saat

dikenai sinar UV.

Penentuan ?maks dilakukan menggunakan 3 seri kadar dengan tujuan untuk

meyakinkan hasil yang didapat benar-benar panjang gelombang serapan maksimum

dari senyawa tersebut. Sehingga nantinya ?maks dapat digunakan untuk analisis

kualitatif senyawa tersebut dalam pelarut metanol dan buffer fosfat pH 3,2, karena

?maks bersifat khas untuk suatu senyawa. Penggunaan 3 seri kadar juga diperlukan

untuk memastikan kebenaran senyawa yang digunakan, dengan membandingkan

panjang gelombang serapan maksimum yang diperoleh dengan panjang gelombang

serapan maksimum dari literatur. Hal ini diperlukan karena parasetamol dan natrium

fenobarbital yang digunakan memiliki kualitas working standard.

Pembacaan serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-300

nm karena berdasarkan literatur parasetamol dan natrium fenobarbital memiliki

panjang gelombang serapan maksimum pada rentang tersebut.

Syarat suatu senyawa untuk dapat ditetapkan kadarnya secara

spektrofotometri ultraviolet harus memiliki gugus kromofor yang bertanggung jawab

dalam penyerapan radiasi ultraviolet. Baik parasetamol maupun natrium fenobarbital

memiliki gugus kromofor yang merupakan ikatan rangkap yang memiliki elektron p

yang mudah tereksitasi ke tingkat yang lebih tinggi yaitu orbital p*. Selain memiliki

gugus kromofor, parasetamol dan natrium fenobarbital juga memiliki gugus


43

auksokrom yang terikat langsung pada gugus kromofor. Gugus auksokrom

merupakan suatu gugus yang memiliki pasangan elektron bebas pada orbital n yang

kemudian dapat berinteraksi dengan elektron p pada kromofor. Dengan demikian,

gugus auksokrom ini berperan dalam pergeseran panjang gelombang dan intensitas

serapan maksimum dari parasetamol dan natrium fenobarbital. Gambar gugus

kromofor dan auksokrom dari masing-masing senyawa dapat dilihat pada gambar

berikut.

OH

HNC

O

CH3

Gambar 6. Gugus kromofor dan auksokrom parasetamol Keterangan : ---------- = kromofor

---------- = auksokrom

NH

HN O

Na

O

O

C2H5

Gambar 7. Gugus kromofor dan auksokrom natrium fenobarbital Keterangan : ---------- = kromofor

---------- = auksokrom


44

Dalam Farmakope Indonesia Edisi IV (1995) disebutkan bahwa pengujian

panjang gelombang serapan maksimum mempunyai makna jika serapan maksimum

tersebut tepat atau dalam batas 2 nm dari panjang gelombang yang ditentukan.

Spektrum serapan yang dihasilkan oleh parasetamol dan natrium fenobarbital dapat

dilihat pada gambar berikut.

Gambar 8. Spektrum serapan parasetamol (?maks = 245 nm) Keterangan : A = konsentrasi 0,005 mg/ml; B = konsentrasi 0,007 mg/ml;

C = konsentrasi 0,009 mg/ml

Pada gambar tersebut terlihat bahwa ketiga seri kadar parasetamol yang

dilarutkan dalam metanol dan buffer fosfat pH 3,2 semua memiliki serapan

maksimum pada panjang gelombang 245 nm. Menurut Clarke (1969), parasetamol

dalam larutan asam memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 245 nm.

Dengan demikian pada penelitian ini panjang gelombang serapan maksimum

parasetamol yang diperoleh sama dengan panjang gelombang serapan maksimum

parasetamol secara teoritis. Berarti dapat dipastikan bahwa senyawa tersebut adalah


45

parasetamol karena memenuhi ketentuan yang disebutkan dalam Farmakope

Indonesia Edisi IV.

Gambar 9. Spektrum serapan natrium fenobarbital (?maks = 236 nm) Keterangan : A = konsentrasi 0,05 mg/ml; B = konsentrasi 0,07 mg/ml;

C = konsentrasi 0,09 mg/ml

Pada gambar tersebut terlihat bahwa ketiga seri kadar natrium fenobarbital

dalam pelarut metanol dan buffer fosfat pH 3,2 yang diuji memiliki panjang

gelombang serapan maksimum 236 nm. Hal ini menunjukkan bahwa panjang

gelombang 236 nm benar-benar merupakan panjang gelombang di mana natrium

fenobarbital memberikan serapan yang maksimum.

Analisis dengan KCKT memerlukan suatu panjang gelombang di mana

kedua senyawa dapat memberikan absorbansi yang optimal untuk dibaca pada

KCKT, yang dinamakan panjang gelombang pengamatan. Spektrum yang dihasilkan

dari parasetamol 0,009 mg/ml ditumpangtindihkan dengan spektrum natrium

fenobarbital 0,09 mg/ml sehingga didapat gambar seperti berikut.


46

Gambar 10. Gabungan spektrum serapan parasetamol (A) konsentrasi 0,009 mg/ml dan natrium fenobarbital (B) konsentrasi 0,09 mg/ml

Pada gambar 10 dapat terlihat bahwa pada perbandingan 1:10 natrium

fenobarbital baru dapat memberikan absorbansi yang mirip dengan parasetamol.

Sehingga berdasarkan spektrum tumpang tindih tersebut, panjang gelombang

pengamatan yang dipilih adalah 236 nm yang merupakan panjang gelombang

serapan maksimum dari natrium fenobarbital. Panjang gelombang ini dipilih supaya

natrium fenobarbital dapat terdeteksi karena absorbansi natrium fenobarbital sangat

kecil dibandingkan parasetamol. Selain itu pada gambar 10 dapat terlihat juga bahwa

parasetamol dapat memberikan absorbansi pada panjang gelombang 236 nm.

D. Optimasi Pemisahan Parasetamol dan Natrium Fenobarbital dengan

KCKT Fase Terbalik

Campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dipisahkan dengan KCKT

jenis kromatografi partisi fase terbalik. Fase diam yang digunakan adalah

oktadesilsilan (C18) yang bersifat nonpolar, sedangkan fase gerak yang digunakan


47

adalah campuran metanol dan buffer fosfat pH 3,2 yang bersifat polar. Dengan

demikian, sampel yang bersifat lebih polar akan terelusi lebih dulu sedangkan sampel

yang lebih nonpolar akan terelusi belakangan karena tertambat pada fase diam

(Willard dkk, 1988).

Pada kromatografi fase terbalik, ionisasi analit harus diminimalkan supaya

analit tidak terlalu polar dan tetap dapat berinteraksi dengan fase diam oktadesilsilan

(C18) yang bersifat nonpolar. Maka pada penelitian ini digunakan buffer asam sebagai

pelarut dan fase gerak, untuk mengubah garam natrium fenobarbital menjadi bentuk

asamnya, supaya tidak mengalami ionisasi dan dapat berinteraksi dengan fase diam.

Apabila digunakan aquabidest sebagai fase gerak, garam natrium fenobarbital akan

larut dan berubah menjadi spesies ion yang tidak dapat berinteraksi dengan fase diam

akibatnya kromatogram natrium fenobarbital tidak dapat diamati.

Dengan demikian untuk selanjutnya natrium fenobarbital akan disebut

sebagai asam fenobarbiturat dalam penelitian ini, kecuali dalam perhitungan kurva

baku dan sampel. Reaksi antara buffer fosfat pH 3,2 dengan natrium fenobarbital,

membentuk asam fenobarbiturat (fenobarbital) adalah sebagai berikut.

+ NH

HN O

Na

O

O

C2H5NH

HN O

H

O

O

C2H5

+

natrium fenobarbital asam fenobarbiturat

P OHO

OH

OH

P OHO

OH

O Na

asam fosfat natrium dihidroksi fosfat

Gambar 11. Reaksi antara natrium fenobarbital dengan asam fosfat


48

Pemisahan pada KCKT dipengaruhi oleh interaksi suatu analit dengan fase

diam dan fase gerak. Parasetamol dan asam fenobarbiturat yang terbentuk memiliki

gugus polar dan nonpolar. Gugus polar akan berinteraksi dengan fase gerak melalui

ikatan hidrogen, sedangkan gugus nonpolar akan berinteraksi dengan fase diam

oktadesilsilan melalui ikatan van der Waals. Gambar gugus nonpolar dari

parasetamol dan asam fenobarbiturat yang akan membentuk ikatan van der Waals

dengan fase diam adalah sebagai berikut.

HOHN C

O

CH3 NH

HN O

O

O

C2H5

(A) (B)

Gambar 12. Gugus nonpolar dari parasetamol (A) dan asam fenobarbiturat (B) yang berinteraksi dengan fase diam

Keterangan : = gugus nonpolar

Pada gambar di atas dapat terlihat bahwa asam fenobarbiturat memiliki

gugus nonpolar yang lebih banyak dibanding parasetamol. Dengan demikian asam

fenobarbiturat akan lebih tertahan pada fase diam dibandingkan parasetamol,

sehingga waktu retensinya lebih lama. Waktu retensi (tR) merupakan waktu yang

dibutuhkan suatu senyawa untuk keluar dari kolom.

Perbandingan fase gerak campuran metanol dan buffer fosfat pH 3,2,

maupun kecepatan alirnya harus dioptimasi terlebih dahulu untuk memperoleh

pemisahan parasetamol dan asam fenobarbiturat yang optimum. Seperti yang


49

disebutkan sebelumnya, pada penelitian ini perbandingan fase gerak buffer fosfat pH

3,2 : metanol yang dioptimasi adalah 90 : 10 dan 70 : 30, sedangkan kecepatan alir

yang dioptimasi adalah 1 dan 1,5 ml/menit.

Komposisi fase gerak dan kecepatan alir yang optimum ditentukan dari

resolusi kromatogram yang dihasilkan. Resolusi merupakan suatu pemisahan yang

nyata antara dua kromatogram yang berdekatan. Suatu pemisahan yang baik

memiliki resolusi yang lebih dari atau sama dengan 1,5, berarti terjadi pemisahan

antara kedua senyawa > 99,7% (Sastrohamidjojoa, 2002). Kromatogram parasetamol

dan asam fenobarbiturat yang diperoleh dapat dilihat pada gambar berikut.


50

Gambar 13. Puncak parasetamol (a) dan asam fenobarbiturat (b) Keterangan : Fase gerak buffer fosfat pH 3,2 : metanol (70 : 30)

Fase diam oktadesilsilan Kecepatan alir 1 ml/menit Deteksi UV 236 nm


51


Fase diam oktadesilsilan Kecepatan alir 1,5 ml/menit Deteksi UV 236 nm


52


Fase diam oktadesilsilan Kecepatan alir 1 ml/menit Deteksi UV 236 nm


53


Fase diam oktadesilsilan Kecepatan alir 1,5 ml/menit Deteksi UV 236 nm


54

Berdasarkan kromatogram optimasi pemisahan tersebut, terlihat bahwa peak

parasetamol mengalami tailing yang disebabkan karena parasetamol memiliki gugus

amin yang akan berinteraksi dengan gugus silanol di dalam kolom. Adanya interaksi

ini dapat menyebabkan pengekoran pada kurva parasetamol, karena sebagian analit

terlambat keluar dari kolom. Tailing juga terjadi pada kromatogram asam

fenobarbiturat karena asam fenobarbiturat juga memiliki gugus amin. Tailing juga

dapat terjadi karena parasetamol dan asam fenobarbiturat memiliki kelarutan rendah

dalam fase gerak yang sebagian besar komposisinya adalah buffer fosfat pH 3,2. Hal

ini menyebabkan analit yang sama-sama memiliki gugus nonpolar tertahan pada

kolom lebih lama, baru kemudian larut pada fase gerak sedikit demi sedikit sehingga

menyebabkan pengekoran kromatogram. Sedangkan munculnya double peak pada

kromatogram parasetamol dan natrium fenobarbital disebabkan karena pelarut yang

digunakan (buffer fosfat pH 3,2:metanol 70:30) memiliki kekuatan ionik yang lebih

besar dibandingkan fase gerak (buffer fosfat pH 3,2:metanol 90:10).

Resolusi kromatogram parasetamol dan asam fenobarbiturat yang diperoleh

dapat dilihat pada tabel berikut.


55

Tabel IV. Resolusi pemisahan parasetamol 0,21 mg/ml dan asam fenobarbiturat 1,5 mg/ml pada KCKT

Buffer fosfat

pH 3,2 : metanol

Kecepatan alir (ml/menit)

Rep Resolusi Keterangan

1 0,35 2 0,32 3 0,37

X 0,35

1

SD 0,03

Tidak memisah

1 0,28 2 0,3 3 0,33

X 0,30

70 : 30

1,5

SD 0,03

Tidak memisah

1 1,79 2 1,63 3 1,56

X 1,66

1

SD 0,12

Memisah

1 1,7 2 1,65 3 1,55

X 1,63

90 : 10

1,5

SD 0,08

Memisah

Berdasarkan data yang diperoleh, komposisi buffer fosfat pH 3,2 : metanol

yang dipilih adalah komposisi 90 : 10 karena dapat memisahkan kromatogram

parasetamol dan asam fenobarbiturat dengan resolusi yang baik sedangkan pada

komposisi 70 : 30 parasetamol dan asam fenobarbiturat tidak dapat memisah.

Komposisi fase gerak 90 : 10 mengandung lebih banyak buffer fosfat pH

3,2, sehingga lebih banyak menyumbangkan ion H+ yang diperlukan untuk

membentuk asam fenobarbiturat. Pada komposisi fase gerak 70 : 30 asam


56

fenobarbiturat memiliki waktu retensi yang lebih cepat, karena sebagian analit

kemungkinan masih berada dalam bentuk garam/ ion yang lebih menyukai fase

gerak, sehingga menyebabkan pemisahannya dengan parasetamol tidak sempurna.

Berdasarkan tabel IV, pada komposisi fase gerak 90 : 10, kedua kecepatan

alir yang dioptimasi memberikan hasil yang memenuhi persyaratan resolusi > 1,5.

Akan tetapi kecepatan alir yang dipilih adalah 1,5 ml/menit. Alasan pemilihan ini

adalah karena kecepatan alir 1,5 ml/menit memiliki tingkat reprodusibilitas yang

lebih baik daripada kecepatan alir 1 ml/menit, hal ini terlihat pada besarnya standar

deviasi dari resolusi yang dihasilkan dari tiga kali replikasi. Selain itu, waktu retensi

asam fenobarbiturat lebih pendek pada kecepatan alir 1,5 ml/menit dibanding

kecepatan alir 1 ml/menit karena adanya tekanan yang lebih besar pada kolom. Hal

ini sangat penting untuk efisiensi waktu kerja dalam analisis.

Dengan demikian, selanjutnya analisis campuran parasetamol dan natrium

fenobarbital dengan metode KCKT menggunakan fase gerak metanol : buffer fosfat

pH 3,2 dengan perbandingan 90 : 10 dan kecepatan alir 1,5 ml/menit.

E. Optimasi Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium Fenobarbital

dengan KCKT Fase Terbalik

Pembuatan kurva baku parasetamol dan natrium fenobarbital untuk

penetapan kadar dilakukan sebanyak 3 kali replikasi. Persamaan kurva baku yang

diperoleh menyatakan hubungan yang linier antara konsentrasi analit dengan AUC

(Area Under the Curve) yang dihasilkan. Parameter linearitas yang digunakan adalah


57

koefisien korelasi (r), yang menunjukkan korelasi atau hubungan antara konsentrasi

dengan AUC. Dari ketiga replikasi kurva baku yang diperoleh, kemudian dipilih satu

kurva yang kemudian akan digunakan untuk analisis kuantitatif senyawa tersebut.

Pemilihan kurva baku didasarkan pada nilai r-nya yang lebih besar dari r tabel untuk

lima data dengan derajat bebas (db) = 3 yaitu sebesar 0,878 (taraf kepercayaan 95%).

Data persamaan kurva baku yang diperoleh dari parasetamol dan natrium

fenobarbital dapat dilihat pada tabel-tabel berikut.

Tabel V. Data kurva baku parasetamol

Replikasi I Replikasi II Replikasi III C

(mg/ml) AUC C

(mg/ml) AUC C

(mg/ml) AUC

0,0704 0,1408 0,2112 0,2816 0,352

2104400 3945868 5711632 7613654 9308203

0,0701 0,1402 0,2104 0,2805 0,3506

2000887 3787538 5610533 7495138 8583764

0,0704 0,1408 0,2111 0,2815 0,3519

1928215 3708519 5286410 7387241 9252065

A B r

314133,8 25675272,73

0,9998

A B r

434227,73 24060393,01

0,9963

A B r

13735,68 26043167,19

0,9990 Keterangan = merupakan data kurva baku parasetamol yang digunakan

Tabel VI. Data kurva baku natrium fenobarbital

Replikasi I Replikasi II Replikasi III C

(mg/ml) AUC C

(mg/ml) AUC C

(mg/ml) AUC

1,019 1,24 1,506 1,77

2,2144

2915335 3123870 3837280 4636561 5981528

1,013 1,233 1,498 1,76

2,2028

2554248 3372032 4211253 4892742 6047231

1,0166 1,24 1,503 1,77 2,21

2948199 3597697 3961215 4905167 6166657

A B r

-19515372 2657257,45

0,991

A B r

-253550,44 2899421,05

0,997

A B r

172807,72 2676481,52

0,993 Keterangan = merupakan data kurva baku natrium fenobarbital yang digunakan


58

Berdasarkan hasil yang diperoleh pada tabel V, data kurva baku yang

digunakan untuk parasetamol adalah replikasi I. Karena koefisien korelasi (r) yang

diperoleh merupakan yang paling tinggi dibanding replikasi yang lain. Kurva baku

tersebut memenuhi persyaratan linearitas karena memiliki nilai r > 0,99 (Anonimc,

2004).

Berdasarkan tabel VI, data kurva baku yang digunakan untuk natrium

fenobarbital adalah replikasi II. Karena koefisien korelasi (r) yang diperoleh juga

merupakan yang paling tinggi dibanding replikasi yang lain dan memenuhi

persyaratan linearitas dengan nilai r > 0,99 (Anonimc, 2004).

Dengan demikian persamaan kurva baku yang digunakan untuk analisis

kuantitatif parasetamol adalah y = 25675272,73 x + 314133,88 dan persamaan kurva

baku yang digunakan untuk analisis kuantitatif natrium fenobarbital adalah y =

2899421,05 x – 253550,44.

Analisis kuantitatif dilakukan pada sampel yang mengandung campuran

parasetamol dan natrium fenobarbital dengan perbandingan 11 : 1 (166,7 mg

parasetamol dan 15 mg natrium fenobarbital). Perbandingan ini disesuaikan dengan

perbandingan parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel di Rumah Sakit X.

Konsentrasi natrium fenobarbital dalam sampel adalah 1,5 mg/ml, sedangkan

konsentrasi parasetamol dalam sampel adalah 16,67 mg/ml.

Karena perbedaan konsentrasi kedua senyawa yang sangat besar, maka

pada penelitian ini parasetamol dan asam fenobarbiturat tidak dapat diamati

kromatogramnya secara bersamaan. Cara yang dilakukan adalah sampel tanpa


59

pengenceran disuntikkan ke dalam kolom terlebih dahulu untuk mengamati

kromatogram asam fenobarbiturat dengan attenuasi 7. Contoh kromatogram sampel

asam fenobarbiturat dapat dilihat pada gambar berikut.

Gambar 17. Kromatogram sampel asam fenobarbiturat replikasi 3

Pada kromatrogram tersebut asam fenobarbiturat memiliki waktu retensi

8,583 menit, waktu retensi ini sama dengan waktu retensi kromatogram asam

fenobarbiturat baku seperti terlihat pada tabel VII dengan demikian dapat dipastikan

bahwa kromatogram tersebut adalah kromatogram asam fenobarbiturat .

Tabel VII. Data waktu retensi (tR) masing-masing senyawa baku dan sampel

Senyawa tR baku (menit) tR sampel (menit) Parasetamol 3,236 3,100

Asam fenobarbiturat 8,525 8,583

Pada gambar 17, terlihat bahwa kromatogram parasetamol tidak dapat

terbaca karena peaknya terlalu tinggi. Maka untuk mendapatkan kromatogram

parasetamol dilakukan pengenceran sebanyak 80 kali terhadap sampel yang sama,


60

sampai diperoleh parasetamol dengan konsentrasi 0,21 mg/ml, kemudian disuntikkan

ke dalam kolom dengan attenuasi 9 menggunakan kondisi KCKT (komposisi fase

gerak serta kecepatan alir) yang sama dengan sampel sebelum diencerkan.

Kromatogram parasetamol yang tampak setelah dilakukan pengenceran sampel dapat

dilihat pada gambar berikut.

Gambar 18. Kromatogram sampel parasetamol replikasi 3

Berdasarkan kromatogram tersebut waktu retensi kromatogram sampel

parasetamol adalah 3, 100 menit, yang sama dengan waktu retensi parasetamol baku

sesuai dengan data pada tabel VII. Dengan demikian dapat dipastikan bahwa

kromatogram tersebut benar-benar merupakan kromatogram parasetamol.

Selanjutnya analisis kuantitatif dilakukan dengan cara menghitung kadar

parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel menggunakan persamaan kurva

baku yang diperoleh. Dari 6 kali replikasi, hasil yang diperoleh adalah sebagai

berikut.


61

Tabel VIII. Data kadar parasetamol dan natrium fenobarbital dalam sampel

Parasetamol Natrium fenobarbital Sampel AUC Kadar (mg/ml) AUC Kadar (mg/ml)

1 2 3 4 5 6

5658262 5745480 5914806 5829954 5682401 5581771

16,65 16,92 17,45 17,18 16,73 16,42

4225605 4033752 4044411 3952644 4048479 4114875

1,55 1,48 1,48 1,45 1,48 1,51

X 16,89 X 1,49 SD 0,37 SD 0,034

% KV 2,2 % % KV 2,3 %

Berdasarkan data tersebut, kadar parasetamol dan natrium fenobarbital

dalam sampel secara berturut-turut adalah (16,89+0,37) mg/ml dan (1,49+0,034)

mg/ml. Kesahihan hasil yang diperoleh tersebut dapat diketahui dengan melakukan

validasi metode penetapan kadar.

F. Validasi Metode Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium

Fenobarbital dalam campuran dengan Perbandingan 11 : 1 dengan Metode

KCKT Fase Terbalik

Kesahihan metode KCKT yang digunakan dalam penetapan kadar

parasetamol dan natrium fenobarbital ditentukan berdasarkan parameter berikut.

1. Akurasi

Akurasi dinyatakan dengan persen perolehan kembali (recovery) dari kadar

yang terukur terhadap kadar yang sebenarnya. Jika % recovery dari 6 kali replikasi

parasetamol semuanya berada pada rentang 90-110 % dan % recovery dari 6 kali


62

replikasi natrium fenobarbital semuanya berada pada rentang 80-120 % maka metode

ini dinyatakan memiliki akurasi yang baik (Anonimc, 2004). Persyaratan untuk

parasetamol lebih ketat disebabkan kadarnya dalam sampel >1 %b/v sedangkan

natrium fenobarbital konsentrasinya lebih rendah yaitu 0,15 %b/v maka

persyaratannya lebih longgar. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel IX. Data % recovery parasetamol dan natrium fenobarbital

Parasetamol Natrium fenobarbital Sampel AUC Recovery (%) AUC Recovery (%)

1 2 3 4 5 6

5658262 5745480 5914806 5829954 5682401 5581771

99,85 101,14 104,4 103,27 100,43 98,31

4225605 4033752 4044411 3952644 4048479 4114875

100,58 98,79 100,61 97,43 98,3

101,07

X 101,24 X 99,46 SE 0,91 SE 0,61

% KV 0,899 % % KV 0,613 %

Pada tabel IX dapat dilihat bahwa % recovery parasetamol sebanyak 6 kali

replikasi semuanya masuk dalam range 90-110% dan % recovery natrium

fenobarbital sebanyak 6 kali replikasi semuanya masuk dalam range 80-120%

dengan rata-rata 101,24% untuk parasetamol dan 99,46% untuk natrium fenobarbital,

sehingga dapat disimpulkan bahwa metode ini memiliki akurasi yang baik.


63

2. Presisi

Presisi suatu metode diukur dengan parameter % KV (koefisien variasi).

Menurut Anonimc (2004), metode KCKT dinyatakan memiliki presisi yang baik jika

% KV < 5 % untuk parasetamol dan % KV harus < 10 % untuk natrium

fenobarbital.

Berdasarkan hasil yang diperoleh, analisis kuantitatif parasetamol dengan

metode ini memiliki % KV 0,899%, sedangkan untuk natrium fenobarbital 0,613 %.

Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa metode ini memiliki presisi yang baik

untuk analisis kuantitatif campuran parasetamol dan natrium fenobarbital.

3. LOD

Penentuan LOD atau Limit of Detection diperlukan untuk mengetahui batas

minimum kadar parasetamol dan natrium fenobarbital yang masih dapat dianalisis

secara kualitatif, dengan menggunakan metode KCKT dengan fase gerak buffer

fosfat pH 3,2 : metanol perbandingan 90 : 10 dan kecepatan alir 1,5 ml/menit.

Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh LOD parasetamol sebesar 0,006

mg/ml sedangkan LOD untuk natrium fenobarbital adalah 0,124 mg/ml. Hal ini

berarti, di bawah kadar parasetamol dan natrium fenobarbital tidak dapat terdeteksi

menggunakan metode ini.


64

4. LOQ

Penentuan LOQ atau Limit of Quantification diperlukan untuk mengetahui

batas minimum kadar parasetamol dan natrium fenobarbital yang masih dapat

dianalisis secara kuantitatif, dengan menggunakan metode KCKT dengan fase gerak

buffer fosfat pH 3,2 : metanol perbandingan 90 : 10 dan kecepatan alir 1,5 ml/menit.

Berdasarkan hasil perhitungan diperoleh LOQ parasetamol sebesar 0,020

mg/ml sedangkan LOQ untuk natrium fenobarbital adalah 0,414 mg/ml. Dengan

demikian, kurang dari kadar tersebut parasetamol dan natrium fenobarbital tidak

dapat diukur kadarnya secara kuantitatif menggunakan metode ini dengan masih

memenuhi akurasi dan presisi.


65

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Kondisi yang optimum untuk memisahkan parasetamol dan natrium fenobarbital

dengan metode KCKT fase terbalik adalah :

Instrument : Shimadzu LC-10 AD

Kolom : C18 merk Waters Bondapac dengan panjang kolom 30

cm No. P61271B02

Fase gerak : buffer fosfat pH 3,2 : metanol (90 : 10)

Kecepatan alir : 1,5 ml/menit

AUFS/Attenuation : 0,01/7 untuk natrium fenobarbital dan 0,01/9 untuk

parasetamol

Detektor : UV pada 236 nm

2. Validitas metode KCKT terbukti dengan akurasi, presisi dan linearitas yang baik

untuk menetapkan kadar campuran parasetamol dan natrium fenobarbital dalam

sediaan pulveres. Dengan nilai LOD dan LOQ untuk parasetamol berturut-turut

0,006 mg/ml dan 0,020 mg/ml, sedangkan untuk natrium fenobarbital berturut-turut

0,124 mg/ml dan 0,414 mg/ml.


66

B. Saran

1. Perlu digunakan pelarut parasetamol dan natrium fenobarbital dengan kekuatan

ionik yang sama dengan fase gerak yaitu buffer fosfat pH 3,2 : metanol dengan

perbandingan 90 : 10.

2. Perlu dilakukan penambahan 30 mM trietilamin pada fase gerak atau

menggunakan kolom C18 end-capped untuk mencegah tailling pada kromatogram

parasetamol dan natrium fenobarbital.

3. Perlu dilakukan analisis kuantitatif campuran parasetamol dan natrium

fenobarbital dalam sampel pulveres di Rumah Sakit X dengan menggunakan metode

ini, sesuai dengan ketentuan dalam Farmakope Indonesia Edisi IV yang menyatakan

bahwa untuk zat aktif kurang dari 50 mg dapat dilakukan uji keseragaman sediaan;

dan Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No.

1197/MENKES/SK/X/2004 tentang Standar Pelayanan Farmasi di Rumah Sakit yang

menyatakan bahwa mutu obat yang diproduksi di Rumah Sakit harus sesuai dengan

CPOB (Cara Pembuatan Obat yang Baik).


67

DAFTAR PUSTAKA

Anonima, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 649, 660, 1009, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Anonimb, 2000, Informatorium Obat Nasional Indonesia 2000, 184, Departemen Kesehatan Republik Indonesia Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta.

Anonimc, 2004, Guidelines for the Validation of Analytical Methods for Active Constituent, Agricultural and Veterinary Chemical Products, 4-5, www.apvma.gov.au/guidlines/downloads/gl69_analytical__methoda.pdf. diakses pada tanggal 28 Agustus 2007

Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, 6th ed., 234,253,465, John Willey & Sons, Inc., USA.

Clarke, E. G. C., 1986, Isolation and identification of Drugs, Second Edition, 849-850, 883-884, The Pharmaceutical Press, London.

Dean, J. A., 1995, Analytical Chemistry Handbook, 464, McGraw-Hill, Inc., Newyork.

Djamhuri, Agus, 1995, Sinopsis Farmakologi dengan Terapan Khusus di Klinik dan Perawatan, diedit oleh P. J. Natanoor, Edisi I, 39-41, Hipokrates, Jakarta.

Gritter, R. J., Bobbit, J. M., and Schwarting, A. E., 1985, Introduction to Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, Edisi II, 205-219, Penerbit ITB, Bandung.

Heyrman, Aimee N., and Henry, Richard A., 2006, Importance of Controlling Mobile phase pH in Reversed Phase HPLC, http://www.hplcsupply.com/pdf/App_9.pdf, diakses tanggal 24 Juni 2007.


68

Harris, D. C., 1999, Quantitative Chemical Analysis, 2nd ed., 643, 648, 716-717, W. H. Freeman Company, New York.

Johnson, E. L., and Stevenson, R., 1978, Basic Liquid Chromatography, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 6-9, 17-25, Penerbit ITB, Bandung.

Kazakevich, Y. and Nair, H. M., 1996, Basic Liquid Chromatography Textbook on HPLC, http://HPLC.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book. Diakses pada 10 Desember 2004

Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, 3-5, 167-172, Penerbit Universitas Indonesia, Jakarta.

Lunn, George and Schmuff, Norman R., 1997, HPLC Methods for Pharmaceutical Analysis, 5-6, John Wiley & Sons Inc, New York.

Mulja, Muhammad H., dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 6-8, 26-28, 139-148, 155, 236-270, Airlangga University Press, Surabaya.

Mulja, M., dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Indonesia Airlangga, Vol. III No. 2, 71-76, Universitas Airlangga Press, Surabaya.

Rohman, Abdul, M.Si., Apt. dan Gandjar, Ibnu Gholib, Prof, Dr., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Cetakan kedua, 33, 323-345, 378-389, 456-470, Penerbit Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

Sastrohamidjojoa, Hardjono, Dr., 2002, Kromatografi, Cetakan ketiga, 71-72, Penerbit Liberty, Yogyakarta.


69

Sastrohamidjojob, Hardjono, Dr., 2002, Spektroskopi, 11, 22-32, Penerbit Liberty, Yogyakarta.

Skoog, D. A., Holler, F. J., and Nieman, T. A., 1988, Principles of Instrumental Analysis, 5th ed., 785, 794, 800, Harcourt Bace College, Philadelphia.

Snyder, L. R., Kirkland, J. J., and Glajh, J. L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2nd ed., 208-209, 236, Jhon Willey Sons, Inc., New York.

Willard, H. H., Merrit, Jr, Dean, J. A., and Settle Jr, F. A., 1988, Instrumental Methods of Analysis, 7th ed., 525-529, 580, 618, Wadworth Publshing Company, California.


70

Lampiran 1. Sertifikat analisis parasetamol


71

Lampiran 2. Sertifikat analisis natrium fenobarbital


72

Lampiran 3. Data penimbangan bahan

1. Penimbangan baku parasetamol dan natrium fenobarbital

Replikasi Parasetamol (mg)

Natrium Fenobarbital (mg)

1 50,29 55,36 2 50,09 55,25 3 50,27 55,07

2. Penimbangan sampel parasetamol dan natrium fenobarbital

Replikasi Parasetamol (mg)

Natrium Luminal (mg)

1 166,71 15,36 2 167,29 14,97 3 167,16 14,71 4 166,42 14,89 5 166,57 15,1 6 166,98 14,91


73

Lampiran 4. Spektra panjang gelombang serapan maksimum parasetamol

1. Spektra ?maks parasetamol konsentrasi 0,005 mg/ml



74



75

Lampiran 5. Spektra panjang gelombang serapan maksimum natrium

fenobarbital

1. Spektra ?maks natrium fenobarbital konsentrasi 0,05 mg/ml



76



77

Lampiran 6. Kromatogram baku parasetamol

1. Kromatogram parasetamol baku konsentrasi 0,0704 mg/ml


78



79



80



81



82

Lampiran 7. Kromatogram baku natrium fenobarbital

1. Kromatogram baku natrium fenobarbital 1,013 mg/ml


83



84



85



86



87

Lampiran 8. Kromatogram sampel parasetamol dan natrium fenobarbital

1. Kromatogram sampel natrium fenobarbital

a. Replikasi 1


88

b. Replikasi 2


89

c. Replikasi 3


90

d. Replikasi 4


91

e. Replikasi 5


92

f. Replikasi 6


93

2. Kromatogram sampel parasetamol

a. Replikasi 1


94

b. Replikasi 2


95

c. Replikasi 3


96

d. Replikasi 4


97

e. Replikasi 5


98

f. Replikasi 6


99

Lampiran 9. Contoh perhitungan kadar larutan baku parasetamol

1. Skema pembuatan

Menimbang seksama lebih kurang 50 mg parasetamol

¤

Dilarutkan dalam 3,0 ml metanol ad 10,00 ml dengan buffer fosfat pH 3,2

(larutan A)

¤

Memipet 5,0 ml larutan stok ad 10,00 ml dengan buffer fosfat pH 3,2 (larutan B)

¤

Memipet larutan intermediet sebanyak 0,280 dan 0,560 ml. Memipet larutan stok

sebanyak 0,420; 0,560 dan 0,700 masing-masing ad 10,00 ml dengan buffer

fosfat pH 3,2

2. Perhitungan seri kadar parasetamol

§ Bobot parasetamol hasil penimbangan = 50,29 mg

§ Kadar parasetamol dalam larutan A = 50,29 mg/10 ml = 5,029 mg/ml

§ Kadar parasetamol dalam larutan B = 029,5105

x = 2,5145 mg/ml

§ Seri larutan baku parasetamol

Kadar parasetamol seri 1 dan 2 = Blarukadarxlaruvolume

npengambilavolumetan

tan

Kadar parasetamol seri 3,4 dan 5 = Alarukadarxlaruvolume


tan


100

Seri kadar Perhitungan kadar parasetamol 1

5145,21028,0

x = 0,0704 mg/ml

2 5145,2

1056,0

x = 0,1408 mg/ml

3 029,5

1042,0

x = 0,2112 mg/ml

4 029,5

1056,0

x = 0,2816 mg/ml

5 029,5

1070,0

x = 0,352 mg/ml


101

Lampiran 10. Contoh perhitungan kadar larutan baku natrium fenobarbital

1. Skema pembuatan

Menimbang seksama lebih kurang 55 mg natrium fenobarbital

¤

Dilarutkan dalam 1,0 ml metanol ad 5,00 ml dengan buffer fosfat pH 3,2 (larutan

C)

¤

Memipet larutan A sebanyak 2,30; 2,80; 3,40 dan 4,00 ml masing-masing ad 5,00

ml dengan buffer fosfat pH 3,2. Larutan A digunakan sebagai seri ke-5 kurva

baku

2. Perhitungan seri kadar natrium luminal

§ Bobot natrium luminal hasil penimbangan = 55,07 mg

§ Kadar natrium luminal dalam larutan A = ml

mg25

07,55 = 2,2028 mg/ml

§ Seri larutan baku natrium luminal

Kadar natrium luminal = Clarukadarxlaruvolume


tan


102

Seri kadar Perhitungan kadar natrium luminal 1

2028,253,2

x = 1,013 mg/ml

2 2028,2

58,2

x = 1,233 mg/ml

3 2028,2

54,3

x = 1,498 mg/ml

4 2028,2

54

x = 1,76 mg/ml

5 2,2028 mg/ml


103

Lampiran 11. Perhitungan CV parasetamol dan natrium luminal dalam sampel

Parasetamol Natrium luminal Sampel AUC Recovery (%) AUC Recovery (%)

1 2 3 4 5 6

5658262 5745480 5914806 5829954 5682401 5581771

99,85 101,14 104,4 103,27 100,43 98,31

4225605 4033752 4044411 3952644 4048479 4114875

100,58 98,79 100,61 97,43 98,3

101,07 X 101,24 X 99,46 SD 2,24 SD 1,49

1. Perhitungan CV parasetamol

SE = 624,2

= 45,224,2

= 0,91

CV = X

SEx 100% = 0,899 %

2. Perhitungan CV natrium fenobarbital

SE = 649,1

= 45,249,1

= 0,61

CV = X

SEx 100% = 0,613 %


104

Lampiran 12. Perhitungan LOD dan LOQ parasetamol dan natrium

fenobarbital

A. Parasetamol

a. LOD

Baku kadar (mg/ml)

AUC y (y- y)2

0,0704 0,1408 0,2112 0,2816 0,352

2104400 3945868 5711632 7613654 9308203

2121673 3929212,2 5736751,4 7544290,6 9351829,8

298356529 277415673,64 630984256,36 4811281259,56 1903297678,24

S = 7921335390,8

Sy/x = 25

8,7921355390−

= 27,2640445130

= 51385,26

Ys-Yb = 3 Sb

Ys- B = 3 Sb

Ys - 314133,8 = 3 (51385,26)

Ys - 314133,8 = 154155,79

Ys = 468289,58

LOD adalah nilai x dengan memasukkan Ys sebagai AUC

468289,58 = 25675272,73(LOD) + 314133,8

LOD = 0,006 mg/ml


105

b. LOQ

Ys-Yb = 10 Sb

Ys- B = 10 Sb

Ys - 314133,8 = 10 (51385,26)

Ys - 314133,8 = 513852,6

Ys = 827986,4

LOQ adalah nilai x dengan memasukkan Ys sebagai AUC

827986,4 = 25675272,73(LOQ) + 314133,8

LOQ = 0,020 mg/ml

B. Natrium Fenobarbital

1. LOD

Baku kadar (mg/ml)

AUC y (y- y)2

1,013 1,233 1,498 1,76

2,2028

2554248 3372032 4211253 4892742 6047231

2683563,1 3321435,7 4089782,3 4849430,6 6133294,2

16722395088 2559985573,7 14755130958,3 1875877369,96 7406874394,24

S = 43320263384,2

Sy/x = 25

4,24332026338−

= 7,41444008779

= 120166,91

Ys-Yb = 3 Sb


106

Ys- B = 3 Sb

Ys + 253550,44 = 3 (120166,91)

Ys + 253550,44 = 360500,75

Ys = 106950,309

LOD adalah nilai x dengan memasukkan Ys sebagai AUC

106950,309 = 2899421,05(LOD) - 253550,44

LOD = 0,124 mg/ml

2. LOQ

Ys-Yb = 10 Sb

Ys- B = 10 Sb

Ys + 253550,44 = 10 (120166,91)

Ys + 253550,44 = 1201669,1

Ys = 948118,66

LOQ adalah nilai x dengan memasukkan Ys sebagai AUC

948118,66 = 2899421,05(LOQ) - 253550,44

LOQ = 0,414 mg/ml


107

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul ”Optimasi Pemisahan dan

Penetapan Kadar Campuran Parasetamol dan Natrium

Fenobarbital dengan Metode Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi Fase Terbalik” memiliki nama lengkap

Marischa Novita Lissanta. Penulis lahir di Bandung

pada tanggal 15 November 1986 sebagai anak sulung

pasangan Bambang Slamet Santoso dan Eko

Sulistyowati. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalah TK Santa

Maria Purwokerto (1990-1992), SD Marsudirini Yogyakarta (1992-1998), SLTP

Maria Immaculata Marsudirini Yogyakarta (1998-2001), SMA Stella Duce I

Yogyakarta (2001-2004), kemudian pada tahun 2004 penulis melanjutkan kuliah di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis

aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi antara lain sebagai sie humas Pekan

Ilmiah Mahasiswa Farmasi Indonesia (2005), sie acara pelepasan

wisudawan/wisudawati, konseptor ”Tiga Hari Temu Akrab Farmasi/ Titrasi” (2006),

koordinator internal tim ceramah dan diskusi Insadha (2007), staff menteri luar

negeri BEM Universitas Sanata Dharma Yogyakarta (2007). Selain itu penulis juga

pernah menjadi asisten dosen pada mata kuliah praktikum Spektroskopi, Kimia

Analisis, Kromatografi dan Analisis Makanan (2007).


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk · sodium phenobarbital in pulveresform for...

Documents