plagiat merupakan tindakan tidak terpuji brine … fileartemia akan tetapi belum ada laporan ilmiah...

BRINE SHRIMP LETHALITY TEST FRAKSI EKSTRAK ETANOL DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL

KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

R. Hendra Krismawan NIM : 018114123

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

'NNE SHE]'IP LETITALIT| TA'I TRAKST E(SflIAK ETAIIOL DAUN

TUMBUEAN TEMBELEKAN (Zzztdu eM, L. ) DESDRTA PROFIL

KROMAIOGRATI LAPTS IIPIsIryA

NM:018114123

Vu.tbr Sri Eralitri MSi- Apl.

Vo[!tr-s DwirtDrk , M.Si

r-eea,....?:.:.?.:...91....


P.ng€.t! SkriFi

DX]NESITI]IMP IEIIL&T! TEST TRAI(SI AICIIFDAUN TT'MBI'SANTE|IIBELEKAX {r8&a@fud L }EES9RTA IROFIL

XROI&IIOORAFI LAI|S TTPI!|NYA

Oleh:R.EodEKnlfu$u

NIM:o lE l l4 l23

DiFrbr.nro! ilt ird.pu Prnt ir P.lsrji SlFildlFddn!f.rutui

Udv.dlt ! S.td. DL.r.Fd.t lesi ! ?0 A8o.tu.2007

Yrlgiu &i qdiili, Msi, A![.

Yot,B [rsi!h*., nt Si,

P.rfth P.r4rji: ,."-"1 ,'&t. Yusri@&i t&nili M.si., Apt ---:./i.**

2. Yolsd llsilltu}r, I,t si. nl I

3.cki'linePd@utt,lvtsi,Ad- ......9..1.....

4 Em Tri Wuhlddi, ll'l-Si- APi r(*gt!,


iv


PERNYATAAN MASLIAN KARYA

sat€ notlt l(e ddgln sesuggulnya baltra shipsi yec saya tulis ini tidak

ncmui k rya arau bagid karya orug lai4 ksuali yas telan disbu{(d dalm

kltipd dd dand lurtal@ sebagrin@ laya,loya t{ya ilniaL

-4=


INTISARI

Daun tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) sering dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai obat tradisional, salah satunya untuk mengobati pembengkakan/tumor, sebagai antiseptik dan antitoksik. Telah diketahui bahwa ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan memiliki efek toksik terhadap larva artemia akan tetapi belum ada laporan ilmiah mengenai efek paling toksik dari fraksi ekstrak etanol. Untuk mengetahui fraksi paling toksik tersebut dilakukan penelitian dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST), yang dinyatakan dengan nilai Lethal Concentration 50 (LC50).

Penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan rancangan posttest only control group design. Penelitian dilakukan dengan menggunakan ekstrak etanol dari daun tumbuhan tembelekan yang dibuat fraksi. Fraksi diperoleh dengan metode Vaccum Coloumn Chromatography (VCC). Hasil fraksinasi diperoleh 3 fraksi yaitu F2, F3, dan F4 yang kemudian diuji dengan metode BST. Sampel uji dan kontrol dibuat seri konsentrasi yaitu F2 (100; 178; 316,84; 563,97; 1003,87) μg/ml, F3 (5; 10,5; 22,05; 43,3; 97,2) μg/ml, dan F4 (10; 32; 102,4; 327,7; 1048,6) μg/ml. Kontrol menggunakan air laut buatan, replikasi sebanyak 5 kali. Jumlah larva Artemia salina Leach yang mati pada tiap konsentrasi dihitung setelah 24 jam perlakuan. Nilai LC50 dihitung dengan analisis probit. Fraksi dikatakan toksik apabila harga LC50 ≤ 1000 μg/ml. Dari fraksi yang paling toksik dilakukan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk mengetahui profil bercak yang terkandung di dalamnya.

Hasil penelitian menunjukkan nilai LC50 dari F2 sebesar 508 μg/ml, F3 sebesar 23 μg/ml, dan F4 sebesar 101 μg/ml sehingga dapat dinyatakan bahwa F3 bersifat paling toksik. Gambaran profil bercak dari fraksi yang paling toksik dengan KLT menunjukkan bahwa bercak yang diduga menyebabkan kematian larva artemia adalah golongan terpenoid dengan Rf sebesar 0,3.

Kata kunci : Daun tumbuhan tembelekan (Lantana camara L. ), Vaccum

Coloumn Chromatography (VCC), Fraksi toksik, Brine Shrimp Lethality Test (BST), LC50.

vi


ABSTRACT

People often use Tembelekan leaf (Lantana camara L) as the traditional

medicine to cure tumor, as antiseptic and also as an antitoxin. It has been known that the ethanol extract and chloroform extract of Lantana camara L has toxin effect to artemia larva but there is no scientific report about the most toxicity of fraction etanol extract. To know the toxicibility of that fraction, the research using Brine Shrimp Lethality Test (BST) method which was determined with LC50.

This research was a pure experiment by applying the posttest only control group design and the etanol extract of tembelekan leaf -that was made into fraction- was used. To get the fraction, the Vaccum Coloumn Chromatography method that was applied. Three fractions to test by using BST method- those are F2, F3, F4 , were gotten. The test and control sample were formed as concentration series-those were F2 (100; 178; 316,84; 563,97; 1003,87) μg/ml, F3 (5; 10,5; 22,05; 43,3; 97,2) μg/ml and F4 (10; 32; 102,4; 327,7; 1048,6) μg/ml. The control used the water with 5 replicate. The number of the dead Artemia Salina Leach on every concentration was counted after 24 hours. The percentage of LC50 was counted by using the probit analysis. Fraction was determined as toxin if the percentage of LC50 was ≤ 1000 μg/ml. To know the contents of the spotted profile, a thin layer chromatography was done to the most toxic fraction.

The result of the research showed that the LC50 percentage of F2 was 508 μg/ml, F3 was 23 μg/ml, and F4 was 101 μg/ml. So it could be said that F3 was the most toxic fraction. The description of spotted profile of the most toxic fraction by using a Thin Layer Chromatography showed that the spot that was estimated as the causing the artemia dead is terpenoid and had Rf of 0,3 Key words: Lantana camara L, Vaccum Coloumn Chromatography (VCC), Brine

Shrimp Lethality Test (BST), LC50, toxic fraction.

vii


KATA PENGANTAR

Puji syukur atas setiap anugerah Tuhan sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi yang berjudul ” Brine Shrimp Lethality Test Fraksi

Ekstrak Etanol Daun Tumbuhan Tembelekan (Lantana camara L. ) Beserta

Profil Kromatografi Lapis Tipisnya”. Selesainya skripsi ini tidak lepas dari

bantuan, dukungan dan bimbingan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis

mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Ibu Rita Suhadi M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

2. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt selaku pembimbing pertama yang selalu

memberi dukungan, pengetahuan, kritik dan saran yang luar biasa dan selalu

sabar pada penulis.

3. Bpk. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Pembimbing kedua yang

banyak memberi dukungan, pengetahuan, masukan dan saran yang berharga.

4. Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji atas masukan-masukan

dan saran yang berharga.

5. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji atas masukan-masukan

dan saran yang berharga.

6. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si. Terima kasih atas diskusi, masukan

dan saran yang diberikan

7. Bapak, Ibu, juga Mas Andre dan adikku Siska terima kasih atas kepercayaan,

dukungan serta doa yang diberikan.

viii


ix

8. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Sarwanto, Mas Andre selaku staf laboratorium.

Terima kasih atas bantuan, “guyonan” dan saran yang diberikan..

9. Team Proyek Tembelekan : Lia KKT, Novi dan Apri. Terima kasih atas

kerjasama dan bantuan serta semangat yang diberikan.

10. Rekan-rekan angkatan 2001 : Rudi Kembongce, Deny, Rima, Endah Sari,

Mario Cahyo, Delila, Wiwin, Mirah, Ade, Theo, Freddy, Prastowo, Prasojo,

Gita, Awan, Maya, Himawan, Lita, Lisa, Themy, Dio, Dewi, serta khususnya

kelompok E. Terima kasih atas semuanya.

11. Wiwid Lecek serta teman-teman Kost : Andi, Tumbur, Dian, Koeprit, Pak

Min, Tommy. Terima kasih atas kebersamaan, bantuan dan pinjaman printer.

12. Mas Bondan, Mbak Dama, Mita serta Mbak Mimin sekeluarga. Terimakasih

atas pinjaman camera juga support yang diberikan.

13. Martina Herliana Wati. Terima kasih untuk diskusi, support, bantuan, dan

kasih sayang yang pernah diberikan. Terimakasih juga telah menyalakan

kembali semangat yang hampir padam. Thank’s.

14. Rekan-rekan angkatan 2003 : Marga (thank’s), Rosa, Devi, Titin, Mitea,

Vitea, Rani, Lintang, Yohana, Nella, Doni, Wati, Hengky, Vera, Ari, Eta,

Galeh. Terima kasih atas diskusi, bantuan, dan kebersamaannya.

15. Rekan-rekan angkatan 2002 : Eddy (thank’s), Kobo, Heri, Nowo, Firman,

Bowo, Peter, Elni, Vicky, TeGe, Puri. Terima kasih atas kebersamaan, canda

tawa, “sindiran” dan diskusi yang diberikan.

16. Ibu Retno dan Bpk. Bagus Wahyuono atas pengertian dan dukungan yang

diberikan.


x

17. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Dalam kesempatan ini, tak lupa penulis memohon maaf kepada semua

pihak atas kekurangan dan kesalahan yang mungkin dilakukan penulis. Oleh

karena itu dengan rendah hati penulis mengharapkan masukan, saran dan kritik

yang membangun.

Penulis


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL……………………………………………………………… i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING………………………………….. ii

HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………………….. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN…………………………………………….……. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA….………………………………………. v

INTISARI………………………………………………………………………… vi

ABSTRACT ………………………………………………………………………. vii

KATA PENGANTAR ….…………...…………………………………………… viii

DAFTAR ISI..……………………………………………………………………. xi

DAFTAR TABEL ……………………………………………………………….. xv

DAFTAR GAMBAR...…………………………….…………………………….. xvi

DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………………….…….. xviii

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG…………………………………..… xx

BAB I. PENGANTAR……………………………………………………………. 1

A. Latar Belakang ……………………………………………………………. 1

1. Perumusan masalah................................................................................ 3

2. Keaslian penelitian................................................................................. 3

3. Manfaat penelitian.................................................................................. 4

B. Tujuan Penelitian…………………………………………………………... 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………………. 5

A. Tembelekan................................................................................................... 5

xi


xii

1. Keterangan botani ................................................................................. 5

2. Nama daerah.......................................................................................... 5

3. Deskripsi tanaman.................................................................................. 5

4. Kandungan kimia................................................................................... 6

5. Kegunaan............................................................................................... 6

6. Penelitian dengan BST........................................................................... 6

B. Terpenoid...................................................................................................... 7

C. Artemia......................................................................................................... 8

1. Lingkungan hidup artemia..................................................................... 9

2. Penggunaan artemia pada metode BST................................................. 10

D. Uji Toksisitas Akut....................................................................................... 13

E. Kanker........................................................................................................... 14

F. Penyarian....................................................................................................... 15

G. Kromatografi Vakum kolom......................................................................... 16

H. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) 17

I. Keterangan Empiris........................................................................................ 19

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN............................................................... 20

A. Jenis dan Rancangan Penelitian................................................................... 20

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional............................................... 20

1. Variabel penelitian................................................................................. 20

2. Definisi Operasional.............................................................................. 21

C. Bahan dan Alat Penelitian............................................................................. 22

1. Bahan penelitian....................................................................................... 22


xiii

2. Alat penelitian.......................................................................................... 23

D. Tata Cara Penelitian...................................................................................... 24

1. Determinasi tumbuhan Tembelekan (Lantana camara L.) ................. 24

2. Pengumpulan bahan............................................................................... 24

3. Penyiapan bahan.................................................................................... 24

4. Maserasi................................................................................................. 24

5. Fraksinasi............................................................................................... 25

6. Pembuatan air laut buatan...................................................................... 27

7. Penetasan telur artemia.......................................................................... 27

8. Pembuatan larutan sampel..................................................................... 28

9. Uji toksisitas akut dengan BST............................................................. 30

10. Uji KLT fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan............................... 30

11. Analisis hasil.......................................................................................... 31

BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN....................................... 32

A. Determinasi Tanaman................................................................................... 32

B. Pengumpulan Bahan ..................................................................................... 32

C. Maserasi Daun Tumbuhan Tembelekan........................................................ 33

D. Fraksinasi Ekstrak etanol hasil maserasi…………………….…………...... 35

E. Pembuatan Air Laut Buatan (ALB) ............................................................. 44

F. Penetasan Telur Artemia............................................................................... 44

G. Uji Toksisitas dengan Metode BST.............................................................. 46

H. Uji KLT fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan....................................... 54


xiv

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................. 65

A. Kesimpulan................................................................................................... 65

B. Saran.............................................................................................................. 65

C. Keterbatasan Penelitian................................................................................. 65

DAFTAR PUSTAKA.............................................................................................. 66

LAMPIRAN............................................................................................................ 69

BIOGRAFI PENULIS............................................................................................. 94


DAFTAR TABEL

Tabel I Seri konsentrasi larutan sampel daun tumbuhan tembelekan... 29

Tabel II Penggabungan hasil fraksinasi menjadi 5 fraksi berdasarkan

data gambar 6……………………………………………… 43

Tabel III Persentase kematian larva artemia akibat pemberian fraksi

ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan.............................. 50

Tabel IV Data kromatogram tiga fraksi toksik....................................... 57

Tabel V Data kromatogram gambar 15.................................................. 62

xv


DAFTAR GAMBAR Hal.

Gambar 1. Struktur pentasiklik triterpenoid (Kaufman, Cseke,

Warbers, Duke, Brielmann, 1988)…………………………

7

Gambar 2. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan

untuk panduan fraksinasi dengan perbandingan fase gerak

93:7…………………………………………………………

36



90:10..………………………………………………………

38



85:15..………………………………………………………

39



80:20..………………………………………………………

40

Gambar 6. Kromatogram 12 fraksi ekstrak etanol daun tumbuhan

tembelekan hasil fraksinasi dengan jarak pengembangan 15

cm…………………………………………………………..

42

Gambar 7. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi F2........ 51

Gambar 8. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi F3…… 52

xvi


xvii

Gambar 9. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi F4........ 52

Gambar 10. Kromatogram tiga fraksi toksik daun tumbuhan

tembelekan………………………………………………….

56

Gambar 11. Potongan atas gambar 14, Kromatogram fraksi toksik daun

tumbuhan tembelekan............................................................

58

Gambar 12 Potongan bawah Gambar 14, Kromatogram fraksi toksik

daun tumbuhan tembelekan...................................................

59

Gambar 13. Potongan tengah Gambar 14, Kromatogram fraksi toksik

daun tumbuhan tembelekan.………………………………..

60

Gambar 14. Foto kromatogram kontrol KLTP. (A) deteksi UV 365 nm,

(B) deteksi vanilin-asam sulfat..............................................

61

Gambar 15. Foto kromatogram KLTP bercak Rf 0,3 dari fraksi

toksik..................................................................................... 62


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tumbuhan tembelekan............ 69

Lampiran 2. Foto tumbuhan tembelekan................................................... 70

Lampiran 3. Foto bunga tumbuhan tembelekan........................................ 70

Lampiran 4. Foto buah tumbuhan tembelekan.......................................... 71

Lampiran 5. Foto aquarium untuk uji BST................................................ 71

Lampiran 6. Foto rangkaian alat Vaccum Coloumn Chromatography

(VCC)……………………………………………………… 72

Lampiran 7. Foto hasil fraksinasi Vaccum Coloumn Chromatography… 72

Lampiran 8. Data fraksinasi dan penggabungan fraksi…………………. 73

Lampiran 9. Data orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi yang

akan digunakan dalam pengujian serta data kematian

setelah perlakuan...................................................................

74

Lampiran 10. Perhitungan data statistik SPSS 10.00 dengan

menggunakan analisis probit terhadap F2 daun tumbuhan

tembelekan............................................................................ 83



tembelekan............................................................................

86



tembelekan.............................................................................

89

xviii


xix

Lampiran 13. Data kromatogram dari 3 fraksi toksik.................................. 92

Lampiran 14. Data kromatogram KLTPreparatif dari bercak Rf 0,3 pada

F3............................................................................................

93


DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG

1. ALB = Air Laut Buatan

2. CaCl2 = kalsium klorida

3. cm = centi meter

4. g = gram

5. KCl = kalium klorida

6. KLT = Kromatografi Lapis Tipis

7. LC50 = Median Lethal Concentration

8. m = meter

9. mg = miligram

10. MgCl2 = magnesium klorida

11. MgSO4 = magnesium sulfat

12. ml = mililiter

13. mm = milimeter

14. NaCl = natrium klorida

15. NaHCO3 = natrium hidrokarbonat

16. nm = nanometer

17. UV = ultraviolet

18. oC = derajat celcius

19. l = liter

20. % = prosen/persen

21. μg/ml = microgram per mililiter

22. μl = microliter

23. μg = microgram

xx


BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Alam Indonesia memiliki berbagai jenis tumbuhan yang layak diteliti

dan dikembangkan potensinya sebagai sumber obat. Salah satunya adalah

tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) yang secara luas sudah digunakan

oleh masyarakat untuk menghilangkan pembengkakan/tumor, rematik, tetanus,

malaria, sebagai antiseptik, antitoksik, dan perangsang muntah (Rana, Prasad, and

Blazquez, 2005).

Daun tumbuhan tembelekan mengandung senyawa golongan terpenoid

diantaranya 1-triacontanol, α-pinene, cadidene, cadinol, camerene, β-

caryophyllen, cineole, citral, dipentene, eugenol, furfural, γ-terpinene, geraniol,

icterogenin, isocamarene, lantadene A, lantadene B, lantanic acid, lantanine,

lantanolic acid, linalool, methyl-3-oxo-ursolate, p-cymene, phellandral,

phellandrene, phellandrone, dan terpineol.(Duke, 2001).

Penelitian dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) yang

dilakukan oleh Sugianti (2007) menggunakan ekstrak etanol daun tumbuhan

tembelekan menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan

bersifat toksik dengan nilai LC50 sebesar 60,4 μg/ml. Perlu dilakukan penelitian

lebih lanjut untuk fraksi dari ekstrak etanol tumbuhan tembelekan dengan harapan

dapat diketahui suatu fraksi yang memberikan efek paling toksik sehingga dapat

dilakukan penelitian yang mengarah ke pengisolasian suatu senyawa murni.

1


2

Metode fraksinasi yang digunakan adalah Vaccum Coloumn Chromatography

(VCC) karena dapat memisahkan suatu senyawa dengan cepat. Metode VCC

termasuk pemisahan senyawa secara preparatif yang dilakukan dalam suatu kolom

dan diaktifkan dengan vakum. Proses eluasi yang terjadi berdasarkan gradien

kepolaran fase gerak (Coll & Bowden, 1986).

Metode BST adalah suatu metode yang cukup praktis, murah, sederhana,

cepat tapi tidak mengesampingkan keakuratannya untuk skrining awal tanaman

berpotensi antikanker dengan menggunakan hewan uji larva Artemia salina Leach.

Prinsip metode ini adalah uji toksisitas akut terhadap artemia dengan penentuan

nilai LC50 setelah perlakuan 24 jam (Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nichols,

and McLaughlin, 1982). Artemia digunakan sebagai hewan uji karena artemia

memiliki kesamaan tanggapan dengan mammalia, misalnya tipe DNA-dependent

RNA polimerase artemia serupa dengan yang terdapat pada mammalia dan

organisme ini memiliki ouabaine-sensitive Na+ and K+ dependend ATPase,

sehingga senyawa maupun ekstrak yang memiliki aktivitas pada sistem tersebut

dapat terdeteksi (Solis, Wright, Anderson, Gupta, and Phillipson, 1993).

Metode BST tidak spesifik terhadap antikanker dan sebagian aksi

fisiologis, namun metode ini dapat memonitor kemungkinan adanya efek

sitotoksik tanpa perlu menghabiskan waktu dan biaya penelitian dibandingkan

dengan pengujian sitotoksisitas umum, misalnya dengan menggunakan biakan sel

kanker. Penelitian yang dilakukan Meyer et al., (1982) dan Solis et al., (1993)

menunjukkan bahwa senyawa yang bersifat sitotoksik akan bersifat toksik bila

diuji dengan metode BST. Namun senyawa yang bersifat toksik pada uji BST


3

belum tentu bersifat sitotoksik, sehingga perlu dilakukan uji tingkat lanjut dengan

menggunakan biakan sel kanker. Suatu larutan memiliki nilai LC50 < 1000 μg/ml

maka larutan tersebut memiliki efek toksik yang besar yang nantinya diharapkan

memiliki efek sitotoksik, yang merupakan syarat utama untuk aktivitas antikanker.

Dengan demikian, diharapkan metode BST dapat digunakan sebagai langkah awal

untuk menemukan senyawa-senyawa yang memiliki efek sitotoksik.

1. Perumusan masalah

a. Fraksi manakah dari ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan yang

paling toksik terhadap larva artemia yang ditunjukkan dengan nilai LC50

paling kecil?

b. Bagaimanakah profil KLT fraksi paling toksik ekstrak etanol daun

tumbuhan tembelekan?

2. Keaslian penelitian

Penelitian yang pernah dilakukan dengan menggunakan daun tumbuhan

tembelekan antara lain isolasi dan identifikasi komponen kimia daun tembelekan

asal Tamalanrea Ujung Pandang oleh Aida (1990); penelitian farmakognosi dan

kandungan kimia dari daun Lantana camara oleh Soelastru (1986); pemeriksaan

flavonoid dan verbaskosid daun Lantana camara L. oleh Asterina (1994); uji

potensi antibakteri ekstrak etanol daun tembelekan terhadap Staphylococcus

aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 35218 oleh Asteria (2006).

Brine Shrimp Lethality test (BST) ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan

(Lantana camara L.) beserta profil kromatografi lapis tipisnya oleh Sugiyanti

(2007). Tetapi sejauh penelusuran pustaka, belum pernah dilakukan penelitian


4

mengenai toksisitas akut fraksi dari ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan

terhadap larva artemia.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi yang berguna

bagi ilmu pengetahuan terutama dalam bidang farmasi mengenai besarnya

toksisitas fraksi dari ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan terhadap

larva artemia sehingga dapat dilakukan isolasi untuk mendapatkan

senyawa yang berpotensi untuk pengobatan kanker.

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada

masyarakat mengenai kemungkinan pengobatan alternatif penyakit kanker

menggunakan daun tumbuhan tembelekan.

B. Tujuan Penelitian

1. Mengetahui fraksi ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan yang paling

toksik terhadap larva artemia yang ditunjukkan dengan nilai LC50 paling kecil.

2. Mengetahui profil KLT dari fraksi paling toksik ekstrak etanol daun tumbuhan

tembelekan.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tembelekan

1. Keterangan botani

Tembelekan (Lantana camara L.) termasuk dalam familia

Verbenaceae. Tembelekan mempunyai sinonim: L. aculeata L., L. antillana

Rafin, L. mutabilis Salisb., L. polyacanthus SCH., L. scabrida Soland, L.

viburnoides Blanco (Dalimartha, 2002)

2. Nama daerah

Sumatra : Bunga pagar, kayu singapore, tahi ayam (Melayu)

Sunda : Kembang satek, saliyara, saliyere, tahi ayam, t. Kotok,

cente.

Jawa : Kembang telek, Oblo, puyengan, pucengan, tembelek,

tembelekan, teterapan, waung, weliran.

Madura : Kamanco, mainco, tamanjho.

(Dalimartha, 2002).

3. Deskripsi tumbuhan

Tembelekan berupa perdu bercabang banyak, tinggi 0,5-5 m. Batang

segi empat, batang muda penuh rambut, kelenjar kecil dan selalu dengan duri

tempel. Daun bertangkai sangat panjang, bulat telur dengan pangkal tumpul, dan

ujung runcing, bergigi, bergerigi, dari sisi atas berbulu kasar, dari sisi bawah

berbulu jarang, (5-8) kali (3,5-5) cm. Bentuk bunga bulir pendek di ketiak,

tunggal bertangkai. Daun pelindung bulat telur jorong, panjang ± 0,5 cm. Kelopak

5


6

berbentuk tabung lonceng, berlekuk tidak dalam, tinggi ± 2 mm. Tabung mahkota

membengkok, panjang ± 1 cm, tepian bertaju 4-5, taju tidak sama besarnya,

orange, merah muda, merah atau putih, sering bergantian warna. Benangsari

empat, yang panjang dua. Buah batu saling berdekatan, bentuk bulat telur, berinti

satu. Tumbuhan hias atau pagar, berasal dari Amerika Tropis, sebagian besar liar,

tumbuh pada ketinggian 1-700 m di atas permukaan laut, tumbuh di daerah yang

cerah matahari sampai cukup teduh. (Van Steenis, 1975).

4. Kandungan kimia

Daun tembelekan mengandung 1-triacontanol, aldehid, α-pinene,

amylase, cadidene, cadinol, camerene, β-caryophyllen, katalase, cineole, citral,

dipentene, eugenol, furfural, γ-terpinene, geraniol, glukosidase, icterogenin,

invertase, isocamarene, lantadene A, lantadene B, lantanic acid, lantanine,

lantanolic acid, linalool, lipase, methyl-3-oxo-ursolate, oksidase, p-cymene,

phellandral, phellandrene, phellandrone, sodium, tannase, tannin, dan terpineol

(Duke, 1999)

5. Khasiat dan kegunaan

Daun tembelekan berkhasiat untuk mengatasi sakit kulit, gatal-gatal,

bisul, luka, batuk, dan perangsang muntah sedangkan akar tembelekan untuk

mengatasi influenza, TBC kelenjar, rematik, keputihan, memar, bengkak, kencing

nanah, gondongan, dan asma (Dalimartha, 2002).

6. Penelitian dengan BST

Penelitian dengan BST diketahui ekstrak etanol daun tumbuhan

tembelekan bersifat toksik terhadap larva artemia. Ekstrak etanol daun tumbuhan


7

tembelekan mempunyai nilai LC50 sebesar 60,4 μg/ml terhadap larva artemia.

Dugaan senyawa yang berperan dalam kematian larva artemia adalah pentasiklik

triterpenoid dan flavonoid (Sugiyanti, 2007).

B. TERPENOID

Terpenoid berasal dari molekul isoprene CH2=C(CH3)-CH=CH2.

Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa mulai dari komponen minyak

atsiri yaitu monoterpenoid dan sesquiterpenoid yang mudah menguap sampai ke

senyawa yang tidak mudah menguap yaitu triterpenoid dan sterol (C30) serta

pigmen karotenoid (C40) (Harborne, 1984). Triterpen tersebar luas dalam damar

gabus, dan kutin tumbuhan (Robinson, 1991). Triterpen di alam dapat berbentuk

ester atau glikosida dan kemungkinan berstruktur alifatik, tetrasiklik atau

pentasiklik. Triterpen saponin biasanya dalam bentuk pentasiklik (Evans and

Trease, 2002). Triterpen alkohol terdapat bebas dan juga sebagai glikosida.

(Robinson, 1999).

HO

Gambar 1. Struktur pentasiklik triterpenoid (Kaufman, Cseke , Warbers,

Duke, Brielmann, 1988)


8

Pentasiklik triterpenoid dapat menghambat kerja enzim topoisomerase

I dan II serta menghambat RNA polymerase sehingga mengakibatkan kematian sel

(Lee, Fang, Wang, Li, Cook, 1991). Untuk mendeteksi adanya triterpenoid salah

satunya dapat dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis. Metode ini dapat

menggunakan fase diam silika gel dan dengan memakai pengembang seperti

heksan, etil asetat (1:1); kloroform, metanol (10:1); atau toluene : etil asetat

(93:7). Sebagai deteksi dapat digunakan penyemprotan dengan vanilin-asam sulfat

pekat, diteruskan dengan pemanasan pada 100°C - 105°C sampai pembentukan

warna sempurna (Harborne, 1984). Untuk senyawa terpenoid, akan menghasilkan

warna abu-abu, merah violet , atau ungu (Wagner, Brady, and Zgainski, 1984).

C. Artemia

Artemia termasuk dalam familia Artemidae, genus Artemia, spesies

Artemia salina Leach (Mudjiman, 1989). Istilah untuk telur artemia yang benar

adalah siste, yaitu telur yang telah berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan

kemudian diselubungi oleh cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna

untuk melindungi embrio terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar

ultraviolet dan mempermudah pengapungan. Sehingga sangat tahan terhadap

keadaan lingkungan yang buruk (Mudjiman, 1989).

Apabila telur artemia direndam dalam air laut bersuhu 25o C, maka

akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Setelah menetas, dari dalam cangkang

keluarlah burayak atau larva/nauplius. Burayak yang baru saja menetas masih

dalam tingkatan instar I. Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak


9

mengandung makanan cadangan. Oleh karena itu mereka masih belum perlu

makan.

Sekitar 24 jam setelah menetas, burayak akan berubah menjadi instar

II. Pada tingkatan instar II, larva sudah mulai mempunyai mulut, saluran

pencernaan dan dubur. Oleh karena itu mereka mulai mencari makanan.

Bersamaan dengan itu, cadangan makanannya juga sudah mulai habis.

Pengumpulan makanannya mereka lakukan dengan menggerak-gerakkan antena II

nya. Selain untuk mengumpulkan makanan, antena II tersebut juga berguna untuk

bergerak.

1. Lingkungan hidup artemia

Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6o C atau

lebih dari 35o C, tetapi hal ini sangat tergantung pada ras dan kebiasaan tempat

hidup. Dengan demikian pertumbuhan artemia yang baik berkisar pada suhu

antara 25-30o C (Mudjiman, 1989).

Daya tahan artemia terhadap perubahan kandungan ion-ion kimia

dalam air ternyata juga sangat tinggi. Apabila kandungan ion natrium

dibandingkan dengan ion kalium di dalam air laut alami adalah 28, maka artemia

masih dapat bertahan pada perbandingan antara 8-173 (Mudjiman, 1989).

Perkembangan artemia yang baik membutuhkan kadar garam yang

tinggi sebab pada kadar garam yang tinggi itu musuh-musuhnya sudah tidak dapat

hidup lagi, sehingga artemia akan dapat aman tanpa gangguan. Untuk

pertumbuhan telur, ternyata dibutuhkan air yang kadar garamnya lebih rendah dari


10

pada suatu batas tertentu. Batas ini berlainan untuk setiap jenis artemia

(Mudjiman,1989).

Artemia dapat hidup dan menyesuaikan diri pada tempat yang kadar

oksigennya rendah maupun yang mengalami kejenuhan oksigen. Pengaruh pH

terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa belum jelas namun berpengaruh

terhadap penetasan telur. Apabila pH untuk penetasan kurang dari 8, maka

efisiensi penetasan akan menurun (Mudjiman, 1989).

2. Penggunaan artemia pada metode BST

Artemia adalah hewan coba yang digunakan untuk praskrining

aktivitas antikanker di National Cancer Institude (NCI), Amerika Serikat (Meyer

et al., 1982). Metode ini sering digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa

aktif yang terdapat di dalam ekstrak tanaman karena murah, cepat, mudah (tidak

memerlukan kondisi aseptis), dan dapat dipercaya (Meyer et al., 1982). Artemia

secara luas telah digunakan untuk pengujian aktivitas farmakologi ekstrak suatu

tanaman. Lebih dari itu, uji larva udang ini juga dapat digunakan untuk skrining

awal terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor karena

uji ini seringkali mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai

antitumor (Anderson, Goets, and Mc Laughin, 1991).

Penggunaan artemia ini memang tidak spesifik untuk antitumor

maupun fisiologis aktif tertentu, namun beberapa penelitian terdahulu

menunjukkan adanya korelasi yang signifikan terhadap beberapa bahan, baik

berupa ekstrak tanaman, atas aksinya sebagai antitumor secara lebih cepat

dibandingkan dengan prosedur pemeriksaan sitotoksisitas yang umum, misalnya


11

dengan biakan sel tumor (Meyer et al., 1982). Melihat adanya potensi sebagai

antitumor tersebut, maka penelitian lanjutan dapat dilakukan, yaitu dengan

mengisolasi senyawa berkhasiat yang terdapat didalam ekstrak disertai dengan

monitoring aktivitasnya dengan uji larva udang atau metode yang lebih spesifik

sebagai antitumor (Mayer et al., 1982).

Penggunaan hewan uji artemia dimaksudkan bahwa artemia memiliki

kesamaan tanggapan dengan mammalia, misalnya tipe DNA-dependent RNA

polimerase artemia serupa dengan yang terdapat pada mammalia dan organisme

ini memiliki ouabaine-sensitive Na+ and K+ dependend ATPase. Pengujian dengan

artemia terhadap tingkat ketoksikan senyawa kimia, antara lain adalah pengujian

pestisida, mikotoksin, anestetika, dan lain-lain (Meyer et al., 1982).

Artemia dapat digunakan sebagai hewan uji karena artemia memiliki

kesamaan tanggapan dengan mamalia, misalnya tipe DNA-dependent RNA

polymerases yang terdapat pada artemia serupa dengan yang terdapat pada

mamalia dan organisme ini juga memiliki ouabaine-sensitive Na+ and K+

dependent ATPase (Solis et al., 1992).

DNA-dependent RNA polymerases merupakan DNA yang

mengarahkan proses transkripsi RNA yang bergantung pada RNA polymerases.

Enzim ini membuka pilinan kedua untai DNA sehingga terpisah dan

mengkaitkannya bersama-sama nukleotida RNA pada saat nukleotida-nukleotida

ini membentuk pasangan-basa di sepanjang cetakan DNA. Eukariotik mempunyai

3 macam RNA polymerases yaitu mRNA (messenger RNA) yang merupakan

pembawa kode genetik dari DNA ke ribosom, tRNA (transfer RNA) yang


12

berfungsi untuk menterjemahkan kodon dan mengikat asam amino yang akan

disusun menjadi protein dan mengangkutnya ke ribosom, serta rRNA (ribosomal

RNA) yang bersama dengan protein membentuk ribosom. Jika RNA polymerases

tersebut dihambat, maka DNA tidak dapat mensintesis RNA dan RNA tidak dapat

terbentuk sehingga sintesis protein juga dihambat. Protein merupakan komponen

utama semua sel. Protein berfungsi sebagai unsur struktural, hormon,

imunoglobulin, serta terlibat dalam kegiatan transport oksigen, kontraksi otot, dan

lainnya (Nuswantari, 1998). Tidak terbentuknya protein dapat mengganggu

metabolisme sel, sehingga pada akhirnya akan menyebabkan kematian sel.

Enzim Na+ K+ ATPase merupakan enzim yang mengkatalisis hidrolisis

ATP menjadi ADP serta menggunakan energi untuk mengeluarkan 3 Na+ dari sel

dan mengambil 2 K+ ke dalam, tiap sel bagi tiap mol ATP dihidrolisis. Na+ K+

ATPase ditemukan dalam semua bagian tubuh. Aktivitas enzim ini dihambat oleh

ouabaine. Adanya ouabaine menyebabkan keseimbangan ion Na+ dan K+ tetap

terjaga (homeostasis). Selain itu, sekarang ini ouabaine juga digunakan untuk

terapi payah jantung. Di dalam jantung, Na+ K+ ATPase secara tak langsung

mempengaruhi transport Ca2+ karena Na+ ekstrasel akan ditukar dengan Ca2+

intrasel. Jika kerja Na+ K+ ATPase dihambat, maka lebih sedikit Ca2+ intrasel

dikeluarkan dan Ca2+ intrasel meningkat, sehingga memudahkan kontraksi otot

jantung (Ganong, 1995).

Suatu senyawa yang mempunyai aktivitas mengganggu kerja salah

satu enzim ini pada artemia dan menyebabkan kematian artemia, maka senyawa

tersebut bersifat toksik dan dapat menyebabkan kematian sel mamalia. Metode


13

BST dengan hewan uji artemia tidak dapat digunakan untuk pengujian senyawa

yang dalam mengganggu kerja salah satu enzim tersebut memerlukan aktivasi

dalam sel mamalia, seperti 6-mercaptopurine yang harus dimetabolisme terlebih

dahulu dalam sel mamalia. Sehingga jika senyawa 6-mercaptopurine diujikan

pada artemia, maka akan memberikan LC50 yang lebih besar dari 1000 (bersifat

tidak toksik pada artemia) (Solis et al.,1992)

Tingkat toksisitas dari ekstrak tanaman dapat ditentukan dengan

melihat harga LC50. Analisis data dilakukan dengan analisis probit untuk

menghitung LC50. Dari persentase data kematian larva artemia dikonversikan

probit untuk menghitung harga LC50. Apabila harga LC50 ≤ 1000 μg/ml maka

dikatakan toksik. Apabila pengujian dengan larva artemia menghasilkan harga

LC50 ≤ 1000 μg/ml dapat dilanjutkan dengan pengujian antikanker menggunakan

biakan sel kanker. Dengan cara ini akan menghemat waktu dan biaya penelitian

(Meyer et al., 1982). Keuntungan penggunaan artemia sebagai hewan uji adalah

kesederhanaan dalam pelaksanaan, waktu relatif singkat, dan konsentrasi kecil

sudah dapat menimbulkan aktivitas biologi (Meyer et al., 1982).

D. Toksisitas Akut

Pada prinsipnya metode BST merupakan uji toksisitas akut yang

dilakukan dengan menghitung jumlah kematian Artemia salina Leach untuk

menentukan besarnya efek toksik.

Toksisitas dapat didefinisikan sebagai kemampuan suatu zat untuk

menimbulkan kerusakan (Katzung, 1987). Uji toksisitas akut merupakan uji

dengan pemberian suatu senyawa pada hewan uji pada suatu saat atau uji


14

ketoksikan suatu senyawa yang diberikan dengan dosis tunggal pada hewan uji

tertentu dan pengamatan dilakukan selama 24 jam. Maksud dari toksisitas akut

yaitu untuk menentukan suatu gejala dan tingkat kematian hewan uji akibat

pemberian senyawa tersebut. Pengamatan aktivitas biologi uji toksisitas akut

berupa pengamatan gejala klinik, kematian hewan uji atau pengamatan

histopatologi organ (Loomis, 1978).

Uji toksisitas akut dilakukan untuk mempersempit kisaran dosis dan

terakhir dilakukan uji toksisitas akut untuk mendapatkan presentase kematian.

Data yang diperoleh dari uji toksisitas akut dapat berupa data kuantitatif yang

dinyatakan dengan LD50 (median lethal dose) atau LC50 (median lethal

concentration). Harga LD50 dan LC50 suatu senyawa harus dilaporkan sesuai

dengan lamanya pengamatan. Bilamana lama pengamatan tidak ditunjukkan,

dianggap bahwa pengamatan dilakukan selama 24 jam (Loomis, 1978).

Parameter yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas

biologis suatu senyawa pada artemia adalah kematian. Keuntungan penggunaan

artemia sebagai hewan uji adalah kesederhanaan dalam pelaksanaan, waktu relatif

singkat, dan konsentrasi kecil sudah dapat menimbulkan aktivitas biologis (Meyer

et al., 1982).

E. Kanker

Kanker adalah suatu penyakit yang ditandai dengan terjadinya

pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat, dan tidak terkendali.

Sel-sel kanker akan terus membelah diri, terlepas dari pengendalian pertumbuhan,

dan tidak lagi menuruti hukum-hukum pembiakan. Jika pertumbuhan ini tidak


15

cepat dihentikan dan diobati maka sel kanker akan terus berkembang. Sel kanker

akan tumbuh menyusup ke jaringan sekitarnya (invasive), lalu membuat anak

sebar (metastasis) ke tempat yang lebih jauh melalui pembuluh darah dan

pembuluh getah bening. Selanjutnya akan tumbuh kanker baru di tempat lain

sampai akhirnya menyebabkan kematian penderita. Pembentukan kanker dapat

dirangsang oleh karsinogen seperti senyawa kimia, faktor fisika (radiasi bom atom

dan radioterapi agresif), virus (virus hepatitis B dan C), dan hormon (Dalimartha,

2003).

F. Penyarian

Pemilihan penyari dalam penyarian merupakan hal yang harus

dipertimbangkan. Cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan zat aktif

yang berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari senyawa

lainnya dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar senyawa aktif

berkhasiat yang diinginkan (Anonim, 2000).

Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari

simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya

matahari langsung. Ekstrak kering harus mudah digerus menjadi serbuk (Anonim,

1979).

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi

dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam penyari. Penyari akan

menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat

aktif. Zat aktif akan larut karena adanya beda konsentrasi antara larutan di dalam

dan di luar sel. Larutan yang lebih pekat akan terdesak keluar. Peristiwa ini


16

berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di dalam dan di

luar sel (Anonim, 1986 ).

G. Kromatografi Kolom Vakum

Kromatografi kolom vakum adalah suatu bentuk fraksinasi kolom yang

terutama bermanfaat untuk fraksinasi secara kasar dengan cepat. Metode ini

merupakan modifikasi kromatografi kinerja tinggi, sehingga dapat diperoleh

resolusi atau pemisahan senyawa yang lebih baik. Cara ini mengacu pemisahan

terpen dan campuran lipid. Kelebihan metode ini antara lain: tekniknya sederhana,

waktunya cepat, fase diam dan fase gerak yang digunakan relatif sedikit. Selain

itu, pemilihan sistem pelarut dapat dilakukan dengan sistem yang sederhana dan

murah yaitu Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Cara ini melibatkan elusi

berdasarkan tingkat kepolaran fase gerak dan kolom diperbolehkan mengering

setelah masing-masing fraksi dikumpulkan. Sampel yang digunakan tidak kurang

dari 1 gram dan hanya 10-15 ml fraksi yang bisa dikumpulkan dari masing-

masing polaritas. Fase diam yang biasa digunakan adalah silika gel dan diisikan

ke dalam kolom dengan tinggi tidak lebih dari 5 cm (coll & bowden, 1986).

Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar

diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang

kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penyerap lalu di vakumkan lagi.

Kolom di hisap sampai kering dan siap dipakai. Cuplikan, dilarutkan dalam

pelarut yang cocok, dimasukkan langsung di bagian atas kolom dan dihisap

perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom, dielusi


17

dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya

rendah lalu kepolaran ditingkatkan perlahan-lahan (Hostettman & Marston, 1986)

H. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis (KLT) ialah metode pemisahan fisikokimia.

Lapisan yang memisahkan terdiri dari bahan berbutir-butir (fase diam),

ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam atau lapisan yang cocok

(Stahl, 1985).

Kelebihan khas KLT ialah keserbagunaan, kecepatan, dan

kepekaannya. Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa disamping

silika, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca

atau penyangga lain. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat

penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada pelat dan merupakan keuntungan

bila digunakan untuk menelaah senyawa labil. Kepekaan KLT sedemikian rupa,

sehingga bila diperlukan dapat dipisahkan bahan yang jumlahnya lebih sedikit

dari ukuran µg (Harborne, 1987)

Fase diam (lapisan penjerap) dibuat dari salah satu penjerap yang

khusus digunakan untuk KLT. Penjerap yang umum digunakan ialah silika gel,

aluminium oksida, kieselgur, selulosa, dan lain-lain. Untuk analisis, tebal

penyerap 0,1-0,3 mm, biasanya 0,2 mm (Stahl, 1985).

Fase gerak ialah medium angkut yang terdiri dari satu atau beberapa

pelarut, bergerak di dalam fase diam yang merupakan lapisan berpori, yang

dipengaruhi oleh gaya kapiler (Stahl, 1985).


18

Deteksi senyawa pada pelat KLT biasanya dilakukan dengan

penyemprotan (Harborne, 1987). Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa

yang menunjukkan penyerapan di daerah UV dengan panjang gelombang 254 nm

(gelombang pendek) atau jika senyawa itu dapat dieksitasi ke fluoresensi radiasi

UV gelombang pendek dan atau gelombang panjang (365 nm) (Stahl, 1985).

Jarak pengembangan senyawa pada kromatografi biasanya dapat

digunakan untuk identifikasi senyawa yang dianalisa.

Rf = awaltitikdaridepangarisJarak

awaltitikdaribercakpusattitikJarak


19

I. KETERANGAN EMPIRIS

Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan data empiris tentang

toksisitas fraksi paling toksik ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan terhadap

larva artemia dengan metode BST yang dinyatakan dalam LC50 serta untuk

memperoleh profil kromatografi lapis tipis fraksi paling toksik daun tumbuhan

tembelekan.

Data empiris yang diperoleh melalui uji toksisitas fraksi daun

tumbuhan tembelekan ini memungkinkan untuk dilakukan eksplorasi guna

mendapatkan senyawa antikanker.


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis eksperimental murni dengan rancangan

Posttest Only Control Group Design.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas

Jenis fraksi dari ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan yang

diujikan pada metode BST.

b. Variabel tergantung

Nilai LC50 dari tiap fraksi setelah diuji dengan metode BST.

c. Variabel pengacau terkendali

1) Lingkungan tempat percobaan: sinar lampu 5 watt, suhu penetasan

25o -30o C, serta pH air laut buatan antara 7-8 dengan kadar garam 5

permil.

2) Hewan uji: Umur larva artemia adalah 48 jam.

3) Tanaman: spesies atau varietas tumbuhan tembelekan.

4) Air laut buatan : merupakan campuran dari 5 gram natrium klorida

(NaCl), 1,3 g magnesium sulfat (MgSO4), 1 g magnesium klorida

20


21

(MgCl2), 0,3 g kalsium klorida (CaCl2), 0,2 g kalium klorida (KCl),

dan 2 g natrium hidrokarbonat (NaHCO3) dalam 1 liter aquades.

2. Definisi operasional

a. Daun tumbuhan tembelekan yang digunakan adalah daun yang masih

muda, merupakan daun ke-3 sampai 4 dari ujung tangkai, dipetik pada saat

tumbuhan sedang berbunga.

b. LC50 (lethal concentration-50) merupakan kadar senyawa uji yang mampu

mengakibatkan terbunuhnya separuh (50%) jumlah hewan uji dan

ditentukan setelah 24 jam perlakuan

c. Ekstrak etanol yang digunakan untuk proses fraksinasi merupakan ekstrak

etanol kering yang telah diketahui toksisitasnya terhadap larva artemia.

d. Fraksi merupakan hasil dari pemisahan ekstrak etanol dengan metode

Vaccum Coloumn Chromatography (VCC) yang belum diketahui LC50-

nya.

e. Fraksi toksik adalah fraksi yang diperoleh dari fraksinasi ekstrak etanol

kering dengan metode VCC menggunakan fase gerak toluen-etil asetat

(85:15 v/v) serta fase diam Silika gel GF 254, yang memiliki LC50 ≤ 1000

μg/ml dalam metode BST.

f. Fraksi paling toksik adalah fraksi yang memiliki harga LC50 paling kecil

dari semua fraksi uji dalam kisaran ≤ 1000 μg/ml dalam metode BST.

g. Hewan Uji adalah larva artemia yang telah berumur 48 jam.


22

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

a. Bahan utama

Daun tumbuhan tembelekan diperoleh pada bulan Agustus 2006

dari tumbuhan tembelekan di belakang RSJ Grahasia, Pakem, Sleman,

Yogyakarta.

b. Bahan untuk penyarian

Bahan yang digunakan untuk penyarian berderajat pro analysis

(p.a.), kecuali bila disebutkan lain. Bahan tersebut adalah aquades (yang

diambil dari Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta).

c. Bahan untuk BST

1) Telur artemia Viper (Jeannie Hoo., LTD, China)

2) Air laut buatan dengan kadar garam 5 per mil

3) Fraksi ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan,

4) Ragi Saccharomyces cerevisae.

d. Bahan untuk air laut buatan

Bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan

berderajat teknis. Bahan-bahan terdiri dari natrium klorida, magnesium

sulfat, magnesium klorida, kalsium klorida, kalium klorida, natrium

hidrokarbonat, aquadest, dan aquadest bebas CO2.


23

e. Bahan untuk KLT

Lempeng KLT dengan fase diam silika gel GF254 (MERCK),

larutan pengembang toluen, etilasetat, pereaksi semprot vanillin-asam

sulfat, ekstrak etanol dan fraksi aktif tumbuhan tembelekan.

f. Bahan untuk Fraksinasi

Fase diam silika gel GF 254 (E.merck), fase gerak Toluen, Etil

asetat, ekstrak etanol tumbuhan tembelekan.

2. Alat penelitian

a. Alat untuk penyarian

Gelas ukur (Pyrex), waterbath (Memmert), Erlenmeyer (Pyrex),

neraca analitik (Mettler Toledo AB 204), vaccum rotary evaporator (Janke

& Kunkel), batang pengaduk, sendok, cawan porselen.

b. Alat untuk uji BST

Flakon, bak penetasan artemia (lokal), mikropipet (Socorex ISBA

S.A), lampu 5 watt (dop), aerator (Niko Nk 1200), pipet tetes, neraca

analitik (Mettler Toledo AB 204), Vortex (Dijkstra).

c. Alat untuk KLT

Pipa kapiler 5 µl, bejana kromatografi, alat semprot, kertas saring,

plat kaca, lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.

d. Alat untuk Fraksinasi

Pipa kolom, vaccum hose Buchner, Beaker glass, gelas ukur, corong,

cawan porselen, sinteredglass.


24

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tumbuhan tembelekan

Determinasi tumbuhan bertujuan untuk memastikan bahwa tumbuhan

yang digunakan adalah Lantana camara L.. Determinasi tumbuhan dilakukan di

Laboratorium Kebun Obat, Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta dengan

menggunakan buku acuan menurut Becker and Backhuizen vol. I (1963) dan Vol

II (1965). Hasil determinasi tumbuhan berupa nama jenis (species) tumbuhan

yang digunakan dalam penelitian ini.

2. Pengumpulan bahan

Daun tumbuhan tembelekan diambil saat tumbuhan sedang berbunga

dan berbuah pada bulan Agustus 2006 di belakang RSJ Grahasia, Pakem, Sleman,

Yogyakarta.

3. Penyiapan bahan

Daun tumbuhan tembelekan yang sudah diambil dicuci dengan air bersih

yang mengalir, kemudian diangin-anginkan. Apabila sudah bersih daun tumbuhan

tembelekan dikeringkan dibawah sinar matahari secara tidak langsung dengan

ditutupi kain hitam. Daun dapat diasumsikan kering apabila daun diremas dapat

hancur. Setelah kering dipotong kecil-kecil dan diserbuk.

4. Maserasi

Serbuk daun tumbuhan tembelekan ditimbang sebanyak 30 g,

dimasukkan dalam erlenmeyer kemudian ditambahkan pelarut etanol pro analysis

(p.a) sebanyak 225 ml. Erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil, lalu diletakkan

pada mesin pengaduk (shaker) dengan laju konstan (130 rpm) selama 24 jam lalu


25

larutan disaring dengan kertas saring. Maserat ditampung dan disimpan pada suhu

kamar sedangkan ampasnya dimaserasi lagi dengan 225 ml etanol p.a.

menggunakan shaker 130 rpm selama 24 jam, lalu disaring dan maserat

ditampung untuk digabungkan dengan maserat hasil maserasi 24 jam pertama.

Maserat yang terkumpul lalu dipekatkan dengan vaccum rotary

evaporator sampai kental (volume kira-kira 1/3 nya). Setelah itu, dengan

menggunakan cawan porselen yang sudah ditimbang terlebih dahulu, ekstrak

diuapkan di atas waterbath dengan suhu 50°C dan dengan kipas angin sampai

didapatkan ekstrak kering.

5. Fraksinasi

Sebelumnya dilakukan KLT orientasi/panduan untuk fraksinasi. Hal ini

dilakukan untuk optimasi pemilihan fase gerak pada proses fraksinasi. Fase diam

yang digunakan adalah silika gel GF 254 dan fase gerak yang digunakan adalah

campuran toluen-etil asetat dengan perbandingan 85:15 v/v.

a. Pembuatan kolom fase diam

Serbuk silica gel dimasukkan ke dalam kolom sampai setinggi ± 5 cm,

dituang ke dalam beaker glass 200 ml, ditambahkan fase gerak sampai terendam

lalu diaduk hingga menjadi bubur homogen. Kolom dipasang di atas vaccum hose

buchner, beakerglass 100 ml diletakkan ke dalamnya, pompa vakum

dihubungkan. Bubur dituangkan ke dalam kolom, kemudian dihisap sampai tidak

ada tetesan, larutan disingkirkan.


26

b. Persiapan sampel

Ekstrak kental ditimbang 0,5 – 1 g dengan cawan porselen, ditambahkan

silica gel sesedikit mungkin, diaduk hingga menjadi serbuk kering. Serbuk sampel

dituang ke atas fase diam sampai rata. Sedikit serbuk silica gel ditaburkan di atas

serbuk sampel, ditutup dengan kertas saring sesuai dengan diameter kolom untuk

menjaga agar ekstrak tidak bergeser ketika dituangi fase gerak.

c. Proses Fraksinasi

Beaker gelas kosong ditempatkan pada posisi penampungan, fase gerak

pertama sebanyak 50 ml dituangkan secara hati-hati pada kolom, hisap dengan

pompa vakum sampai tidak menetes. Beaker gelas yang berisi larutan sampel

dipindahkan dan disimpan, diberi label no 1. Beaker gelas diganti dengan yang

baru, fase gerak kedua dituang sebanyak 50 ml ke dalam kolom secara hati-hati,

hisap dengan pompa vakum sampai tidak menetes. Pindahkan dan simpan beaker

gelas yang berisi larutan sampel, beri label no 2. Cara yang sama dilakukan untuk

sampel no 3 dan selanjutnya. Proses fraksinasi dihentikan ketika profil bercak

pada KLT fraksi sudah sesuai dengan profil bercak pada KLT orientasi.

d. Uji KLT fraksinasi

Sampel yang diperoleh kemudian dikentalkan sampai sekitar ± 30 ml,

ditotolkan 5 µl pada lempeng KLT (fase diam silica gel GF 254), dielusi pada fase

gerak toluene-etil asetat (85:15). Deteksi dengan dilihat pada UV 254 nm dan 365

nm serta dengan vanillin-asam sulfat. Kromatogram didokumentasikan. Fraksi

dengan kesamaan bercak dijadikan satu.


27

6. Pembuatan air laut buatan

Komposisi bahan yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan

berkadar garam 5 per mil adalah 5 gram natrium klorida (NaCl), 1,3 g magnesium

sulfat (MgSO4), 1 g magnesium klorida (MgCl2), 0,3 g kalsium klorida (CaCl2),

0,2 g kalium klorida (KCl), dan 2 g natrium hidrokarbonat (NaHCO3) dicampur

dalam 1 liter aquades. Bahan-bahan sebagian dilarutkan dalam sebagian aquadest

dalam labu takar satu liter. Khusus untuk magnesium sulfat dilarutkan dalam air

panas, sedangkan natrium hidrokarbonat dilarutkan dengan air bebas CO2.

Kemudian ditambah aquadest sampai volume tepat 1 liter. Air laut buatan

berkadar garam 5 per mil dan pH antara 7,3 – 8,4 (Mudjiman, 1989).

7. Penetasan telur artemia

Artemia ditetaskan dari telurnya dengan media air laut buatan berkadar

5 permil. Telur artemia ditetaskan dalam aquarium yang disekat menjadi dua

bagian, bagian terang dan bagian gelap, dengan sekat berlubang. Bagian gelap

merupakan tempat telur artemia ditaburkan. Telur menetas setelah kira-kira 24-36

jam kemudian menjadi nauplius (Mudjiman, 1989). Nauplius yang aktif akan

bergerak menuju tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Setelah 48 jam,

nauplius diambil dari bagian yang terang menggunakan pipet dan digunakan

sebagai hewan uji (Meyer et al., 1982).


28

8. Pembuatan larutan sampel

a. Pembuatan larutan A dan B ( larutan stok )

1) F2

Larutan A dengan konsentrasi 10 mg/ml (10 μg/μl) dibuat

dengan menimbang 100,0 mg ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan

kemudian dilarutkan dalam etanol p.a. sampai 10,0 ml. Larutan B dengan

konsentrasi 1 μg/μl dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A

kemudian dilarutkan dalam etanol p.a. sampai 10,0 ml.

2) F3

Larutan A dengan konsentrasi 10 mg/ml atau 10 μg/μl dibuat




kemudian dilarutkan dalam etanol p.a. sampai 10,0 ml. Larutan C dengan

konsentrasi 0,5 μg/μl dibuat dengan mengambil 0,5 ml dari larutan A


3) F4

Larutan A dengan konsentrasi 10 mg/ml atau 10 μg/μl dibuat






29

b. Pembuatan larutan sampel

Dari larutan stok tersebut dibuat seri konsentrasi untuk tiap fraksi (cara

memperoleh konsentrasi lihat pada Lampiran 9).

1) F2 : (100; 178; 316,84; 563,97; 1003,87) μg/ml.

2) F3 : ( 5; 10,5; 22,05; 43,3; 97,2) μg/ml.

3) F4 : (10; 32; 102,4; 327,7; 1048,6) μg/ml.

Tabel I. Seri konsentrasi larutan sampel daun tumbuhan tembelekan

Konsentrasi larutan

stok

Volume larutan stok

yang diambil

Volume air laut buatan

yang ditambahkan

Konsentrasi larutan sampel yang diujikan

(C1) (V1) (V2) (C2)

Sampel

(μg/ml) (ml) (ml) (μg/ml) 0,50 5 100 1000 0,890 5 178 0,160 5 316,84 0,280 5 563,97

F2

10000

0,50 5 1003,87 500 0,050 5 5

0,050 5 10,5 0,110 5 22,05 0,220 5 43,3

F31000

0,490 5 97,2 0,050 5 10 0,160 5 32 1000

0,510 5 102,4 0,160 5 327,7

F4

10000 0,520 5 1048,6


30

9. Uji toksisitas akut dengan BST

Uji toksisitas dilakukan dengan menggunakan larva artemia yang

berumur 48 jam (Meyer et al., 1982). Sepuluh ekor larva artemia yang berumur 48

jam diambil, dimasukkan ke dalam flakon yang telah berisi sampel dengan

konsentrasi tertentu, air laut buatan sebanyak 3 ml dan 1 tetes ragi (3mg/5ml)

sebagai makanan yang kemudian divortek. Air laut buatan ditambahkan sampai 5

ml. Setiap pengujian selalu disertai dengan kontrol dan masing-masing

konsentrasi dibuat dalam 5 kali replikasi. Flakon dijaga agar selalu mendapat

penerangan. Setelah 24 jam, jumlah larva artemia yang mati dihitung untuk

mengetahui nilai probit dan dianalisis untuk mengetahui harga LC50 (Meyer et al.,

1982).

10. Uji KLT fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan

Uji dengan KLT ini bertujuan untuk mengetahui profil bercak dari fraksi

yang terdapat dalam fraksi daun tumbuhan tembelekan. Ekstrak kental fraksi daun

tumbuhan tembelekan dilarutkan dengan etanol dan ditotolkan pada lempeng

KLT. Lempeng KLT dimasukkan dalam bejana yang berisi fase gerak yang telah

jenuh lalu dielusi sampai jarak rambat 15 cm, kemudian diangkat dan dikeringkan.

Setelah itu elusi yang terjadi diamati dengan melihat bercak yang timbul.

Pengamatan bercak dilakukan dibawah sinar UV dengan panjang gelombang 254

nm dan 365 nm serta dengan pereaksi semprot.

Identifikasi triterpenoid, sistem KLT yang digunakan adalah sebagai berikut :

fase diam : silika gel GF 254 (MERCK)

fase gerak : toluen:etil asetat (85:15 v/v)


31

deteksi : visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm, dan vanillin asam sulfat

(pemanasan 100-110 °C, 10 menit)

11. Analisis hasil

Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis

menggunakan analisis probit SPSS untuk menghitung harga LC50. Dalam

perhitungan analisis probit secara manual, konsentrasi ditransformasikan menjadi

log konsentrasi (sebagai nilai x) dan % kematian ditransformasikan menjadi nilai

probit (sebagai nilai y). Setelah didapatkan persamaan garis data di atas, dicari

nilai LC50 dengan menghitung nilai x pada y=5. Setelah itu, nilai x di anti-log kan

untuk mendapatkan konsentrasi dimana dapat membunuh 50% hewan uji.

Jika pada kontrol ada artemia yang mati, maka persen kematian

ditentukan dengan rumus Abbot :

kontrol padakematian % - 100kontrol padakematian % - perlakuan padakematian % KEMATIAN % =

(Kumar, Prasad, and Singh, 2005)


BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran tumbuhan yang

akan digunakan dalam penelitian. Determinasi tumbuhan dilakukan secara

makroskopis dengan melihat ciri-ciri morfologi tumbuhan secara keseluruhan

mulai dari daun, bunga, batang kemudian dibandingkan dengan determinasi

tumbuhan yang terdapat dalam buku acuan menurut Backer and Bakhuizen Van

den Brink (1963 & 1965).

Berdasarkan determinasi tumbuhan yang telah dilakukan (lampiran 1),

diperoleh kesimpulan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah benar-benar

tumbuhan Lantana camara L.

B. Pengumpulan Bahan

Daun tumbuhan tembelekan diperoleh dari tumbuhan tembelekan yang

tumbuh di belakang RSJ Grahasia, Pakem. Lokasi tumbuh diusahakan sama untuk

menghindari variasi kandungan kimia yang terlalu besar karena perbedaan kondisi

lingkungan. Pemilihan daun ke-4 sampai ke-5 dari ujung tangkai bertujuan agar

daun yang digunakan memiliki umur yang relatif sama sehingga kadar senyawa

aktifnya tidak berbeda secara bermakna (Anonim, 1985). Daun diambil dalam

keadaan tumbuhan sedang berbunga karena pada saat itu kandungan kimia

mencapai kadar optimum sehingga senyawa aktif yang terbentuk juga dalam

keadaan optimal (Anonim, 1985).

32


33

Pengeringan bertujuan untuk menurunkan kadar air sehingga tidak

ditumbuhi jamur, mempermudah pembuatan serbuk, dan menjamin agar

kualitasnya tetap baik sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama.

Reaksi enzimatis serta perubahan kimiawi juga dapat diminimalkan, sehingga

senyawa aktif yang terkandung dalam daun tumbuhan tembelekan tidak hilang

terurai (Anonim, 1986).

Pembuatan serbuk bertujuan untuk memperluas permukaan yang kontak

dengan cairan penyari sehingga kandungan kimia yang terlarut dalam proses

penyarian lebih banyak dan penyarian dapat berlangsung lebih sempurna

(Anonim, 1986).

C. Maserasi Daun Tumbuhan Tembelekan

Maserasi merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan merendam

serbuk sampel dalam cairan penyari. Penyarian merupakan peristiwa perpindahan

massa zat aktif yang semula berada di dalam sel ditarik oleh cairan penyari

sehingga di dalam cairan penyari terdapat zat aktif. Penyarian dengan cara

maserasi perlu dilakukan pengadukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar

serbuk sampel sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya

perbedaan konsentrasi yang sebesar-besarnya antara larutan dalam sel dengan

larutan diluar sel. Makin besar perbedaan konsentrasi, makin besar pula daya

dorong untuk memindahkan massa dari dalam sel ke dalam cairan penyari

(Anonim, 1986).


34

Maserasi kinetika adalah maserasi dengan menggunakan mesin shaker

yang berputar terus menerus dilakukan 6 sampai 24 jam (Anonim, 1986). Dalam

penelitian ini digunakan 30 gram serbuk daun tembelekan dan 225 ml etanol p.a.

yang dimasukkan dalam Erlenmeyer yang ditutup dengan aluminium foil. Hal ini

bertujuan agar larutan penyari (etanol p.a.) tidak menguap terlebih dahulu,

sehingga penyarian dapat maksimal.

Pada penelitian didapatkan maserat sebanyak 450 ml. Untuk

mendapatkan ekstrak etanol kering maka etanol diuapkan menggunakan vaccum

rotary evaporator hingga kental (± 100 ml), kemudian dipekatkan lagi di

waterbath dengan suhu tidak lebih 60° C menggunakan cawan. Vaccum rotary

evaporator digunakan karena dengan alat ini dapat diketahui dan diatur tekanan

alat (175 mmHg pada 40o C untuk etanol), sebab pada tekanan sebesar itu dapat

menurunkan titik didih dari etanol yang nantinya akan mempercepat penguapan

etanol tanpa membutuhkan pemberian panas tinggi. Selain itu, dengan

menggunakan alat ini dapat meningkatkan efisiensi biaya penelitian karena etanol

yang menguap dapat diperoleh kembali dalam suatu wadah penampung pada

rangkaian alat.

Pengeringan maserat didapatkan 2,27 gram ekstrak etanol kering. Cawan

porselen yang berisi ekstrak etanol kemudian ditutup dengan aluminium foil lalu

dimasukkan dalam eksikator. Dalam eksikator tidak ada air dan udara yang

masuk, karena dalam eksikator terdapat kapur tohor yang dapat menyerap air di

udara, yang dapat memungkinkan terjadinya perubahan senyawa dalam ekstrak

tersebut atau dapat merusak senyawa oleh adanya bakteri atau cendawan.. Selain


35

itu, dapat juga menarik sisa air yang mungkin masih tertinggal dalam ekstrak

karena proses pengeringan yang kurang sempurna.

D. Fraksinasi Ekstrak Etanol Hasil Maserasi

Kromatografi kolom vakum adalah suatu bentuk kolom yang terutama

bermanfaat untuk fraksinasi secara kasar dengan cepat. Fraksinasi ini tidak dapat

mengisolasi dalam bentuk suatu senyawa tunggal namun hanya mengisolasi

berdasarkan polaritas senyawa pada fase gerak. Senyawa ataupun golongan

senyawa yang diperoleh bisa lebih dari satu. Penggunaan vakum akan

mempercepat proses pengeluasian karena selain adanya gaya gravitasi juga

terdapat perbedaan tekanan pada kolom.

Ekstrak etanol dari tumbuhan tembelekan yang didapat dari metode

maserasi kemudian di fraksinasi dengan kromatografi kolom vakum. Sebelum di

fraksinasi dilakukan tahap KLT orientasi berdasarkan pemisahan senyawa

terpenoid. Hal ini didasarkan pada kandungan senyawa golongan terpenoid yang

terdapat di daun tumbuhan tembelekan. Fase gerak yang digunakan pada KLT

adalah toluen-etil asetat dengan perbandingan 93 banding 7 (v/v) dan fase diam

yang digunakan adalah silika gel. Toluen merupakan pelarut yang relatif non-

polar memiliki indeks polaritas 2,4 P’ dan etil-asetat merupakan pelarut yang

relatif lebih polar daripada toluen memiliki indeks polaritas 4,4 P’ (Skoog, 1985).

Campuran kedua fase gerak didapatkan indeks polaritas sebesar 2,54 P’. Silika gel

merupakan bahan penjerab yang polar. Hal ini dikarenakan adanya atom oksigen

yang polar dan adanya gugus hidroksi pada permukaannya (Gritter dkk, 1991).


36

Hasilnya pemisahan belum cukup optimal karena pada profil bercak KLT masih

terdapat beberapa bercak yang bertumpuk pada daerah awal jarak pengeluasian

(awal penotolon) yang menunjukkan bahwa beberapa bercak bersifat lebih polar

sehingga lebih berinteraksi kuat dengan fase diamnya (Gambar 2)..

Gambar 2. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan untuk panduan fraksinasi dengan perbandingan fase gerak 93:7, jarak pengembangan 15 cm.

Keterangan : Fase diam : silika gel GF254 Fase gerak : toluen : etil asetat (93:7 v/v) Deteksi : Sinar UV 365 nm

( Dari kiri ke kanan merupakan urutan bercak penotolan dari 1 kali penotolan sampai n kali penotolan.)


37

Bercak yang menumpuk akan mempengaruhi hasil dari proses fraksinasi

yang diharapkan akan diperoleh fraksi dengan profil bercak yang jelas serta

terpisah menurut kepolarannya. Modifikasi fase gerak diperlukan untuk bisa

mengeluasi bercak yang bertumpuk hingga bercak terpisah dan juga untuk

mendapatkan kerapatan jarak antar bercak yang teratur. Melihat sifat bercak yang

polar maka modifikasi fase gerak dibuat menjadi lebih polar daripada sebelumnya

yang non polar. Fase gerak non polar, dalam hal ini toluen, dikurangi

konsentrasinya dan fase gerak yang lebih polar, etil asetat, konsentrasinya

ditambah. Perbandingan fase gerak dibuat toluen (90) : etil asetat (10), indeks

polaritas campuran 2,6 P’.

Setelah dilakukan proses eluasi, hasil pemisahan dengan perbandingan

ini masih belum memuaskan karena masih terdapat bercak yang menumpuk dan

kerapatan jarak antar bercak masih belum merata (Gambar 3).


38


Keterangan : Fase diam : silika gel GF254 Fase gerak : toluen : etil asetat (90:10 v/v)

Deteksi : Sinar UV 365 nm

Modifikasi selanjutnya dirubah pada perbandingan toluen (85) : etil

asetat (15), indeks polaritas campuran fase gerak 2,7 P’. Pemisahan becak sudah

baik karena bercak sudah tidak menumpuk dan diperoleh kerapatan jarak antar

bercak yang hampir merata(Gambar 4).


39

Gambar 4. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan untuk panduan fraksinasi dengan perbandingan fase gerak 85:15, jarak pengembangan 15 cm..


Hasil dengan perbandingan 85:15 sudah baik, namun dirasa masih perlu

dilakukan modifikasi lebih lanjut untuk mendapatkan hasil yang lebih baik lagi.

Perbandingan selanjutnya yang digunakan adalah toluen (80) banding etil asetat

(20). indeks polaritas campuran fase gerak 2,8 P’. Hasilnya kerapatan jarak antar


40

bercak sudah merata dan namun terdapat bercak yang menumpuk pada posisi

akhir jarak pengeluasian(Gambar 5).




41

Melihat profil dari ke empat KLT orientasi di atas maka diputuskan

untuk memakai fase gerak toluen-etil asetat dengan perbandingan 85:15 v/v.

Setelah diperoleh sistem pemisahan dari KLT orientasi, kemudian

diaplikasikan ke metode Vaccum Coloumn Chromatography (VCC) atau disebut

juga Kromatografi Kolom Vakum. Volume fase gerak yang digunakan untuk

setiap kali fraksinasi sebanyak 50 ml karena diharapkan dapat mengeluasi bercak

berdasarkan urutan kepolarannya. Pada perbandingan fase gerak 85:15, indeks

polaritas campuran dari kedua senyawa tersebut adalah 2,7 P’ yang masuk dalam

kategori fase gerak yang relatif non-polar. Bercak/senyawa yang bersifat non

polar akan terfraksinasi terlebih dahulu. Berturut-turut selanjutnya akan

didapatkan bercak/senyawa yang cenderung lebih polar. Senyawa-senyawa yang

non-polar akan berinteraksi dengan fase gerak yang non-polar sehingga lebih

cepat tereluasi sedangkan senyawa yang relatif lebih polar akan berinteraksi

dengan fase diam sehingga waktu eluasinya lebih lama.

Fase diam yang digunakan adalah silika gel yang dibuat menjadi bubur

dengan pelarut fase gerak yang akan digunakan. Pembuatan bubur ini bertujuan

untuk memudahkan dalam pemasukan ke dalam kolom serta untuk menghindari

terjadinya rongga udara pada kolom yang dapat mengganggu dalam proses

fraksinasi. Penghisapan pelarut bubur dalam kolom dimaksudkan untuk lebih

memampatkan fase diam sehingga diperoleh kerapatan fase diam yang kompak

dan merata.

Fraksinasi dengan menggunakan kromatografi vakum-cair didapatkan 12

fraksi hasil (Gambar 6).


42

Gambar 6. Kromatogram 12 fraksi ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan hasil fraksinasi dengan jarak pengembangan 15 cm.


Proses fraksinasi dapat dihentikan karena sudah didapatkan profil bercak

yang sesuai dengan KLT orientasi. Pada fraksi no 1 didapatkan profil bercak yang

berwarna hijau pada UV 365 nm. Profil bercak ini sudah sesuai dengan profil

bercak pada KLT orientasi yang tereluasi pertama kali yang juga memberikan

warna hijau pada UV 365 nm. Akhir pengeluasian pada profil bercak KLT

orientasi juga ditandai dengan bercak yang berwarna hijau pada UV 365 nm dan

bercak ini sudah diperoleh profil bercaknya mulai dari fraksi no 8.


43

Fraksi-fraksi yang mempunyai kesamaan bercak kemudian digabung.

Selain itu penggabungan bercak juga didasarkan pada bercak yang dominan pada

fraksi. Bercak dominan adalah bercak yang mempunyai area relatif lebih lebar dan

terlihat lebih tebal. Fraksi yang mempunyai kesamaan bercak yaitu pada fraksi no

8 sampai 12 yang kemudian digabung menjadi satu. Profil bercak pada fraksi no 3

sampai 7 mempunyai profil yang hampir sama dalam rentang panjang bercak

pengeluasiannya. Namun, profil bercak pada fraksi no 4 sampai 7 lebih dominan

pada bercak bagian bawah pengeluasian (polar) sehingga fraksi no 4 sampai 7

digabung menjadi satu. Fraksi no 1 sampai 3 tidak digabung karena mempunyai

karakteristik bercak dominan yang berbeda. Penggabungan ini bertujuan untuk

mendapatkan profil fraksi dari yang nonpolar sampai ke fraksi yang polar. Selain

itu untuk mendapatkan profil dari fraksi yang memiliki efek toksik pada larva

artemia.

Tabel II. Penggabungan hasil fraksinasi menjadi 5 fraksi berdasarkan data gambar 6

Penggabungan Fraksi

no nama dan berat fraksi gabungan 1 F1 berat 40 mg 2 F2 berat 150 mg 3 F3 berat 60 mg

4 sampai 7 F4 berat 150 mg 8 sampai 12 F5 berat 20 mg

Hasil penggabungan didapatkan lima fraksi yaitu F1, F2, F3, F4, F5. Tabel

penggabungan fraksi menunjukkan berat dari fraksi gabungan. Berat fraksi yang

besar ditunjukkan pada F2 dan F4. Lima fraksi gabungan tersebut, tiga fraksi yang

diujikan dengan metode BST yaitu F2, F3, F4. Pengujian dengan metode BST tidak


44

melibatkan F1 karena profil bercak KLT pada F1 sudah terwakili pada F2. Pada F5

tidak diuji karena profil nya sudah terwakili pada F4.

E. Pembuatan Air Laut Buatan (ALB)

Komposisi bahan pembuat ALB terdiri dari natrium klorida, magnesium

sulfat, magnesium klorida, kalsium klorida, kalium klorida, natrium

hidrokarbonat, dan aquadest. Hal ini dimaksudkan untuk menyesuaikan dengan air

laut alami sehingga lingkungan hidupnya hampir sama. Natrium hidrokarbonat

dilarutkan dengan menggunakan air bebas karbondioksida untuk mempertahankan

sifat kebasaan atau agar pH tetap dipertahankan. Pemecahan cangkang siste

dibantu oleh kegiatan enzim penetasan yang membutuhkan pH lebih dari 8 (antara

8-9), sehingga pH sangat berpengaruh terhadap penetasan siste.

ALB memiliki kadar garam 5 permil yang artinya dalam 1 ml aquadest

mengandung 5 mg Natrium klorida. Menurut Mudjiman (1989), peningkatan

kadar garam yang mendadak dari 5 permil menjadi 35 permil tidak akan

mempengaruhi kehidupan artemia, sebab mereka mempunyai toleransi yang tinggi

terhadap perubahan kadar garam. Bahkan lebih dari 35 permil, misalnya sampai

140 permil. Hal ini disebabkan artemia mempunyai kelenjar garam, yang dapat

mengatur penyesuaian diri terhadap perubahan kadar garam.

F. Penetasan Telur Artemia

Siste yang kering memiliki kadar air kurang dari 10% berisi embrio

dalam keadaan diapauze (metabolisme terhenti sementara). Perendaman


45

dilakukan agar siste menyerap sejumlah air yang digunakan untuk mengaktifkan

metabolismenya. Air tawar digunakan dalam merendam siste karena proses

penyerapan air ke dalam siste berlangsung secara hiperosmotik (tekanan osmose

di dalam siste lebih tinggi dibandingkan tekanan osmose diluar siste).

Siste dimasukkan pada media ALB berkadar 5 per mil dengan pH 8.

Untuk pertumbuhan siste diperlukan ALB dengan kadar garam rendah, karena jika

kadar garam terlalu tinggi maka siste tidak akan menetas karena tekanan osmose

di luar siste lebih tinggi sehingga siste tidak dapat menyerap air yang cukup untuk

proses metabolismenya. Suhu juga berpengaruh untuk pertumbuhan artemia yang

baik. Suhu yang baik berkisar antara 25oC – 30oC sehingga penelitian dilakukan

dalam suhu kamar. Selain kadar garam dan pengaruh suhu, kadar oksigen juga

sangat menentukan proses penetasan siste. Untuk memenuhi kebutuhan akan

oksigen terlarut sekitar 3mg/l maka selama penetasan media diberi udara (aerasi)

dengan menggunakan aerator, gelembung udara juga berfungsi untuk mengaduk

siste secara merata agar siste tidak mengendap di dasar. Siste yang mengendap

akan kekurangan oksigen dan tidak menetas. Untuk merangsang penetasan, media

penetasan perlu disinari dengan lampu 5 watt yang diatur sedemikian rupa

sehingga tidak terlalu panas. Pemisahan cangkang telur dan larva dapat dipercepat

dengan memanfaatkan sifat artemia yang tertarik pada cahaya (fototaksis positif).

Wadah penetasan dibagi dalam dua kompartemen yaitu kompartemen gelap

dengan cara ditutup kaca hitam dan kompartemen terang dengan cahaya lampu.

Larva terseleksi akan bergerak dari kompartemen gelap ke kompartemen terang

melalui celah, sedangkan larva yang tidak cukup kuat dan aktivitasnya kurang


46

baik tidak dapat menuju kompartemen terang. Antara kedua kompartemen

tersebut diberi sekat dengan lebar celah kira-kira 1 cm.

Setelah larva menetas, maka larva dipindahkan ke dalam wadah

penetasan yang berisi ALB yang berkadar garam 5 permil dengan kondisi sama.

Pengambilan larva dilakukan dengan menggunakan pipet tetes. Pemindahan larva

ke dalam satu tempat tersebut bertujuan agar umur larva yang akan digunakan

pada saat penelitian sama. Umur larva yang berbeda akan memberikan hasil yang

berbeda. Larva artemia yang digunakan untuk uji yaitu larva yang berumur 48 jam

setelah menetas. Larva yang berumur 48 jam dalam keadaan paling peka karena

dinding selnya masih lunak sehingga hanya diperlukan konsentrasi sampel yang

kecil untuk menimbulkan efek yang diamati.

G. Uji Toksisitas dengan Metode BST

Uji toksisitas yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode BST

(Brine Shrimp Lethality Test). Metode BST merupakan skrining awal untuk

mengetahui toksisitas suatu senyawa. Karena itu uji toksisitas akut yang dilakukan

dalam penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek toksik fraksi ekstrak etanol

daun tumbuhan tembelekan. Uji toksistas akut dengan metode BST ini

menggunakan larva artemia sebagai organisme uji. Toksisitas akut dapat

ditentukan dengan melihat nilai LC50nya, jika harga LC50 lebih kecil dari 1000

μg/ml dikatakan toksik, sebaliknya jika harga LC50 lebih besar dari 1000 μg/ml

dikatakan tidak toksik. Tingkat ketoksikan tersebut akan memberikan makna

terhadap potensi aktivitasnya sebagai antitumor (Meyer et al., 982). Larva artemia


47

sangat mungkin digunakan untuk mendeteksi senyawa yang memiliki aktivitas

biologis terhadap mamalia (misalnya senyawa yang memiliki aktivitas

sitotoksisitas) karena memiliki kesamaan dengan sistem enzim pada mamalia.

Beberapa sistem tersebut antara lain tipe DNA-dependent RNA polimerase, dan

ouabaine sensitive Na+ and K+ dependent ATPase (Solis et al., 1993), sehingga

jika suatu senyawa antikanker berefek toksik terhadap larva artemia maka

senyawa antikanker tersebut dapat digunakan pada mamalia.

Penelitian ini menggunakan larva artemia yang berumur 48 jam. Tzong

& Jiann (1987) mengungkapkan bahwa pada umur ini sifat selnya masih lunak

dan peka sehingga hanya dibutuhkan konsentrasi sampel yang kecil untuk

menimbulkan efek toksik yang diinginkan pada percobaan. Sifat sel yang masih

lunak pada kulit artemia diasumsikan sebagai membran semipermiabel pada sel

mamalia. Sampel yang diujikan diharapkan masuk ke dalam tubuh artemia

melalui difusi pasif karena perbedaan gradien kadar yang kemudian diharapkan

sampel tersebut memberikan efek toksik pada artemia. Membran semi permiabel

terdiri atas lapisan lipid-air-lipid maka senyawa yang bersifat nonpolar (terpenoid)

akan lebih mudah masuk ke dalam sel.

Sampel tiap fraksi dilarutkan dalam etanol, dengan mikropipet larutan

sampel diambil dan dimasukkan ke dalam flakon sesuai konsentrasi yang

digunakan. Sebelum dibuat seri konsentrasi, masing-masing sampel fraksi

dilakukan orientasi kadar terlebih dahulu yaitu 10, 100, 1000 μg/ml (Meyer et al.,

1982). Dalam pembuatan seri konsentrasi, dibuat konsentrasi tinggi yang dapat

membunuh semua atau hampir semua hewan uji, dan konsentrasi rendah yang


48

hanya mematikan kurang dari separuh hewan uji. Setelah pengujian dengan kadar

orientasi, didapatkan jumlah larva yang mati, yang kemudian digunakan untuk

menghitung persentase kematian larva tersebut (lampiran 9). Dari data persentase

kematian ini diambil konsentrasi yang memberikan harga persentase kematian

larva antara 20%-80% sebagai konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi.

Digunakan persentase kematian larva antara 20%-80% karena dengan persentase

kematian tersebut sudah dapat memberikan kurva yang lebih linier, sehingga LC50

yang didapatkan pada uji BST ini lebih dapat menggambarkan hasil yang

sebenarnya. Selanjutnya untuk mendapatkan lima seri konsentrasi dengan

kelipatan yang sama, yang merupakan syarat probit dapat dihitung dengan rumus

F (lampiran 9). Seri konsentrasi didapatkan dari orientasi kadar dengan masing-

masing konsentrasi fraksi yaitu F2 (100; 178; 316,84; 563,97; 1003,87) μg/ml, F3

( 5; 10,5; 22,05; 43,3; 97,2) μg/ml, F4 (10; 32; 102,4; 327,7; 1048,6) μg/ml.

Pelarut diuapkan pada suhu kamar dengan cara diangin-anginkan

sampai tidak berbau lagi. Hal ini dimaksudkan untuk mencegah efek yang tidak

dikehendaki dari pelarut. Jadi diharapkan kematian larva yang timbul hanya

disebabkan oleh sampel yang dimasukkan. Karena itu dalam penelitian ini

diperlukan kontrol negatif. Kontrol dibuat dengan cara yang sama, tetapi hanya

menggunakan pelarut sampel fraksi saja. Kontrol dipakai untuk mengkoreksi

kemungkinan timbulnya efek pelarut yang tidak dikehendaki yaitu penguapan

belum sempurna dan faktor-faktor lain dari pelarut yang berpengaruh. Apabila

dalam pengamatan terhadap kontrol ditemukan larva artemia yang mati, maka

persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot’s.


49

Setelah flakon diisi sampel dan dikeringkan, ditambahkan + 3 ml ALB

dan satu tetes ragi sebagai makanan yang kemudian divortex untuk mencampur

sampel dengan ALB, sehingga sampel uji akan terdistribusi merata dalam ALB.

Dari flakon-flakon tersebut masing-masing secara acak dimasukkan larva artemia

sebanyak 10 ekor menggunakan pipet tetes dengan latar belakang terang

(Mudjiman, 1991). Setelah itu ditambahkan 2 ml ALB ke dalam flakon sehingga

didapatkan volume ALB di dalam flakon sebesar 5 ml. Meyer et al., (1982)

memaparkan konsentrasi ragi yang digunakan adalah 3 mg ragi dalam 5 ml ALB.

Dengan makanan tersebut maka dapat dicegah kemungkinan larva artemia mati

karena kekurangan makanan. Artemia merupakan filter feeder (penyaring

makanan) dan menelan apa saja yang berukuran kecil. Artemia tidak bisa

membedakan antara makanan dan bukan makanan maka pemberian makanan

perlu diukur konsentrasinya untuk menghindari terjadinya penumpukan makanan

dalam flakon. Apabila jumlah makanan yang diberikan berlebihan maka jumlah

yang ditelan juga lebih banyak. Hal tersebut dapat menyebabkan sisa makanan

yang belum dicerna dengan sempurna akan didesak oleh makanan baru yang terus

menerus masuk dalam jumlah banyak, sehingga makanan tersebut keluar lagi

dalam keadaan belum tercerna dengan baik (Mudjiman, 1991).

Setelah 24 jam, larva yang hidup dihitung. Setelah perhitungan

didapatkan % kematian pada masing-masing konsentrasi perlakuan dan kontrol.

Kontrol digunakan untuk mengoreksi kematian larva yang bukan disebabkan oleh

pengaruh fraksi daun tumbuhan tembelekan.


50

Tabel III. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian fraksi

ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan

fraksi 2 fraksi 3 fraksi 4

Konsentrasi

( µg/ml)

Persentase kematian

(%)

Konsentrasi( µg/ml)

Persentase kematian

(%)

Konsentrasi ( µg/ml)

Persentase kematian

(%)

100 20 5 17,39 10 25

178 33,33 10,5 34,78 32 40

316,84 39,13 22,05 47,83 102,4 51,06

563,97 53,33 43,3 61,70 327,7 57,77

1003,87 62,22 97,2 81,25 1048,6 76,59

Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan metode analisis probit

untuk menentukan nilai LC50. Pada analisis probit, konsentrasi sampel

ditransformasikan ke dalam bentuk logaritma sebagai variabel tetap (nilai x)

sedangkan nilai probit dari persentase kematian ditetapkan menjadi variabel

tergantung (nilai y). Dari data tersebut diperoleh persamaan garis regresi linier.

Data dianalisis dengan analisis probit menggunakan program SPSS

10.00. Untuk F2, setelah dianalisis dengan analisis probit diperoleh persamaan

garis linier adalah y = 1,11990x – 3,02990. Diperoleh suatu tabel yang

mencantumkan nilai LC50 yang dihasilkan yaitu 508 μg/ml dengan kisaran batas

bawah sebesar 399 μg/ml dan kisaran batas atas sebesar 698 μg/ml (lampiran 10).

Untuk F3, setelah dianalisis dengan analisis probit diperoleh persamaan garis

linier adalah y = 1,34949x – 1,84601. Diperoleh suatu tabel yang mencantumkan

nilai LC50 yang dihasilkan yaitu 23 μg/ml dengan kisaran batas bawah sebesar 19


51

μg/ml dan kisaran batas atas sebesar 29 μg/ml (lampiran 11). Untuk F4, setelah

dianalisis dengan analisis probit diperoleh persamaan garis linier adalah y =

0,63690x – 1,27778. Diperoleh suatu tabel yang mencantumkan nilai LC50 yang

dihasilkan yaitu 101 μg/ml dengan kisaran batas bawah sebesar 66 μg/ml dan

kisaran batas atas sebesar 155 μg/ml (lampiran 12). Kurva hubungan antara nilai

probit dengan log konsentrasi tiap fraksi dapat dilihat pada gambar 7 untuk F2,

gambar 8 untuk F3, gambar 9 untuk F4.

Berdasarkan kurva yang dihasilkan, maka terdapat korelasi yang

diharapkan antara konsentrasi dengan respon. Semakin besar konsentrasi yang

diberikan maka banyaknya hewan uji yang mati pun semakin banyak. Hal tersebut

nampak dari nilai probit yang meningkat seiring meningkatnya log konsentrasi

serta nilai koefisien korelasi yang mendekati 1 (r = 0,99227 untuk F2; r = 0,99624

untuk F3; r = 0,98666 untuk F4).

Probit Transformed Responses

Log of KONS

3,23,02,82,62,42,22,01,8

Prob

it

,4

,2

0,0

-,2

-,4

-,6

-,8

-1,0 Rsq = 0,9846

Gambar 7. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi F2


52


Log of KONS

2,01,81,61,41,21,0,8,6

Prob

it

1,0

,5

0,0

-,5

-1,0 Rsq = 0,9925



Log of KONS

3,53,02,52,01,51,0,5

Prob

it

,8

,6

,4

,2

0,0

-,2

-,4

-,6

-,8 Rsq = 0,9735


Konsentrasi fraksi daun tumbuhan tembelekan dimana dapat membunuh

50% hewan uji (LC50) juga dapat diketahui dengan menggunakan kurva di atas,

yaitu dengan menarik garis lurus pada probit 0,0 ke arah kanan sampai pada garis,

lalu ditarik garis ke arah bawah, sehingga didapatkan log konsentrasi yang

kemudian dapat diketahui konsentrasi dari fraksi aktif. Gambar di atas juga dapat

digunakan untuk menentukan nilai Rsq yang merupakan koefisien determinasi

yang mengukur tingkat ketepatan dari regresi linier sederhana, yaitu merupakan


53

presentase sumbangan X terhadap variasi Y. Setelah dilakukan analisis, untuk F2

didapatkan nilai Rsq sebesar 0,9846 yang berarti bahwa persentase sumbangan X

yaitu konsentrasi F2 daun tumbuhan tembelekan terhadap variasi Y yaitu respon

(jumlah kematian artemia) sebesar 98,46%. Untuk F3 didapatkan nilai Rsq sebesar

0,9925 yang berarti bahwa persentase sumbangan X yaitu konsentrasi F3 daun

tumbuhan tembelekan terhadap variasi Y yaitu respon (jumlah kematian artemia)

sebesar 99,25%. Sedangkan untuk F4 didapatkan nilai Rsq sebesar 0,9735 yang

berarti bahwa persentase sumbangan X yaitu konsentrasi F4 daun tumbuhan

tembelekan terhadap variasi Y yaitu respon (jumlah kematian artemia) sebesar

97,35%.

Nilai Rsq juga dapat untuk menghitung nilai R yaitu akar dari Rsq. Nilai

R didapatkan dari penelitian ini sebesar 0,9923 untuk F2 sedangkan untuk F3

sebesar 0,9962 dan untuk F4 sebesar 0,9867. Nilai R merupakan koefisien korelasi

dalam hubungan dua variabel X dan Y yang mengukur kuatnya hubungan antara

X dan Y. Dari tabel nilai R, dengan taraf kepercayaan 95% pada derajad bebas 3

dapat dilihat nilai R sebesar 0,878 sehingga didapatkan nilai R penelitian lebih

besar daripada nilai R tabel. Hal ini menunjukkan hubungan korelasi yang linier

antara konsentrasi dengan nilai probit. Meningkatnya konsentrasi diikuti dengan

meningkatnya nilai probit (respon).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua fraksi mempunyai nilai

LC50 < 1000 μg/ml, yang berarti bahwa semua fraksi tersebut bersifat toksik.

Untuk F3, mempunyai nilai LC50 yang paling kecil yaitu 23 μg/ml. Semakin besar

nilai LC50 berarti toksisitasnya semakin kecil, dan sebaliknya semakin kecil nilai


54

LC50 berarti toksisitasnya semakin besar. Merujuk hasil tersebut maka fraksi yang

memiliki efek toksik paling besar adalah F3, sehingga kemungkinan besar F3

memiliki aktivitas sitotoksik paling besar.

Setelah diperoleh fraksi paling toksik, maka dilakukan pengamatan

profil bercak tsb dengan KLT. Profil yang diperoleh berupa Rf dan warna bercak

yang terbentuk setelah disemprot pereaksi vanilin-asam sulfat.

H. Uji KLT fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan

Uji KLT dilakukan pada fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan

terhadap larva artemia dengan tujuan untuk mengetahui profil bercak yang

terdapat dalam fraksi tersebut. Fraksi daun tumbuhan tembelekan yang dilihat

profilnya adalah F2, F3, F4.

Uji KLT ini dilakukan dengan fase diam dan fase gerak yang sesuai

sehingga akan memberikan bercak yang akan dideteksi dengan sinar tampak, sinar

UV dan pereaksi-pereaksi semprot yang spesifik. Untuk senyawa terpenoid

digunakan deteksi dengan vanilin-asam sulfat. Daun tumbuhan tembelekan

mengandung senyawa golongan terpenoid. Salah satu senyawa utama yang

terdapat pada tumbuhan tembelekan adalah Lantadene. Lantadene termasuk dalam

golongan pentasiklik triterpene (Duke, 2001).

Fraksi yang akan ditotolkan dilarutkan dalam etanol. Larutan fraksi

tersebut kemudian ditotolkan pada fase diam yang akan digunakan. Sebenarnya

banyaknya totolan tergantung penampakannya di sinar UV 254 nm dan sinar UV

365 nm, artinya totolan dihentikan jika bercaknya sudah terlihat jelas di bawah


55

sinar UV 254 nm dan sinar UV 365 nm. Namun KLT yang dilakukan dalam

penelitian ini merupakan KLT semikuantitatif karena penotolan dilakukan dengan

mengetahui jumlah larutan dan konsentrasi sampel yang ditotolkan. Larutan yang

ditotolkan merupakan larutan A yang mempunyai konsentrasi 10 μg/μl, ditotolkan

sebanyak 3 totolan dengan menggunakan pipet 5 μl, sehingga dalam tiap kali

totolan ditotolkan 150 μg fraksi. Hal ini dimaksudkan untuk menyamakan

perlakuan terhadap semua fraksi toksik yang selanjutnya digunakan untuk

menduga konsentrasi bercak senyawa yang kemungkinan memiliki peran besar

terhadap kematian larva artemia. Asumsi bercak senyawa yang memiliki

konsentrasi tinggi dapat ditunjukkan dengan ketebalan dan lebar bercak serta

intensitas warna pada plat KLT. Semakin tebal dan semakin lebar bercak serta

semakin jelas intensitas warna yang terjadi menandakan bahwa pada bercak

tersebut mempunyai massa senyawa yang besar. Profil bercak dari tiap fraksi

toksik dapat dilihat pada gambar 10.


56

Gambar 10. Kromatogram tiga fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan

Keterangan : Fase diam : silika gel GF254 Fase gerak : toluen : etil asetat (85:15 v/v) Deteksi : vanilin-asam sulfat

Pada F2, bercak yang memiliki ketebalan dan lebar yang besar

ditunjukkan pada bercak nomor 6 (Rf 0,55) dan 8 (Rf 0,85). Pada F3 ditunjukkan

pada bercak nomor 2 (Rf 0,3) sedangkan pada F4 ditunjukkan pada bercak nomor

1 (Rf 0,14) (Lampiran 13). Melihat hal ini dapat dikatakan bercak-bercak pada

tiap fraksi tersebut memiliki konsentrasi yang lebih besar dibandingkan bercak

yang lain dalam KLT atau dapat dikatakan bercak tersebut merupakan bercak

dominan. Apabila melihat kepolarannya, maka berdasarkan dari sistem KLT yang


57

digunakan pada F1 terdapat senyawa-senyawa yang relatif non polar sedangkan

pada F3 terdapat senyawa-senyawa semi non polar dan pada F4 terdapat senyawa-

senyawa yang relatif lebih polar.

Tabel IV. Data kromatogram tiga fraksi toksik deteksi senyawa uji bercak no Rf

Vanilin-as.sulfat 1 0,30 ungu 2 0,39 hijau kuning 3 0,43 hijau 4 0,47 ungu 5 0,51 hijau kuning 6 0,55 hijau tua 7 0,64 ungu

Fraksi 2

8 0,85 ungu 1 0,25 ungu biru 2 0,30 ungu hijau 3 0,39 hijau kuning 4 0,43 hijau 5 0,47 ungu 6 0,51 hijau kuning

Fraksi 3

7 0,55 hijau tua 1 0,14 ungu 2 0,20 ungu biru 3 0,25 ungu biru 4 0,30 ungu

Fraksi 4

5 0,51 hijau kuning

Untuk senyawa terpenoid, akan menghasilkan warna abu-abu, merah

violet atau ungu (Wagner, Brady, and Zgainski, 1984). Profil ketiga fraksi

terdapat bercak yang mempunyai warna ungu atau keunguan. Pada F2 bercak

nomor 1 (Rf 0,3), 4 (Rf 0,47), 7 (Rf 0, 64), 8 (0,85); kemudian pada F3 bercak

nomor 1 (Rf 0,25), 2 (Rf 0,3), 5 (Rf 0,47); dan pada F4 bercak nomor 1 (Rf 0,14),

2 (Rf 0,20), 3 (Rf 0,25), 4 (Rf 0,3) mengandung warna ungu. Melihat profil dari

ketiga fraksi diduga semua fraksi mengandung senyawa terpenoid.


58

Fakta menunjukkan F2 memiliki LC50 sebesar 508 μg/ml, F3 memiliki

LC50 sebesar 23 μg/ml, dan F4 memiliki LC50 sebesar 101 μg/ml. Berturut-turut,

fraksi yang memiliki aktivitas paling toksik terhadap artemia adalah F3 kemudian

F4 dan terakhir F2. Fakta pada kromatogram (Gambar 11) menunjukkan sebagian

besar profil bercak pada F3 juga terdapat pada F2.

Gambar 11. Potongan atas gambar 10, Kromatogram fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan.


Bercak nomor 2,3,4,5,6 pada F2 memiliki kesamaan bercak dengan F3 pada bercak

nomor 3,4,5,6,7 (Gambar 11). Merujuk pada data bahwa LC50 dari F2 lebih besar

daripada F3 maka dapat dikatakan bahwa bercak pada F3 yang memiliki kesamaan

bercak dengan F2 kemungkinan bukan yang menyebabkan kematian larva artemia.

Bercak-bercak tersebut kemungkinan bukan yang memberikan efek yang paling

toksik.


59

Data pada F4 menunjukkan terdapat bercak nomor 3 yang mempunyai

kesamaan bercak dengan bercak nomor 1 pada F3 (gambar 12). Data juga

menunjukkan nilai LC50 pada F4 juga lebih besar daripada nilai LC50 pada F3.

Gambar 12. Potongan bawah Gambar 14, Kromatogram fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan.


Efek toksik dari F4 lebih kecil daripada F3 maka dapat dikatakan bahwa

bercak nomor 1, 2, 3 yang terdapat pada F4 dan bercak nomor 1 pada F3

kemungkinan tidak menyebabkan kematian pada larva artemia.

Terdapat profil bercak yang mempunyai kesamaan pada ketiga fraksi

toksik yaitu bercak nomor 1 pada F2, bercak nomor 2 pada F3, dan bercak nomor 4

pada F4 yang sama-sama mempunyai Rf 0,3 (Gambar 13). Dugaan bercak yang

berperan dalam membunuh Artemia mengarah kepada bercak dengan Rf 0,3

tersebut. Profil bercak dapat dilihat bahwa bercak tersebut pada F3 sangat tebal,

kemudian pada F4 agak tebal, dan pada F2 tipis. Dugaan didasarkan pada

konsentrasi bercak dimana pada bercak F3 terlihat sangat tebal yang artinya


60

mempunyai konsentrasi lebih tinggi sehingga dapat membunuh larva artemia lebih

banyak dibandingkan F2 dan F4.

Gambar 13. Potongan tengah gambar 10, Kromatogram fraksi toksik daun tumbuhan tembelekan.


Penelitian ini memang belum bisa membuktikan dengan pasti bahwa profil bercak

dengan Rf 0,3 tersebut merupakan bercak yang menyebabkan kematian larva

artemia.

Profil bercak KLT yang diduga menyebabkan larva artemia pada F3

terlihat menumpuk (Gambar 13). Dapat dilihat bercak terdiri dari 2 warna yaitu

warna ungu (bercak atas) dan warna hijau (bercak bawah). Untuk memperoleh

profil bercak yang lebih jelas maka dilakukan pemisahan dengan Kromatografi

Lapis Tipis Preparatif (KLTP). Penggunaan KLTP dalam penelitian ini

dimaksudkan untuk mengisolasi dan memperoleh bercak yang menumpuk. Bercak

yang telah diperoleh tersebut kemudian dieluasi dengan sistem KLT yang berbeda

dengan maksud agar didapatkan suatu profil bercak yang jelas. Untuk kontrol


61

bahwa bercak yang diperoleh merupakan bercak yang diinginkan maka dilakukan

eluasi dengan sistem KLT yang sama dengan sistem KLT profil fraksi. Fase gerak

toluen etil asetat dengan perbandingan 85:15 v/v. Ternyata bercak yang diperoleh

terkontaminasi dengan bercak nomor 1 dari F3. Data yang diperoleh menunjukkan

pada KLT kontrol terdapat 3 bercak, bercak nomor 1 terpisah sedangkan bercak

nomor 2 dan 3 menumpuk (Gambar 14) .

Gambar 14. Foto kromatogram kontrol KLTP. (A) deteksi UV 365 nm, (B)

deteksi vanilin-asam sulfat.

Keterangan : Fase diam : silika gel GF254 Fase gerak : toluen : etil asetat (85:15 v/v)


62

Sistem KLTP yang digunakan dirubah pada perbandingan fase

geraknya yang sebelumnya 85:15 v/v menjadi 97:3 v/v. Fase gerak yang

digunakan menjadi bersifat lebih non-polar sehingga bercak nomor 3 akan

mempunyai nilai Rf yang lebih besar dibandingkan bercak yang bernomor 2.

Gambar 15. Foto kromatogram KLTP bercak Rf 0,3 dari fraksi toksik.

Keterangan : Fase diam : silika gel GF254 Fase gerak : toluen : etil asetat (93:7 v/v) Deteksi : (kiri) UV 365 nm, (kanan) vanilin-asam sulfat

Tabel V. Data kromatogram gambar 15 deteksi Senyawa

uji bercak

no

Rf Vanilin-as.sulfat

Bercak 1 0,07 ungu RF 0,3 2 0,09 hijau

dari 3 0,14 ungu


63

Terbukti bercak nomor 3 KLTP mempunyai Rf 0,14 sedangkan bercak

nomor 2 mempunyai Rf 0,09 (gambar 15). Hal ini disebabkan bercak nomor 3

mempunyai sifat relatif lebih non-polar dibanding dengan bercak nomor 2.

Deteksi warna dengan menggunakan pereaksi vanillin-asam sulfat

menunjukkan bercak nomor 3 pada KLTP berwarna ungu. Dugaan senyawa

mengarah pada golongan terpenoid. Bercak yang diduga menyebabkan kematian

larva artemia salah satunya diduga merupakan golongan terpenoid

Senyawa terpenoid yang diduga menyebabkan kematian sel dalam daun

tumbuhan tembelekan adalah pentasiklik triterpenoid. Mekanisme senyawa

tersebut dalam membunuh sel belum diketahui secara rinci dan mendetail. Namun

telah diketahui bahwa pentasiklik triterpenoid dapat menghambat enzim

topoisomerase I dan II (Lee et al., 1991). Topoisomerase merupakan enzim yang

memegang peranan penting dalam transkripsi dan replikasi DNA. Beberapa fungsi

enzim ini adalah untuk menguraikan untaian DNA dan untuk memasangkan DNA

dengan pasangannya selama replikasi. Mekanisme kerja pentasiklik triterpenoid

dalam menghambat replikasi DNA belum dapat dijelaskan secara lebih terperinci

dan pasti, namun setidaknya dapat melalui dua cara yaitu dengan berikatan

dengan DNA menggantikan kedudukan enzim topoisomerase, sehingga DNA

tidak dapat bereplikasi atau dapat juga dengan berikatan dengan topoisomerase

sehingga topoisomerase tidak dapat berikatan dengan DNA dan DNA tidak dapat

bereplikasi. Jika DNA tidak terbentuk maka sel-sel tersebut akan mati. Selain itu,

senyawa ini juga dapat menghambat enzim yang mengkatalis sintesis RNA, yaitu


64

menghambat RNA polymerase. Jika enzim ini dihambat, DNA dan protein juga

tidak akan terbentuk sehingga menyebabkan kematian sel.

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, F3 merupakan fraksi yang

paling toksik. Profil bercak yang diduga bertanggungjawab terhadap kematian

larva artemia adalah golongan terpenoid dengan Rf 0,3.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Fraksi 2 (LC50 508 μg/ml), fraksi 3 (LC50 23 μg/ml) dan fraksi 4 (LC50 101

μg/ml); fraksi 3 yang paling toksik.

2. Profil bercak yang diduga bertanggungjawab terhadap kematian larva artemia

adalah golongan terpenoid dengn Rf sebesar 0,3.

B. Saran

1. Penelitian lebih lanjut yang harus dilakukan adalah isolasi bercak dengan Rf 0,3

dari fraksi toksik pada penelitian ini untuk membuktikan dugaan bahwa bercak

tersebut sungguh memberikan efek toksik pada larva artemia.

2. Penelitian berikutnya yang harus dilakukan adalah identifikasi senyawa yang

bertanggungjawab terhadap kematian artemia.

C. Keterbatasan Penelitian

1. Proses fraksinasi dalam penelitian ini dihentikan saat sudah diperoleh fraksinat

yang sesuai dengan profil KLT orientasi. Seharusnya, proses fraksinasi dilakukan

sampai semua senyawa habis terfraksinasi.

2. Pengujian fraksi tidak dilakukan semua. Seharusnya, semua fraksi diujikan

semua.

3. Ekstraksi dan fraksinasi hanya dilakukan satu kali. Seharusnya, dilakukan

replikasi.

65


DAFTAR PUSTAKA Aida, 1990, Usaha Isolasi dan Identifikasi Komponen Kimia Daun Tembelekan asal

Tamalanrea Ujung Pandang, Skripsi Anderson, J.E., Goets, C.M., and Mc Laughin, J.L., 1991, A Blind Comparison of

simple Benzh-top Bioassay and Human Tumor Cell Cytotoxicities as Antitumor Prescreens, Phytochemical Analysis, Volume 2, 107-111

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 4-5,16-20, Depkes RI, Jakarta Asteria, W.I.S., 2006, Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Tembelekan

terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 35218, Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.

Asterina, R., 1994, Pemeriksaan Flavonoid dan Verbakosid Daun Tembelekan,

Skripsi, ITB, Bandung Backer,C.A., Bakhuizen Van den Brink, R.C., 1963, Flora of Java, Vol I hal 3-6, 29-

34, N.V.P. Noordoff, Groningen, The Netherlands Backer,C.A., Bakhuizen Van den Brink, R.C., 1965, Flora of Java, Vol II hal 594-

597, N.V.P. Noordoff, Groningen, The Netherlands Coll, J.C., Bowden, B.F., 1986, The Application of Vaccum Liquid Chromatography

to the Separation of Terpene Mixtures, 934-936, James Cook University of North Queensland, Queensland, Australia.

Dalimartha, S., 1999, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia jilid I, 154-157, Trubus

Agriwidya, Ungaran Dalimartha, S., 2002, Ramuan Tradisional Untuk Pengobatan Kanker, 1-4, Penebar

Swadaya, Jakarta Donatus, I.A., 1990, Toksikologi Pangan, edisi I, 247-248, PAU Pangan dan Gizi

UGM, Yogyakarta Duke, J.A., 2001, Handbook of Phytochemical constituent of Gras Herbs and Other

Economic Plants, CRC Press, 325, London, USA. Duke, J.A., 1992, Handbook of phytochemical constituents of GRAS herbs and other

economic plants. Boca Raton, FL. CRC Press. http://www.ars-grin.gov/duke, diakses pada tanggal 2 februari 2007

Evans, WC., Trease, 2002, Pharmacognosy 15th edition, 113-114,394-406, W.B.

Saunders, New York

66


67

Gritter, R.Y., Babbit, J.M., and Schwartng, A.E., 1991, Pengantar Kromatografi,

edisi II, Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 107-115, Penerbit ITB, Bandung.

Heinrich, M., Barnes, J., Gibbons, S., Williamson, EM., 2004, Fundamental of

Pharmacognosy and Phytotherapy, 75-77,85-89, Churchil Livingstone, Philadelphia

Hembing, W., 2000, Ensiklopedi Milenium Tumbuhan Berkhasiat Indonesia, 159-

163, Prestasi Insan Indonesia, Jakarta Katzung, B.G., 1987, Basic and Clinical Pharmakology, 3rd Edition, Diterjemahkan

oleh Petrus Andrianto, 858, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta. Loomis,T.A., 1978, Essential of Toxicology, Edisi III, diterjemahkan oleh Imono

Argo Donatus, 228-233, IKIP Semarang, Semarang Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoid , diterjemahkan oleh

Kosasih Padmawinata, 20-34, Penerbit ITB, Bandung Meyer B.N., Ferrigni N.R., Putnama J.E., Jacobsen L.B., Nichols D.E., and

McLaughlin J.L., 1982, Brine Shrimp: A convenient General Bioassay for Active Plant Constituents, Planta Medica, 45,31-34

Mudjiman, A., 1989, Udang Renik Air Asin (Artemia salina), 15-18, Penerbit

Bhatara Karya Aksara, Jakarta Mudjiman, A., 1991, Makanan Ikan, 72-88, Penebar Swadaya, Jakarta Mursyidi, A.,1990, Analisis Metabolit Sekunder, 171-175, UGM Press,Yogyakarta Nafrialdi & Gan, 1995, Antikanker cit Ganiswara, Farmakologi dan Terapi, 686,

Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta Negara, A., 2003, Penggunaan Analisis Probit untuk Pendugaan Tingkat Kepekaan

Populasi Spodoptera Exigua terhadap Deltametrin di Daerah Istimewa Yogyakarta, 4, Balai Pengkajian Teknologi Pertanian, Sulawesi Tengah

Peter J.H. and Amala R., 1998, Laboratory Handbook for the Fractionation of

Natural Extracts, 39,118-119, Thomson , London. Rana, V.S., Prasad, D., Blazquez, M.A., 2005, Chemical Composition of the Leaf Oil

of Lantana camara, http://www.findarticles.com/p/articles/mi_qa409/is_200503/ai_n13505544. Diakses pada 20 Februari 2006.


68

Robbers, JE., Speedie, MK., Tyler, VE., 1996, Pharmacognosy &

Pharmacognotechnology, 89-90, 138-170, Lea&Febiger, USA Robinson T., 1991, The Organic Constituent of Higher Plants, diterjemahkan oleh

Kosasih Padwawinata dan Iwang Soediro, 115, ITB Press, Bandung Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, 4th revised edition, 22, Kristianstads

Boktryckeri AB, Kristianstad, Sweden. Sharma O.M.P., Sharma P.D., 1989, Natural products of the Lantana plant- the

present and prospects, Journal of Scientific Industrial Research 48:471-478 Skoog, D.A., 1985, Principles of Instrument Analysis, 3rd Edition, 802, Saunders

College Publishing. Soelastru, 1986, Penelitian Farmakognosi dan Kandungan Kimia dari daun Lantana

camara , Skripsi, FF Unair, Surabaya Solis P.N., Wright, C.W., Anderson M.M., Gupta M.F., Philipson J.D., 1993, A

Microwell Cytotoxicity Assay using Artemia salina (Brine Shrimp), Planta Medica, 59,250-252

Stahl, 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy, diterjemahkan oleh

Kosasih Padwawinata dan Iwang Soediro, 3-17, ITB Press, Bandung Sugianti, N., 2007, Brine Shrimp Lethality Test Ekstrak Etanol Daun Tumbuhan

Tembelekan (Lantana camara L) Beserta Profil Kromatografi Lapis Tipisnya., Skripsi, Fakultas Farmasi USD, Yogyakarta.

Tyler,VE., Brady, LR., Robbers, JE., 1988, Pharmacognosy 9th edition ,443-444,

Lea&Febiger, Philadelphia Tzong, S,C., and Jiann, C.C., 1987, Acute Toxicity of Ammonia to Larvae of the

Tiger Prawn, Pneus Monodon, in Aqua Culture, volume 66, 247-253, Elsevier Sciens Publisher B. V., Amsterdam.

Wagner, H., Brady, S., dan Zgainski, E. M., 1984, Plant Drug Analysis A Thin Layer

Chromatography Atlas, 164, 226, Springer-Verlag, Berlin


Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tumbuhan tembelekan

69


70

Lampiran 2. Foto tumbuhan tembelekan

Lampiran 3. Foto bunga tumbuhan tembelekan


71

Lampiran 4. Foto buah tumbuhan tembelekan

Lampiran 5. Foto aquarium untuk uji BST


72

Lampiran 6. Foto rangkaian alat Vaccum Coloumn Chromatography (VCC)

Lampiran 7. Foto hasil fraksinasi Vaccum Coloumn Chromatography


73

Lampiran 8. Data fraksinasi dan penggabungan fraksi

FRAKSINASI

Sampel ekstrak etanol kering berat sampel 1 gram sistem fraksinasi Vaccum Coloumn chromatografy (VCC)

fase diam silika gel GF 254

fase gerak toluen-etil asetat (85:15) v/v volume tiap fraksi 50 ml

12 buah fraksi No 1 No 2 No 3 No 4 No 5 No 6 No 7 No 8 No 9 No 10 No 11

Fraksi yang diperoleh

No 12

Penggabungan fraksi

no nama dan berat fraksi hasil

1 fraksi 1 berat 40 mg 2 fraksi 2 berat 150 mg 3 fraksi 3 berat 60 mg 4 sampai 7 fraksi 4 berat 150 mg 8 sampai 12 fraksi 5 berat 20 mg


74

Lampiran 9. Data orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi yang akan

digunakan dalam pengujian serta data kematian setelah

perlakuan

BERAT FRAKSI

1. Fraksi 2 (F2) Berat yang diperoleh : 100 mg dilarutkan dalam 10 ml etanol PA.

Konsentrasi :mlmg

10100 = 10 mg/ml

2. Fraksi 3 (F3) Berat yang diperoleh : 50 mg dilarutkan dalam 5 ml etanol PA.

Konsentrasi :mlmg

550 = 10 mg/ml

3. Fraksi 4 (F4) : Berat yang diperoleh : 100 mg dilarutkan dalam 10 ml etanol PA.

Konsentrasi :mlmg

10100 = 10 mg/ml

PENGAMBILAN DOSIS ORIENTASI

A. Konsentrasi larutan stok 1. Lart. A = 10 mg/ml

2. Lart. B = 1 ml lart. A dalam 10 ml pelarut

→ C1 x V1 = C2 x V2 → 10mg/ml x 1 ml = C2 x 10 ml → C2 = 1 mg/ml

3. Lart. C = 0,5 ml lart. A dalam 10 ml pelarut → C1 x V1 = C2 x V2

→ 10mg/ml x 0,5 ml = C2 x 10ml → C2 = 0,5 mg/ml

B. Perhitungan dosis orientasi

1. fraksi 2 10 µg/ml = 0,01 mg/ml


75

C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,01 mg/ml x 5ml → C1 = 0,05 ml 50 µl dari stok lart. B ⇒ 100 µg/ml = 0,1 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,1 mg/ml x 5ml → C1 = 0,5 ml 500 µl dari stok lart. B ⇒ 1000 µg/ml = 1 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 10 mg/ml x C1 = 1 mg/ml x 5ml → C1 = 0,5 ml 500 µl dari stok lart. A ⇒ 2. fraksi 3 5 µg/ml = 0,005 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 0,5 mg/ml x C1 = 0,005 mg/ml x 5ml → C1 = 0,05 ml 50 µl dari stok lart. C ⇒ 10 µg/ml = 0,01 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,01 mg/ml x 5ml → C1 = 0,5 ml 50 µl dari stok lart. B ⇒ 100 µg/ml = 0,1 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,1 mg/ml x 5ml → C1 = 0,5 ml 500 µl dari stok lart. B ⇒ 1000 µg/ml = 1 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 10 mg/ml x C1 = 1 mg/ml x 5ml → C1 = 0,5 ml 500 µl dari stok lart. A ⇒ 3. fraksi 4 10 µg/ml = 0,01 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,01 mg/ml x 5ml → C1 = 0,5 ml 50 µl dari stok lart. B ⇒ 100 µg/ml = 0,1 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,1 mg/ml x 5ml → C1 = 0,5 ml 500 µl dari stok lart. B ⇒ 1000 µg/ml = 1 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 10 mg/ml x C1 = 1 mg/ml x 5ml → C1 = 0,5 ml 500 µl dari stok lart. A ⇒


76

DATA ORIENTASI KONTROL F2

10 µg

100 µg

1000 µg

10 µg

100 µg

1000 µg

0 0 0 2 2 7 0 0 0 1 4 6 0 1 0 2 3 7 0 3,33 0 16,67 30 66,67 KONTROL F3

5 µg

10 µg

100 µg

1000 µg

5 µg

10 µg

100 µg

1000 µg

0 0 0 1 3 6 7 10 1 0 2 2 2 8 10 9 1 1 0 0 2 6 9 9 6,67 3,33 6,67 10 23,33 66,67 86,67 93,33

KONTROL F4

10 µg

100 µg

1000 µg

10 µg

100 µg

1000 µg

0 0 0 3 7 8 0 0 0 1 4 8 0 1 0 2 5 7 0 3,33 0 20 53,3 76,67

% rata-rata= 105

xjumlah

% KEMATIAN ORIENTASI A). Fraksi 2

10 µg = 0100067,16

−− x 100% = 16,67 %

100 µg = 33,310033,330

−− x 100 % = 27,59 %

1000 µg = 0100067,66

−− x 100 % = 66,67 %


77

B). Fraksi 3

5 µg = 67,610067,633,23

−− x 100 % = 17,85 %

10 µg = 33,310033,367,66

−− x 100 % = 65,52 %

100 µg = 67,610067,667,86

−− x 100 % = 85,72 %

1000 µg = 101001033,93

−− x 100 % = 92,59 %

C). Fraksi 4

10 µg = 0100020−− x 100 % = 20 %

100 µg = 33,310033,333,53

−− x 100 % = 51,7 %

1000 µg = 0100067,76

−− x 100 % = 76,67 %

PERHITUNGAN DOSIS PERLAKUAN

F = 1−nSDLD ket: F= faktor pengali

n= jumlah seri konsentrasi yang diinginkan LD = konsentrasi terbesar

SD = konsentrasi terkecil


78

1). PERHITUNGAN DOSIS FRAKSI 2

a). F = 1−nSDLD ⇒ 15

1001000

− = 1,78

5 seri konsentrasi :

1. 100 µg/ml 2. 100 x 1,78 = 178 µg/ml 3. 178 x 1,78 = 316,84 µg/ml 4. 316,84 x 1,78 = 563,97 µg/ml 5. 563,97 x 1,78 = 1003,87 µg/ml b). Perhitungan dosis

• 100 µg/ml = 0,1 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,1 mg/ml x 5ml

→ C1 = 0,5 ml 500 µl dari lart. B ⇒ • 178 µg/ml = 0,178 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,178 mg/ml x 5ml → C1 = 0,89 ml 890 µl dari lart. B ⇒ • 316,84 µg/ml = 0,31684 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 10 mg/ml x C1 = 0,31684 mg/ml x 5ml → C1 = 0,158 ml ⇒ ≈ 160 µl dari lart. A • 563,97 µg/ml = 0,56397 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 10 mg/ml x C1 = 0,56397 mg/ml x 5ml → C1 = 0,282 ml ⇒ ≈ 280 µl l dari lart. A • 1003,87 µg/ml = 1,00387 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 10 mg/ml x C1 = 1,00387 mg/ml x 5ml → C1 = 0,502 ml ⇒ ≈ 500 µl dari lart. A


79

DATA PERLAKUAN F 2

KONTROL F2 100 µg

178 µg

316,84 µg

563,97 µg

1003,87 µg

100 µg

178 µg

316,84 µg

563,97 µg

1003,87 µg

1 2 1 1 1 3 3 5 8 8 1 1 0 1 1 2 3 4 5 5 0 1 1 1 0 4 5 4 6 6 2 0 2 0 2 3 7 3 6 7 1 1 0 2 1 2 2 6 4 7

10 10 8 10 10 28 40 44 58 66 % KEMATIAN FRAKSI 2

100 µg = 101001028−− x 100% = 20 %

178 µg = 101001040−− x 100 % = 33,33 %

316 µg = 8100844−− x 100 % = 39,13 %

564 µg = 101001058−− x 100 % = 53,33 %

1000 µg = 101001066−− x 100 % = 62,22 %


a). F = 1−nSDLD ⇒ 15

5100

− = 2,1


80

5 seri konsentrasi : 1. 5 µg/ml 2. 5 x 2,1 = 10,5 µg/ml 3. 10,5 x 2,1 = 22,05 µg/ml 4. 22,05 x 2,1 = 43,305 µg/ml 5. 43,305 x 2,1 = 97,24 µg/ml b). Perhitungan dosis

• 5 µg/ml = 0,005 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 0,5 mg/ml x C1 = 0,005 mg/ml x 5ml

→ C1 = 0,05 ml 50 µl dari lart. C ⇒ • 10,5 µg/ml = 0,0105 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,0105 mg/ml x 5ml → C1 = 0,052 ml ⇒ ≈50 µl dari lart. B • 22,05 µg/ml = 0,02205 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,02205 mg/ml x 5ml → C1 = 0,11025 ⇒ ≈ 110 µl dari lart. B • 43,305 µg/ml = 0,043305 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,043305 mg/ml x 5ml → C1 = 0,2165 ml ⇒ ≈ 220 µl l dari lart. B • 97,24 µg/ml = 0,09724 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,09724 mg/ml x 5ml → C1 = 0,4862 ml ⇒ ≈ 490 µl dari lart. B

DATA PERLAKUAN F 3

KONTROL F 3 5

µg 10,5 µg

22,5 µg

43,3 µg

97,2 µg

5 µg

10,5 µg

22,5 µg

43,3 µg

97,2 µg

2 1 1 0 1 2 4 4 4 8 0 0 1 2 0 2 4 4 8 9 1 1 0 0 0 3 3 6 7 8 0 1 1 0 0 2 5 5 7 7 1 0 1 1 1 3 3 7 6 9 8 6 8 6 4 24 38 52 64 82


81

% KEMATIAN FRAKSI 3

5 µg = 8100824−− x 100 % = 17,39%

10,5 µg = 6100638−− x 100 % = 34,78 %

22,05 µg = 8100852−− x 100 % = 47,83 %

43,3 µg = 6100664−− x 100 % = 61,70 %

97,2 µg = 4100482−− x 100 % = 81,25 %


a). F = 1−nSDLD ⇒ 15

101000

− = 3,2

5 seri konsentrasi :

1. 10 µg/ml 2. 10 x 3,2 = 32 µg/ml 3. 32 x 3,2 = 102,4 µg/ml 4. 102,4 x 3,2 = 327,7 µg/ml 5. 327,7 x 3,2 = 1048,6 µg/ml b). Perhitungan dosis

• 10 µg/ml = 0,01 mg/ml C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,01 mg/ml x 5ml

→ C1 = 0,05 ml 50 µl dari lart. B ⇒ • 32 µg/ml = 0,032 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,032 mg/ml x 5ml → C1 = 0,16 ml 160 µl dari lart. B ⇒ • 102,4 µg/ml = 0,1024 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 1 mg/ml x C1 = 0,1024 mg/ml x 5ml


82

→ C1 = 0,51 ml 510 µl dari lart. B ⇒ • 327,7 µg/ml = 0,3277 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 10 mg/ml x C1 = 0,3277 mg/ml x 5ml → C1 = 0,16 ml 160 µl dari lart. A ⇒ • 1048,6µg/ml = 1 mg/ml

C1 x V1 = C2 x V2 → 10 mg/ml x C1 = 1,0486 mg/ml x 5ml → C1 = 0,524 ml ⇒ ≈520 µl dari lart. A

DATA PERLAKUAN F 4 KONTROL F 4

10 µg

32 µg

102,4 µg

327,7 µg

1048,6 µg

10 µg

32 µg

102,4 µg

327,7 µg

1048,6 µg

1 0 1 0 0 3 5 6 8 9 0 2 0 2 1 2 4 6 5 7 0 2 1 2 2 4 5 5 8 8 1 0 1 0 0 2 6 4 6 8 0 1 0 1 0 3 3 6 4 7 4 10 6 10 6 28 46 54 62 78

% KEMATIAN FRAKSI 4

10 µg = 4100428−− x 100% = 25 %

32 µg = 101001046−− x 100 % = 40 %

102,4 µg = 6100654−− x 100 % = 51,06 %

327,7 µg = 101001062−− x 100 % = 57,77 %

1048,6 µg = 6100678−− x 100 % = 76,59 %


83

Lampiran 10. Perhitungan data statistik SPSS 10.00 dengan menggunakan analisis probit terhadap F2 daun tumbuhan tembelekan

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. Parameter estimates converged after 10 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. KONS 1,11990 ,16802 6,66510 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -3,02990 ,42808 -7,07782 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = ,729 DF = 3 P = ,866 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected KONS Subjects Responses Responses Residual Prob 2,00 100,0 20,0 21,474 -1,474 ,21474 2,25 100,0 33,3 30,515 2,815 ,30515


84

2,50 100,0 39,1 40,935 -1,805 ,40935 2,75 100,0 53,3 52,043 1,287 ,52043 3,00 100,0 62,2 62,994 -,774 ,62994 Confidence Limits for Effective KONS 95% Confidence Limits Prob KONS Lower Upper ,01 4,24838 ,67488 11,70242 ,02 7,44111 1,48836 18,10125 ,03 10,61881 2,45707 23,88445 ,04 13,87566 3,58130 29,43359 ,05 17,24866 4,86423 34,89511 ,06 20,75827 6,31090 40,34484 ,07 24,41842 7,92760 45,82924 ,08 28,24006 9,72167 51,38016 ,09 32,23267 11,70124 57,02149 ,10 36,40502 13,87523 62,77244 ,15 60,26100 28,02001 93,69788 ,20 89,94797 48,73443 129,48109 ,25 126,83213 77,81420 172,07340 ,30 172,68299 117,25765 224,41164 ,35 229,84724 168,79946 291,54615 ,40 301,49716 233,11870 382,38422 ,45 392,01130 309,78184 511,25535 ,50 507,58207 399,23794 698,42726 ,55 657,22483 504,81006 972,48778 ,60 854,53395 632,89168 1378,15961 ,65 1120,91646 793,30296 1991,53777 ,70 1491,97997 1001,34820 2950,76273 ,75 2031,34297 1282,76383 4526,75190 ,80 2864,31761 1685,40670 7310,70188 ,85 4275,39448 2311,41645 12812,37862 ,90 7077,03474 3431,64855 26013,21887 ,91 7993,11950 3774,35033 30874,03136 ,92 9123,19431 4185,16679 37192,64813 ,93 10551,03266 4688,22604 45647,07516 ,94 12411,41903 5321,30854 57386,33170 ,95 14936,78912 6147,60444 74511,13332 ,96 18567,73696 7282,74137 101280,82796 ,97 24262,57179 8967,81912 147736,03817 ,98 34623,82590 11823,32912 244089,47877 ,99 60644,13527 18271,08957 538810,87067


85


Log of KONS

3,23,02,82,62,42,22,01,8

Prob

it

,4

,2

0,0

-,2

-,4

-,6

-,8

-1,0 Rsq = 0,9846


86

Lampiran 11 . Perhitungan data statistik SPSS 10.00 dengan menggunakan

analisis probit terhadap F3 daun tumbuhan tembelekan * * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. Parameter estimates converged after 11 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. KONS 1,34949 ,14003 9,63719 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -1,84601 ,19742 -9,35050 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = ,828 DF = 3 P = ,843 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected KONS Subjects Responses Responses Residual Prob ,70 100,0 17,4 18,333 -,943 ,18333


87

1,02 100,0 34,8 31,992 2,788 ,31992 1,34 100,0 47,8 48,680 -,850 ,48680 1,64 100,0 61,7 64,153 -2,453 ,64153 1,99 100,0 81,3 79,859 1,391 ,79859 Confidence Limits for Effective KONS 95% Confidence Limits Prob KONS Lower Upper ,01 ,44061 ,15827 ,87508 ,02 ,70155 ,28286 1,29214 ,03 ,94237 ,40867 1,65540 ,04 1,17661 ,53882 1,99516 ,05 1,40947 ,67454 2,32289 ,06 1,64365 ,81651 2,64446 ,07 1,88077 ,96520 2,96337 ,08 2,12198 1,12099 3,28196 ,09 2,36810 1,28420 3,60190 ,10 2,61982 1,45516 3,92448 ,15 3,98023 2,43670 5,60842 ,20 5,54967 3,65892 7,47249 ,25 7,38100 5,16708 9,59303 ,30 9,53529 7,01360 12,05858 ,35 12,08913 9,25760 14,98836 ,40 15,14222 11,96356 18,55327 ,45 18,82813 15,20189 23,00295 ,50 23,33053 19,05781 28,69976 ,55 28,90959 23,65514 36,16566 ,60 35,94674 29,19468 46,16558 ,65 45,02505 36,00599 59,87919 ,70 57,08410 44,62969 79,25785 ,75 73,74526 55,98492 107,80294 ,80 98,08027 71,76345 152,46879 ,85 136,75433 95,50670 229,20646 ,90 207,76780 136,36724 384,14871 ,91 229,85244 148,55696 435,35550 ,92 256,51270 163,01462 498,81877 ,93 289,40986 180,51394 579,41505 ,94 331,16229 202,25467 685,02705 ,95 386,18186 230,22167 829,32041 ,96 462,61072 268,00126 1038,35764 ,97 577,60083 322,95908 1369,24272 ,98 775,87351 413,68929 1978,51693 ,99 1235,35521 610,74341 3536,62361


88


Log of KONS

2,01,81,61,41,21,0,8,6

Prob

it

1,0

,5

0,0

-,5

-1,0 Rsq = 0,9925


89

Lampiran 12. Perhitungan data statistik SPSS 10.00 dengan menggunakan analisis probit terhadap F4 daun tumbuhan tembelekan

* * * * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * * * * * * * DATA Information 5 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. Parameter estimates converged after 8 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept + BX): Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E. KONS ,63690 ,08387 7,59380 Intercept Standard Error Intercept/S.E. -1,27778 ,17825 -7,16866 Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 1,740 DF = 3 P = ,628 Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. Observed and Expected Frequencies Number of Observed Expected KONS Subjects Responses Responses Residual Prob 1,00 100,0 25,0 26,080 -1,080 ,26080


90

1,51 100,0 40,0 37,481 2,519 ,37481 2,01 100,0 51,1 50,103 ,957 ,50103 2,52 100,0 57,8 62,715 -4,945 ,62715 3,02 100,0 76,6 74,087 2,503 ,74087 Confidence Limits for Effective KONS 95% Confidence Limits Prob KONS Lower Upper ,01 ,02258 ,00116 ,13194 ,02 ,06049 ,00436 ,29024 ,03 ,11303 ,01010 ,47898 ,04 ,18092 ,01897 ,69853 ,05 ,26525 ,03167 ,94984 ,06 ,36736 ,04897 1,23421 ,07 ,48877 ,07175 1,55324 ,08 ,63116 ,10098 1,90879 ,09 ,79639 ,13775 2,30293 ,10 ,98647 ,18328 2,73795 ,15 2,39300 ,59605 5,62245 ,20 4,83971 1,51344 10,01522 ,25 8,85592 3,34433 16,54259 ,30 15,23667 6,75825 26,18365 ,35 25,19188 12,81689 40,55033 ,40 40,59503 23,12430 62,47576 ,45 64,40997 39,93524 97,27524 ,50 101,45066 66,19380 155,34914 ,55 159,79258 105,81414 257,24682 ,60 253,53441 164,88203 443,91391 ,65 408,55375 254,17206 800,47469 ,70 675,49128 393,77546 1517,53738 ,75 1162,18671 623,41688 3065,91974 ,80 2126,62153 1029,89034 6773,84996 ,85 4300,96714 1834,74152 17197,53074 ,90 10433,44847 3767,99324 55923,18195 ,91 12923,60429 4479,82269 74408,36965 ,92 16306,75240 5404,91614 101502,40898 ,93 21057,39309 6642,23442 142848,43285 ,94 28016,61618 8359,32021 209287,34296 ,95 38801,71888 10862,12187 323637,73663 ,96 56887,81071 14770,06500 540315,96276 ,97 91054,61611 21540,60958 1015075,32469 ,98 170161,10189 35548,15513 2348657,67534 ,99 455900,23354 78201,32164 8821418,52454


91


Log of KONS

3,53,02,52,01,51,0,5

Prob

it,8

,6

,4

,2

0,0

-,2

-,4

-,6

-,8 Rsq = 0,9735


92

Lampiran 13. Data kromatogram dari 3 fraksi toksik

Deteksi warna senyawa uji

bercak no Rf visibel Rf UV 254 Rf UV

365 Rf Vanilin-as.sulfat

1 0,39 kuning hijau 0,39 kuning

hijau 0,30 merah muda 0,30 ungu

2 0,43 hijau 0,43hijau coklat muda

0,39 merah 0,39 hijau kuning

3 0,51 Hijau kuning 0,51 hijau

kuning 0,43 merah hijau 0,43 hijau

4 0,55 Hijau tua 0,55 hijau

kecoklatan 0,51 merah gelap 0,47 ungu

5 0,85 kuning 0,85 kuning 0,55 merah muda 0,51 hijau

kuning 6 0,85 hijau 0,55 hijau tua 7 0,64 ungu

Fraksi 2

8 0,85 ungu

1 0,30 hijau tua 0,30 coklat

gelap 0,20 merah muda 0,25 ungu biru

2 0,39 kuning hijau 0,39 hijau

kuning 0,30 merah muda 0,30 ungu

hijau

3 0,43 hijau 0,43coklat muda terang

0,39 merah 0,39 hijau kuning


kuning 0,43 merah hijau 0,43 hijau

5 0,55 hijau 0,55hijau coklat muda

0,51 merah gelap 0,47 ungu

6 0,55 merah muda 0,51 hijau

kuning

Fraksi 3

7 0,55 hijau tua

1 0,10 kuning 0,10 kuning hijau 0,10 hijau

gelap 0,14 ungu


coklat 0,20 merah muda 0,20 ungu biru

3 0,30 hijau tua 0,24 ungu 0,30 merah

muda 0,25 ungu biru

4 0,51 hijau kuning 0,30 hijau

kuning 0,51 merah gelap 0,30 ungu

5 0,39 hijau kuning 0,55 merah

muda 0,51 hijau kuning

Fraksi 4

6 0,51 hijau kuning


93

Lampiran 14. Data kromatogram KLTPreparatif dari bercak Rf 0,3 pada F3

Deteksi warna Senyawa

uji bercak

no Rf visibel Rf UV

254 Rf UV 365 Rf Vanilin-as.sulfat

1 0,14 hijau 0,14 hijau 0,07 merah muda 0,07 ungu

2 0,09 merah muda 0,09 hijau

Bercak RF 0,3

dari F3

3 0,14 merah

muda 0,14 ungu


BIOGRAFI PENULIS

Robertus Hendra Krismawan merupakan anak

kedua dari pasangan Y. Suwondo dan Th.

Sutirah. Dilahirkan di Ngawi pada tanggal 23

April 1981. Menempuh pendidikan di SD

Negeri Tambakromo 2 Geneng pada tahun

1988-1994, dilanjutkan ke SLTP Negeri 2

Ngawi tahun 1994-1997.

Pendidikan Sekolah Menengah Atas ditempuh di SMFK Bina Farma, Madiun

tahun 1997-2000 dan melanjutkan jenjang S1 di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta tahun 2001-2007. Sebelum melanjutkan kuliah,

penulis pernah bekerja di Century Health Care, Jakarta sebagai asisten apoteker

pada tahun 2000-2001. Selama kuliah, penulis bekerja pada Apotik Amalia dari

tahun 2005-sekarang. Penulis juga aktif dalam mengikuti beberapa kegiatan

organisasi di kampus dan juga aktif mengikuti kegiatan sosial di Pos Kesehatan

Kotabaru.

94


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji brine … fileartemia akan tetapi belum ada laporan ilmiah...

Documents