plagiat merupakan tindakan tidak terpuji · 1. aris widayati, m.si, ph.d., apt. selaku dekan...

VALIDASI METODE ANALISIS ALOPURINOL DALAM TABLET SECARA SPEKTROFOTOMETRI DAN JAMU SECARA

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK SERTA APLIKASINYA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh : Ria Kusuma Dewi NIM : 108114047

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

VALIDASI METODE ANALISIS ALOPURINOL DALAM TABLET SECARA SPEKTROFOTOMETRI DAN JAMU SECARA KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI FASE TERBALIK SERTA APLIKASINYA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh : Ria Kusuma Dewi NIM : 108114047

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2014


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ini ku persembahkan untuk Orang tua dan adik tercinta

Sahabat-sahabat, teman-teman serta almamaterku semua


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan yang Maha Esa atas

berkat dan kasih-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul

Validasi Metode Analisis Alopurinol Dalam Tablet Secara Spektrofotometri Dan

Jamu Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Serta Aplikasinya

dapat terselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat

untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,

penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena

itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Aris Widayati, M.Si, Ph.D., Apt. Selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt selaku dosen pembimbing yang dengan

sabar memberikan pengarahan, masukan, kritik dan saran baik selama

penelitian maupun penyusunan skripsi ini.

3. Jeffry Julianus, M.Si selaku dosen penguji atas saran, kritik dan masukan

yang telah diberikan.

4. Florentinus Dika Octa Riswanto M.Sc selaku dosen penguji atas saran,

kritik dan masukan yang telah diberikan.

5. Sanjayadi, M.Si yang telah membantu penulis dalam penyusunan skripsi

ini.


viii

6. Dewi Setyaningsih, M.Sc. Apt yang telah membantu penulis dalam

melakukan penelitian di laboratorium.

7. Seluruh staf laboratorium kimia fakultas farmasi Universitas Sanata

Dharma : Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto, Mas Agung, Pak Ketul, Pak

Darto yang telah banyak membantu selama penelitian di laboratorium.

8. Meta Kartika Sari dan Sugiarto Adji Soenarso atas perjuangan bersama

selama penelitian ini. Semuanya sangat bermakna dan menambah banyak

pengalaman.

9. Farmasi kelas A dan FST A 2010 kebersamaan selama ini menjadikan

hidup menjadi berwarna.

10. Mama, papa, dan adik tercinta yang selalu mendukung baik dari segi moril

materiil sehingga dapat terselesaikannya penelitian ini.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan

skripsi ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis

harapkan. Semoga skripsi ini dapat membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada

khususnya ilmu pengetahuan.

Penulis


ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .............................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................... v

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ................................. vi

PRAKATA .............................................................................................. vii

DAFTAR ISI ........................................................................................... ix

DAFTAR TABEL ................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................ xvi

INTISARI ................................................................................................ xviii

ABSTRACT ............................................................................................ xix

BAB I PENGANTAR............................................................................. 1

A. Latar Belakang ............................................................................. 1

1. Permasalahan.......................................................................... 3

2. Keaslian Penelitian ................................................................. 3

3. Manfaat Penelitian .................................................................. 4

B. Tujuan Penelitian.......................................................................... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................ 6

A. Alopurinol .................................................................................... 6


x

1. Mekanisme Kerja Alopurinol .................................................. 7

2. Dampak Alopurinol ................................................................ 8

3. Penetapan Kadar Alopurinol ................................................... 9

B. Tablet ........................................................................................... 9

C. Obat Tradisional ........................................................................... 9

D. Spektrofotometri Ultraviolet ......................................................... 11

1. Instrumentasi Spektrofotometri Ultraviolet ............................. 11

2. Interaksi Elektron Dengan Radiasi Elektromangnet ................ 12

3. Hukum Lambert Beer ............................................................. 13

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ................................................. 13

1. Instrumentasi KCKT ............................................................... 14

2. Parameter Pemisahan .............................................................. 16

3. Fase Diam............................................................................... 20

4. Fase Gerak .............................................................................. 21

F. Validasi Metode ........................................................................... 24

1. Akurasi ................................................................................... 25

2. Presisi ..................................................................................... 26

3. Linearitas................................................................................ 28

4. Batas Kuantitasi (LOQ) .......................................................... 28

G. Landasan Teori ............................................................................. 28

H. Hipotesis ...................................................................................... 29

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ............................................. 30

A. Jenis Penelitian ............................................................................. 30

B. Variabel Penelitian ....................................................................... 30

C. Definisi Operasional ..................................................................... 30

D. Bahan-bahan Penelitian ................................................................ 31

E. Alat-alat Penelitian ....................................................................... 31

F. Tata Cara Penelitian ..................................................................... 31

I. Metode Spektrofotometri ............................................................ 31

1. Pembuatan larutan NaOH 0,1 N .............................................. 31


xi

2. Pembakuan NaOH 0,1 N ........................................................ 32

3. Pengamatan panjang gelombang pengamatan ......................... 32

4. Pembuatan larutan baku alopurinol ......................................... 32

5. Uji keseragaman bobot tablet alopurinol ................................. 33

6. Validasi analisis dalam tablet alopurinol ................................. 33

7. Penetapan kadar alopurinol dalam tablet ................................. 34

II. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik ........ 35

1. Penentuan panjang gelombang pengamatan alopurinol ........... 35

2. Pembuatan fase gerak ............................................................. 35

3. Kurva baku alopurinol ........................................................... 35

4. Kurva baku alopurinol dalam matriks jamu ............................. 36

5. Pengaruh matriks jamu pada penetapan kadar alopurinol ........ 37

6. Validasi metode analisis dalam jamu ...................................... 37

7. Penetapan kadar alopurinol dalam jamu .................................. 38

G. Analisis Hasil ............................................................................... 40

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN................................................. 44

A. Validasi metode analisis alopurinol secara spektrofotometri ......... 45

1. Pembuatan dan pembakuan larutan NaOH 0,1 N ..................... 45

2. Penentuan panjang gelombang pengamatan ............................ 47

3. Pembuatan kurva baku alopurinol ........................................... 48

4. Validasi metode analisis pada tablet ........................................ 50

i. Akurasi pada tablet alopurinol ............................................. 50

ii. Presisi pada tablet alopurinol ............................................... 51

iii. LOQ pada tablet alopurinol ............................................... 51

5. Penetapan kadar alopurinol pada tablet ................................... 52

B. Validasi metode analisis alopurinol secara KCKT ........................ 55

1. Penentuan panjang gelombang pengamatan ............................ 55

2. Pembuatan fase gerak ............................................................. 57

3. Kurva baku alopurinol ............................................................ 58

4. Kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ............................. 61


xii

5. Pengaruh matriks jamu dalam penetapan kadar alopurinol ...... 62

6. Validasi metode analisis dalam jamu ...................................... 64

i. Linearitas .......................................................................... 64

ii. Akurasi ............................................................................. 65

iii. Presisi ............................................................................... 65

iv. LOQ .................................................................................. 66

7. Penetapan kadar alopurinol dalam jamu .................................. 66

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................. 67

A. Kesimpulan .................................................................................. 67

B. Saran ............................................................................................ 67

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 68

LAMPIRAN ............................................................................................ 72

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................. 121


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I Modifikasi silika pada kolom dan aplikasinya ............... 21

Tabel II Nilai indeks polaritas pelarut ........................................ 23

Tabel III Kriteria rentang recovery .............................................. 25

Tabel IV Kriteria presisi yang dapat diterima............................... 27

Tabel V Panjang gelombang maksimum alopurinol dengan

pelarut NaOH 0,1 N ...................................................... 47

Tabel VI Kurva baku alopurinol .................................................. 49

Tabel VII Rata-rata penetapan % recovery pada tablet alopurinol . 50

Tabel VIII Persen koefisien variasi dari metode penambahan baku 51

Tabel IX Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet ..................... 53

Tabel X Keseragaman bobot tablet alopurinol ............................ 53

Tabel XI Kadar alopurinol dalam tablet ....................................... 54

Tabel XII Panjang gelombang maksimum alopurinol dengan

pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol ........... 56

Tabel XIII Kurva baku alopurinol periode I ................................... 59

Tabel XIV Hubungan r dengan n .................................................... 60

Tabel XV Kurva baku alopurinol periode II .................................. 60

Tabel XVI Kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ................... 62

Tabel XVII Hasil uji t slope kurva baku alopurinol dalam pelarut periode I


xiv

dan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ........... 63

Tabel XVIII Hasil uji t slope kurva baku alopurinol dalam pelarut periode II

dan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu ............ 63

Tabel XIX Persen koefisien variasi dari metode penambahan baku 65

Tabel XX Kadar alopurinol dalam sampel jamu ............................ 66


xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur alopurinol ........................................................ 6

Gambar 2. Mekanisme kerja alopurinol .......................................... 7

Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik ................................. 13

Gambar 4. Pelebaran puncak selama pemisahan dalam KCKT ....... 19

Gambar 5. Reaksi kalium biftalat dengan NaOH ............................ 44

Gambar 6. Reaksi fenolftalein dengan NaOH ................................. 46

Gambar 7. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum

alopurinol dengan pelarut NaOH 0,1 N ......................... 48

Gambar 8. Plot kurva baku alopurinol ............................................ 49

Gambar 9. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum

alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5%

dalam metanol .............................................................. 57

Gambar 10. Interaksi amonium hidroksida dengan residu silanol dalam

Kolom C18 .................................................................... 58

Gambar 11. Perbandingan kurva baku dan kurva adisi ..................... 63


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku alopurinol ................................. 73

Lampiran 2. Sertifikat analisis SPE MCX ......................................... 74

Lampiran 3. Perhitungan indeks polaritas NaOH 0,1 N dan

amonium hidroksida 5% dalam metanol ....................... 75

Lampiran 4. Perhitungan pembakuan NaOH 0,1 N ........................... 76

Lampiran 5. Spektogram pada penetapan panjang gelombang

maksimum dengan pelarut NaOH 0,1 N ........................ 77

Lampiran 6. Pembuatan kurva baku pada metode

spektrofotometri ........................................................... 79

Lampiran 7. Data kadar alopurinol dalam tablet dan contoh

perhitungan .................................................................. 80

Lampiran 8. Akurasi alopurinol pada tablet ...................................... 83

Lampiran 9. Penimbangan bahan untuk akurasi sampel pada tablet... 85

Lampiran 10. Perhitungan LOQ untuk metode spektrofotometri ......... 88

Lampiran 11. Spektogram scanning panjang gelombang maksimum

alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5%

dalam metanol .............................................................. 90

Lampiran 12. Kromatogram kurva baku alopurinol periode II ............ 92

Lampiran 13. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar


xvii

baku pada metode KCKT ............................................. 98

Lampiran 14. Contoh perhitungan uji t untuk slope kurva baku

adisi dalam matriks dan kurva baku dalam pelarut ...... 100

Lampiran 15. Kromatogram kurva baku adisi alopurinol dalam

Matriks jamu ............................................................... 101

Lampiran 16. Data penimbangan sampel ............................................ 111

Lampiran 17. Kromatogram sampel A ................................................ 114

Lampiran 18. Kromatogram sampel B ................................................ 116

Lampiran 19. Kromatogram sampel C ................................................ 118

Lampiran 20. Perhitungan penetapan kadar alopurinol dalam

sampel jamu ................................................................. 120


xviii

INTISARI

Alopurinol merupakan zat aktif yang digunakan untuk mengatasi asam urat. Identifikasi alopurinol dilakukan pada sampel tablet dan jamu. Alopurinol memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri. Batas kuantitasi alopurinol dengan metode spektrofotometri adalah 15.58 g/mg. Pada sampel jamu batas kuantifikasinya 0,52g/mg sedangkan pada sampel tablet batas kuantifikasinya 300 g/mg oleh karena itu metode spektrofotometri lebih tepat digunakan dalam sampel tablet.

Metode spektrofotometri menggunakan pelarut NaOH 0,1 N, digunakan panjang gelombang maksimum 257 nm. Parameter validasi yang diteliti meliputi akurasi, presisi, LOQ. Hasil menunjukkan akurasi dinyatakan recovery sebesar 98,6-100,3%; presisi dinyatakan dengan nilai CV0.4-0.6%; sensitivitas dinyatakan nilai LOQ yang diperoleh 1,46 µg/ mg bobot sampel. Kadar alopurinol dalam tablet adalah 311,6 mg/g tablet.

Identifikasi alopurinol dalam jamu menggunakan metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang disertai ekstraksi cair cair dan proses clean up dengan SPE MCX. Metode ini menggunakan KCKT fase terbalik dengan kolom shimadzu C18 (250 x 4,6 mm, 5 μm), fase gerak campuran metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90), kecepatan alir 0,5 mL/menit dan detektor UV 274 nm. Hasil menunjukkan bahwa metode memiliki linearitas dengan r = 0,967; akurasi tidak dapat ditentukan, presisi dinyatakan dengan nilai % CV sebesar 0,1-0,6%; LOQ tidak dapat ditentukan.

Kata kunci : alopurinol, spektrofotometri, KCKT fase terbalik, validasi metode


xix

ABSTRACT

Allopurinol is an active substance that is used to treat gout. Identification of allopurinol was performed on tablets and herbal medicine. Allopurinol has chromophore and auxochrome group which can be analyzed by spectrophotometric method. Limit of quantitation allopurinol with spectrophotometric method is 15,58 µg/mg. Limit quantification in herbal medicine samples is 0,52 µg / mg while in the tablet sample is 300 μg/mg therefore spectrophotometric method is more precise used in tablet samples. Spectrophotometric method using solvent NaOH0.1 N , use maximum wavelength257 nm. Validation parameters examined included accuracy, precision, LOQ. The results obtain a good validity with % recovery 98.6-100.3%; % CV 0.4-0.6%; LOQ of 1.46 mg / mg. Levels of allopurinol in tablets was 311,6 mg /gtablet. Identification of allopurinol in herbal medicine using High Performance Liquid Chromatography with extraction and clean-up. This method uses a reversed-phase HPLC with a Shimadzu C18 column (250 x 4.6 mm, 5 µm), mobile phase methanol: ammonium hydroxide 0,1 % in aquabidest (10:90), flow rate of 0.5 mL/ min and 274 nm UV detector. The results show that the method has linearity r = 0.967; accuracy can not determined, CV 0.1 to 0.6%; LOQ can not determined.

Key words: allopurinol, spectrophotometry, HPLC, method validation


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Penyakit asam urat merupakan salah satu masalah kesehatan yang sering

dialami oleh masyarakat di Indonesia. Kebiasaan dan pola hidup yang kurang baik

serta mengkonsumsi makanan yang tinggi purin akan meningkatkan prevalensi

penyakit ini (Iskandar, 2006).

Salah satu obat yang yang banyak dipasarkan di Indonesia untuk

mengobati penyakit asam urat adalah alopurinol. Produk alopurinol yang banyak

beredar di pasaran dalam bentuk tablet dimana bentuk tablet lebih praktis dan

nyaman untuk penggunaannya (Iskandar, 2006).

Aktivitas farmakologis dan efektivitas terapi dapat tercapai ketika dosis

obat yang digunakan tepat. Oleh karena itu, dibutuhkan penjaminan mutu dan

kualitas zat aktif dalam suatu sediaan obat, yang salah satunya adalah penjaminan

kesesuaian dosis sediaan obat terhadap label klaim pada kemasan. Tujuan

penjaminan mutu ini adalah untuk melindungi konsumen agar tetap mendapatkan

obat dengan kualitas zat aktif yang tepat. Dalam penjaminan mutu suatu sediaan

obat dibutuhkan metode yang tervalidasi. Pada penelitian ini dilakukan proses

validasi metode spektrofotometri ultraviolet.

Untuk mengatasi penyakit asam urat tidak hanya digunakan produk obat

sintesis, masyarakat Indonesia juga menggunakan produk obat tradisional jamu

untuk mengatasi penyakit tersebut. Kecenderungan gaya hidup back to nature


2

menyebabkan masyarakat mulai beralih dari penggunaan obat moderen ke

penggunaan obat tradisional. Pertimbangan berdasarkan pada aspek ekonomi dan

keamanan bagi kesehatan menjadi dua alasan mendasar dimana masyarakat mulai

beralih ke penggunaan obat tradisional. Penggunaan obat tradisional terus

berkembang secara luas dan digunakan di seluruh dunia selama beberapa dekade

terakhir ini. Menurut WHO, 65-80% populasi dunia menggunakan obat

tradisional sebagai pelindungan untuk kesehatan (Yee, 2003).

Berdasarkan Keputusan Kepala Badan POM no.HK.00.05.41.1384 tahun

2005,obat tradisional tidak boleh mengandung bahan kimia obat atau hasil sintesis

yang berkhasiat sebagai obat.

Untuk keamanan konsumen, harus dilakukan penelitian untuk

mengidentifikasi dan mengkuantifikasi adanya penambahan obat sintetis ke dalam

jamu asam urat. Jaminan kualitas terhadap produk tradisional jenis jamu penting

dilakukan. Tujuan dari penjaminan kualitas adalah terciptanya produk yang

berkhasiat dan aman pada obat tradisional khususnya jamu. Penjaminan kualitas

pada jamu memerlukan metode yang tervalidasi meliputi linearitas, akurasi,

presisi dan sensitivitas yang baik (Snyder, 2010). Pemilihan metode penetapan

kadar yang akan digunakan untuk analisis kuantitatif sangat penting, karena akan

mempengaruhi validitas data yang diperoleh.

Validitas metode merupakan proses yang dilakukan melalui penelitian

laboratorium untuk membuktikan bahwa karakteristik kinerja metode itu

memenuhi persyaratan aplikasi analitik yang dimaksudkan. Tujuan dilakukan


3

validasi metode adalah untuk membuktikan dan menjamin bahwa metode analisis

yang digunakan memiliki validitas yang baik sehingga hasilnya dapat dipercaya.

Pada penelitian ini dilakukan proses validasi terhadap sistem KCKT

(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) fase terbalik hasil optimasi dalam rangkaian

penelitian penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Berdasarkan hasil optimasi

yang diperoleh kondisi optimal sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase

diam C18 dan fase gerak metanol : amonium hidroksida 0,1% dalam akuabides

(10:90) dengan flow rate 0,5 mL/menit yang selanjutnya digunakan sebagai

sistem acuan pada proses validasi ini.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang tersebut permasalahan yang mucul adalah

a. Apakah metode spektrofotometri UV memenuhi parameter

validitas akurasi, presisi dan LOQ (Limit of Quantitation) serta

berapakah kadar alopurinol yang terdapat dalam tablet?

b. Apakah metode KCKT fase terbalik standar adisi alopurinol

dalam matriks jamu memenuhi parameter validitas linearitas,

akurasi, presisi dan LOQ ( Limit of Quantitation) serta berapakah

kadar alopurinol yang terdapat dalam matriks jamu?

2. Keaslian Penelitian

Berbagai penelitian telah dilakukan mengenai evaluasi dan analisis baik

kualitatif maupun kuantitatif sediaan obat tradisional. Penelitian sejenis yaitu

penetapan kadar bahan kimia obat metampiron dalam jamu yang pernah dilakukan


4

oleh (Mayasari, 2009). Optimasi Metode Identifikasi Antalgin dan Klorfeniramin

secara KCKT Photodiode Array Setelah Pemisahan dengan Solid Phase

Extraction pada Sediaan Serbuk Obat Tradisional (Permata, 2012). Quantification

of Oxipurines and Allopurinol Metabolites in Biological Fluids by Cation

Exchange Chromatography (Sweetman, 1969). Namun validasi dan penetapan

kadar alopurinol dalam jamu asam urat dengan menggunakan metode

kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik belum pernah dilakukan

sebelumnya.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai validasi

metode spektrofotometri dalam penetapan kadar alopurinol dalam sediaan tablet

dan validasi metode KCKT fase terbalik dalam penetapan kadar alopurinol dalam

sediaan jamu.

b. Manfaat Metodologis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa metode

spektrofotometri dapat digunakan dalam menetapkan kadar alopurinol dalam

sediaan tablet dan metode KCKT fase terbalik dapat menetapkan kadar alopurinol

dalam sediaan obat tradisional dengan validitas yang memenuhi persyaratan.


5

c. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberi tambahan informasi bagi ilmu

pengetahuan khususnya bidang kefarmasian mengenai parameter-parameter

validasi dan penetapan kadar alopurinol dengan metode spektrofotometri dan

metode KCKT fase terbalik.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Mengetahui validitas metode spektrofotometri dengan melihat parameter

akurasi,presisi, LOQ serta kadar alopurinol yang terdapat dalam sediaan

tablet.

2. Mengetahui validitas metode standar adisi alopurinol dalam matriks jamu

pada KCKT fase terbalik dengan melihat parameter linearitas, akurasi, presisi

dan LOQ serta kadar alopurinol yang terdapat dalam matriks jamu.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Alopurinol

Alopurinol dengan nama kimia 1H-Pyrazolol[3,4-d]pirimidin-4ol dengan

rumus kimia : C5H4N4O. Alopurinol berupa serbuk halus putih hingga hampir

putih;berbau lemah yang sedikit larut dalam air dan etanol, larut dalam larutan

kalium dan natrium hidroksida, praktis tidak larut dalam eter dan klorofom.

(kelarutan dalam air = 0,35 g/L pada suhu 25°C). Alopurinol memiliki bobot

molekul 136,11 dan titik didih >300°C (Dirjen POM RI, 1995). Alopurinol

memiliki pka 9,4 dan log p 0,33 (Machatha, 2005).Menurut Moffat, alopurinol

memiliki serapan maksimum dalam larutan asam pada panjang gelombang 250

nm (퐴 = 563 a) dan pada larutan alkalis memiliki serapan maksimum pada

panjang gelombang 257 nm (퐴 = 523 a)

Struktur alopurinol sebagai berikut

(Dirjen POM RI, 1995).

Gambar 1. Struktur alopurinol


7

1. Mekanisme Kerja Alopurinol

Alopurinol secara struktur kimia merupakan analog struktur dari

hipoxantin, maka alopurinol adalah analog subtrat untuk enzim xantin oksidase.

Jadi, fungsi alopurinol sebagai analog subtrat akan menempati sisi aktif enzim

xantin oksidase yang biasa ditempati oleh hipoxantin. Alopurinol menghambat

aktivitas enzim secara irreversible dengan mengurangi bentuk xantin oksidase

sehingga menghambat pembentukan asam urat (Khayoon et al, 2008).

Gambar 2. Mekanisme kerja Alopurinol (Khayoon et al, 2008).

Alopurinol dalam tubuh dimetabolisme oleh xanthin oksidase menjadi

oxipurinol yang keduanya bekerja menghambat kerja enzim xanthin oksidase.

Enzim ini bertanggung jawab terhadap oksidase hipoxantin dan xantin dalam

produksi asam urat yang merupakan produk metabolisme purin pada manusia.


8

Adanya pengeblokan produksi asam urat dengan penghambatan xantin oksidase

Oleh karena itu alopurinol bekerja dengan menurunkan pembentukan asam urat

dan purin (Khayoon et al, 2008).

2. Dampak Alopurinol

Alopurinol dapat menimbulkan reaksi kulit, reaksi alergi berupa demam,

menggigil, leukopenia atau leukositosis, eosinofilia, artralgia dan pruritus,

gangguan saluran pencernaan, pruritus, urtikaria, eksfoliatif dan lesi purpura,

dermatitis, nefritis, faskulitis dan sindrome poliartritis, kegagalan hati dan ginjal,

mual, muntah, diare, rasa mengantuk, sakit kepala dan rasa logam (Wells, 2009).

Alopurinol tidak memberikan efek mutagenik maupun karsinogenetik

karena terbukti pada penelitian menunjukkan bahwa alopurinol tidak menginduksi

penyimpangan kromosom pada sel darah manusia secara invitro pada kadar

hingga 100 μg/mL dan secara invivo mencapai dosis 60 mg/hari pada periode 40

bulan serta tidak mengindikasikan adanya efek teratogen namun alopurinol dan

oksipurinol didistribusikan ke air susu ibu sehingga alopurinol rentan

menimbulkan efek samping terutama reaksi hipersensitivitas (Medsafe, 2011).

LD50 yang ditetapkan untuk tikus secara oral dengan pemakaian akut

sebesar > 7500 mg/kg sedangkan untuk pemakaian kronis menggunakan nilai

NOAEL sebesar 12 mg/kg/hari (Glaxosmithkline, 2013).


9

3. Penetapan kadar alopurinol

Alopurinol dapat ditetapkan kadarnya secara spektrofotometri ultraviolet

dengan pelarut NaOH P 0,4% b/v dan asam klorida P 1% v/v (Dirjen POM RI,

1995).

B. Tablet

Tablet adalah sediaan padat yang mengandung bahan obat dengan atau

tanpa bahan pengisi. Berdasarkan metode pembuatan, dapat digolongkan sebagai

tablet cetak dan tablet kempa. Tablet kempa dibuat dengan memberikan tekanan

tinggi pada serbuk atau granul menggunakan cetakan baja. Tablet cetak dibuat

dengan cara menekan massa serbuk lembab dengan tekanan rendah ke dalam

lubang cetakan (Dirjen POM RI, 1995).

C. Obat Tradisional

Obat tradisional bahan atau ramuan bahan yang berupa bahan tumbuhan,

bahan hewan, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan tersebut yang

secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan berdasarkan pengalaman

(Permenkes RI No.007 Tahun 2012).

Sediaan obat tradisional yang beredar dibuat dari simplisia nabati, yaitu

bagian tanaman atau seluruh tanaman baik segar ataupun sudah dikeringkan atau

hasil penyariannya dengan berbagai bentuk sediaan seperti rajangan, serbuk, pil,

tablet, kapsul, cairan (sediaan luar dan sediaan dalam), salep, krim, parem, tapel

dan sebagainya (POM, 2004).


10

Sediaan obat tradisional ini perlu dilakukan berbagai jenis pengujian

untuk mengetahui mutu dari sediaan obat tradisional yang akan diproduksi. Jenis

pengujian ini meliputi pengujian mutu dan pengujian keamanan. Pengujian mutu

meliputi organoleptik, kemasan, makroskopis, kebenaran simplisia, kadar air dan

keseragaman bobot. Pengujian keamanan meliputi uji cemaran logam berat,

cemaran pestisida, cemaran mikroba, zat tambahan yang diizinkan seperti bahan

pengawet, cemaran afatoksin dan penetapan ada tidaknya bahan kima obat yang

ditambahkan dalam sediaan obat tradisional (Kepmenkes RI no

661/MENKES/SK/VII/1994).

Menurut Keputusan Badan POM RI No. 00.05.4.2411 tahun 2004,

berdasarkan cara pembuatan serta klaim penggunaan dan tingkat pembuktian

khasiat, Obat Bahan Alam Indonesia dikelompokkan menjadi 3 jenis yaitu :

1. Jamu (Obat tradisional warisan nenek moyang)

2. Obat Herbal Terstandar(telah dikembangkan berdasarkan bukti-bukti ilmiah,

uji praklinis dan standarisasi bahan baku)

3. Fitofarmaka(telah melewati uji klinis dan standariasasi bahan baku).

Menurut Keputusan Kepala Badan POM No. HK.00.05.41.1384 tahun

2005 di dalam jamu dilarang digunakan

1. Bahan kimia hasil isolasi atau sintetik yang berkhasiat obat.

2. Narkotika atau psikotropika.

3. Hewan atau tumbuhan yang dilindungi sesuai dengan ketentuan peraturan

perundang-undangan yang berlaku.


11

D. Spektrofotometri Ultraviolet

Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara

radiasi elektromagnet dan molekul atau atom dari suatu senyawa. Teknik yang

sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi spektrofotometri ultraviolet,

cahaya tampak, infra merah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang

untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm dan daerah cahaya tampak 380-780

nm (Dirjen POM RI, 1995).

Radiasi ultraviolet diabsorpsi oleh molekul organik, molekul yang

mengandung elektron 휋 terkonjugasi dan atom yang mengandung elektron-n

menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat energi elektron

dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi

tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga

dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (Satiadarma, 2004).

1. Instrumentasi Spektrofotometer Ultraviolet

Spektrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum

ultraviolet terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan sinar

monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang 190-380 nm. Komponen –

komponen meliputi sumber sinar, monokromator dan sistem optik.

a. Sumber lampu

Lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang

190-380 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu tungsten digunakan

untuk daerah visibel (pada panjang gelombang 380-780 nm)


12

b. Monokromator

Monokromator digunakan mendispersikan sinar ke dalam komponen-

komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya dipilih oleh celah (slit).

Monokromator berputar seingga kisaran panjang gelombang dilewatkan pada

sampel sebagai scan instrumen melewati spektrum.

c. Optik

Optik dapat dirancang untuk memecah sumber sinar sebagai sumber sinar

yang melewati 2 kompartemen pada spektrofotometer berkas ganda (double

beam), suatu larutan blangko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk

mengkoreksi pembacaan atau spektrum sampel. Larutan yang paling sering

digunakan sebagai blangko dalam spektrofotometri adalah semua pelarut yang

digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi (Gandjar dan Rohman, 2010).

2. Interaksi elektron dengan Radiasi Elektromagnet

Secara umum ada 3 macam distribusi elektron di dalam suatu senyawa

organik yang dikenal sebagai elektron pi (휋), sigma (휎) dan elektron tidak

berpasangan (n). Apabila molekul tersebut dikenakan radiasi elektromagnetik

maka akan terjadi eksitasi elektron yang lebih tinggi (Mulja dan Suharman, 1995).

Ada empat jenis transisi elektronik yang terjadi diantara tingkat energi

dalam suatu molekul yaitu :

i. Transisi sigma-sigma star (휎-휎∗)

ii. Transisi n-sigma star (n-휎∗)

iii. Transisi n-phi star (n-휋∗)

iv. Transisi n-phi star (n-휋∗) (Gandjar dan Rohman, 2010).


13

Gambar 3. Diagram tingkat energi elektronik

3. Hukum Lambert Beer

Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan

sel yang disinari. Menurut hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya

monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan

konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu

dalam hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus

terhadap konsentrasi dan ketebalan sel sesuai pada persamaan :

log Io/It = A = 휀. b. c

Io : intensitas radiasi yang masuk

It : intensitas radiasi yang ditransmisikan

A : absorbansi

휀 : konstanta koefisien molar ekstingsi

b : ketebalan kuvet yang dinyatakan dalam cm

c : konsentrasi analit (mol. L-1) (Watson, 2003).

E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah teknik pemisahan

campuran senyawa berdasarkan interaksi dengan fase diam dibawah aliran fase


14

gerak, dimana fase gerak dialirkan dengan bantuan tekanan menuju kolom secara

cepat dan dideteksi dengan detektor yang sesuai (Hendayana, 2006).

1. Instrumentasi KCKT

Komponen pokok instrumentasi KCKT pada dasarnya terdiri atas

kolom, wadah fase gerak, tempat penyuntikan sampel, pompa, detektor dan

sisem pengolah data untuk menampilkan hasil pemisahan.

a. Kolom

Suatu bagian dimana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses

pemisahan analit. Oktadesil silika (C18) merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran

rendah, sedang maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek sesuai

untuk solut yang polar (Gandjar dan Rohman, 2010).

b. Wadah fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Fase gerak sebelum

digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) yang ada pada fase

gerak, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di

pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. (Gandjar dan Rohman,

2010).

c. Tempat penyuntikan sampel (injektor)

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam

fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan syringe

yang terbuat dari tembaga tahan karat. (Gandjar dan Rohman, 2010).


15

d. Pompa

Pompa harus bersifat inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan

sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan

fase gerak dengan kecepatan alir 3mL/menit. Tujuan penggunaan pompa adalah

untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secar tepat,

reprodusibel, konstan dan bebas dari gangguan (Gandjar dan Rohman, 2010).

e. Detektor

Fungsi detektor dalam KCKT adalah untuk mendeteksi komponen-

komponen cuplikan hasil pemisahan kolom secara kualitatif dan kuantitatif

bergantung pada kebutuhan analisis. Detektor KCKT yang baik harus mempunyai

sensitivitas yang cukup tinggi atau mempunyai limit deteksi yang sangat kecil,

sehingga memberikan perubahan sinyal yang besar pada perubahan konsentrasi

komponen cuplikan yang kecil. Detektor yang sensitif akan membantu analisis

kualitatif maupun kuantitatif terutama untuk trace analysis (Gandjar dan Rohman,

2010).

f. Sistem Pengolah Data (Rekorder/Integrator/Komputer)

Sistem KCKT memerlukan sistem pengolah data sebagai sistem pencatat

yang berkualitas baik dan mampu menampilkan hasil kromatogram dengan jelas,

tepat dan peka. Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder

dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektronik yang

dihasilkan oleh detektor lalu mem-plotkannya sebagai suatu kromatogram yang

selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang analis (pengguna).


16

2. Parameter Pemisahan

Dalam metode kromatografi, suatu pemisahan dikatakan baik bila

memenuhi beberapa parameter utama yang dikenal dengan istilah faktor retensi

(k), faktor pemisahan (ɑ), jumlah total pelat (N) dan resolusi (R). Ketiga faktor ini

harus diperhitungkan untuk menggambarkan tingkat resolusinya.

Faktor retensi (k) adalah retensi relatif dari masing-masing puncak

kromatogram pada kolom. Faktor retensi tidak tergantung pada panjang kolom

dan aliran fase gerak, namun mewakili rasio molar dari senyawa di dalam fase

diam dan fase gerak. Faktor retensi biasanya bernilai antara 1 hingga 10. Jika nilai

k terlalu rendah, maka derajat pemisahan mungkin tidak cukup dikarenakan tidak

adanya interaksi antara analit dengan fase diam karena analit lewat fase diam

terlalu cepat. Sebaliknya, jika nilai k terlalu besar, maka waktu analisis juga akan

menjadi terlalu lama (Jeffrey, 1996).

Persamaan untuk menghitung nilai k sebagai berikut :

k=

keterangan : k=faktor retensi

tR=waktu retensi analit

t0=waktu retensi dari puncak pertama yang keluar dari kolom

Faktor pemisahan (selektivitas) merupakan besaran yang menunjukkan

pemisahan relatif antara dua puncak dalam satu kromatogram. Dua komponen


17

dalam suatu campuran tidak dapat dipisahkan , kecuali memiliki perbedaan nilai k

dengan nilai k2>k1. Jika nilai ɑ=1 maka artinya tidak terjadi pemisahan atau

menunjukkan kedua komponen memiliki waktu retensi yang sama. Faktor

pemisahan atau selektivitas (훼) adalah suatu ukuran dari potensi sistem

kromatografi untuk mampu atau tidak memisahkan dua senyawa (Jeffrey, 1996).

Persaman selektivitas :

훼=

Keterangan : 훼= faktor pemisahan

k1= faktor retensi analit 1


Resolusi (R) dari dua puncak tergantung pada faktor pemisahan

(훼), faktor efisiensi (N) dan faktor retensi (k). Jika diasumsikan N1=N2 dibawah

kondisi pemisahan isokratik. Isokratik adalah cara pemrograman aliran fase gerak

yang hanya memerlukan satu macam komposisi pelarut tunggal maupun

campuran (Jeffrey, 1996).

Persamaan resolusi :

R= (훼 − 1)√푁 = (훼 − 1)√푁

Keterangan : R= resolusi

훼= faktor pemisahan


18



N= jumlah pelat teoritis (faktor efisiensi)

Jumlah pelat teoritis (N) atau faktor efisiensi adalah karaterisasi efisien

kolom. Faktor efisien (N) mengukur derajat ketajaman puncak kromatogram yang

didapatkan. Nilai faktor efisiensi yang meningkat menandakan proses

pengemasan (packing) yang lebih baik, panjang kolom yang lebih panjang,

kondisi aliran fase gerak yang optimum. Kolom dengan nilai efisiensi yang tinggi,

berarti dapat memisahkan campuran yang terdiri atas komponen yang memiliki

faktor pemisahan yang mirip (Jeffrey, 1996).

Persamaan jumlah pelat teoritis :

N=16

Keterangan : N= jumlah pelat teoritis

tR= waktu retensi analit

w= luas area analit

Pada saat pemisahan kromatografi, analit individual akan membentuk

profil konsentrasi yang simetri / profil Gaussian dalam arah aliran fase gerak.

Peak kromatogram secara perlahan akan melebar dan sering membentuk profil

asimetrik karena analit melanjutkan migrasinya ke fase diam (Gandjar dan

Rohman, 2010). Alasan timbulnya bentuk puncak dan pelebaran puncak


19

didasarkan pada difusi Eddy, difusi longitudinal, dan transfer massa (Snyder et

al., 2010).

Difusi longitudinal adalah saat analit melewati kolom. Proses difusi ini

menyebabkan pelebaran peak untuk meningkatkan retention time ( Snyder et al.,

2010). Spesies analit menyebar ke segala arah dengan difusi ketika berada di

dalam fase gerak. Difusi terjadi dengan arah yang sama dan berlawanan dengan

fase gerak sehingga berkontribusi terhadap pelebaran pita secara simetris (Gandjar

dan Rohman, 2010).

Gambar 4. Pelebaran puncak selama pemisahan dalam KCKT (Snyder et al., 2010)

Difusi Eddy menggambarkan faktor lain yang menyebabkan pelebaran

pita. Molekul analit masuk ke dalam kolom melewati partikel fase diam dengan

arah yang berbeda-beda menuju keluar kolom. Molekul yang bergerak lebih

lambat akan keluar lebih lambat. Molekul yang bergerak lebih cepat akan keluar


20

lebih dahulu. Pelebaran pita tidak tergantung dari kecepatan alir yang digunakan

dan hanya bergantung dari penyusunan dan ukuran partikel dalam kolom.

Pelebaran pita yang diakibatkan karena difusi Eddy akan semakin besar seiring

dengan peningkatan ukuran partikel kolom (Snyder et al., 2010).

Transfer massa dapat menyebabkan pelebaran pita, terjadinya transfer

massa disebabkan oleh transfer massa fase gerak yang merupakan kecepatan alir

analit yang mempengaruhi pelebaran pita, diantara partikel fase diam terdapat

rongga bilamana analit melewatinya akan lebih cepat keluar terbaca detektor dan

bila analit cenderung lebih menyamping maka akan terjadi interaksi dahulu

terhadap partikel fase diam. Transfer massa fase diam menggambarkan analit

yang terpenetrasi ke dalam partikel fase diam dan tinggal lebih lama sebelum

meninggalkan partikel fase diam. Perbedaan lama waktu tinggal dan adanya analit

yang terlebih dahulu terelusi keluar akan menyebabkan pelebaran pita (Snyder et

al., 2010).

3. Fase Diam

Kolom pada KCKT tidak memerlukan temperatur tinggi karena sifat

ikatan kimia terhadap fase diam sangat sensitif terhadap temperatur tinggi.

pemilihan kolom berdasarkan jenis fase gerak dan sifat fisika kimia zat analit

(Snyder et al, 2010).

Sifat bahan pengisi atau fase diam dalam kolom bervariasi meskipun dari

satu produk yang sama. Variasi fase diam yang banyak digunakan dapat

berdasarkan partikel yang porous atau non porous dengan ukuran diameter yang


21

kecil dan permukaan partikel kecil yang porous. Salah satu fase diam yang

digunakan dalam instrumen KCKT adalah silika.

Silika adalah suatu adsorben dengan sifat yang terkenal dan banyak

digunakan sebagai bahan isian kolom. Silika terdiri dari atom silikon yang

dijembatani secara tiga dimensi oleh atom oksigen. Silika mengandung gugus OH

(silanol) sehingga permukaannya memungkinkan untuk dimodifikasi untuk

memberikan sifat yang spesifik. Modifikasi dari kolom silika sebagai bahan isian

kolom telah sangat berkembang (Munson, 1991).

Tabel I. Modifikasi silika pada kolom dan aplikasinya (Munson, 1991)

Kolom Fase Aplikasi

C18 Octadecyl Non-polar umum

C8 Octyl Non-polar umum

Phenyl Styryl Asam lemak, ikatan rangkap

Cyano Cyanopropil Keton, aldehide

Diol Aminopropil Sugar,anion

Amino Dihydroxylhexyl Protein

SAX (Strong anion exchanger)

Aromatic quaternaryamine Anion

4. Fase Gerak

Pada pemilihan fase gerak yang perlu diperhatikan adalah fase gerak

harus berinteraksi dengan fase diam yang sesuai untuk memisahkan suatu

campuran secepat dan seefisien mungkin. Secara umum pemilihan fase gerak


22

harus memenuhi kriteria viskositas, transparansi UV, titik didih, kemurnian, sifat

inert, toksisitas dan harga (Chan et al, 2004).

Viskositas yang rendah menghasilkan tekanan yang rendah dibanding

suatu pelarut dengan viskositas yang lebih tinggi pada suatu aliran tertentu. Untuk

transparansi UV, jika serapan UV yang digunakan maka fase gerak yang

digunakan haruslah transparan pada panjang gelombang yang digunakan (Jeffrey,

1996).

Pelarut yang digunakan dalam KCKT harus standar KCKT dan disaring

dengan ukuran pori 0,2 μm. Pelarut yang digunakan harus murni dan tidak

mengandung gas untuk menghindari pembentukan gelembung gas ketika

melewati katub atau memasuki bejana piston. Suatu sistem degassing dibutuhkan

untuk menghilangkan udara dalam larutan (Christian, 1994). Adanya gas dalam

fase gerak akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan

detektor sehingga akan mengacaukan analisis (Gandjar dan Rohman, 2012).

Syarat-syarat fase gerak untuk KCKT adalah : murni, tanpa cemaran,

tidak bereaksi dengan kemasan, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan

cuplikan, mempunyai viskositas yang rendah, memungkinkan memperoleh

kembali cuplikan dengan mudah, harganya wajar (Gandjar dan Rohman, 2012).

Pemilihan fase gerak yang digunakan terutama berdasarkan indeks

polaritas (P’) campuran fase geark tersebut. Semakin besar nilai indeks polaritas

menyatakan semakin polar fase gerak yang digunakan. Fase gerak yang sering

digunakan merupakan kombinasi dari dua atau lebih campuran pelarut yang saling


23

bercampur secara keseluruhan. Campuran fase gerak tersebut akan menghasilkan

nilai polaritas tersendiri yang disebut indeks polaritas fase gerak (Harvey, 2000).

P’AB = 휙A. P’A + 휙B. P’B

Dengan 휙A dan 휙B merupakan fraksi volume pelarut yang digunakan

pada pelarut A dan B, sedangkan P’A dan P’B merupakan indeks polaritas pelarut

yang digunakan pada pelarut A dan B (Harvey, 2000).

Untuk mengetahui nilai indeks polaritas dari fase gerak yang digunakan

maka dapat dilihat dari tabel berikut.

Tabel II. Nilai indeks polaritas pelarut (Snyder et al., 1997).

Pelarut Indeks polaritas

Eluotropic values UV Cut off (nm) Alumina C18 Silika

Heksan 0,1 0,01 - 0,00 195

Sikloheksan 0,2 0,04 - - 200

Toluen 2,4 0,29 - 0,22 284

Tetrahidrofuran 4,0 0,45 3,7 0,53 212

Etil asetat 4,4 0,58 - 0,48 256

Aseton 5,1 0,56 8.8 0,53 330

Metanol 5,1 0,95 1,0 0,70 205

Asetonitril 5,8 0,65 3,1 0,52 190

Air 10,2 - - - 190


24

Deret elutropik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan

suatu panduan yang berguna dalam memilih fase gerak yang akan digunakan

dalam sistem KCKT. Nilai UV cut off (pemenggalan UV) merupakan panjang

gelombang dimana kuvet 1 cm yang digunakan pelarut akan memberikan absorbsi

lebih dari satu satuan absorbansi. Pentingnya mengetahui panjang gelombang

pemenggalan UV sangat berguna saat menggunakan detektor UV, penggunaan

panjang gelombang deteksi dianjurkan tidak bertepatan atau di sekitar panjang

gelombang pemenggalan UV dari pelarut yang digunakan sebagai fase gerak

(Gandjar dan Rohman, 2010).

F. Validasi Metode

Validasi metode analisis adalah proses dimana suatu metode ditetapkan

melalui serangkaian uji laboratorium bahawa karakter penampilan metode

tersebut memenuhi persyaratan untuk penerapan metode yang dimaksud. Tujuan

akhir validasi metode adalah untuk menjamin bahwa tiap pengukuran di masa

yang akan datang dalam suatu analisis rutin harus cukup dekat dengan nilai

kandungan analit sebenarnya yang terkandung dalam suatu sampel (Gandjar dan

Rohman, 2012).

Validasi metode menurut Association of Official Analytical Chemistry

(AOAC) adalah suatu proses yang menetapkan karakteristik suatu metode yang

ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk aplikasi analisis yang diharapkan

dengan cara studi laboratorium. Validasi dibagi menjadi empat kelas yaitu kelas

A, B, C dan D. Kelas A digunakan untuk identifikasi senyawa. Kelas B digunakan

untuk mendeteksi dan menentukan pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa


25

secara kuantitatif. Kelas D untuk mencari ciri suatu senyawa (Levin, 2002).

Parameter metode validasi dalam penelitian ini meliputi lineritas, spesifisitas,

keseksamaan (presisi), ketepatan (akurasi), batas deteksi (limit of detection) dan

batas kuantifikasi (limit of quantification).

Karakter penampilan metode dinyatakan sebagai parameter analisis.

Beberapa parameter yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis

adalah :

1. Akurasi (Ketepatan)

Ketepatan suatu prosedur analisis adalah kedekatan hasil yang diterima

(baik sebagai nilai teoritis maupun dengan nilai rujukan yang diterima) dengan

nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran (Chan et al., 2004). Ketepatan

menurut (Horwitz, 2005), adalah kedekatan nilai hasil percobaan yang diperoleh

dari suatu metode terhadap nilai sebenarnya. Ketepatan diukur dengan

menghitung recovery menggunakan metode penambahan standar. Nilai recovery

tergantung pada matriks sampel, prosedur proses sampel dan konsentrasi analit.

Batas penerimaan recovery menurut AOAC adalah 80-120%.

% recovery = x 100%

Keterangan : a = konsentrasi sampel + konsentrasi standar yang terukur

b = konsentrasi sampel

c = konsentrasi standar teoritis yang ditambahkan


26

Acceptance criteria untuk nilai recovery diharapkan sesuai dengan matriks

sampel, prosedur pembuatan sampel dan konsentrasi analit. Rentang % recovery

yang diperbolehkan dapat dilihat pada tabel III berikut :

Tabel III. Kriteria rentang recovery (Gonzales and Herrador, 2007)

Analyte (%)

Analyte fraction Unit Recovery range

(%)

100 1 100% 98-102

10 10-1 10% 98-102

1 10-2 1% 97-103

0,1 10-3 0,1% 95-105

0,01 10-4 100 ppm 90-107

0,001 10-5 10 ppm 80-110

0,0001 10-6 1 ppm 80-110

0,00001 10-7 100 ppb 80-110

0,000001 10-8 10 ppb 60-115

0,0000001 10-9 1 ppb 40-120

2. Presisi (Keseksamaan)

Presisi adalah ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya

diekspresikan sebagai simpangan baku atau Relative Standard Deviation (RSD)

dari sejumlah sampel. Sesuai ICH presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang

berbeda yaitu keterulangan (repeatibility), presisi antara (intermediete precision)

dan. reprodusibilitas. penetapan pada keterulangan ada 2 cara yaitu (1) suatu

pengukuran sebanyak 9 kali yang mencakup kisaran yang digunakan dalam

prosedur analisis ( misalnya 3 konsentrasi berbeda dengan masing-masing


27

dilakukan replikasi sebanyak 3 kali) atau (2) dilakukan 6 kali penetapan terhadap

larutan dengan konsentrasi yang sama (Chan et al., 2004).

Ada 2 ukuran presisi yaitu :

a. Presisi sistem (replikabilitas) : merupakan penilaian terhadap keberulangan

sistem untuk mengetahui kesalahan karena sistem , yang tidak bergantung pada

penyiapan sampel.

b. Presisi metode (repeatibilitas) : merupakan ukuran dari variabilitas intrinsik,

termasuk kesalahan yang disebabkan oleh penyiapan sampel.

Besarnya % RSD yang dapat diterima dapat dilihat pada tabel IV berikut :

Tabel IV. Kriteria presisi yang dapat diterima (Gonzales and Herrador, 2007)

Analyte (%)

Analyte fraction

Unit Horwitz %RSD

AOAC %RSD

100 1 100% 2 1,3

10 10-1 10% 2,8 1,8

1 10-2 1% 4 2,7

0,1 10-3 0,1% 5,7 3,7

0,01 10-4 100 ppm 8 5,3

0,001 10-5 10 ppm 11,3 7,3

0,0001 10-6 1 ppm 16 11

0,00001 10-7 100 ppb 22,6 15

0,000001 10-8 10 ppb 32 21

0,0000001 10-9 1 ppb 45,3 30


28

3. Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh

hasil-hasil uji yang secara proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran

yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva

kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). (Snyder

et al., 1997).

4. Batas kuantitasi (LOQ)

merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memberikan

resopon yang memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi dan kuantitasi

dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi

(Snyder et al., 1997).

G. Landasan Teori

Asam urat merupakan penyakit yang berkaitan dengan hiperurisemia

karena peningkatan sintesis asam urat yang ditandai dengan arthritis akut pada

persendian dan kartilago (Johnstone, 2005).

Penyakit asam urat dapat diatasi dengan obat sintesis maupun jamu

sebagai obat tradisional. Untuk menjaga keamanan konsumen perlu dilakukan

jaminan kualitas untuk obat sintesis maupun jamu.

Alopurinol merupakan salah satu zat aktif obat yang digunakan untuk

menurunkan kadar asam urat dalam darah. Alopurinol memiliki gugus kromofor

dan auksokrom yang dapat menyerap radiasi pada panjang gelombang di daerah

ultraviolet, maka alopurinol dapat dianalisis dengan metode spektrofotometri.


29

Pada tablet alopurinol mengandung tidak kurang dari 93% dan tidak

lebih dari 107% C5H4N4O dari label klaim sediaan (Dirjen POM RI, 1995).

Penggunaan metode spektrofotometri dalam penetapan kadar alopurinol dalam

tablet perlu dilakukan untuk memberikan hasil dengan reprodusibilitas dan

reabilitas yang baik. Validasi suatu metode analisis ditentukan oleh parameter :

linearitas, akurasi, presisi, LOQ.

Selain menggunakan obat sintesis untuk mengatasi asam urat, masyarakat

juga menggunakan jamu sebagai alternatif dalam mengatasi penyakit ini. Menurut

Keputusan Kepala Badan POM No. HK.00.05.41.1384 tahun 2005 di dalam jamu

dilarang digunakan bahan sintetik yang berkhasiat obat.

Menurut Sari(2014), analisis alopurinol dalam jamu tidak dapat

menggunakan metode spektrofotometri karena jamu memiliki matriks yang

kompleks dan metode spektrofotometri tidak mencapai batas kuantifikasi yang

ditentukan. Oleh karena itu dikembangkan metode analisis menggunakan KCKT.

Untuk metode KCKT ini juga dilakukan validasi metode analisis untuk menjamin

metode memiliki spesifikasi yang diterima meliputi : linearitas, akurasi, presisi

dan LLOQ.

H. Hipotesis

Dapat dilakukan validasi dan penetapan kadar alopurinol dalam tablet

secara spektrofotometri serta dalam jamu secara KCKT.


30

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan

rancangan deskriptif karena tidak dilakukan manipulasi terhadap subjek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah kondisi optimal dari hasil optimasi

Sari (2014) dan Soenarso (2014).

2. Variable tergantung pada penelitian ini adalah parameter validitas yaitu

akurasi, presisi, linearitas, dan LOQ.

3. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini, yaitu :

Kualitas bahan baku, kemurnian pelarut, digunakan pelarut yang memiliki

grade pro analysis.

C. Definisi Operasional

1. Alopurinol merupakan senyawa yang sering digunakan untuk mengatasi

penyakit asam urat.

2. Validasi metode yang dilakukan pada penelitian ini meliputi pengukuran

terhadap parameter-parameter validitas yaitu akurasi, presisi, linearitas, dan

LOQ.


31

3. Sampel yang digunakan yaitu dan tablet alopurinol dan jamu asam urat.

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan adalah baku alopurinol (PT. Ifars), metanol

(E.Merck), asam klorida (E.Merck), natrium hidroksida (E.Merck), kloroform

(E.Merck), ammonium hidroksida solution 25% (E.Merck), akuades dan

akuabides, matriks sampel jamu asam urat, sampel tablet alopurinol

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu : seperangkat

spektrofotometer UV-VIS merek Optima SP 300 Plus, seperangkat KCKT fase

terbalik merek Shimadzu dengan sistem gradient, kolom oktadesilsilan C18 150 x

4,6 mm dengan ukuran pori 5 m, ultrasonikator, neraca analitik Ohaus Carat

Series PAJ 1003, milipore filter ukuran 0,45 µm, mikropipet Socorex ukuran 100-

1000 μL, indikator pH (E.Merck), organic and anorganic solvent membrane filter

(Whatman) ukuran pori (0,45 μm dengan diameter 47 mm), vakum dan

seperangkat alat gelas (Pyrex).

F. Tata Cara Penelitian

I. Metode Spektrofotometri

1. Pembuatan larutan NaOH 0,1 N

Sejumlah 1 gram pelet NaOH dilarutkan dengan akuades hingga semua

larut sempurna lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL dan diencerkan

dengan akuades hingga batas tanda(Mursyidi,2008).


32

2. Pembakuan NaOH 0,1 N

Ditimbang lebih kurang 400 mg kalium biftalat secara seksama yang

sebelumnya telah dihaluskan dan dikeringkan pada suhu 120ºC selama 2 jam dan

larutkan dalam 75 mL air bebas karbondioksda lalu tambahkan 2 tetes indikator

fenolftalein dan titrasi dengan larutan natrium hidroksida hingga terjadi warna

merah muda mantap. Normalitas NaOH dihitung dengan menggunakan rumus :

N NaOH =

(Mursyidi,2008).

3. Penentuan panjang gelombang pengamatan alopurinol

Dibuat seri larutan kurva baku dengan konsentrasi 4, 8, dan 12 μg/mL

dengan cara mengambil 2,4, dan 6 mL dari larutan intermediet 2 lalu dimasukkan

ke dalam labu ukur 10 mL dan diencerkan dengan menggunakan NaOH 0,1 N

hingga tanda. Kemudian ukur serapan pada panjang gelombang 200-400 nm

4. Pembuatan larutan baku alopurinol

a. Pembuatan larutan induk baku alopurinol

Sejumlah lebih kurang 50 mg baku alopurinol ditimbang seksama,

dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL dilarutkan dengan NaOH 0,1 N hingga

tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 μg/mL.

b. Pembuatan larutan intermediet 1 alopurinol

Dari larutan induk diambil 1,0mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur

10 mL, encerkan dengan NaOH 0,1 N hingga tanda sehingga diperoleh larutan

dengan konsentrasi 100 μg/mL


33

c. Pembuatan larutan intermediet 2 alopurinol

Dari larutan induk intermediet 1 diambil 10 mL lalu dimasukkan ke

dalam labu ukur 50 mL, encerkan dengan NaOH 0,1 N hingga tanda sehingga

diperoleh larutan dengan konsentrasi 20 μg/mL.

d. Pembuatan kurva baku alopurinol

Larutan intermediet 2 diambil sebanyak 2,3,4,5,6, dan 7 mL dari

kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL. Ditambahkan NaOH 0,1 N

hingga batas tanda sehingga diperoleh seri larutan kurva baku alopurinol dengan

konsentrasi 4, 6, 8, 10, 12, dan 14 μg/mL. Larutan seri baku tersebut diukur

absorbansinya pada panjang gelombang pengamatan menggunakan

spektrofotometer UV. Dibuat kurva regresi linear antara kadar alopurinol dan

absorbansi yang diperoleh, kemudian ditentukan persamaan regresi linear dan

nilai koefisien korelasinya.

5. Uji keseragaman bobot tablet alopurinol

Disiapkan 20 tablet alopurinol kemudian ditimbang satu per satu untuk

mengetahui keseragaman bobot tablet. Bobot tablet yang diperoleh dihitung bobot

rata-ratanya. Setelah dilakukan uji keseragaman bobot, tablet alopurinol digerus

menggunakan mortir dan stamper dan disimpan dalam wadah yang kering.

6. Validasi metode analisis dalam tablet alopurinol

Dua puluh tablet alopurinol digerus kemudian ditimbang sampel

sebanyak 77 mg. Ke dalam masing-masing sampel ditambahkan baku alopurinol

4, 6, dan 8 mg. Replikasi dilakukan 5 kali. Masing-masing sampel yang telah


34

diadisi dengan baku alopurinol kemudian larutkan dengan NaOH 0,1 N dan saring

dengan menggunakan kertas saring, masukkan ke dalam labu ukur 25 mL.

Diambil 1,0mL lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan add hingga

tanda. Diambil lagi 1,0mL dan diencerkan hingga 10 mL, ukur serapan

konsentrasi larutan sampel pada panjang gelombang pengamatan dengan replikasi

5 kali. Dilakukan penetapan blanko dengan replikasi 5 kali.

Dilakukan pengukuran absorbansi larutan adisi sampel dan blanko

menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang maksimum. Nilai

absorbansi yang didapat digunakan untuk menghitung kadar alopurinol dengan

memasukkan nilai absorbansi pada persamaan kurva baku yang telah dibuat.

Dihitung persen perolehan kembali (% recovery), nilai koefisien variasi (% CV)

dan LOQ (Limit of Quantitation) alopurinol yang telah diadisi ke dalam matriks

tablet alopurinol.

7. Penetapan kadar alopurinol dalam tablet

Dua puluh tablet alopurinol digerus kemudian ditimbang sebanyak 77

mg. Dilarutkan dengan NaOH 0,1 N dan saring dengan menggunakan kertas

saring, masukkan ke dalam labu ukur 25 mL. Diambil 1,0 mL lalu dimasukkan ke

dalam labu ukur 10 mL dan add hingga tanda. Diambil lagi 1,0 mL dan

diencerkan hingga 10 mL, ukur serapan konsentrasi larutan sampel pada panjang

gelombang maksimum. Masukkan hasil absorbansi ke persamaan kurva baku

alopurinol sehingga diperoleh kadar alopurinol dalam sampel. Replikasi dilakukan

5 kali.


35

II. Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik

1. Penentuan panjang gelombang pengamatan alopurinol

Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan cara

mengukur spektra larutan baku alopurinol dengan menggunakan konsentrasi 5,0;

7,5; 10,0; 12,5 dan 15,0 μg/mL. Pengukuran dilakukan pada rentang panjang

gelombang 200-400 nm terhadap blanko amonium hidroksida 5% dalam metanol.

Berdasarkan spektra yang diperoleh kemudian ditentukan panjang gelombang

maksimum. Panjang gelombang ini akan digunakan pada deteksi sistem KCKT

2. Pembuatan fase gerak

Fase gerak yang digunakan yaitu campuran metanol : amonium

hidroksida 0,1% dalam akuabides (10:90). Masing-masing larutan disaring

menggunakan kertas saring Whatman yang dibantu dengan pompa vakum dan

diawaudarakan selama 15 menit. Pencampuran fase gerak dilakukan di dalam

sistem KCKT.

3. Kurva baku alopurinol

a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama

lebih kurang 25 mg baku alopurinol, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur

25 mL dan dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol.

b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol.Dibuat larutan intermediet

dengan konsentrasi 10 g/mL dengan cara mengambil sebanyak 100 L dari

larutan stok baku alopurinol, dimasukkan labu takar 10 mL dan diencerkan

dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda.


36

c. Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Diambil sejumlah100, 200,

300, dan 400 μL larutan intermediet alopurinol kemudian masing-masing

dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL. Masing-masing labu takar diencerkan

dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda. Masing-masing seri

baku alopurinol disaring menggunakan milipore kemudian di-degassing

menggunakan ultrasonikator selama 15 menit. Sejumlah 10 μL masing-masing

seri larutan baku disuntikkan ke sistem KCKT. Replikasi dilakukan 3 kali.

4. Kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu

a. Pembuatan larutan stok baku alopurinol. Ditimbang secara seksama lebih

kurang 25 mg baku alopurinol, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL

dan dilarutkan dengan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol.

b. Pembuatan larutan intermediet alopurinol.Dibuat larutan intermediet

dengan konsentrasi 500 g/mL dengan cara mengambil sebanyak 5 mL dari

larutan stok baku alopurinol, dimasukkan labu takar 10 mL dan diencerkan

dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda.

c. Pembuatan seri larutan baku alopurinol. Diambil sejumlah 100, 300, dan

600 μL larutan intermediet alopurinol kemudian masing-masing dimasukkan ke

dalam labu takar 10 mL. Masing-masing labu takar diencerkan dengan amonium

hidroksida 5% dalam metanol hingga tanda, sehingga diperoleh konsentrasi 5, 15,

dan 30 μg/mL.

d. Pembuatan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu

Diambil 20 bungkus jamu merek asam urat yang telah dibeli, ditimbang

secara seksama 0,5 g jamu merek asam urat yang sebelumnya telah


37

dihomogenkan dengan menimbang 20 bungkus jamu dan dihitung bobot rata-

ratanya, kemudian dilarutkan dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Ditambahkan sebanyak

200 μL seri larutan baku 5, 15, 30 μg/mL dan 100, 200, 300 µL dari larutan

intermediet sehingga diperoleh massa alopurinol yang ditambahkan sebanyak 51,

103, 156 µg kemudian diekstraksi dengan kloroform 3 mL sebanyak tiga kali.

Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air (bagian atas), tampung dalam

flakon. Fase air ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH 2 dan diperoleh volume akhir

4 mL. Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan ke dalam catridge MCX yang telah

dikondisikan dengan metanol dan air. Kolom SPE MCX dicuci dengan dialiri 2

mL asam asetat 2% dan 2 mL metanol. Selanjutnya elusi dengan 10 mL

amonium hidroksida 5% dalam metanol. Fraksi amonium hidroksida 5% dalam

metanol ditampung dalam flakon, lalu diuapkan seluruhnya. Kemudian dilarutkan

dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak 10 mLlalu disaring

dengan menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi selama 15 menit.

Masing-masing diinjeksikan ke dalam sistem KCKT dengan replikasi lima kali.

5. Pengaruh Matriks Jamu pada Penetapan Kadar Alopurinol

Untuk mengetahui pengaruh matriks pada penetapan kadar alopurinol

dalam jamu, maka dilakukan perbandingan antara slope kurva baku alopurinol

dan slope kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu.

6. Validasi metode analisis dalam jamu

Validasi metode analisis dilakukan padadata yang diperoleh di langkah 4

meliputi linearitas, akurasi dan sensitivitas.

a. Linearitas. Linearitas ditentukan dengan nilai koefisien korelasi. Luas area

diplotkan terhadap massa alopurinol yang ditambahkan ke dalam matriks jamu


38

untuk memperoleh regresi linier dengan persamaan y = bx + a. Nilai koefisien

korelasi (r) yang akan digunakan untuk parameter validasi linearitas.

b. Akurasi. Akurasi ditentukan dengan % perolehan kembali.

% perolehan kembali =

x 100%

c. Presisi. Presisi ditentukan nilai % CV yang dapat dihitung dengan rumus

berikut.

% CV = x 100%

d. Sensitivitas. Sensitivitas ditentukan dengan nilai LOQ yang dapat dihitung

dengan rumus berikut.

LOQ = 3,3

Keterangan:

Sa: standar deviasi dari intersep kurva baku

b: slope

7. Penetapan Kadar Alopurinol dalam Jamu

Ditimbang secara seksama 0,5 gram jamu merek A,B dan C, kemudian

dilarutkan dengan 10 mL NaOH 0,1 N. Diekstraksi dengan kloroform 3

mLsebanyak tiga kali. Didapatkan 2 fase pemisahan, diambil fase air (bagian

atas), tampung dalam flakon. Fase air ditambahkan HCl 0,1 N hingga pH 2 dan

diperoleh volume akhir 4 mL. Sebanyak 1 mL sampel dimasukkan ke dalam

catridge MCX yang telah dikondisikan dengan metanol dan air. Kolom SPE MCX

dicuci dengan dialiri 2 mL asam asetat 2% dan 2 mL metanol. Selanjutnya elusi

dengan 10 mL amonium hidroksida 5% dalam metanol. Fraksi amonium


39

hidroksida 5% dalam metanol ditampung dalam flakon,lalu diuapkan seluruhnya.

Kemudian dilarutkan dengan amonium hidroksida 5% dalam metanol sebanyak

10 mL lalu disaring dengan menggunakan milipore kemudian diultrasonifikasi

selama 15 menit. Sejumlah 20 μL masing-masing sampel diinjeksikan ke sistem

KCKT dengan replikasi tiga kali.


40

G. Analisis Hasil

1. Analisis Hasil Metode Spektrofotometri UV

a. Akurasi

Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery).

%recovery =

x 100%

Menurut Gonzales dan Herrador (2007) % recovery yang baik yaitu 98-

102%.

b. Presisi

Presisi dinyatan sebagai % CV

% CV=

Keterangan :

CV = koefisien variasi

SD = simpangan deviasi

X = rata-rata

c. LOQ (batas kuantitasi)

Batas kuantitasi diperoleh dengan menghitung simpangan baku dari

intersep kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu dan diolah menggunakan

persamaan matematis secara statistik menggunakan program powerfit, untuk

menghitung nilai LOQ digunakan rumus :

LOQ = 3,3

Keterangan :

LOQ = batas kuantitasi


41

k = 3,3

Sa = standar deviasi dari intersep kurva baku

b = slope

d. Perhitungan kadar alopurinol dalam sediaan tablet

Untuk kadar alopurinol dalam sampel, analisis dilakukan dengan cara

memplotkan absorbansi alopurinol dalam sampel tablet ke dalam kurva baku

yang didapatkan. Kadar alopurinol dihitung menggunakan persamaan :

Y = Bx + A

Keterangan :

Y = AUC alopurinol dalam sampel

X = kadar alopurinol

Sehingga kadar alopurinol dalam sampel adalah x =

2. Analisis Hasil Metode KCKT fase terbalik

a. Linearitas

Linearitas dinyatakan dalam koefisien relasi (r) pada regresi linear. Linearitas

yang baik bila r hitung ≥ nilai r pada tabel.

b. Akurasi

Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery).

%recovery =

x 100%

Menurut Gonzales dan Herrador (2007) % recovery yang baik yaitu 80-110%.


42

c. Presisi

Presisi dinyatan sebagai % CV

% CV=

Keterangan :

CV = koefisien variasi

SD = simpangan deviasi

X = rata-rata

d. LOQ (batas kuantitasi)

Batas kuantitasi diperoleh dengan menghitung simpangan baku dari

intersep kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu dan diolah menggunakan

persamaan matematis secara statistik menggunakan program powerfit, untuk

menghitung nilai LOQ digunakan rumus :

LOQ = 3,3

Keterangan :

LOQ = batas kuantitasi

k = 3,3

Sa = standar deviasi dari intersep kurva baku

b = slope

e. Perhitungan kadar alopurinol dalam jamu

Untuk kadar alopurinol dalam sampel, analisis dilakukan dengan cara

memplotkan absorbansi alopurinol dalam sampel jamu ke dalam kurva baku yang

didapatkan. Kadar alopurinol dihitung menggunakan persamaan :


43

Y = Bx + A

Keterangan :

Y = AUC alopurinol dalam sampel

X = kadar alopurinol

Sehingga kadar alopurinol dalam sampel adalah x =


44

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Alopurinol memiliki gugus kromofor dan auksokrom sehingga dapat

dianalisis menggunakan metode spektrofotometri. Menurut Sari (2014), batas

kuantitasi alopurinol dengan metode spektrofotometri adalah 15.58 g/mg. Pada

sampel jamu asam urat batas kuantifikasinya 0,52 g/mg sedangkan pada sampel

tablet batas kuantifikasinya 300 g/mg. Metode spektrofotometri UV lebih tepat

digunakan untuk penetapan kadar alopurinol dalam sampel tablet obat karena nilai

LOQ yang diperoleh jauh lebih kecil dari batas yang ditentukan.

Di dalam matriks sediaan tablet mengandung eksipien berupa zat pengisi,

zat pengikat, zat penghancur (disintegran) yang beberapa tidak larut dalam pelarut

yang digunakan. Oleh karena itu dibutuhkan optimasi isolasi proses penyaringan

agar larutan yang dibuat bebas dari partikel ekspien. Berdasarkan penelitian yang

dilakukan oleh Soenarso (2014), diperoleh bahwa penyaringan dengan

menggunakan pelarut 20 mL sebanyak satu kali merupakan ekstraksi yang

optimal.

Metode spektrofotometri untuk penetapan kadar alopurinol dalam tablet

perlu dilakukan validasi untuk menjamin bahwa metode analisis memenuhi

spesifikasi yang dapat diterima.


45

A. Validasi Metode Analisis Alopurinol Dalam Tablet

Prinsip metode analisis alopurinol dalam tablet (Dirjen POM RI, 1974),

dilakukan pengembangan metode analisis dengan cara melarutkan sampel tablet

ke dalam larutan NaOH 0,1 N kemudian diukur serapan pada maks dengan

spektrofotometri UV. Validasi dilakukan menurut tata cara berikut:

1. Pembuatan dan Pembakuan Larutan NaOH 0,1 N

Pelarut yang digunakan pada metode spektrofotometri ini adalah NaOH

0,1 N karena alopurinol larut baik dalam pelarut ini (Moffat, 2011). Namun

NaOH yang akan digunakan sebagai pelarut harus dilakukan standarisasi. Tujuan

dilakukan standarisasi ini adalah karena larutan NaOH bersifat hidroskopis yang

dapat menyerap air dari lingkungannya sehingga terjadi pengenceran atau dengan

kata lain dapat mengalami perubahan konsentrasi sehingga harus distandarisasi.

Selain itu NaOH juga dapat bereaksi dengan gas CO2 dari udara.

NaOH + CO2 → Na2CO3 + H2O

NaOH distandarisasi dengan menggunakan kalium hidrogen biftalat

sebagai standar primer. Pada pembakuan NaOH dengan kalium biftalat reaksi

yang terjadi adalah

Gambar 5. Reaksi kalium biftalat dengan NaOH


46

Standarisasi NaOH ini merupakan asidimetri dimana menentukan

konsentrasi NaOH dari asam yang telah diketahui konsentrasinya terlebih dahulu.

Asidimetri ini menggunakan prinsip titrasi yang mereaksikan kalium hidrogen

biftalat sebagai asam dan NaOH sebagai basa hingga pada saat sejumlah mol ion

OH- yang ditambahkan ke larutan sama dengan jumlah mol ion H+ yang semula

ada. Dalam menentukan titik ekuivalen dalam suatu titrasi, kita harus mengetahui

dengan tepat berapa volume basa yang ditambahkan dari buret ke asam dalam

labu dengan cara menambahkan indikator asam basa. Indikator yang dipakai harus

dipilih agar titik akhir titrasi dan teoritis berhimpit atau sangat berdekatan. Untuk

itu harus dipilih indikator yang memiliki trayek perubahan warnanya di sekitar

titik akhir teoritis (Gandjar dan Rohman, 2010).

Pada penelitian ini digunakan indikator fenolftalein yang memiliki trayek

pH 8,2-10 ( Jenkins, 1967). Digunakan indikator fenolftalein karena fenolftalein

memiliki trayek perubahan warna disekitar titik akhir teoritis. Fenolftalein pada

suasana basa akan memberikan warna merah muda.

Gambar 6. Reaksi fenolftalein dengan NaOH


47

Pada penelitian ini dibutuhkan NaOH sejumlah 21,35 ml, maka normalitas

NaOH yang digunakan adalah 0,092 N (Lampiran 4).

2. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan

Penentuan panjang gelombang pengamatan bertujuan untuk mengetahui

panjang gelombang alopurinol yang memiliki serapan maksimum. Pada panjang

gelombang maksimum ini diharapkan semua kadar alopurinol dalam sampel dapat

terdeteksi dengan baik oleh detektor UV.

Pada penetapan alopurinol dalam sediaan tablet diperlukan pembacaan

serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-400 nm menggunakan

pelarut NaOH 0,1 N karena panjang gelombang maksimum alopurinol secara

teoritis berada pada rentang tersebut. Pada penelitian ini digunakan tiga level

konsentrasi yaitu 4,8 dan 12 μg/mL.

Tabel V. Panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut NaOH 0,1 N

Konsentrasi (µg/mL) Panjang gelombang pengamatan (nm)

4 257 8 257

12 257

Panjang gelombang maksimum pada konsentrasi 4,8 dan 12 µg/mL

menunjukkan dengan panjang gelombang yang sama dengan panjang gelombang

teoritis menurut Moffat (2011) yaitu pada 257 nm. Berikut spektrogram

alopurinol:


48

Gambar 7. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut NaOH 0,1 N pada (A) konsentrasi 4µg/mL, (B) konsentrasi 8 µg/mL, (C) konsentrasi 12 µg/mL

Berdasarkan Gambar 7. diatas dapat dilihat bahwa ketiga seri konsentrasi

yang berbeda dihasilkan bentuk spektra yang sama, sehingga dapat disimpulkan

bahwa spektra tersebut merupakan spektra alopurinol.

3. Pembuatan Kurva Baku Alopurinol

Pembuatan kurva baku digunakan untuk mengetahui apakah hubungan

antara respon instrumen dengan konsentrasi analit linier pada seri larutan kurva

baku. Larutan seri kurva baku alopurinol yang digunakan terdiri dari 6 seri

konsentrasi yaitu 4, 6, 8, 10, 12, dan 14 μg/mL.

Pelarut yang digunakan untuk seri larutan baku adalah NaOH 0,1 N.

Digunakan NaOH 0,1 N karena alopurinol larut dengan baik pada larutan alkalis

NaOH 0,1 N (Moffat, 2011). Persamaan regresi linier yang didapatkan


49

merupakan hubungan antara konsentrasi alopurinol vs absorbansi yang dihasilkan

dari pengukuran spektrofotometri. Hasil kurva baku alopurinol disajikan pada

Tabel VI dan Gambar 8.

Tabel VI. Kurva baku alopurinol

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 konsentrasi

baku (µg/mL)

Abs konsentrasi

baku (µg/mL)

Abs konsentrasi

baku (µg/mL)

Abs

4 0,256 4 0,253 4 0,253 6 0,356 6 0,355 6 0,367 8 0,453 8 0,460 8 0,475 10 0,563 10 0,570 10 0,587 12 0,659 12 0,686 12 0,683 14 0,755 14 0,776 14 0,798

Dari ketiga replikasi yang diperoleh kemudian data dimasukkan ke dalam

progam powerfit untuk dapat diperoleh kurva kalibrasi gabungan. Kurva kalibrasi

gabungan yang diperoleh persamaan yaitu Y = 0,052 x + 0,045 dengan nilai r

yaitu 0,998. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa respon instrumen linier

terhadap konsentrasi analit.

Gambar 8. Plot kurva baku alopurinol


50

4. Validasi Metode Analisis Pada Tablet

i. Akurasi pada tablet alopurinol

Penetapan persen recovery dilakukan menggunakan 3 seri baku dengan

masing-masing 5 kali replikasi. Nilai AUC yang diperoleh pada pengukuran

kemudian dihitung menggunakan persamaan regresi liner Y = 0,052 x + 0,045.

Akurasi yang dimaksud adalah penentuan akurasi baku alopurinol yang

dispike ke dalam matriks sampel. Digunakan 3 level massa alopurinol yaitu 4 ,6

dan 8 mg masing-masing replikasi sebanyak 5 kali. Sebagai blanko digunakan

sampel tablet alopurinol yang tidak diadisi dengan baku alopurinol. Berdasarkan

hasil perhitungan (Lampiran 8) nilai akurasi baku alopurinol (hasil adisi) dapat

dilihat pada Tabel VII berikut.

Tabel VII. Rata-rata penetapan % recovery pada tablet alopurinol

Penambahan alopurinol

(mg)

Rata-rata konsentrasi

alopurinol (mg)

Rata-rata alopurinol yang

diperoleh kembali (mg)

rata-rata % recovery (n=5)

(%)

0 23,8 - -

4 27,6 3,9 98,6

6 29,7 5,9 98,9

8 31,8 8,1 100,3

Berdasarkan data pada Tabel VII diatas menunjukkan bahwa rata-rata %

recovery pada ketiga level adisi memenuhi kriteria % perolehan kembali yang

dipersyaratkan yaitu padar rentang 98-102% (Gonzales dan Herrador, 2007).


51

ii. Presisi pada tablet alopurinol

Presisi adalah ukuran yang menyatakan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang pada suatu metode

analisis (Snyder et al., 1997). Suatu metode dapat dikatakan memiliki presisi yang

baik apabila memiliki CV < 2 % (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007).

Hasil penelitian ditunjukkan pada Tabel VIII.

Tabel VIII. Persen koefisien variasi dari metode penambahan baku

Penambahan (mg)

konsentrasi alopurinol

(n = 5) (mg)

% CV

0 23,8±0,08 0,4 4 27,6±0,15 0,5 6 29,7±0,15 0,5 8 31,8±0,18 0,6

Berdasarkan data pada Tabel VIII, dapat diketahui bahwa setiap level

massa alopurinol telah memenuhi syarat presisi yang baik dilihat dari nilai % CV

yang kurang dari 2%.

iii. LOQ pada tablet alopurinol

Limit of quantitation (LOQ) adalah konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima

pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2012).

Berdasarkan penelitian Sari (2014) dan Soenarso (2014) dalam penelitian ini,

digunakan kurva adisi yang berasal dari matriks sampel tablet 77 mg + adisi


52

alopurinol (4.6 dan 8 mg) untuk menghitung nilai LOQ. Rumus untuk menghitung

LOQ:

LOQ = 3,3 x

Nilai Sa (standar deviasi intersep) dari kurva diperoleh menggunakan

program powerfit. Perhitungan LOQ ada di lampiran 10. Pada penelitian ini

diperoleh nilai LOQ = 1,46 µg/mg bobot sampel. Aplikasi metode

spektrofotometri akan digunakan untuk penetapan alopurinol dalam jamu. Namun

menurut Sari (2014), batas kuantifikasi alopurinol yang harus dicapai dalam jamu

adalah 0,52 µg/mg. Oleh karena itu, untuk penentapan kadar alopurinol dalam

jamu tidak dapat menggunakan metode spektrofotometri karena batas kuantifikasi

pada metode spektrofotometri tidak mencapai batas yang ditentukan.

5. Penetapan Kadar Alopurinol Pada Tablet

Penetapan kadar alopurinol dalam tablet diawali dengan preparasi sampel

tablet dengan cara penentuan keseragaman bobot tablet. Keseragaman bobot ini

ditetapkan untuk menjamin keseragaman bobot tiap tablet yang dibuat. Tablet-

tablet yang bobotnya seragam diharapkan akan memiliki kandungan bahan obat

yang sama, sehingga akan mempunyai efek terapi yang sama. Keseragaman bobot

dapat dilakukan dengan cara menimbang 20 tablet satu persatu lalu dihitung

bobot rata-rata tablet alopurinol adalah 306 mg. Tidak boleh ada 2 tablet yang

bobotnya menyimpang dari bobot rata-rata yang ditetapakan pada kolom A dan

tidak boleh satu bobot tablet pun yang bobotnya menyimpanng dari bobot rata-

rata yang ditetapkan pada kolom B (Dirjen POM RI, 1995).


53

Tabel IX. Penyimpangan bobot rata-rata pada tablet

bobot rata-rata ( mg) penyimpangan bobot rata-rata A B

25 atau kurang 15% 30% 26 sampai dengan 150 10% 20% 151 sampai dengan 300 7,5% 15% Lebih dari 300 5% 10%

Pada penelitian ini bobot rata-rata yang diperoleh adalah 306 mg, maka

dikategorikan bobot tablet lebih dari 300 mg. Persayaratan untuk penyimpangan

bobot rata-rata yang harus dipenuhi adalah tidak lebih dari 2 tablet yang bobotnya

menyimpang sebesar 5% bobot rata-rata dan tidak boleh satu bobot tablet pun

yang bobotnya menyimpang sebesar 10% dari bobot rata-rata.

Tabel X. Keseragaman bobot tablet alopurinol

No Bobot tablet (mg) no Bobot tablet (mg) 1 307,9 11 307,1 2 310,1 12 303,9 3 311,4 13 305,9 4 306,4 14 310,0 5 307,5 15 302,0 6 305,6 16 302,0 7 306,0 17 302,7 8 309,2 18 304,1 9 305,6 19 303.2 10 304,4 20 304,8 Σ = 6119.8 푥̅ = 306 range 5% : 290,7-321,3 range 10% : 275,4-336,6

Pada Tabel X. diatas menunjukkan bahwa tablet alopurinol merek X

memenuhi uji keseragaman bobot karena tidak ada satu tablet pun yang bobot nya

menyimpang sebesar 5% atau 10 % dari bobot rata-rata.

Tablet yang telah diuji keseragaman bobotnya kemudian digerus dengan

menggunakan stamper dan mortir. Tujuan tablet digerus adalah untuk

menghomogenkan dan mengecilkan ukuran partikel serbuk kasar, diharapkan


54

kehomogenan dan kecilnya ukuran partikel dapat meningkatkan luas permukaan

serbuk yang dapat terbasahi dan terekstraksi oleh perlarut. Pelarut yang digunakan

adalah NaOH 0,1 N.

Analisis kuantitatif untuk mengetahui kadar alopurinol pada sediaan

tablet dilakukan dengan dengan cara perhitungan berdasarkan persamaan kurva

baku yang diperoleh dari proses validasi yakni Y = 0,052 x + 0,045. Berikut

disajikan kadar alopurinol dalam sediaan tablet serta nilai % CV.

Tabel XI. Kadar alopurinol pada tablet

Sampel Abs alopurinol

konsentrasi (µg/mL)

Berat alopurinol dalam tablet (mg)

Kadar alopurinol dalam tablet

(mg/g) Replikasi 1 0,537 9,5 95,1 310,8 Replikasi 2 0,538 9,5 95,2 311,1 Replikasi 3 0,542 9,5 96,0 313,7 Replikasi 4 0,539 9,6 95,2 311,1 Replikasi 5 0,540 9,5 95,3 311,4 rata-rata 0,539 9,5 95,4 311,6 CV 0,4 0,5 0,4 0,4

Berdasarkan Tabel XI di atas data penetapan kadar yang diperoleh rata-

rata kadar alopurinol per tablet adalah 311,6 mg/g dengan CV 0,4 %. Pada

penelitian ini menggunakan tablet alopurinol dengan dosis 100 mg/tablet.

Berdasarkan persyaratan dari Dirjen POM RI (1995), kadar alopurinol yang harus

terkandung dalam tablet dalam rentang 93-107%. Oleh karena itu tablet

alopurinol yang dianalisis telah memenuhi persyaratan yang ditentukan.

Menurut Gonzales and Herrador (2007) CV yang baik < 2 %, maka CV

yang diperoleh pada penelitian ini telah memenuhi syarat yang ditentukan.


55

B. Validasi metode Analisis Alopurinol Secara Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi fase Terbalik

Pada penelitian ini juga dilakukan penetapan kadar alopurinol dalam

jamu. Menurut Sari (2014), batas kuantifikasi alopurinol dalam jamu yang harus

dicapai yang diturunkan dari NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) adalah

0,52 µg/mg sehingga metode spektrofotometri tidak dapat digunakan untuk

penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Oleh karena itu untuk penetapan kadar

alopurinol dalam jamu digunakan metode KCKT.

Metode KCKT untuk penetapan kadar alopurinol dalam jamu perlu

dilakukan validasi untuk menjamin bahwa metode analisis memenuhi spefikasi

yang dapat diterima. Proses validasi metode analisis dilakukan menurut tata cara

berikut :

1. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan

Penentuan panjang gelombang pengamatan bertujuan untuk mengetahui

panjang gelombang alopurinol yang memiliki serapan maksimum. Analisis suatu

senyawa menggunakan KCKT memerlukan panjang gelombang maksimum

dimana suatu senyawa memberikan serapan maksimum untuk dapat terbaca pada

detektor UV pada alat KCKT. Pada panjang gelombang maksimum ini diharapkan

semua kadar alopurinol dalam sampel dapat terdeteksi dengan baik oleh detektor

UV.

Pada penetapan alopurinol dalam jamu asam urat diperlukan pembacaan

serapan dilakukan pada rentang panjang gelombang 200-400 nm dengan


56

menggunakan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol. Penggunaan

pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol ini karena pelarut ini dapat

melarutkan dengan baik alopurinol dan pelarut ini digunakan dalam proses elusi

pada clean up menggunakan solid phase extraction (Waters, 2008).

Pada penelitian ini digunakan lima level konsentrasi. Konsentrasi yang

digunakan adalah 5; 7,5; 10; 12,5 dan 15 μg/mL.

Tabel XII. Panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol

Konsentrasi

(g/mL) maks terukur Rata-rata maks terukur

5,0 272,9

273,7 ≈ 274 nm 7,5 273,9

10,0 273,7 12,5 274,0 15,0 273,8

Pada Tabel XII di atas menunjukkan bahwa 휆 maks terukur rata-rata

yang diperoleh adalah 274 nm, digunakan sebagai panjang gelombang

maksimum. Berikut spektrogram alopurinol :


57

Gambar 9. Bentuk spektra panjang gelombang maksimum alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol pada (A) konsentrasi 5 µg/mL, (B) konsentrasi 10

µg/mL, (C) konsentrasi 15 µg/mL

Berdasarkan Gambar 9. diatas dapat dilihat bahwa ketiga seri konsentrasi

yang berbeda dihasilkan bentuk spektra yang sama, sehingga dapat disimpulkan

bahwa spektra tersebut merupakan spektra alopurinol.

2. Pembuatan Fase Gerak

Pemilihan fase gerak yang akan digunakan sangat penting karena akan

mempengaruhi waktu retensi dan pemisahan komponen-komponen dalam sampel

yang akan dianalisis. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sari (2014)

komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum adalah

metanol:akuabides/amonium hidroksida 0.1% adalah 10:90 dengan flow rate 0,5

mL/ menit.

Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol p.a. dan akuabides

yang ditambahkan dengan amonium hidroksida 0,1%. Metanol digunakan karena

memiliki viskositas yang rendah yaitu 0,55 cp sehingga dapat menurunkan

tekanan pada kolom (Gandjar dan Rohman, 2010).


58

Penambahan amonium hidroksida 0.1 % dalam fase gerak berfungsi untuk

menutup residu silanol dalam kolom C18. Senyawa yang dianalisis yaitu

alopurinol bersifat basa sehingga dapat berikatan dengan residu silanol yang

bersifat asam sehingga peak yang dihasilkan dapat mengalami tailing. Dengan

demikian, amonium hidroksida dapat menurunkan tailing factor yang dialami oleh

senyawa-senyawa yang bersifat basa (Snyder, 2010). Berikut gambar Interaksi

amonium hidroksida dengan residu silanol dalam kolom C18.

Gambar 10. Interaksi amonium hidroksida dengan residu silanol dalam kolom C18

Sebelum digunakan, masing-masing komponen fase gerak harus disaring

menggunakan kertas whatman untuk menghilangkan adanya partikel. Selanjutnya

fase gerak di degassing dengan menggunakan ultrasonikator selama 15 menit

yang bertujuan untuk menghilangan gelembung udara pada fase gerak. Adanya

gelembung udara dapat mengakibatkan tekanan pompa tidak stabil sehingga

mempengaruhi pembacaan sinyal dalam instrumen KCKT.

3. Kurva Baku Alopurinol

Pembuatan kurva baku digunakan untuk mengetahui apakah hubungan

antara respon instrumen. Pada penelitian ini dilakukan 2 kali pembuatan kurva

baku yaitu pada periode I (Desember 2013) dan periode II (Februari 2014). Pada


59

periode I dibuat untuk perhitungan kadar alopurinol di dalam sampel sedangkan

kurva baku periode II untuk perhitungan LOD. Kurva baku periode I dan II

disajikan pada tabel XIII dan XV.

Tabel XIII. Kurva baku alopurinol periode I

Replikasi Massa

alopurinol (ng)

AUC Persamaan Persamaan kumulatif

1

101 247249

F(x) = -471920.3 + 6859.7 x r= 0.999

F(x) = -477792.8 + 6876.6 x r = 0.999

201 818744 302 1654925 402 2309629 503 2986392 603 3639311

2

101 245974

F(x) = -480792.2 + 6886.3 x r = 0.999

201 813919 302 1651463 402 2307736 503 2986772 603 3653295

3

101 245746

F(x) = -480665.7 + 6883.9 x r = 0.999

201 815105 302 1650687 402 2306361 503 2981560 603 3655325

Pada Tabel XIII diperoleh persamaan kumulatif dengan koefisien

korelasi (r) sebesar 0,999. Batasan yang digunakan untuk nilai koefisien korelasi

ini menggunakan Pearson’s correlation coefficient test, dimana dapat dijelaskan

bahwa koefisien korelasi memiliki hubungan terhadap banyaknya jumlah

determinasi (n) yang dilakukan. Hubungan tersebut dapat dilihat pada tabel

berikut.


60

Tabel XIV. Hubungan r dengan n (Cook et al., 2000)

Apabila nilai r dari suatu regresi linear lebih besar daripada nilai r pada

tabel tersebut menunjukkan hubungan linearitas pada kurva baku secara statistik

terpenuhi. Pada Tabel XIII diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,999

dengan n = 6 ( tiga replikasi) , maka dapat dikatakan linear secara statistik karena

r > 0,811. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa respon istrumen linier

terhadap konsentrasi analit.

Tabel XV. Kurva baku alopurinol periode II

Replikasi Massa

Alopurinol (ng)


1

1 18307 y= 12280.5 + 5346.5 x r = 0.992

y = 11013 + 5686.2 x r = 0,993

2 22397 3 27433 4 34450

2

1 16573 y = 10111.5 + 5923.7 x r = 0.995

2 21598 3 26991 4 34521

3

1 16871 y = 10647 + 5788.3 x r = 0.997

2 21857 3 27438 4 34305


61

Pada Tabel XV diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,993 dengan

n = 4 ( tiga replikasi) , maka dapat dikatakan linear secara statistik karena r >

0,95. Dengan demikian dapat dikatakan bahwa respon istrumen linier terhadap

konsentrasi analit.

4. Kurva Adisi Alopurinol Dalam Matriks Jamu

Komposisi matriks jamu asam urat sangat kompleks, oleh karena itu

perlu diketahui pengaruh matriks sampel pada determinasi alopurinol dengan

menggunakan KCKT. Apabila matriks sampel jamu asam urat memberikan

pengaruh yang signifikan maka perlu dipertimbangkan penggunaan kurva adisi

alopurinol dalam matriks jamu.

Seri larutan kurva baku alopurinol dalam matriks jamu asam urat dibuat

dengan menambahkan baku alopurinol ke dalam sampel blanko matriks jamu

asam urat yang telah melalui tahap ekstraksi dan clean up hingga diperoleh

sejumlah massa alopurinol (10,2; 54,1 dan 81,9 ng) yang diinjeksikan kedalam

sistem KCKT. Hasil disajikan dalam tabel berikut :


62

Tabel XVI. Kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu

Rep

Massa alopurinol

yang ditambahkan

(ng)

Massa alopurinol

yang diinjeksikan

(ng)


1 51 10,2 161281 Y=-466882,3+

43535,2 x r = 0,967

y=-470009,5 + 43683,7 x

r = 0,967

103 54,1 1413539 156 81,9 3389374

2 51 10,2 160994 Y=-469763,3+

43705,7x r = 0,967

103 54,1 1417681 156 81,9 3401810

3 51 10,2 160904 Y=-478220,1+

44085,7x r = 0,966

103 54,1 1418200 156 81,9 3431567

4 51 10,2 160153 Y=-468067,2+

43576,7x r = 0.967

103 54,1 1415550 156 81,9 3391014

5 51 10,2 158998 Y=-467114,8+

43514,9 r = 0,968

103 54,1 1416969 156 81,9 3384573

Berdasarkan Tabel XVI diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,967

dengan n = 3 ( lima replikasi) dapat dikatakan tidak linear secara statistik karena

nilai r < r tabel XIV (0,997). Dengan demikian dapat dikatakan bahwa respon

instrumen belum linier terhadap konsentrasi analit dalam matriks jamu.

5. Pengaruh Matriks Jamu Dalam Penetapan Kadar Alopurinol Tujuan melihat pengaruh matriks adalah untuk melihat matriks jamu

memberikan pengaruh dalam penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Pengaruh

matriks dapat diketahui dari slope kurva baku alopurinol dan kurva baku adisi

alopurinol dalam matriks jamu dilakukan uji signifikansi slope. Uji signifikansi

perbedaan slope kurva baku alopurinol periode I dan II terhadap kurva adisi

alopurinol dalam matriks jamu ditampilkan pada Tabel XVII dan XVIII.


63

Tabel XVII. Hasil uji t slope kurva baku alopurinol dalam pelarut periode I dan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu

Slope t hitung P t tabel Kesimpulan Kurva baku

periode I 6876,6 3,22 0,05 2,048 berbeda signifikan Kurva adisi 43683,7

Tabel XVIII. Hasil uji t slope kurva baku alopurinol dalam pelarut periode II dan kurva adisi alopurinol dalam matriks jamu

Slope t hitung P t tabel Kesimpulan Kurva baku 5686.2

2,89 0,05 2,059 berbeda signifikan Kurva baku

adisi 43683,7

Berdasarkan Tabel XVII dan Tabel XVIII. diatas menunjukkan bahwa

slope kurva baku alopurinol dalam pelarut baik periode II dan II terhadap kurva

adisi alopurinol dalam matriks jamu berbeda signifikan secara statistik, hal ini

ditunjukkan dengan t hitung > t tabel. Berikut gambar perbandingan kurva baku dan

kurva adisi.

Gambar 11. Perbandingan kurva baku dan kurva adisi

0500000

1000000150000020000002500000300000035000004000000

0 200 400 600 800

AUC

massa alopurinol (ng)

Perbandingan kurva baku dan kurva adisi

kurva adisi

kurva baku periode I

kurva baku periode II


64

Perbedaan slope yang signifikan pada kedua kurva baku disebabkan

adanya pengaruh matriks jamu pada penetapan kadar alopurinol dalam jamu. Oleh

karena itu digunakan kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu untuk

penetapan kadar alopurinol dalam sampel.

6. Validasi Metode Analisis Dalam Jamu

Validasi metode analisis dilakukan untuk membuktikan bahwa metode

KCKT yang digunakan pada penelitian ini memiliki validitas yang baik atau tidak

dalam penetapan kadar alopurinol dengan kondisi percobaaan sesuai hasil

optimasi.

i. Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji yang

proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang diberikan (Gandjar dan

Rohman, 2012). Pada penelitian ini diperoleh persamaan kurva adisi alopurinol

dalam matriks jamu adalah y= -470009,5 + 43683,7 x dengan linearitas r = 0,967.

Linieritas dinyatakan sebagai koefisien korelasi. Batasan yang digunakan

untuk nilai koefisien korelasi ini menggunakan Pearson’s correlation coefficient

test, dimana dapat dijelaskan bahwa koefisien korelasi memiliki hubungan

terhadap banyaknya jumlah determinasi (n) yang dilakukan. Hubungan tersebut

dapat dilihat pada tabel XIV di atas.

Apabila nilai r dari suatu regresi linear lebih besar daripada nilai r pada

tabel menunjukkan hubungan linieritas pada kurva baku secara statistik terpenuhi.

Persamaan kurva baku adisi alopurinol dalam matriks jamu memiliki (r) sebesar


65

0,967 dengan n = 3 (lima replikasi) maka dapat dikatakan belum linier secara

statistik karena r > 0,997

ii. Akurasi

Konsentrasi sampel setelah adisi diluar rentang linearitas kurva baku

periode I dan II serta pengaruh matriks yang sangat besar (Gambar 11), oleh sebab

itu tidak dapat ditentukan akurasi .

iii. Presisi

Presisi adalah ukuran yang menyatakan derajat kesesuaian antara hasil uji

individual yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang pada suatu metode

analisis (Snyder et al., 1997). Presisi ditunjukkan dengan nilai koefisien variasi

(CV). Suatu metode dapat dikatakan memiliki presisi yang baik apabila memiliki

CV < 2 % (AOAC dalam Gonzales and Herrador, 2007). Hasil penelitian

ditunjukkan pada Tabel XIX.

Tabel XIX. Persen koefisien variasi dari metode penambahan baku

Massa alopurinol yang ditambahkan (n = 5)

(ng)

Rata-rata ditemukan (n=5) (ng)

SD % CV

10,2 3,4 0,02 0,6 54,1 32,2 0,4 0,1 81,9 77,6 0,43 0,6

Berdasarkan data pada Tabel XIX, dapat diketahui bahwa setiap level

massa alopurinol telah memenuhi syarat presisi yang baik dilihat dari nilai % CV

yang kurang dari 2%.


66

iv. LOQ

Limit of quantitation (LOQ) adalah konsentrasi analit terendah dalam

sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima

pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2012).

Parameter akurasi tidak dapat ditentukan oleh karena itu nilai LOQ juga tidak

dapat diperoleh.

7. Penetapan Kadar Alopurinol dalam Jamu

Meskipun metode analisis tidak valid penulis mencoba melakukan

penetapan kadar terhadap 3 sampel jamu yang beredar di pasaran dengan

menggunakan kurva adisi y= -470009,5 + 43683,7 x.

Tabel XX. Kadar alopurinol dalam sampel jamu

Sampel rata-rata kadar alopurinol (ng

/g)

A rep 1

Tidak terdeteksi rep 2 rep 3

B rep 1

46,39 rep 2 rep 3

C rep 1

83,72 rep 2 rep 3

Hasil penetapan kadar di atas tidak dapat digunakan karena validitas

metode analisis yang tidak dapat dipertanggung jawabkan.


67

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Hasil metode spektrofotometri pada penetapan kadar alopurinol dalam

sediaan tablet dengan melihat parameter akurasi yang dinyatakan dengan nilai

recovery sebesar 98,6 -100,3 %; presisi dinyatakan dengan nilai % CV

sebesar 0.4-0.6%; LOQ dengan nilai 1,46 µg/mg sampel. Kadar rata-rata

alopurinol yang terdapat dalam sediaan tablet adalah 311,6 mg/g.

2. Hasil validasi metode standar adisi alopurinol dalam matriks jamu pada

KCKT fase terbalik tidak valid.

B. Saran

1. Pada metode spektrofotometri perlu dilakukan untuk penetapan kadar sampel

alopurinol pada merek tablet yang berbeda.

2. Pada metode KCKT fase terbalik perlu dilakukan perbaikan terhadap

pembuatan kurva baku adisi


68

Daftar pustaka

Chan, C.C.,Lee,Y.C., Lam, H., and Zhang, X.M., 2004, Analytical method validation and instrument performance verification, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, pp. 17,18.

Cook, et al., 2000, Pearson’s Product Moment Correlation Coefficient, http://media3.bmth.ac.uk/spss/focus_pages/focus_10a.htm, diakses tanggal 16 Agustus 2014

Direktorat Pengawas Obat dan Makanan RI,1974, Farmakope Indonesia, edisi 3,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 26-30.

Direktorat Pengawas Obat dan Makanan RI,1995, Farmakope Indonesia, edisi 4, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 73-75.

Gandjar, I.G. dan Rohman,A., 2010, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp.378-400.

Gandjar, I.G., dan Rohman,A., 2012, Analisis Obat Secara Spektrofotometri dan Kromatografi, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, pp.417-428.

Gennaro, A.R., (Ed.), Remington The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Lipincott William and Wilkins, Philadelphia, pp. 1462-1464.

Glaxosmithkline, 2013, Safety Data Sheet of Allopurinol, www.msds-gsk.com/GetSdsFile.ashx?fileId=2421, diakses tanggal 1 April 2014

Gonzales, A.G. and Herrador, M.A., 2007, A practical guide to analytical method validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles, Trends in Anal. Chem., 26, pp. 232-234.

Harmita, 2006, Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi, Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia, Depok, pp. 157-165.

Harvey, D., 2000, Modern Analytical Chemistry, McGraw Hill, New York, pp. 578-586.

Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan, PT Remaja Rosdakarya, Bandung, pp. 67-112.

Horwitz, W., Latimer, G.W., (Eds), 2005, Official Method of Analysis, AOAC International, USA, pp. 254-250.

Iskandar, J.,2006. Rematik dan Asam Urat. Bhuana Ilmu Komputer. Jakarta, pp.

34-38.


69

Jeffrey, R., 1996, Analytical Detection Limit Guidance & Laboratory Guide for Determining Method Detection Limit, Laboratory Certification Program, Department of Natural Resources, Wisconsin.

Jenkins,G.L., 1967, Quantitative Chemical Analysis, Second Edition, W.H. Freeman and Company, New York

Johnstone, A., 2005, Gout The disease and Non Drug Treatment, Hospital Pharmacist, 12, pp. 391-394

Kantasubrata,J., 2004, Kiat Memahami HPLC, Puslitkimia, LIPI, pp. 12-24.

Kepmenkes RI no 661/MENKES/SK/VII/1994, Tentang Persyaratan Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI,Jakarta

Khayoon,W.S, Abaichy,M.Q., Jasim, M., and Hamadany, M.A., 2008, Spectrophotometric Determination of Allopurinol in Tablet Formulation, Journal of Phisical Science, 19(2), 23-30.

Levin, S., 2002, Quantitative Work in HPLC, http://forumsci.co.il/HPLC, diakses tanggal 31 Desember 2013.

Long, William dan Henderson, 2007, Chromatography of Nitrogen Containing Compounds Without Triethylamine, Agilent Technology.

Machata, S.G., 2005, Comparison of the Octanol/Water Partition Coefficients Calculated by ClogP®, ACDlogP and KowWin® to Experimentally Determined Values, International Journal of Pharmaceutics, 294, pp. 185-192.

Mayasari, 2009, Analisis Kandungan Metampiron Pada Jamu Tradisional Yang Beredar Di Kota Medan Tahun 2009, Skripsi, Fakultas Kesehatan Masyarakat, Universitas Sumatra Utara, Sumatra Utara

Mandell and Brian, F., 2008, Clinical manifestation of hyperuricemia and gout, Clinic Journal of Medicine, 15(3), 256-260.

Medsafe, 2011, Allopurinol, http://www.medsafe.govt.nz/profs/datasheet/a/apoallopurinoltab.pdf, diakses tanggal 1 April 2014

Moffat, C., Osselton, M.D., Widdop, B., 2011, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons, 4th edition, Pharmaceutical Press, London, UK, pp. 125-150.

Mulja, M., Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, pp. 26-27, 33-34.

Munson, J.W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan oleh Harjana, Parwa B., Volume II, Airlangga University Press, Surabaya, pp. 12-18.


70

Mursyidi, A., Volumetri dan Gravimetri, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta, pp. 88,89,108.

Permata, D., 2012, Optimasi Metode Identifikasi Antalgin Dan Klorfeniramin Maleat Secara KCKT Photodiode Array Setelah Pemisahan Dengan Solid Phase Extraction Pada Sediaan Obat Tradisional, Skripsi, Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Program Ekstensi Departemen Farmasi, Universitas Indonesia, Depok

Pengawas Obat dan Makanan (POM), 2004, Tentang Ketentuan Pokok Pengelompokan dan Penandaan Obat Bahan Alam Indonesia, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Pengawas Obat dan Makanan (POM), 2005, Kriteria dan Tata Laksana Pendaftaran Obat Tradisional, Obat Herbal Terstandar dan Fitofarmaka, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Permenkes RI. No. 246/Menkes/Per/V/1990, Tentang Izin Usaha Industri Obat Tradisional dan Pendaftaran Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.

Permenkes RI. No. 007 tahun 2012, Tentang Registrasi Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RI, Jakarta

Reinders et al, 2007, A simple method for quantification of allopurinol and oxypurinol in human by high performance liquid chromatography with uv detection, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45(2), pp. 312-317.

Sari, M.K., 2014, Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Alopurinol Dalam Matriks Tablet Obat Secara Spektrofotometri UVdan Matriks Sampel Jamu Asam Urat Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Satiadarma, K., 2004, Azas Pengembangan Prosedur Analisis, Edisi pertama, Airlangga University Press, Surabaya, pp. 378-388

Sastrohamidjojo, H., 1991, Kromatografi, Liberty, Yogyakarta, pp. 99-105.

Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J., 1998, Analytical Chemistry, Sixth edition, Saunders College Publishing, USA, pp. 383-385.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 25-28.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Dolan, J.W., 2010, Introduction of Modern Liquid Chromatography, 3 rd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 25, 28, 33, 40-42, 51-52, 71, 109, 152, 316, 327.


71

Soenarso, S.A., Optimasi Isolasi Alopurinol Dalam Sediaan Tablet Dan Jamu, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Sweetman,L., 1969, Quantitation of Oxypurines and Allopurinol Metabolites in Biological Fluid by Cation Exchange Chromatography, Analytical Biochemistry,31, pp. 358-365.

United States Pharmacopeial Convention, 2009, The United States Phamacopeia 32-National Formulary, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, pp. 733

Waters, 2008, Oasis Sample Preparation, Water Corporation, USA, pp.7

Watson, D.G., 2003, Pharmaceutical Analysis: A Textbook for Pharmacy Students and Pharmaceutical Chemist, Churchill Livingstone, USA, p. 79

Wells, B.G., 2009, Pharmacotherapy Handbook, 7th edition, McGraw Hill Inc., New York, pp. 345-347, 457-460.

Yee, S.K., 2003, Regulatory Control Of Chinese Propretary Medicines in Singapore, J.Healthy Policy,15(2) 71, 133-149.


72

LAMPIRAN


73

Lampiran 1. Sertifikat analisis baku alopurinol


74

Lampiran 2. Sertifikat analisis SPE MCX


75

LAMPIRAN 3. Perhitungan indeks polaritas NaOH 0,1 N dan amonium

hidroksida 5% dalam metanol

Diketahui data berikut :

Pelarut / Solvent Polarity Index

Metanol 5,1

Air 10,2

Perhitungan indeks polaritas NaOH 0,1N

= 1 x 10,2 = 10,2

Perhitungan indeks polaritas amonium hidroksida 5% dalam metanol

= 푥 10,2 + 푥 5,1

= 0,5 + 4,8

= 5,3


76

Lampiran 4. Perhitungan Pembakuan NaOH

Penimbangan kalium biftalat dan NaOH

Penimbangan Kalium biftalat (g)

NaOH

(g)

Berat wadah 0,4374 63,4134

Berat wadah + zat 0,8375 67,3383

Berat wadah + sisa 0,4377 63,4134

Berat zat 0,3998 3,9248

Diketahui : bobot kalium biftalat : 0,3998 g = 399,8 mg

BM kalium biftalat : 204,2

Valensi kalium biftalat : 1

Volume NaOH : 21,35 mL

Rumus : N NaOH =

= , , ,

= 0,0917 N

Warna larutan setelah terjadi titik akhir titrasi


77

Lampiran 5. Spektrogram pada penetapan panjang gelombang maksimum dengan pelarut NaOH 0,1 N

a. Kosentrasi 4 μg/mL

b. Konsentrasi 8 μg/mL


78

c. Konsentrasi 12 μg/mL


79

Lampiran 6. Pembuatan kurva baku pada metode spektrofotometri

Penimbangan baku alopurinol

penimbangan replikasi I (g) replikasi II (g) replikasi III (g)

berat kertas 0,2560 0,2455 0,2545

berat kertas + zat

0,3064 0,2961 0,3050

berat kertas + sisa

0,2564 0,2461 0,2550

berat zat 0,0500 0,0500 0,0500

konsentrasi larutan induk

50 푚푔 푥 100,51 %50 푚푙

= 1005,1 μg/mL

50 푚푔 푥 100,51 %50 푚푙

= 1005,1 μg/mL

50 푚푔 푥 100,51 %50 푚푙

= 1005,1 μg/mL

Tingkat kemurnian alopurinol = 100,51 (berdasarkan CoA pada lampiran 1)

Jumlah allopurinol = 50 mg x 100,51% = 5025,5 mg

C stok = 5025,5 mg/ 50 mL

= 1,0051 mg/mL

= 1005,1 μg/mL

C1V1 = C2V2

C baku intermediet 1 →1005,1 x 1 mL = C2 x 10 mL

C2 = 100,51 μg/mL

C baku intermediet 2 →100,51 x 10 mL = C2 x 50 mL

C2 = 20,102 μg/mL

Seri 1→ 20,102 μg/mL x 2 mL = C2 x 10 mL


80

C2 = 4,0204 μg/mL

NB : perhitungan seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan

menyesuaikan volume larutan baku intermediet 2 yang diambil.


81

Lampiran 7. Data kadar alopurinol dalam tablet dan contoh perhitungan

sampel Abs alopurinol

konsentrasi (µg/mL)

berat sampel (mg)

Berat alopurinol

dalam sampel(mg)

Berat alopurinol dalam tablet (mg)

Replikasi 1 0,537 9,5 76.1 23,7 95,1

Replikasi 2 0,538 9,5 76,2 23,7 95,2

Replikasi 3 0,542 9,6 76,2 23,9 96,0

Replikasi 4 0,539 9,5 76,3 23,8 95,2

Replikasi 5 0,540 9,5 76,4 23,8 95,3

rata-rata 0,539 9,5 76,3 23,8 95,4 CV 0,4 0,4 0,1 0,3 0,4

Contoh perhitungan kadar alopurinol dalam sediaan tablet

Absorbansi alopurinol dalam sediaan tablet replikasi 1 = 0,537, kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva baku

Y = 0,052 x + 0,045

0,537 = 0,052 x + 0,045

0,052 x = 0,492

x = 9,5 μg/mL


82

bobot alopurinol dalam sampel : konsentrasi x faktor pengenceran

: 9,5 μg/mL x 10 mL x

x

: 23653,9 μg = 23,7 mg

Bobot alopurinol dalam sediaan tablet:

= bobot alopurinol dalam sampel x

= 23,7 mg x , ,

= 95,1 mg


83

Lampiran 8. Akurasi alopurinol pada tablet

adisi bobot

sampel (g)

alopurinol yang

ditambahkan (µg)

absorbansi konsentrasi alopurinol (µg/mL)

bobot alopurinol

(µg)

% recovery

rata-rata

0

0,0761 0,537 9,5 23653,8

- -

0,0762 0,538 9,5 23701,9 0,0762 0,542 9,6 23894,2 0,0763 0,539 9,5 23750,0 0,0764 0,54 9,5 23798,1 Rata-rata bobot alopurinol dalam sampel 23759,6

4

0,0765 3900 0,618 11,0 27548,1 97,1

97,8

0,0764 3800 0,617 11,0 27500,0 97,4 0,0765 4100 0,624 11,1 27836,5 98,5 0,0764 3900 0,62 11,1 27644,2 98,6 0,0764 4100 0,623 11,1 27788,5 97,3

6

0,0763 5800 0,658 11,8 29471,2 97,8

98,3

0,0764 6000 0,662 11,9 29663,5 97,8 0,0765 6100 0,666 11,9 29855,8 99,3 0,0765 5900 0,661 11,8 29615,4 98,6 0,0764 5900 0,66 11,8 29567,3 97,8

8

0,0765 7900 0,704 12,7 31682,7 99,8

99,8

0,0764 8000 0,706 12,7 31778,8 99,8 0,0765 8100 0,71 12,8 31971,2 100,9 0,0764 8100 0,711 12,8 32019,2 101,5 0,0765 7900 0,703 12,7 31634,6 99,2


84

Contoh perhitungan recovery baku alopurinol 4 mg replikasi I

Persamaan kurva baku alopurinol : Y = 0,052 x + 0,045

X = kadar terukur, Y = absorbansi

Absorbansi adisi baku alopurinol replikasi I : 0,618

Y = 0,052 x + 0,045

0,618 = 0,052 x + 0,045

0,052 x = 0,573

x = 11, 0 μg/mL

bobot adisi alopurinol 4 mg : konsentrasi x faktor pengenceran

: 11,0 μg/mL x 10 mL x

x

: 27548,1μg

% recovery :

x 100 %

: , , x 100 %

: 97, 1 %


85

Lampiran 9. Penimbangan bahan untuk akurasi pada tablet

a. Penimbangan sampel tanpa adisi

Penimbangan Replikasi I (g)

Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

Replikasi IV (g)

Replikasi V (g)

berat kertas 0,2457 0,2560 0,2446 0,2580 0,2449 berat kertas +zat 0,3222 0,3326 0,3212 0,3346 0,3214 berat kertas + sisa 0,2461 0,2564 0,2450 0,2583 0,2450 berat zat 0,0761 0,0762 0,0762 0,0763 0,0764

b. Penimbangan sampel dengan adisi 4 mg alopurinol


Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

Replikasi IV (g)

Replikasi V (g)

berat kertas 0,2487 0,2512 0,2412 0,2438 0,2514 berat kertas +zat 0,3253 0,3278 0,3178 0,3204 0,3280 berat kertas + sisa 0,2488 0,2514 0,2413 0.2440 0,2516 berat zat 0,0765 0,0764 0,0765 0,0764 0,0764


86

c. Penimbangan sampel dengan adisi 6 mg alopurinol


Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

Replikasi IV (g)

Replikasi V (g)

berat kertas 0,2501 0,2506 0,2458 0,2456 0,2411 berat kertas +zat 0,3267 0,3272 0,3224 0,3222 0.3177 berat kertas + sisa 0,2504 0,2508 0,2459 0,2457 0,2413 berat zat 0,0763 0,0764 0,0765 0,0765 0,0764

d. Penimbangan sampel dengan adisi 8 mg alopurinol


Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

Replikasi IV (g)

Replikasi V (g)



87

Penimbangan baku alopurinol yang ditambahkan ke dalam sampel

a. Penambahan alopurinol 4 mg


Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

Replikasi IV (g)

Replikasi V (g)


b. Penambahan alopurinol 6 mg


Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

Replikasi IV (g)

Replikasi V (g)



88

c. Penambahan alopurinol 8 mg


Replikasi II (g)

Replikasi III (g)

Replikasi IV (g)

Replikasi V (g)



89

Lampiran 10. Perhitungan LOQ untuk metode spektrofotometri

addisi (mg)

Abs

Replikasi

I

Replikasi

II

Replikasi

III

Replikasi

IV

Replikasi

V

4 0,618 0,617 0,624 0,62 0,623

6 0,658 0,658 0,658 0,658 0,658

8 0,704 0,706 0,71 0,711 0,703

LOQ = 3,3

= 3,3 ., .

=0,45 µg/mL

LOQ = ,/( )

=1,46 µg/mg


90

LAMPIRAN 11. Spektogram scaning panjang gelombang maksimum

alopurinol dengan pelarut amonium hidroksida 5% dalam metanol

a. Alopurinol 5,0 μg/mL

b. Alopurinol 7,5 μg/mL


91

c. Alopurinol 10 μg/mL

d. Alopurinol 12,5 μg/mL

e. Alopurinol 15 μg/mL


92

Lampiran 12. Kromatogram kurva baku alopurinol periode II

1. Replikasi I a. Seri 1 (alopurinol 0,1μg/mL)

b. Seri 2 (alopurinol 0,2μg/mL)


93

c. Seri 3 (alopurinol 0,3μg/mL)

d. Seri 4 (alopurinol 0,4μg/mL)


94

2. Replikasi II a. Seri 1 (alopurinol 0,1 μg/mL)



95




96

3. Replikasi III a. Seri 1 (alopurinol 0,1 μg/mL)



97




98

Lampiran 13. Penimbangan baku dan contoh perhitungan kadar baku pada metode KCKT

a. Penimbangan baku

Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g)

Berat kertas 0,3056 0,3025 0,3047

Berat kertas + zat 0,3308 0,3277 0,3299

Berat kertas + sisa 0,3058 0,3027 0,3049

Berat zat 0,0250 0,0250 0,0250

b. DATA AUC

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3 massa

baku (ng) AUC massa baku (ng) AUC massa

baku (ng) AUC

1,0051 18307 1,0051 16573 1,0051 16871 2,0102 22397 2,0102 21598 2,0102 21857 3,0153 27433 3,0153 26991 3,0153 27438 4,0204 34450 4,0204 34521 4,0204 34305

c. Contoh perhitungan kadar Replikasi I

Tingkat kemurnian allopurinol = 100,51 (berdasarkan CoA pada lampiran 1)

Jumlah allopurinol = 25 mg x 100,51% = 25,1275 mg

C stok = 25,1275 mg/25 mL

= 1005,1 mg/1000 mL

= 1005,1 μg/mL

C1V1 = C2V2

C baku intermediet →1005,1 x 0,1 mL = C2 x 10 mL


99

C2 = 10,051 μg/mL

Seri 1→10,051 μg/mL x 0,1 mL = C2 x 10 mL

C2 = 0,10051 μg/mL = 0,10051 ng/μL

Setiap penginjekan ke sistem KCKT menggunakan volume 10 μl

Maka massa alopurinol yang masuk ke dalam sistem KCKT :

0,10051 ng/μL x 10 μl = 1,0051 ng = 1 ng

NB : perhitungan seri baku lainnya dilakukan dengan cara yang sama dengan

menyesuaikan volume larutan baku intermediet yang diambil.


100

Lampiran 14. Contoh perhitungan Uji T untuk slope kurva baku adisi dalam matriks dan kurva baku dalam pelarut periode I t hitung =

untuk mencari nilai s digunakan rumus : 푠 =( ) ( )( )

= ( )43683,7 ( )6876,6

( )

s = 31269.4

t hitung = 43683,7 .

.

= 3.22

t tabel= 2,048

karena nilai t hitung (2,89) lebih besar daripada t tabel (2,048) pada tingkat kepercayaan 95% dengan harga degree of freedom 28, maka nilai slope antara kurva baku adisi dalam matriks dan kurva baku dalam pelarut berbeda signifikan.


101

Lampiran 15. Kromatogramkurva baku adisi alopurinol dalam matriks

jamu

1.Replikasi I

a. Blanko sampel (tanpa adisi baku alopurinol)

b. Kadar rendah (sampel dispike dengan alopurinol 51μg)


102

c. Kadar sedang (sampel dispike dengan alopurinol 103μg)

d. Kadar tinggi (sampel dispike dengan alopurinol 156μg)


103

2. Replikasi II


b. Kadar rendah (sampel dispike dengan alopurinol 51μg)


104

c. kadar sedang (sampel dispike dengan alopurinol 103 μg)

d. Kadar tinggi (sampel dispike dengan alopurinol 156 μg)


105

3.Replikasi III


b. Kadar rendah (sampel dispike dengan alopurinol 51 μg)


106

c. Kadar sedang (sampel dispike dengan allopurinol 103μg)

d. Kadar tinggi (sampel dispike dengan allopurinol156 μg)


107

4. Replikasi IV


b. Kadar rendah (sampel dispike dengan allopurinol 51 μg)


108

c. Kadar sedang (sampel dispike dengan alopurinol 103 μg)



109

5. Replikasi V


b. Kadar rendah (sampel dispike dengan alopurinol 51 μg)


110

c. Kadar sedang (sampel dispike dengan alopurinol 103 μg)



111

Lampiran 16. Data penimbangan sampel

a. Penimbangan baku

Penimbangan Replikasi I (g) Replikasi II (g) Replikasi III (g) Replikasi IV (g) Replikasi V (g)

Berat kertas 0,2125 0,2147 0,2136 0,2786 0,2546

Berat kertas + zat 0,2375 0,2397 0,2386 0,3036 0,2796

Berat kertas + sisa 0,2125 0,2147 0,2136 0,2786 0,2546

Berat zat 0,0250 0,0250 0,0250 0,0250 0,0250

b. Penimbangan sampel A untuk blanko


Berat kertas 0,3125 0,3028 0,2996 0,3455 0,3578

Berat kertas + zat 0,8165 0,8025 0,7997 0,8476 0,8590


Berat zat 0,5038 0,4995 0,5000 0,5019 0,5010


112

c. Penimbangan sampel A untuk adisi 51 μg


Berat kertas 0,3065 0,3055 0,2978 0,3123 0,3089

Berat kertas + zat 0,8090 0,8124 0,7973 0,8135 0,8115


Berat zat 0,5015 0,5063 0,4997 0,5010 0,5024

d. Penimbangan sampel A untuk adisi 103 μg


Berat kertas 0,3067 0,3045 0,3065 0,3012 0,3053

Berat kertas + zat 0,8093 0,8067 0,8079 0,8037 0,8063


Berat zat 0,5024 0,5020 0,5012 0,5023 0,5008


113

e. Penimbangan sampel A untuk adisi 156 μg


Berat kertas 0,3044 0,3078 0,3034 0,3066 0,3087

Berat kertas + zat 0,8061 0,8097 0,8059 0,8102 0,8118


Berat zat 0,5015 0,5017 0,5023 0,5034 0,5026


114

Lampiran 17. Kromatogram sampel A

a. Replikasi I

b. Replikasi II


115

c. Replikasi III


116

Lampiran 18. Kromatogram sampel B

a. Replikasi I

b. Replikasi II


117

c. Replikasi III


118

Lampiran 19. Kromatogram sampel C

a. Replikasi I

b. Replikasi II


119

c. Replikasi III


120

Lampiran 20. Perhitungan penetapan kadar alopurinol dalam sampel jamu

Data penimbangan sampel :

Sampel penimbangan (g)

rata-rata Replikasi I Replikasi II Replikasi III

A 0,5012 0,5044 0,5047 0,5034

B 0,5082 0,5012 0,5025 0,5039

C 0,5043 0,5034 0,5047 0,5041

AUC yang diperoleh :

Sampel AUC

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

A 17983 18710 18677

B 554547 550842 548114

C 1372118 1372292 1374533

Data AUC kemudian dikonversi menjadi bobot seperti tabel di bawah ini :

Sampel bobot (ng)

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

A Tidak terdeteksi

B 23,45 23,37 23,31

C 42,17 42,17 42,22


121

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Validasi Metode Analisis Alopurinol Dalam Tablet Secara Spektrofotometri Dan Jamu Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Serta Aplikasinya” ini memiliki nama lengkap Ria Kusuma Dewi. Penulis dilahirkan di Surakarta pada 8 Maret 1992 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Tomo dan Mikke Iskandar. Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis yaitu TK Marsudirini (1996-1998), SD Widya Wacana (1998-2004), SMP Bintang Laut (2004-2007), SMA Regina Pacis (2007-2010) dan pada tahun 2010

melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan kepanitiaan antara lain menjadi anggota tim dalam kegiatan penyuluhan dengan tema waspadai demam chikungunya (2011), peserta dalam kegiatan seminar Kanker Serviks dan Kanker Paru-Paru (2011), peserta dalam acara seminar nasional Pemberdayaan Pasien dalam Self Management Diabetes Melitus untuk Meningkatkan Kualitas Hidup, peserta dalam acara Hari Aids Sedunia (2011), sie konsumsi dalam acara Pharmacy Performance and Event Cup (2012), co kesekretariatan dalam kegiatan Pelepasan Wisuda (2012), peserta dalam acara seminar Who are you, Give or Be Given (2012), asisten praktikum biokimia dan farmakognosi fitokimia(2012), sie perlengkapan dalam Komisi Pemilihan Umum Gubernur Badan Eksekutif Mahasiswa dan Ketua Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas Farmasi (2013), asisten praktikum analisis farmasi dan validasi metode (2014).


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji · 1. aris widayati, m.si, ph.d., apt. selaku dekan...

Documents