perkembangan in vitro sel beta pankreas tikus … · atau transplantasi organ pankreas. meskipun...

PERKEMBANGAN IN VITRO SEL BETA PANKREAS TIKUS

(Rattus norvegicus) DALAM MEDIUM KULTUR YANG

DIBERI EKSTRAK JINTAN HITAM (Nigella sativa)

DENY PUTRA ROMADHON

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER

INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Perkembangan In Vitro

Sel Beta Pankreas Tikus (Rattus norvegicus) dalam Medium Kultur yang Diberi

Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa) adalah benar karya saya dengan arahan dari

komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan

tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang

diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks

dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Agustus 2014

Deny Putra Romadhon

NIM B04100092

ABSTRAK

DENY PUTRA ROMADHON. Perkembangan In Vitro Sel Beta Pankreas Tikus

(Rattus norvegicus) dalam Medium Kultur yang Diberi Ekstrak Jintan Hitam

(Nigella sativa). Dibimbing oleh KUSDIANTORO MOHAMAD dan WAHONO

ESTHI PRASETYANINGTYAS.

Nigella sativa (jintan hitam) adalah tanaman obat yang banyak digunakan

dalam mengobati berbagai penyakit, termasuk diabetes melitus. Penelitian ini

bertujuan untuk menganalisis proliferasi dan deferensiasi sel-sel β pankreas tikus

(Rattus norvegicus) setelah pemberian ekstrak jintan hitam secara in vitro. Sel

pankreas diisolasi dari anak tikus usia lima hari dan dikultur secara in vitro dalam

medium dulbecco modified eagle medium dengan penambahan ekstrak Nigella

sativa (NS) sebagai perlakuan (NS 0% [kontrol], NS 1%, dan NS 10%). Sel

diinkubasi dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 oC selama tujuh hari dan

diamati population doubling time (PDT), persentase dan diameter pulau

Langerhans, serta ekspresi sel β pankreas dalam menghasilkan insulin setelah

pewarnaan dithizone. Penelitian menunjukkan pemberian ekstrak jintan hitam

(NS) secara nyata (P < 0,05) mampu memperpendek PDT (4.66 ± 0.24, 3.98 ±

0.20, dan 3.66 ± 0.21 hari berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%),

meningkatkan persentase dan diameter pulau Langarhans (6.00 ± 1.80, 14.33 ±

3.01, dan 18.67 ± 1.25% berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%),

meningkatkan diameter pulau Langerhans (66.11 ± 2.09, 101.66 ± 0.83, dan

142.77 ± 1.73 µm berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%, dan NS 10%), serta

meningkatkan persentase ekspresi sel β pankreas dalam menghasilkan insulin

(4.67 ± 0.57, 9.67 ± 2.08, dan 17.33 ± 3.21% berturut-turut untuk NS 0%, NS 1%,

dan NS 10%). Berdasarkan hasil keseluruhan dapat disimpulkan bahwa pemberian

ekstrak jintan hitam mampu meningkatkan proliferasi dan deferensiasi sel-sel

pankreas secara in vitro.

Kata kunci: kultur in vitro, Nigella sativa, perkembangan, sel β pankreas.

ABSTRACT

DENY PUTRA ROMADHON. In Vitro Development of Pancreatic Beta Cells of

Rat (Rattus norvegicus) in Culture Medium Supplemented by Black Seed (Nigella

sativa) Extract. Supervised by KUSDIANTORO MOHAMAD and WAHONO

ESTHI PRASETYANINGTYAS.

Nigella sativa (black seed) is a medicinal plant that is widely used for

treating various diseases, including diabetes mellitus. This study examined the

proliferation and differentiation of pancreatic β cells of rats (Rattus norvegicus)

after in vitro culture in medium supplemented by Nigella sativa extracts (NS).

Pancreatic cells were isolated from five days old rat (Rattus norvegicus) and

cultured in dulbecco modified eagle medium suplemented with Nigella sativa

(NS) exstract (NS 0% [control], NS 1%, and NS 10% for treatment groups). The

cell were incubated in 5 % CO2 incubator at 37 oC for seven days and observed

cell population doubling time (PDT), percentage and diameter of Langerhans

islets, and percentage of expression the β cell producing insulin in Langerhans

islets after dithizone staining. The result showed that NS significantly (p < 0.05)

decreased the population doubling time (4.66 ± 0.24, 3.98 ± 0.20, and 3.66 ± 0.21

days for NS 0%, NS 1%, and NS 10%, respectively), increased the percentage of

Langerhans islets (6.00 ± 1.80, 14.33 ± 3.01, and 18.67 ± 1.25% for NS 0%, NS

1%, and NS 10%, respectively), increased the diameter of Langerhans islets

(66.11 ± 2.09, 101.66 ± 0.83, and 142.77 ± 1.73 µm for NS 0%, NS 1%, and NS

10%, respectively), and increased the percentage of expression the β cell

producing insulin (4.67 ± 0.57, 9.67 ± 2.08, and 17.33 ± 3.21% for NS 0%, NS

1%, and NS 10%, respectively). It was concluded that the supplementation of NS

in culture medium can improve the proliferation and differentiation of pancreatic

cells in vitro.

Keywords: development, in vitro culture, Nigella sativa, pancreatic β cells.

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

pada

Fakultas Kedokteran Hewan

PERKEMBANGAN IN VITRO SEL BETA PANKREAS TIKUS

(Rattus norvegicus) DALAM MEDIUM KULTUR YANG

DIBERI EKSTRAK JINTAN HITAM (Nigella sativa)

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

DENY PUTRA ROMADHON

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas

segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2014 ini ialah

Perkembangan In Vitro Sel Beta Pankreas Tikus (Rattus norvegicus) dalam

Medium Kultur yang Diberi Ekstrak Jintan Hitam (Nigella sativa).

Terima kasih penulis ucapkan kepada Drh Kusdiantoro Mohamad, MSi

PAVet dan Drh Wahono Esthi Prasetyanigtyas, MSi PAVet selaku pembimbing,

serta Dr Drh Ita Djuwita, MPhil PAVet (alm) yang telah merancang,

membimbing, dan memberikan bantuan dana penelitian. Di samping itu,

penghargaan penulis sampaikan kepada Wahyudin, AMd selaku staf dan teknisi

Laboratorium Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor,

Devi Syafrianti, SPd, MSi, dan Ria Ceriana, SSi, MSi, serta teman-teman sesama

penelitian (Dwi Budiono, Juita Siregar, Fitri Susana, Siti Khadijah, Putri Ekandini

dan Fatimah) atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian berlangsung.

Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, dan seluruh keluarga

atas segala doa dan kasih sayangnya.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2014

Deny Putra Romadhon

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL ix

DAFTAR GAMBAR ix

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 1

Perumusan Masalah 2

Manfaat Penelitian 2

TINJAUAN PUSTAKA

Jintan Hitam (Nigella sativa) 2

Pankreas 3

Kultur In Vitro 3

METODE

Waktu dan Tempat 4

Bahan 4

Alat 4

Tahapan dan Prosedur Kerja 4

Evaluasi Hasil Kultur 6

Rancangan Percobaan dan Analisis Data 7

HASIL DAN PEMBAHASAN 8

SIMPULAN DAN SARAN 11

Simpulan 11

Saran 12

DAFTAR PUSTAKA 12

RIWAYAT HIDUP 14

DAFTAR TABEL

1. Population doubling time (PDT) sel pankreas pada kultur in vitro yang

diberi ekstrak Nigella sativa 8

2. Persentase pulau Langerhans terhadap sel pankreas pada kultur in vitro

yang diberi ekstrak Nigella sativa 9

3. Diameter pulau Langerhans yang tumbuh dalam medium yang diberi

ekstrak Nigella sativa 9

4. Persentase pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang

menunjukkan ekspresi terhadap pewarnaan DTZ dalam medium yang

diberi ekstrak Nigella sativa 11

DAFTAR GAMBAR

1. Alur pengamatan dan penghitungan pulau Langerhans dan sel-sel

pankreas 7

2. Pengukuran diameter pulau Langerhans 7

3. Populasi sel-sel pankreas pada H-0 dan H-7 kultur in vitro 8

4. Pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang menunjukkan

ekspresi menghasilkan insulin 10

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Penyakit diabetes melitus (DM) merupakan penyakit yang ditemukan di

seluruh dunia, termasuk Indonesia. Penelitian epidemiologis oleh Perkumpulan

Endokrinologi Indonesia (PERKENI) menyebutkan beberapa wilayah di

Indonesia memiliki prevalensi penyakit DM yang terus meningkat setiap tahun.

Berdasarkan pola pertambahan penduduk, diperkirakan pada tahun 2020 dari 178

juta penduduk berusia di atas 20 tahun dengan asumsi prevalensi DM sebesar 4 %

akan didapatkan 7 juta pasien DM (PERKENI 2011).

Hormon insulin merupakan hormon penting yang dihasilkan oleh sel beta

pankreas dan berfungsi mengatur metabolisme glukosa dengan mengubah glukosa

dalam darah menjadi glikogen. Apabila terjadi kerusakan pada sel-sel beta

pankreas, maka akan terjadi ketidak-seimbangan kadar hormon insulin dan proses

metabolisme glukosa. Hal ini dapat menimbulkan penyakit degeneratif DM,

terutama DM tipe 1 (ADA 2013).

Terapi DM tipe 1 karena kerusakan sel beta dapat dilakukan dengan

pemberian insulin harian atau transplantasi organ pankreas. Meskipun demikian,

jumlah donor organ masih sangat sedikit dan mahal, serta efek samping dari

imunosupresan yang digunakan untuk mencegah reaksi imunologik saat

transplantasi masih menjadi kendala dalam pengobatan DM dengan teknik

transplantasi (Setiawan 2006). Alternatif lain yang menjadi pilihan dalam

pengobatan DM tipe 1 adalah dengan menggunakan obat herbal, diantaranya

adalah Nigella sativa. Terapi lain melalui penerapan bioteknologi untuk

menggantikan sel β pankreas yang rusak dapat dilakukan dengan teknik kultur in

vitro dan transplantasi sel-sel hasil kultur.

Nigella sativa diketahui mempunyai banyak efek farmakologi, salah

satunya adalah antidiabetik (efek hipoglikemik) (Yulianti dan Junaedi 2006).

Nigella sativa mengandung thymoquinone yang dapat memperbaiki kerusakan sel

beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi insulin (Kanter 2003).

Selain itu, Nigella sativa juga memiliki kandungan seng yang cukup tinggi

(Yulianti dan Junaedi 2006). Seng (Zn) berfungsi sebagai bagian dari enzim atau

sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratus jenis enzim (Almatsier 2001).

Menurut El-Dakhakhny et al. (2002) Nigella sativa mampu memperbaiki

metabolisme glukosa pada tikus model diabetes in vivo. Selain itu, Nigella sativa

mampu meningkatkan proliferasi dan regenerasi sel β pankreas yang rusak secara

in vivo, dengan demikian insulin dalam darah dapat meningkat (Kanter et al.

2003). Namun belum ada pembuktian secara empiris Nigella sativa berperan

dalam menginduksi proliferasi (pertumbuhan) serta diferensiasi (perkembangan)

sel β pankreas secara in vitro.

Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian adalah untuk menganalisis kemampuan ekstrak jintan

hitam (Nigella sativa) dalam menginduksi proses proliferasi (pertumbuhan) dan

diferensiasi (perkembangan) sel-sel β pankreas tikus secara in vitro.

2

Perumusan Masalah

Nigella sativa telah banyak dikonsumsi masyarakat karena dipercaya

memilki berbagai khasiat, misalnya untuk mangatasi penyakit DM tipe 1. Nigella

sativa diketahui mampu meningkatkan populasi sel β pankreas serta sekresi

insulin secara in vivo, namun belum ada data empiris yang membuktikan bahwa

Nigella sativa berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan sel-sel ß pankreas

secara in vitro. Sistem kultur in vitro dapat digunakan untuk membuktikan

peranan Nigella sativa dalam menginduksi proses proliferasi (pertumbuhan) dan

diferensiasi (perkembangan) sel-sel ß pankreas.

Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah memberikan data ilmiah mengenai potensi

ekstrak Nigella sativa dalam meningkatkan proliferasi (pertumbuhan) dan

diferensiasi (perkembangan) sel-sel β pankreas tikus secara in vitro berdasarkan

data-data empiris, khususnya untuk pengobatan diabetes melitus tipe 1.

TINJAUAN PUSTAKA

Jintan Hitam (Nigella sativa)

Nama atau sebutan bagi tanaman jintan hitam berbeda-beda di setiap

tempat. Di negara-negara barat tanaman ini sering disebut dengan black caraway,

black seed, dan coriander seeds. Di negara-negara Arab, tanaman ini dikenal

dengan nama habbatussauda (hitam) atau habbatuk baraka (yang diberkati).

Semantara di Persia tanaman ini dikenal dengan shonaiz, di Turki dikenal dengan

cotu siyah, dan dalam bahasa Hindi dikenal dengan nama kalounji. Di Indonesia

dan Malaysia dikenal dengan nama jintan hitam (Yulianti dan Junaedi 2006).

Tanaman jintan hitam diklasifikasikan sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Traceabionta

Filum : Spermatophyta

Subfilum : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida dicotyledon

Subkelas : Magnoliidae

Ordo : Ranunculales

Famili : Ranunculalceae

Genus : Nigella

Spesies : Nigella sativa

Nigella sativa memiliki kandungan asam lemak tak jenuh (82.5%) lebih

banyak dibandingkan asam lemak jenuh (17.0%). Kandungan asam lemak tak

jenuh yang penting diantaranya ialah asam linoleat (55.6%), asam palmitat

(12.5%), dan asam oleat (23.4%) (Nickavar et al. 2003).

3

Nigella sativa diketahui mempunyai banyak efek farmakologi, salah satunya

adalah anti-diabetes (efek hipoglikemik) (Yulianti dan Junaedi 2006). Nigella

sativa diketahui mengandung thymoquinone yang dapat memperbaiki kerusakan

sel beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi insulin (Kanter 2003).

Selain itu, Nigella sativa juga memiliki kandungan seng yang cukup tinggi

(Yulianti dan Junaedi 2006). Seng (Zn) berfungsi sebagai bagian dari enzim atau

sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratus jenis enzim (Almatsier 2001).

Pankreas

Pankreas merupakan kelenjar endokrin yang memiliki fungsi sebagai

penghasil hormon insulin dalam tubuh. Pankreas terdiri dari sel-sel yang tersusun

mengelompok atau yang disebut pulau Langerhans. Pulau Langerhans tersusun

atas berbagai macam sel-sel endokrin membentuk bingkai yang saling

beranastomose, yaitu sel alfa (α, menghasilkan glukagon), sel beta (β,

menghasilkan insulin), sel-epsilon (δ, menghasilkan somatostatin), dan sel gamma

(γ, menghasilkan polipeptida pankreas) (Criscimanna et al. 2011). Pankreas juga

memiliki sel-sel duktus yaitu sel-sel progenitor yang berperan dalam neogenesis

(proliferasi dan deferensiasi) (Bonner et al. 1993, Rosenberg 1998). Pada rodensia (mencit dan tikus), pulau-pulau Langerhans memiliki morfologi berupa kumpulan sel berbentuk bola (spheroid), sel-sel β terletak di tengah dan dikelilingi oleh sel-

sel α, serta sel-sel γ tersebar di antara sel β dan α (Ramiya et al. 2000).

Pankreas merupakan salah satu organ yang memiliki kemampuan terbatas

dalam melakukan proliferasi (Soria et al. 2001), namun secara in vitro sel-sel

pankreas masih memiliki kemampuan dalam melakukan proliferasi dan

diferensiasi (Demeterco et al. 2000).

Kultur In Vitro

Kultur sel didefinisikan sebagai teknik untuk menumbuhkan dan

memelihara sel-sel dari organisme multiseluler di luar tubuh dengan mengunakan

wadah khusus yang ditempatkan pada kondisi lingkungan menyerupai kondisi

tubuh, seperti: temperatur, kelembaban, nutrisi, serta kondisi bebas kontaminasi.

Tujuan dilakukan kultur sel adalah untuk digunakan dalam riset dan terapi medis

(Halim et al. 2010). Menurut Butler (2004) riset kultur sel asal hewan memiliki

beberapa tujuan, antara lain: (1) mengetahui fisiologi normal atau proses biokimia

yang terjadi dalam sel, misalnya metabolisme sel; (2) menguji pengaruh senyawa

kimiawi ataupun obat pada tipe sel yang spesifik, misalnya senyawa metabolit,

hormon, senyawa toksik, senyawa mutagenik, dan lain-lain; (3) mempelajari

kombinasi variasi tipe sel sehingga menghasilkan jaringan buatan; serta (4)

mensintesis produk biologis pada kultur sel skala besar.

Kondisi in vitro pada dasarnya diciptakan agar menyerupai kondisi in vivo,

antara lain: temperatur (37oC), pH (7.4), kadar CO2 (5%), kadar oksigen (5%),

tekanan osmosis (280-300 mOsmol/Kg), permukaan untuk perlekatan sel, nutrien,

proteksi terhadap zat toksik, hormon, dan faktor pertumbuhan (Malole 1990).

Keberhasilan suatu kultur in vitro, perlu diperhatikan komponen-komponen

4

utama, antara lain: medium, serum, antibiotik, dan faktor pertumbuhan. Medium

berperan penting untuk menciptakan suatu kondisi lingkungan yang memiliki pH,

tekanan osmotik, dan faktor pendukung lainnya yang serupa untuk pertumbuhan

dan perkembangan sel. Serum berperan penting sebagai sumber nutrisi sel.

Antibiotik diperlukan untuk menghindari kontaminasi mikroorganisme yang dapat

mengganggu pertumbuhan dan bersifat patogen jika diperuntukkan untuk terapi.

Untuk menginduksi pertumbuhan, mempertahankan pluripotensi, atau

merangsang terjadinya diferensiasi, maka faktor pertumbuhan perlu ditambahkan

dalam medium kultur (Halim et al. 2010).

METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan April 2014 di

Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi, Histologi, dan Embriologi,

Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan,

Institut Pertanian Bogor.

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan antara lain tikus (Rattus norvegicus) strain

Sprague Dawley (SD) umur 5 hari, serbuk jintan hitam (Nigella sativa), medium

kultur dulbecco modified eagle medium suplemented (DMEM) yang dimodifikasi

dengan penambahan asam amino non-esensial (NEAA Sigma, USA), new born

calf serum (NBCS Sigma, USA), NaHCO3 (Sigma, USA), insulin transferrin

selenium (ITS Sigma, USA), dithizone (DTZ Sigma, USA), dimetil sulfoxide

(DMSO Sigma, USA), alkohol 70%, Dubelcco Phosphate Buffered Saline (DPBS

Sigma, USA), dan gentamycin.

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain gunting bedah, pinset,

mortar beserta penggerus, timbangan digital, pipet mikro, inkubator, laminar flow

(clean bench), mikroskop Olympus Ix70-S8F2 yang dilengkapi dengan kamera,

cawan petri, gelas obyek, gelas penutup, membran filter 0,22 µm, spoit 1 mL dan

10 mL, gelas ukur, gelas piala, haemositometer Improved Neubeuer, alat

penghitung, centrifuge rotor fixed, hot plate, dan vortex.

Tahapan dan Prosedur Kerja

Persiapan ekstrak Nigella sativa

Ekstrak Nigella sativa dibuat dengan cara diseduh. Sebanyak 2 mL

aquabides dididihkan terlebih dahulu, lalu sambil didinginkan dimasukkan

masing-masing 0.02 g dan 0.2 g serbuk Nigella sativa, masing-masing untuk

5

perlakuan Nigella sativa 1% dan 10%. Selanjutnya larutan ekstrak dihomogenkan

dengan menggunakan pipet dan dibiarkan sampai hingga dingin. Setelah homogen

dan dingin, larutan difilter menggunakan membran filter berpori-pori 0.22 µm.

Larutan ekstrak Nigella sativa disimpan pada suhu -4 °C dan siap untuk

digunakan.

Persiapan cawan petri

Cawan petri disertai cover glass steril direndam dengan gelatin 0.1%

sebanyak 1 mL dan didiamkan selama satu jam. Setelah satu jam, gelatin dibuang

dengan menggunakan mikropipet, selanjutnya cawan petri dibilas menggunakan

Dulbecco’s phosphate saline buffered (DPBS) yang telah dimodifikasi dengan

penambahan gentamycin 50 µg/mL. Setelah dibilas, cawan petri didiamkan

selama 5 menit hingga kering.

Masing-masing cawan petri yang telah kering dimasukkan 2 mL medium

kultur dulbecco modified eagle medium (DMEM) yang dimodifikasi dengan

penambahan NaHCO3 1%, non-essential amino acids (NEAA) 1%, gentamycin

50 µg/mL, neonatal calf bovine serum (NCBS) 10%, dan insulin transferrin

selenium (ITS) yang mengandung 5 µg/mL insulin, 10 µg/mL transferin, dan 5

µg/mL selenium.

Isolasi dan kultur sel-sel pankreas

Sel pankreas anak tikus (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley (SD)

usia 5 hari diisolasi berdasarkan metode Johansson et al. (2006) yang

dimodifikasi. Tikus dikorbankan dengan cara dianastesi dan kemudian didislokasi

leher (cervicalis dislocation). Pankreas yang diisolasi dicuci dalam larutan DPBS

yang mengandung gentamisin 50 µg/mL dan NCBS 0.1% (mPBS) sambil

dibersihkan dari selaput dan pembuluh darah. Setelah bersih, jaringan dipotong-

potong kurang dari 2 mm secara manual dengan gunting steril, kemudian

didisosiasi lebih lanjut menggunakan enzim kolagenase 0.1% sebanyak 50 µL/mL

mPBS dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15-30 menit. Tujuan pemotongan

tersebut adalah meningkatkan luas permukaan sehingga kerja enzim kolagenase

efektif mendisosiasi dengan mengurangi jaringan ikat yang mengelilingi pulau

Langerhans (Ru et al. 2004). Selanjutnya suspensi sel pankreas dicuci dengan

sentrifugasi selama 10 menit (kecepatan 200 g) dalam medium DPBS dan

DMEM, masing-masing 3 dan 2 kali pencucian. Suspensi sel-sel pankreas yang

telah dicuci ditaman dalam cawan petri yang telah disiapkan, dengan konsentrasi

akhir 5 x 104 sel/mL.

Kultur sel dilakukan dalam inkubator CO2 5%, pada suhu 37 °C selama 7

hari. Medium kultur diperbaharui setiap 2 hari sekali, yaitu pada hari ke-2, 4, dan

6. Pada hari ke-2, 4, dan 6 (setelah medium diperbaharui) sel-sel pankreas

diinduksi dengan penambahan larutan Nigella sativa 100 µL masing-masing

untuk perlakuan 0.01 g/mL (1%) dan 0.1 g/mL (10%) dalam 2 mL medium

DMEM. Pada hari ke-6 kultur sel-sel pankreas diinduksi dengan 1 µL glukosa 26

mM. Selanjutnya kultur dievaluasi pada hari ke 7, dan dilakukan pewarnaan

dithizone (DTZ) untuk mengetahui jumlah pulau Langerhans yang

mengekspresikan produksi insulin.

6

Pewarnaan sel beta pankreas yang mensekresikan insulin

Pewarnaan sel beta pankreas dilakukan pada hari ketujuh kultur, yaitu

setelah dilakukan evaluasi persentase pulau Langerhans dan pengambilan gambar

untuk evaluasi diameter pulau Langerhans. Pewarnaan menggunakan pewarna

dithizone (DTZ) berdasarkan metode Shiroi et al. (2002).

Stok DTZ dibuat dengan melarutkan 50 mg DTZ ke dalam 5 mL dimethyl

sulfoxide. Larutan pewarnaan siap pakai dibuat dengan melarutkan 1 µL larutan

stok dalam 1 mL DPBS yang mengandung 1.25 µL/mL gentamycin dan difilter

menggunakan membran filter dengan ukuran pori-pori 0.22 µm.

Sel kultur yang akan diwarnai dicuci terlebih dahulu dalam larutan mDPBS.

Selanjutnya dilakukan proses pewarnaan dengan cara menginkubasi sel dalam

larutan DTZ selama 15 menit pada suhu 37 °C. Setelah proses inkubasi selama 15

menit, sel dicuci dengan menggunakan larutan DPBS dan siap untuk diamati

menggunakan mikroskop. Sel beta pankreas dalam pulau Langerhans yang

mensekresikan insulin akan menunjukkan warna merah, sedangkan sel beta yang

tidak mensekresikan insulin tidak berwarna setelah dilakukan pewarnaan (Shiroi

et al. 2002).

Evaluasi Hasil Kultur

Tingkat proliferasi sel berdasarkan population doubling time

Population doubling time (PDT) adalah waktu yang diperlukan oleh

populasi sel untuk menjadi jumlah dua kali dari jumlah sel semula (Davis 2011).

Tingkat proliferasi dievaluasi dengan menghitung jumlah sel pada saat akan

diinkubasi (H0) dan setelah kultur selama tujuh hari (H7). Pada hari ketujuh

setelah pewarnaan DTZ, medium dibuang lalu sel hasil kultur dicuci dengan

DPBS kemudian dimasukkan larutan enzim kolagenase 0.1% sebanyak 50 µL/mL

DPBS dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 15-30 menit. Selain dilakukan

disosiasi menggunakan enzim, disosiasi dilakukan secara manual dengan

menggunakan mikropipet. Sel yang telah terdisosiasi disentrifugasi selama 10

menit dengan kecepatan 200 g. Selanjutnya sel dihitung menggunakan

hemositometer Improved Neubeuer. Perhitungan PDT dilakukan menurut Davis

(2011) dengan rumus sebagai berikut:

Persentase pulau Langarhans

Penghitungan persentase pulau Langerhans terhadap sel-sel pankreas

dilakukan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 40 x 10 dengan alur

pengamatan seperti pada Gambar 1. Penghitungan dilakukan terhadap 100 sel-sel

pankreas yang diamati dan dilakukan sebanyak dua kali pengulangan.

PDT= 1

(log ∑jumlah sel akhir- log ∑ jumlah sel awal) x 3.32

Waktu (hari)

7

Gambar 1 Alur pengamatan dan penghitungan pulau Langerhans dan sel-sel

pankreas.

Pengukuran diameter pulau Langerhans

Diameter pulau Langerhans dihitung dengan menggunakan mikrometer

yang diamati pada hasil foto mikroskop pada perbesaran 40 x 10. Penghitungan

dilakukan pada enam pulau Langerhans pada tiap perlakuan.

Gambar 2 Pengukuran diameter pulau Langerhans. A. Pengukuran diameter pulau

Langerhans yang simetris; B. Pengukuran diameter pulau Langerhans

yang tidak simetris, penjumlahan diameter terpanjang dan terpendek

dibagi dua. Bar = 50 µm.

Penghitungan persentase ekspresi sel beta penghasil insulin

Penghitungan persentase ekspresi sel beta pada pulau Langerhans yang

menghasilkan insulin dengan pewarnaan DTZ dan diamati dengan mikroskop

pada perbesaran 40 x 10. Penghitungan dilakukan terhadap 100 agregat sel-sel

pankreas dan/atau pulau Langerhans pada tiap perlakuan.

Rancangan Percobaan dan Analisis Data

Penelitian dilakukan dengan menggunakan dua konsentrasi Nigella sativa

yaitu kontrol 2 mL DMEM tanpa penambahan Nigela sativa, 2 mL DMEM

dengan penambahan 100 µL Nigella sativa 0.01 g/mL (NS 1%) dan 2 mL DMEM

dengan penambahan 100 µL Nigella sativa 0.1 g/mL (NS 10%). Masing-masing

kelompok perlakuan memiliki tiga kali ulangan. Data kuantitatif yang diperoleh

diuji secara statistik dengan menggunakan Analysis of Varian (ANOVA) dan uji

lanjut Duncan untuk menentukan beda nyata antar perlakuan dengan selang

kepercayaan 95 %.

8

HASIL DAN PEMBAHASAN

Population doubling time (PDT) adalah waktu yang diperlukan oleh

populasi sel untuk menjadi jumlah dua kali dari jumlah sel semula. Semakin kecil

nilai PDT, maka semakin cepat proliferasi sel yang terjadi (Davis 2011). Hasil

PDT kultur sel pankreas yang diberi perlakuan ekstrak Nigella sativa dapat dilihat

pada Tabel 1 dan Gambar 3.

Tabel 1 Population doubling time (PDT) sel pankreas pada kultur in vitro yang

diberi ekstrak Nigella sativa

* Penghitungan berdasarkan metode Davis (2011).

Ekstrak Nigella sativa (NS); Kontrol (dMEM), NS 1% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.01 g/mL);

NS 10% (2 mL dMEM + 100 µL NS 0.1 g/mL).

Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama berbeda nyata pada taraf uji 5% (p < 0.05).

Gambar 3 Populasi sel-sel pankreas pada H-0 dan H-7 kultur in vitro. (A,B) NS

0% (kontrol), (C,D) NS 1%, dan (E,F) NS 10%. (A,C,E) kultur

pankreas pada H-0, (B,D,F) kultur pankreas pada H-7. Tanda panah

solid = sel pankreas, tanda panah kosong = pulau Langerhans. Bar = 20

µm.

Ulangan Population doubling time (PDT)*

Kontrol NS 1 % NS 10 %

1 4.47 3.96 3.47

2 4.58 3.79 3.61

3 4.93 4.18 3.88

Rata-rata 4.66 ± 0.24a

3.98 ± 0.20b

3.66 ± 0.21c

9

Nilai PDT pada kontrol adalah 4.66 ± 0.24 hari, sedangkan nilai PDT pada

pemberian ekstrak Nigella sativa 1% dan 10% masing-masing secara berturut-

turut adalah 3.98 ± 0.20 dan 3.66 ± 0.21 hari. Pemberian ekstrak Nigella sativa

pada kultur sel pankreas dengan konsentrasi 1% dan 10% mampu memperkecil

nilai PDT jika dibandingkan dengan kontrol (p < 0.05). Nilai PDT yang semakin

kecil menandakan pemberian ekstrak Nigella sativa dapat meningkatkan

proliferasi pada sel pankreas yang dikultur secara in vitro.

Persentase pulau Langerhans yang terbentuk menunjukkan peningkatan

pada setiap peningkatan konsentrasi Nigella sativa jika dibandingkan dengan

kontrol (p < 0.05). Hasil persentase pulau Langerhans dapat dilihat pada Tabel 2.

Persentase pulau Langerhans yang terbentuk pada kontrol adalah 6.00 ± 1.80%,

sedangkan persentase pulau Langerhans pada pemberian ekstrak Nigella sativa

1% dan 10% masing-masing adalah 14.33 ± 3.01% dan 18.67 ± 1.25%.

Diameter pulau Langerhans setelah pemberian Nigella sativa pada kultur

sel-sel pankreas dengan konsentrasi 1% dan 10% mampu meningkatkan diameter

pulau Langerhans jika dibandingkan dengan kontrol (p < 0.05). Hasil evaluasi

diameter pulau Langerhans dapat dilihat pada Tabel 3. Diameter pulau

Langerhans pada kontrol adalah 66.11 ± 2.09 µm sedangkan diameter pulau

Langerhans pada pemberian ekstrak Nigella sativa 1% dan 10% masing-masing

adalah sebagai berikut 101.66 ± 0.83 µm dan 142.77 ± 1.73µm.

Tabel 2 Persentase pulau Langerhans terhadap sel pankreas pada kultur in vitro

yang diberi ekstrak Nigella sativa




Tabel 3 Diameter pulau Langerhans yang tumbuh dalam medium yang diberi

ekstrak Nigella sativa




Ulangan Pulau Langerhans terhadap Sel Pankreas (%)

Kontrol NS 1% NS 10%

1 5.5 14.0 17.5

2 4.5 11.5 18.5

3 8.0 17.5 20.0


14.33 ± 3.01b

18.67 ± 1.25c

Ulangan Diameter Pulau Langerhans (µm)


1 68.33 100.83 140.83

2 65.83 102.50 143.33

3 64.16 101.66 144.16

Rata-rata 66.11 ± 2.09a

101.66 ± 0.83b

142.77 ± 1.73c

10

Berdasarkan nilai PDT, persentase, dan diameter pulau Langerhans, ekstrak

Nigella sativa mampu meningkatkan proliferasi dan perkembangan sel-sel

pankreas secara in vitro. Menurut Kanter et al. (2003) Nigella sativa mampu

meningkatkan proliferasi dan regenerasi sel β pankreas yang rusak secara in vivo,

dengan demikian insulin dalam darah dapat meningkat. Beberapa zat aktif yang

terkandung dalam jintan hitam adalah thymoquinone dan seng (Zn).

Thymoquinone mempunyai efek antidiabetik yang mampu menurunkan kadar

glukosa darah (El-Dakhakhny et al. 2002). Thymoquinone merupakan komponen

utama dalam minyak Nigella sativa yaitu hampir 50%. Zat ini diketahui dapat

memperbaiki kerusakan sel beta pankreas sehingga mampu meningkatkan sekresi

insulin (Kanter et al. 2003). Seng (Zn) adalah kelompok zat gizi mikro yang

dibutuhkan dalam jumlah yang sangat kecil untuk memelihara kehidupan optimal.

Seng dalam tubuh berperan dalam berbagai aktifitas enzim, pembelahan dan

pertumbuhan, diferensiasi sel, serta stabilitas fungsi berbagai jaringan tubuh

(Hidayat 1999, Paik 2001).

Hasil persentase pewarnaan dithizone (DTZ) pada kultur primer sel-sel

pankreas secara in vitro menunjukkan tidak seluruh pulau Langerhans yang

terbentuk dalam kultur mampu terwarnai dengan pewarnaan DTZ. Hal ini

disebabkan tidak semua sel β pankreas yang terdapat pada pulau Langerhans aktif

menghasilkan insulin. Gambar ekspresi sel β pankreas terhadap pewarnaan DTZ

pada kultur sel-sel pankreas dapat dilihat pada Gambar 4, sedangkan hasil

persentase ekspresi sel β pankreas terhadap pewarnaan DTZ pada kultur sel

pankreas yang diberi perlakuan ekstrak Nigella sativa dapat dilihat pada Tabel 4.

Gambar 4 Pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang menunjukkan

ekspresi menghasilkan insulin. A. Pulau Langerhans dengan sel beta

negatif ekspresi insulin, B. Pulau Langerhans dengan sel beta positif

ekspresi insulin. Pewarnaan dithizone. Bar = 30 µm

Hasil persentase ekspresi sel β pankreas terhadap pewarnaan dithizone

(DTZ) pada kontrol adalah 4.67 ± 0.57%, sedangkan pada pemberian ekstrak

Nigella sativa 1% dan 10% secara berturut-turut adalah sebagai berikut 9.67 ±

2.08% dan 17.33 ± 3.21%. Pemberian ekstrak Nigella sativa pada kultur sel-sel

pankreas dengan konsentrasi 1% dan 10% mampu meningkatkan ekspresi insulin

pada sel β pulau Langerhans terhadap pewarnaan DTZ jika dibandingkan dengan

kontrol (p < 0.05). Selain itu, warna merah yang dihasilkan memiliki tingkat

intensitas yang berbeda, hal ini disebabkan adanya perbedaan konsentrasi atau

jumlah seng yang terkandung di dalam sel β pulau Langerhans.

11

Tabel 4 Persentase pulau Langerhans dengan sel-sel beta pankreas yang

menunjukkan ekspresi terhadap pewarnaan DTZ dalam medium yang

diberi ekstrak Nigella sativa

Ulangan Sel β Pankreas yang positif dithizone (%)


1 5 8 16

2 5 9 21

3 4 12 15


9.67 ± 2.08b

17.33 ± 3.21c




Diferensiasi menggambarkan struktur dan fungsi sel dan jaringan yang

berkembang menjadi karakteristik sel yang lebih khusus. Diferensiasi terjadi

apabila ada interaksi antar berbagai sel (McGeady et al. 2006). Sel yang

mengalami diferensiasi terus berkembang dan terdiferensiasi menjadi jaringan,

organ, dan sistem. Pewarnaan insulin dalam penelitian ini dapat menggambarkan

proses terjadinya diferensiasi sel β pankreas dalam kultur in vitro.

Dithizone (DTZ) adalah pewarnaan khusus sel β pankreas dengan cara

mengikat seng (zinc-binding subtance) pada insulin, sehingga menghasilkan

warna merah muda hingga merah tua pada sel-sel yang mengandung seng (Shiroi

et al. 2002). Sel β pankreas yang terdapat pada pulau Langerhans merupakan sel

yang mengandung seng. Seng dalam sel β pankreas berperan penting dalam

mengikat insulin sehingga membentuk dimer maupun heksamer yang

memudahkan penyimpanan insulin dalam secretory vesicles sel β pankreas

(Chausmer 1998, Garnuszek et al. 2000).

Tingginya persentase ekspresi insulin oleh sel beta pada pulau Langerhans

yang diberi perlakuan dipengaruhi oleh adanya senyawa-senyawa kimia yang

dikandung Nigella sativa. Salah satu kandungan nutrisi yang cukup tinggi

dikandung Nigella sativa adalah seng. Seng berfungsi sebagai bagian dari enzim

atau sebagai kofaktor pada aktivitas lebih dari dua ratu jenis enzim (Almatsier

2001). Seng berperan dalam sintesis, penyimpanan, dan sekresi hormon insulin

dan glukagon pada pankreas, namun tidak berperan secara langsung terhadap

aktivitas insulin. Selain itu, seng juga berperan dalam proses diferensiasi sel (Paik

2001).

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) berpotensi sebagai anti-diabetes

melitus secara in vitro. Ekstrak Nigella sativa secara nyata mempersingkat

population doubling time, meningkatkan persentasi dan diameter pulau

Langerhans, serta meningkatkan persentase ekspresi sel beta penghasil insulin

setelah kultur in vitro.

12

Saran

Perlu dilakukan analisa fraksi ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) yang

memiliki potensi meningkatkan perkembangan sel beta pankreas setelah kultur in

vitro, analisa kandungan insulin pada conditional medium yang dihasilkan dari

kultur in vitro, serta analisa mengenai toksisitas ekstrak jintan hitam (Nigella

sativa) secara in vitro dan in vivo.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini merupakan bagian dan didanai dari penelitian Hibah

Kompetensi DIKTI a.n Dr Drh Ita Djuwita, MPhil PAVet (alm) dengan kontrak

nomor: 035/SP2H/PL/Dit.Litabmas/V/2013.

DAFTAR PUSTAKA

[ADA] American Diabetes Association. 2013. Diagnosis and classification of

diabetes mellitus. Diabetes Care. 36 Suplemen 1: S67-S74.

[PERKENI] Perkumpulan Endokrinologi Indonesia. 2011. Konsensus

Pengelolaan dan Pencegahan Diabetes Melitus Tipe 2 di Indonesia 2011.

[tempat tidak diketahui].

Almatsier S. 2001. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta (ID): Gramedia Pustaka

Utama.

Bonner WS, Baxter LA, Schuppin GT. 1993. A second pathway for regeneration

of adult exocrine and endocrine pancreas. A possible recapitulation of

embryonic development. Diabetes. 42(12):1715-1720.

Butler M. 2004. Animal Cell Culture and Technology. Cornwall (UK): Bios

Scientific Publishers.

Chausmer AB. 1998. Zinc, insulin and diabetes. J Am Coll Nutr. 17(2):109-115.

Criscimanna A, Bertera S, Esni F, Trucco M, Bottino R. 2011. The enigma of β-

cell regeneration in the adult pancreas: self-renewal versus neogenesis, type

1 diabetes complications. Gastroenterology. 141:1451-1462.

Davis JM. 2011. Animal Cell Culture Essential Methods. Chichester (UK): John

Wiley and Sons Ltd.

Demeterco C, Beattie GM, Dib AS, Lopes AD, Hayek A. 2000. A role for activin

A and beta cellulin in human fetal pancreatic cell differentiation and growth.

J Clin Endocrinol Metab. 85(10): 3892-3897.

El-Dakhakhny M, Mady N, Lembert N, Ammon HP. 2002. The hypoglycemic

effect of Nigella sativa oil is mediated by extra pancreatic actions. Planta

Med. 68(5):465-466.

Garnuszek P, Licinka I, Mroek A, Wardawa A, Fiedor PS, dan Mazurek AP.

2000. Identification of transplanted pancreatic islet cell by radioactive

dithizone-[131

]-histamine conjugate, preliminary report. Nucl Med Rev Cent

East Eur. 3(1):61-63.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14600983

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14600983

13

Hidayat A. 1999. Seng (zinc): Esensial bagi kesehatan. J Kedokter Trisakti.

18(1):19-26.

Halim D, Murti H, Sandra F, Boediono A, Djuwantono T, Setiawan B. 2010. Stem

Cell: Dasar Teori & Aplikasi Klinis. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga.

Johansson M, Matsson G, Anderson A, Jansson L, Carlsson P. 2006. Islet

endothelial cell and pancreatic cell proliferation: studies in vitro and during

pregnancy in adult rat. Endocrinology. 147(5):2315-2324.

Kanter M, Meral I, Yener H, Ozbek H, Demir H. 2003. Partial

regeneration/proliferation of the beta-cell in islet of Langerhans by Nigella

sativa in streptozotocin-induced diabetic rats. Tohoku J Exp Med.

201(4):213-219.

Malole MBM. 1990. Kultur Sel dan Jaringan Hewan. Bogor (ID): Institut

Pertanian Bogor.

McGeady TA, Quinn PJ, FitzPatrick S, Ryan MT, Cahalan S. 2006. Veterinary

Embriology. Oxford (UK): Blackwell Publishing.

Nickavar B, Mojab F, Javidnia K, Amoli MAR. 2003. Chemical composition of

the fixed and volatile oils of Nigella sativa L. from Iran. Z Naturforsch.

58:629-631.

Paik IK. 2001. Application of chelated minerals in animal production. Asian-Aust

J Anim Sci. 14:191-198. Ramiya VK, Maraist M, Arfors KE, Schatz DA, Peck AB, Cornelius JG. 2000.

Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from

pancreatic stem cells. Nat Med. 6(3):278-282.

Rosenberg L. 1998. Induction of islet cell neogenesis in the adult pancreas: the

partial duct obstruction model. Microsc Res Tech. 43(4):337-346.

Ru AH, Peng FR, Xia L, Xiao LY, Hai PQ, Ying DZ. 2005. Isolation, cultivation

and identification of pancreatic stem/progenitor cells in rabbit. J Agricul

Biotechnol. 3(2):89-94.

Setiawan B. 2006. Aplikasi terapeutik sel stem embrionik pada berbagai penyakit

degeneratif. Cermin Dunia Kedokteran. 153:5-8.

Shiroi A, Yoshikawa M, Yokota H, Fukui H, Ishizaka S, Tatsumi K, Takahashi Y.

2002. Identification of insulin-production cell derived from embrionic stem

cell by zinc-chelating dithizone. Stem Cell. 20(4):284-292.

Soria B, Skoudy A, Martin F. 2001. From stem cells to beta cells: new strategies

in cell therapy of diabetes mellitus. Diabetologia. 44:407-415.

Yulianti S, Junaedi E. 2006. Sembuhkan Penyakit dengan Habbatus Sauda (Jintan

Hitam). Tangerang (ID): Agromedia Pustaka.

.

14

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Nganjuk pada tanggal 16 Maret 1992, merupakan

putra pertama dari dua bersaudara dari Bapak Supeno dan Ibu Sri Anik. Jenjang

pendidikan formal yang telah ditempuh oleh penulis di antaranya lulusan SDN

Kedondong 1 Nganjuk tahun 2004, lulusan SMP Negeri 3 Nganjuk tahun 2007,

dan lulusan SMA Negeri 2 Nganjuk tahun 2010. Penulis melanjutkan pendidikan

dan diterima di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor melalui jalur

Undangan Seleksi Masuk Institut Pertanian Bogor (USMI) tahun 2010 dengan

memperoleh beasiswa Bidik Misi IPB. Selama perkuliahan penulis aktif dalam

kegiatan organisasi Himpunan Minat Profesi Ruminansia (2011-2013) sebagai

anggota.

perkembangan in vitro sel beta pankreas tikus … · atau transplantasi organ pankreas. meskipun...

Documents