perbandingan antara metode sybr green dan metode...

i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan

DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time PCR

SKRIPSI

AFIFAH NURUL IZZAH

NIM : 1110102000014

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

OKTOBER 2014

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode


DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time

Polymerase Chain Reaction (PCR)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

AFIFAH NURUL IZZAH

NIM : 1110102000014

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

OKTOBER 2014

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Afifah Nurul Izzah

NIM : 1110102000014

Tanda Tangan :

Tanggal : 9 Oktober 2014

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING


NIM : 1110102000014

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA

Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time Polymerase

Chain Reaction (PCR)

Disetujui Oleh:

Pembimbing 1 Pembimbing 2

Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt

NIP: 19750104200912201

Zilhadia, M.Si., Apt

NIP: 197308222008012007

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt.

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh


NIM : 1110102000014

Program Studi : Farmasi

Judul : Perbandingan antara Metode SYBR Green dan

Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA

Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan

Menggunakan Real Time Polymerase Chain

Reaction (PCR)

Telah berhasil dipertahankan dihadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai

bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana

Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt ( )

Pembimbing II : Zilhadia, M.Si., Apt ( )

Penguji I : Yuni Anggraeni, M.Farm., Apt ( )

Penguji II : Lina Elfita, M.Si., Apt ( )

Ditetapkan di : Ciputat

Tanggal : 9 Oktober 2014

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK


Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode


DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Pemanfaatan gelatin secara luas menimbulkan kontroversi dan kekhawatiran bagi

masyarakat muslim karena pada umumnya gelatin terbuat dari kulit babi dan sapi.

Salah satu teknik analisis yang dapat membedakan gelatin sapi dan gelatin babi

adalah Real Time PCR. Real Time PCR merupakan metode analisis berbasis DNA

yang handal, efektif, dan terpecaya. Dalam analisa kualitatif dan kuantitatif, Real

Time PCR membutuhkan pewarna fluoresens. Pewarna fluoresens yang umum

digunakan pada Real Time PCR, yaitu SYBR Green dan Hydrolysis Probe. Telah

dilakukan perbandingan antara metode SYBR Green dan Hydrolysis Probe dalam

analisis DNA gelatin menggunakan Real Time PCR. DNA pada gelatin diekstraksi

dan diisolasi menggunakan kit komersial. Isolat DNA gelatin sapi dan DNA gelatin

babi didapatkan sebanyak 19,38 ng/μl dan 13,63 ng/μl dengan kemurnian 1,566 dan

1,573. Isolat DNA dilakukan analisis dengan metode SYBR Green menggunakan

suhu annealing 65oC untuk primer sapi dan suhu annealing 60oC untuk primer

babi. Isolat DNA dianalisis dengan metode Hydrolysis Probe menggunakan suhu

annealing 60oC untuk primer babi dan primer sapi. Hasil analisis dari kedua metode

menunjukkan bahwa metode Hydrolysis Probe mampu mengidentifikasi DNA pada

gelatin secara spesifik dibandingkan menggunakan metode SYBR Green.

Kata Kunci: Real Time Polymerase Chain Reaction, Gelatin, SYBR Green,

Hydrolysis Probe

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Afifah Nurul Izzah

Major : Pharmacy

Title : Comparison of SYBR Green and Hydrolysis Probe methods

in Analysis of Porcine Gelatin DNA and Bovine Gelatin

DNA Using Real Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

The wide usage of gelatin in various products led to continous controvercy among

Muslim consumers because most of them are derived from porcine and bovine skin.

One of the analytical techniques that can differentiate bovine gelatin and porcine

gelatin is Real Time PCR. Real Time PCR is a DNA-based technology analysis

which is a robust, effective, and reliable. In qualitative and quantitative analysis,

there are two kinds methods popular of floresence dye. They are SYBR Green and

Hydrolysis Probe. In this study, we have perfomed a comparison between SYBR

Green method and Hydrolysis Probe method in analysis Porcine gelatin DNA and

Bovine gelatin DNA using Real Time PCR. The DNA is extracted and isolated by

commercial kit. Porcine gelatine DNA and Bovine gelatin DNA obtained were

19.38 ng/μl and 13.63 ng/μl with purity were 1,566 and 1,573. Then, DNA isolates

were analyzed by SYBR Green methods, with annealing temperature was 65oC

using bovine primer and 60oC using porcine primer. While DNA is analyzed by

Hydrolysis Probe methods, with annealing temperature was 60oC using both

porcine primer annd bovine primer. The result showed that Hydrolysis Probe is able

to identify DNA of porcine and bovine gelatin with high specificity than SYBR

Green.

Keyword: Real Time Polymerase Chain Reaction, Gelatin, SYBR Green,

Hydrolysis Probe.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang senantiasa mencurahkan

segala rahmat-Nya kepada kita semua, khususnya penulis dalam menyelesaikan

skripsi yang berjudul “Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan

Menggunakan Real Time PCR”. Shalawat dan salam senantiasa terlimpah kepada

junjungan kita Nabi Muhammad SAW, teladan bagi umat manusia dalam menjalani

kehidupan.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian akhir

guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S. Far) pada Program Studi Farmasi,

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta. Selesainya penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas

dari bantuan berbagai pihak, maka dalam kesempatan ini perkenankanlah penulis

menyampaikan ucapan terimakasih yang tulus dan sebesar-besarnya, khususnya

kepada:

1. Bapak Prof. Dr. (hc). Dr. MK.Tadjudin, Sp. And selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I dan Ibu Zilhadia,

M.Si., Apt. sebagai Pembimbing II yang sangat baik telah memberikan ilmu,

nasehat, waktu, tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan

penulisan skripsi.

3. Bapak Drs.Umar Mansur, M.Sc., Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Kedua orang tua, ayahanda tersayang Ali Mugiono dan ibunda tercinta Fahrida

yang selalu ikhlas memberikan dukungan moral, material, nasehat-nasehat,

serta lantunan doa yang tiada pernah putus di setiap hembusan nafas beliau

hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta. Juga kepada kakakku tersayang Aini Zahra dan adikku

tercinta Abdurrahman Marahimin yang selalu memberikan dukungan dan

semangat

5. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan ilmu

pengetahuan, bimbingan dan bantuan selama penulis menempuh pendidikan di

farmasi, FKIK UIN Jakarta

6. Teman-teman Andalusia yang telah menjadi kepingan memori yang berharga.

Kebersamaan kita di dalam suka dan duka akan selalu terkenang didalam hati

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

7. Kak Rahmadi, Kak Liken, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Rani, Kak Tiwi, Kak

Lilis, dan Kak Ai yang sangat banyak membantu penulis melakukan penelitian

di laboratorium.

8. Teman-teman seperjuangan tim PCR: Yanti dan Kak Sulaiman yang selalu

meluangkan waktunya untuk bekerja sama, berdiskusi, memberikan masukan,

membantu penulis dalam melakukan peneltian, serta memberikan dukungan

doa dan semangat kepada penulis dalam penyelesaian skripsi ini. Terimakasih

atas kebersamaan yang indah ini.

9. Tim Roche Indonesia: Pak Deka, Pak Yos, dan Mbak Helen yang telah

memberikan masukan dan bantuan selama penulis melakukan penelitian.

10. Sahabat tersayang “ngocol”: Dias, Zakiya, Ipho, Vicka, Diah, Amel, Dita, dan

Desi yang senantiasa mewarnai kehidupan selama dikampus. Terima kasih atas

dukungan, kasih sayang, perhatian, doa dan persahabatan yang indah ini.

11. Farida, Yusna, Fahrur, Yuni, Deisy, Desti, Hanny, Liana, Delvina, Mayta,

Athiyah, Fathia, Dwikky, Hadi, Fikry, yang menginspirasi. Terimakasih atas

dukungan dan semangatnya.

12. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak

dapat disebutkan namanya satu persatu.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapatkan balasan dari Allah

SWT. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari

kesempurnaan. Oleh karena itu, saran dan kritik yang bersifat membangun akan

penulis nantikan. Dan semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu

pengetahuan.

Jakarta, 14 Oktober 2014

Penulis

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:


NIM : 1110102000014

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul :

Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe

dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan

Menggunakan Real Time PCR

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : Oktober 2014

Yang menyatakan,

Afifah Nurul Izzah

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL................................................................................................. i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS..................................................... ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING......................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI.................................................................. iv

ABSTRAK.................................................................................................................. v

ABSTRACT............................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR............................................................................................... vii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.............................. ix

DAFTAR ISI.............................................................................................................. x

DAFTAR GAMBAR................................................................................................. xii

DAFTAR TABEL...................................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................. xiv

DAFTAR SINGKATAN........................................................................................... xv

DAFTAR ISTILAH................................................................................................... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN.......................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang......................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah.................................................................................... 3

1.4 Tujuan Penelitian..................................................................................... 3

1.5 Manfaat Penelitian................................................................................... 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA................................................................................ 4

2.1 Gelatin...................................................................................................... 4

2.1.1 Sifat Fisika Kimia Gelatin............................................................. 5

2.1.2 Struktur Kimia Gelatin.................................................................. 7

2.1.3 Aplikasi dan Pemanfaatan gelatin................................................. 7

2.2 Asam Nukleat.......................................................................................... 8

2.2.1 DNA............................................................................................... 9

2.2.3.1 Struktur DNA................................................................... 9

2.2.3.2 Sifat Fisika DNA.............................................................. 11

2.2.2 DNA Mitokondria.......................................................................... 12

2.3 Ekstraksi dan Isolasi DNA....................................................................... 14

2.4 Elektroforesis Gel Agarosa...................................................................... 16

2.5 PCR.......................................................................................................... 18

2.5.1 Pengertian PCR.............................................................................. 18

2.5.2 Tahapan PCR................................................................................. 19

2.5.3 Komponen PCR............................................................................. 22

2.6 Real-Time PCR........................................................................................ 22

2.6.1 Pewarna Fluoresens....................................................................... 23

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 3 Metodologi Penelitian................................................................................... 26

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian.................................................................. 26

3.1.1 Tempat........................................................................................... 26

3.1.2 Waktu............................................................................................. 26

3.2 Alat dan Bahan........................................................................................ 26

3.2.1 Alat................................................................................................ 26

3.2.2 Bahan............................................................................................. 26

3.3 Prosedur Penelitian.................................................................................. 27

3.3.1 Ekstraksi dan Isolasi DNA............................................................ 27

3.3.2 Analisis Isolat DNA....................................................................... 29

3.3.2.1 Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa....... 29

3.3.2.2 Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV.......... 30

3.3.3 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI.......... 31

3.3.4. Amplifikasi DNA Menggunakan Real Time PCR........................ 31

3.3.5.1 Amplifikasi DNA dengan Metode SYBR Green............... 31

3.3.5.2 Amplifikasi DNA dengan Metode Hydrolysis Probe....... 34

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................... 36

4.1 Hasil Analisis Isolat DNA....................................................................... 36

4.1.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa........... 36

4.1.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV............. 37

4.2. Hasil Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI.......... 38

4.3 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan Real

Time Polymerase Chain Reaction (PCR)................................................

40

4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan

Real Time PCR dengan Metode SYBR Green................................

40

4.3.2 Hasil Ampifikasi DNA Gelatin Sapi dan Babi Menggunakan

Real Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe........................

46

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN..................................................................... 50

5.1 Kesimpulan.............................................................................................. 50

5.2 Saran........................................................................................................ 50

DAFTAR PUSTAKA................................................................................................ 51

LAMPIRAN............................................................................................................... 57

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Metode Ekstraksi Gelatin dari Jaringan yang Mengandung

Kolagen...........................................................................................

5

Gambar 2.2 Struktur dan Asam Amino Penyusun Kolagen dan Gelatin............ 6

Gambar 2.3 Komponen Asam Amino Penyusun................................................ 7

Gambar 2.4 Struktur Nukleotida......................................................................... 9

Gambar 2.5 Ikatan Fosfodiester pada DNA dan RNA....................................... 10

Gambar 2.6 Struktur DNA.................................................................................. 11

Gambar 2.7 Struktur Mitokondria...................................................................... 12

Gambar 2.8 Struktur DNA Mitokondria............................................................. 13

Gambar 2.9 Presipitasi DNA Setelah Penambahan Etanol Absolut................... 15

Gambar 2.10 Interkalasi Etidium Bromida pada DNA......................................... 18

Gambar 2.11 Tahapan Proses PCR....................................................................... 19

Gambar 2.12 Pelipatgandaan Molekul DNA Target............................................ 21

Gambar 2.13 Bentuk Kurva Real-Time PCR........................................................ 23

Gambar 2.14 Mekanisme Hydrolysis Probe dan SYBR Green............................. 25

Gambar 4.1 Hasil Elektroforesis Isolat DNA..................................................... 37

Gambar 4.2 Hasil Uji Spesifisitas Primer Babi pada Database NCBI............... 39

Gambar 4.3 Hasil Uji Spesifisitas Primer Sapi pada Database NCBI................ 39

Gambar 4.4 Kurva Amplifikasi dengan Metode SYBR Green Menggunakan

Primer Sapi......................................................................................

41

Gambar 4.5 Melting Peaks Hasil Amplifikasi dengan Metode SYBR Green

Menggunakan Primer Sapi..............................................................

42

Gambar 4.6 Kurva Amplifikasi dengan Metode SYBR Green Menggunakan

Primer Babi.....................................................................................

44

Gambar 4.7 Melting Peaks Hasil Amplifikasi dengan Metode SYBR Green

Menggunakan Primer Babi.............................................................

45

Gambar 4.8 Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe

Menggunakan Primer-Probe Sapi...................................................

47


Menggunakan Primer-Probe Babi...................................................

48

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Kisaran Umum Konsentrasi Agarosa................................................... 17

Tabel 2 Urutan Basa Primer-Probe.................................................................... 27

Tabel 3 Pengaturan Program Amplifikasi dengan Metode SYBR Green.......... 32

Tabel 4 Pengaturan Program Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe.. 34

Tabel 5 Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi..................................... 38

Tabel 6 Campuran Reaksi SYBR Green Mastermix.......................................... 60

Tabel 7 Campuran Reaksi Hydrolysis Probe Mastermix.................................. 60

Tabel 8 Spesifikasi Kit Ekstraksi Komersial..................................................... 62

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Kerangka Penelitian................................................................... 57

Lampiran 2 Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe................... 58

Lampiran 3 Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer........................ 60

Lampiran 4 Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA............. 61

Lampiran 5 Hasil Optimasi Suhu Annealing dengan Metode Gradien PCR. 62

Lampiran 6 Spesifikasi Kit Ekstraksi dan Isolasi DNA................................ 63

Lampiran 7 Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan Metode

SYBR Green Menggunakan Primer Sapi dengan Suhu

Annealing 60oC..........................................................................

64



Annealing 62oC..........................................................................

65



Annealing 64oC..........................................................................

66



Annealing 65oC..........................................................................

67


SYBR Green Menggunakan Primer Babi dengan Waktu

Annealing 10 detik dan Waktu Extension 7 detik......................

68



Annealing 20 detik dan Waktu Extension 30 detik....................

69



Annealing 20 detik dan Waktu Extension 25 detik....................

70

Lampiran 14 Hasil Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe

Menggunakan Primer Sapi.........................................................

71

Lampiran 15 Hasil Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe

Menggunakan Primer Babi.........................................................

71

Lampiran 16 Gambar Alat yang Digunakan dalam Penelitian........................ 72

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

BHQ-1 : Black Hole Quencher-1

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool

CP : Crossing Point

cyt b : Cytochrome b

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

dNTP : Deoxyribonucleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythymidine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

ELISA : Enzyme-linked Immunosorbent Assay

FAM : Fluorescein Amidite

FTIR : Forier Transform Infrared Spectroscopy

LCMS : Liquid Chromatography Mass-Spectrophotometry

mtDNA : mitochondria DNA

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NTC : No Template Control

PCR : Polymerase Chain Reaction

pb : Pasang Basa

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction

RE : Retikulum Endoplasma

RNA : Ribonucleic Acid

SDS : Sodium Dodesil Sulfat

TAE : Tris-Acetate-EDTA

Tm : Temperature Melting

Ta : Temperature Annealing

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISTILAH

BLAST : Basic Local Aligment Search Tool merupakan program

untuk menganalisis kesejajaran sekuen query (DNA atau

protein) dengan sekuen DNA atau protein pada database

NCBI.

Blastn : Nucleotide Basic Local Aligment Search Tool merupakan

salah satu variasi dari program BLAST untuk menganalisis

kesejajaran nukleotida query dengan nukleotida pada

database di NCBI.

CP : Crossing Point merupakan siklus yang menunjukkan sinyal

fluoresensi dari akumulasi amplikon telah melewati garis

threshold.

Garis Treshold : Garis penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu saat sinyal

fluoresensi berada pada tingkat terendah ( siklus 3-15).

Formasi Hairpin : Terbentuknya struktur loop/hairpin pada primer yang

disebabkan oleh interaksi intramolekular yang dapat

memicu terbentuknya amplifikasi yang nonspesifik.

Melting curve : Analisis data pada Real-time PCR digunakan untuk menguji

spesifisitas amplikon yanng terbentuk.

Mis-priming : Penempelan primer di luar sekuen target sehingga

membentuk produk amplifikasi yang nonspesifik.

NCBI : National Center for Biotechnology Information merupakan

suatu institusi milik United States National Library of

Medicine yang berperan sebagai sumber informasi

perkembangan biologi molekular. Situs NCBI berisi

database meliputi gene bank mengenai sekuens DNA atau

protein serta memuat publikasi ilmiah.

NTC : No Template Control merupakan kontrol negatif karena well

tidak dimasukkan DNA.

Primer-Dimer : Berikatannya suatu primer dengan primer sejenis atau

dengan primer lainnya sehingga membentuk produk

amplifikasi yang nonspesifik.

Query : Sekuen yang dimasukkan ke dalam program BLAST untuk

diketahui kesejajarannya.

Tm : Temperature melting atau suhu melting adalah suhu saat

50% bagian DNA telah terbuka menjadi untai tunggal.

1


BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 LATAR BELAKANG

Gelatin adalah polipeptida larut air yang merupakan hasil hidrolisis

parsial kolagen dari kulit, tulang dan tulang rawan hewan (Zhang et al.,

2008). Gelatin memiliki sifat yang unik dan berbagai fungsi yaitu sebagai zat

pembentuk gel, zat pengental, zat pembentuk film, zat pengemulsi, dan zat

pensuspensi (Rowe, Sheskey & Quinn, 2009). Oleh karena itu gelatin

digunakan secara luas dalam berbagai sektor industri, misalnya sektor industri

farmasi, makanan, fotografi, kosmetik, dan produk kedokteran. Dalam

industri makanan, gelatin dapat ditemukan dalam produk ice cream, jelly,

dan marshmallow. Pada industri farmasi, gelatin digunakan dalam tablet,

cangkang kapsul keras dan lunak, tablet salut gula, enkapsulasi vitamin, dan

pensubtitusi plasma darah (Nhari, Ismail & Che Man, 2012).

Sumber gelatin yang beredar di pasaran berasal dari babi, sapi, tulang

ikan, kerang, rumput laut, dan lain-lain (Hinterwaldner, 1997; R.T. Jones,

2004). Produksi gelatin di dunia pada tahun 2007 dilaporkan bahwa 46%

berasal dari kulit babi; 29,4% dari kulit sapi; 23,1% dari campuran tulang

babi dan sapi; dan 1,5% dari tulang ikan, kerang, dan lain-lain (Guillen et al.,

2009). Pembuatan gelatin yang bersumber dari babi dan sapi lebih banyak

diminati karena gelatin yang dihasilkan memberikan kualitas yang lebih baik

dibandingkan dengan sumber lainnya seperti ikan (Hinterwaldner, 1997).

Gelatin umumnya masih diimpor dari negara-negara nonmuslim

sehingga menimbulkan kontroversi kehalalannya. Pemanfaatan gelatin dalam

berbagai bidang industri dan peningkatan kesadaran masyarakat muslim

terhadap penggunaan produk halal, menimbulkan konsekwensi perlunya

perlindungan konsumen dengan pemberian jaminan kehalalan sumber gelatin

(Jamaludin et al., 2012). Hal ini membutuhkan metode identifikasi gelatin

sapi dan gelatin babi yang handal, tepercaya, efektif, dan efisien.

1

2


Keberadaan gelatin babi dan sapi pada produk pangan, kosmetik, dan

obat-obatan sangat sukar untuk diidentifikasi karena memiliki sifat fisik dan

kimia yang sangat mirip (Nemati et al., 2004). Oleh karena itu, perlu

diupayakan metode yang akurat untuk identifikasi gelatin sapi dan gelatin

babi. Metode identifikasi gelatin sapi dan gelatin babi telah banyak dilakukan

dan dikembangkan. Di antaranya dengan teknik presipitasi kimia (Hikada dan

Liu, 2003), FTIR (Hashim et al., 2010), LCMS (Zhang et al., 2008), ELISA

(Venien dan Levieux, 2005), dan analisis berbasis DNA dengan Real Time

PCR (Cai et al., 2011; Demirhan et al., 2011).

DNA merupakan molekul yang memiliki kestabilan tinggi, sehingga

analisis berbasis DNA dengan Real Time PCR dapat dilakukan pada produk

olahan. Selain itu, metode ini dapat mendeteksi campuran gelatin babi dan

gelatin sapi dengan level kontaminasi 1% (Cai et al., 2011; Demirhan et al.,

2011). Dengan metode ini, kita dapat mengamati secara langsung hasil

amplifikasi atau perbanyakan DNA fragmen. Metode ini juga dapat

menentukan konsentrasi DNA yang terdapat pada sampel dengan mengukur

peningkatan pewarna fluoresens yang berpendar ketika terikat dengan untai

ganda DNA (Arya et al., 2005). Dengan demikian, analisis kehalalan gelatin

dengan Real-Time PCR merupakan metode yang sederhana, handal dan

terpercaya (Cai et al., 2011).

Dalam mendeteksi dan identifikasi DNA pada sampel, Real Time PCR

membutuhkan pewarna fluoresens. Pewarna fluoresens yang umum

digunakan dalam Real-Time PCR adalah SYBR Green dan Hydrolysis Probe.

Pewarna fluoresens SYBR Green akan berpendar ketika terinterkalasi dengan

untai ganda DNA. Sedangkan fluoresens dari Hydrolysis Probe akan

berpendar ketika Probe, yang merupakan dua pewarna fluoresens (terdiri atas

Reporter dan Quencher), secara fisik terpisah melalui hidrolisis oleh aktivitas

nuclease (Arya et al., 2005). Dibandingkan Hydrolysis Probe, metode SYBR

Green lebih ekonomis dan mudah dalam penanganan. SYBR Green tidak

memerlukan Probe yang membutuhkan banyak biaya untuk mensintesisnya.

Namun demikian, SYBR Green sangat tergantung dari spesifisitas primer

karena dapat menyebabkan terjadinya mis-priming dan primer-dimer

3


sehingga menyebabkan terbentuknya produk amplifikasi yang nonspesifik.

Sedangkan Hydrolysis Probe lebih mampu mencegah terjadinya produk

amplifikasi yang nonspesifik (Arya et al., 2005).

Pada penelitian ini akan dilakukan perbandingan antara metode SYBR

Green dan metode Hydrolysis Probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan

DNA gelatin babi dengan menggunakan Real Time PCR.

1.2 RUMUSAN MASALAH

a. Belum diketahuinya efektivitas metode SYBR Green dan Hydrolysis

Probe dalam menganalisis DNA gelatin sapi dan gelatin babi

menggunakan Real Time PCR.

b. Belum diketahuinya apakah metode SYBR Green dan metode Hydrolysis

Probe secara spesifik dapat mengamplifikasi DNA gelatin sapi atau

gelatin babi.

1.3 TUJUAN PENELITIAN

Mengetahui perbandingan hasil analisis DNA gelatin sapi dan DNA

gelatin babi dengan metode SYBR Green dan Hydrolisis Probe.

1.4 MANFAAT PENELITIAN

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

perbandingan metode SYBR Green dan metode Hydrolysis Probe dalam

analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi, khususnya pada produk

makanan, obat-obatan, ataupun kosmetik yang mengandung gelatin.

4


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gelatin

Kata gelatin berawal dari bahasa latin “gelatus” yang berarti kaku

atau beku. Gelatin adalah polipeptida hasil hidrolisis parsial kolagen yang

diperoleh dari jaringan ikat, kulit, atau tulang rawan sapi dan babi. Proses

hidrolisis ini dapat dikatalisis dengan penambahan asam kuat atau basa kuat

(Rabadiya, 2013). Ketika kolagen diperlakukan dengan asam atau basa dan

diikuti dengan panas, struktur fibrosa kolagen dipecah ireversibel

menghasilkan gelatin. Gelatin dihasilkan melalui cross-linking (ikatan silang)

diantara rantai polipetida pada kolagen dengan disertai sejumlah perusakan

pada rantai ikatan peptida (Zhou dan Regenstein, 2004). Selain berasal dari

hewan mamalia, gelatin juga dapat diperoleh dari limbah tulang ikan.

Pembuatan gelatin merupakan upaya untuk mendayagunakan limbah tulang

yang biasanya tidak terpakai dan dibuang dirumah pemotongan hewan (Balti

et al., 2010).

Berdasarkan proses pembuatannya, gelatin dapat dikategorikan

dalam dua prinsip dasar (Jannah, 2008), yaitu:

a. Gelatin Tipe A (Acid)

Gelatin ini dihasilkan dengan proses asam dari bahan baku kolagen.

Tipe A umumnya diperoleh dari kulit babi, tetapi ada juga beberapa

pabrik yang menggunakan bahan dasar tulang babi. Kulit dari babi

muda tidak memerlukan penanganan alkalis yang intensif, karena

jaringan ikatnya tidak terlalu kuat. Oleh karena itu, pada proses ini

kulit muda cukup direndam dengan asam klorida (HCl) encer selama

beberapa hari, kemudian dinetralkan dan dicuci beberapa kali dengan

aquadest agar garam yang terbentuk hilang.

b. Gelatin Tipe B (Base)

Gelatin tipe tipe ini dihasilkan melalui proses basa atau alkali. Bahan

dasar biasanya berasal dari kulit tua atau keras maupun tulang

4

5


ruminasia. Proses pembuatannya yaitu bahan mula-mula direndam

dalam larutan kalsium hidroksida, sehingga ikatan jaringan kolagen

akan mengembang dan terurai. Kemudian bahan dinetralkan dengan

asam dan dicuci dengan aquadest untuk menghilangkan garam yang

terbentuk.

Gambar 2.1 Metode ekstrasi gelatin dari jaringan yang mengandung kolagen

(Sumber: Ikada, 2002)

2.1.1 Sifat Fisika Kimia Gelatin

Fraksi protein pada gelatin hampir seluruhnya terdiri atas berbagai

macam asam amino yang bergabung melalui ikatan amida dan membentuk

polimer yang linear. Gelatin memiliki berat molekul yang bervariasi yaitu

20 kDa sampai 200 kDa. Kadar protein pada gelatin tinggi yaitu pada

gelatin kering (dengan kadar air 8 – 12%) mengandung protein sekitar 84 -

86% (Carr et al.,1995).

Gelatin komersial secara luas diproduksi di berbagai belahan dunia.

Di eropa, gelatin untuk pangan tersedia dalam bentuk lembaran tipis (flake),

sedangkan di Amerika Serikat gelatin dapat diperoleh dalam bentuk granul

atau serbuk. Gelatin tidak memiliki rasa dan bau. Warna serbuk granul dan

flakes pada gelatin yaitu putih agak kuning pucat. Pada bentuk lembaran,

gelatin berwarna kuning pucat transparan (Rowe, Sheskey & Quinn, 2009).

6


Gelatin praktis tidak larut dalam pelarut organik seperti aseton,

kloroform, etanol (95%), eter dan metanol. Zat ini larut dalam gliserin,

larutan asam dan basa. Namun pada larutan asam kuat atau basa kuat,

gelatin akan mengalami presipitasi. Gelatin larut dalam air hangat dan

apabila didinginkan dibawah suhu 30oC, larutan koloid ini akan membetuk

gel dengan sifat tiksotropik dan reversibel menjadi cair kembali apabila

dipanaskan. pH larutan atau gel gelatin akan berbeda tergantung tipenya

yaitu tipe A pH 3,8 – 5,5; sedangkan tipe B pH 5,0 – 7,5.

Gambar 2.2. Struktur dan Asam Amino Penyusun Kolagen dan Gelatin

(Sumber: http://www.gelatin.in)

Bloom (kekuatan gel) tergantung pada konsentrasi gelatin di dalam air,

berat molekul gelatin, dan pH gel. Bloom akan meningkat apabila

konsentrasi gelatin tinggi, berat molekul gelatin tinggi, dan pH gel yang

mendekati netral. Gelatin memiliki kekuatan Bloom yang bervariasi, yaitu

50 hingga 300. Industri gelatin umumnya mencampur bahan baku untuk

mendapatkan kekuatan gel yang diinginkan (Rabadiya, 2013).

2.1.2 Struktur Kimia Gelatin

Struktur gelatin terdiri dari 300 sampai 4.000 rantai asam amino yang

dihubungkan oleh ikatan peptida. Gelatin mengandung sejumlah 18 asam

7


amino spesifik yang berbeda dan bekerja sama berurutan untuk membentuk

rantai polipeptida dengan 1000 asam amino setiap rantai. Sebanyak 3 rantai

polipeptida terbentuk bekerja sama sebagai spiral sisi kiri untuk memberi

struktur sekunder. Dalam struktur tersier, spiral menggulung dan melipat

sendiri pada sisi kanan (triplehelix). Ini membentuk molekul berbentuk

tangkai yang disebut protofibril.

Rantai asam amino dominan yang terdapat dalam gelatin adalah glysin

(26-34%), prolin (10-18%) dan hidroksiprolin (7-15%). Jenis asam amino

lain terdapat dalam gelatin, yaitu alanin (8-11%), arginin (8-9%), asam

aspartat (6-7%), dan asam glutamat (10-12%). Meskipun demikian, gelatin

bukan merupakan protein yang lengkap. Hal ini karena gelatin tidak

mengandung asam amino triptofan dan hanya sedikit mengandung asam

amino isoleusin, treonin, metionin, sistein, dan sistin (Rabadiya, 2013).

Gambar 2.3. Komponen Asam Amino Penyusun Gelatin

(Sumber: http://www.pbgelatins.com)

2.1.3 Aplikasi dan pemanfaatan gelatin

Gelatin merupakan bahan pangan yang telah lama digunakan

secara luas pada produk pangan dan farmasi. Gelatin tidak memiliki rasa

dan bau, akan tetapi gelatin memiliki sifat gel yang unik, sehingga dapat

digunakan sebagai penstabil, pengikat, dan pengemulsi dalam industri

farmasi. Sebagai bahan pangan, gelatin memiliki sifat yang unik sebagai

8


penstabil busa, yaitu dibutuhkan pada saat pembuatan permen. Bahan

pangan yang menggunakan gelatin antara lain cokelat, susu, permen, jelly,

roti, marshmallow, pada produk daging sebagai pengikat air, dan lain-lain.

Sedangkan penggunaan gelatin pada industri farmasi dan kedokteran

meliputi cangkang kapsul, salut tablet, zat pengemulsi dan penstabil dalam

pembuatan krim, mikroenkapsulasi, dan plasma pensubtitusi darah. Tidak

hanya pada industri pangan dan farmasi, gelatin juga dapat bermanfaat

pada bidang fotografi yaitu sebagai pelapis zat warna film.

Dari data SKW biosystem, penggunaan gelatin dalam industri

nonpangan sejumlah 100.000 ton, pada industri pembuatan film foto

sebanyak 27.000 ton, untuk kapsul lunak sebanyak 22.600 ton, untuk

produksi cangkang capsul keras sebanyak 20.200 ton, serta dalam dunia

farmasi dan teknis sebanyak 12.000 ton dan 6.000 ton. Penggunaan gelatin

dalam industri pangan adalah sebesar 154.000 ton, dimana penggunaan

terbesar adalah industri konfeksioneri yaitu sebesar 68.000 ton, dan produk

jelli sebanyak 36.000 ton. Pada industri daging dan susu memiliki jumlah

penggunaan gelatin yang sama yaitu 16.000 ton dan pada makanan

fungsional (food supplement) memeliki kontribusi penggunaan gelatin

yang sama yaitu sebesar 4.000 ton (LPPOM MUI, 2008).

2.2. Asam Nukleat

Asam nukleat dan protein merupakan senyawa polimer utama yang

terdapat pada sel. Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan

informasi genetik dalam sel (Koolman & Roehm, 2005). Sel mempunyai

dua jenis molekul asam nukleat yaitu DNA (asam deoksiribonukleat) dan

RNA (asam ribonukleat). DNA menyimpan informasi genetik yang spesifik

untuk setiap individu dan spesies tertentu, yang akan diwariskan ke generasi

berikutnya (Gaffar, 2007). DNA ditemukan di dalam nukleus pada sel

eukariotik, dan ditemukan di sitoplasma atau nukleoid pada sel prokariotik.

Molekul RNA disintesis dari DNA template dan berperan dalam

pembentukan protein didalam sitoplasma (Stansfield et al., 2003).

9


2.2.1 DNA

2.2.1.1 Struktur DNA

DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang

tersusun dari subunit nukleotida. Nukleotida merupakan ester dari asam

fosfat dan nukleosida. Komponen penyusun nukleotida terdiri dari tiga

jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa

pada RNA), basa nitrogen heterosiklik, dan gugus fosfat yang bermuatan

negatif (Gaffar, 2007).

Gambar 2.4. Struktur Nukleotida (Sumber: Gaffar, 2007)

Basa yang ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin =

A, guanin = G) dan basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, dan urasil =

U). Monomer nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon

3’, gugus fosfat pada posisi karbon 5’ dan basa pada posisi karbon 1’

molekul gula. Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan membentuk

polinukleotida melalui ikatan fosfodiester antara gugus 5’fosfat dengan

gugus 3’hidroksil. Sehingga tulang punggung molekul DNA dan RNA

terdiri dari gugus fosfat dan pentosa secara bergantian (Stansfield et al.,

2003).

Struktur DNA mirip dengan struktur RNA. Perbedaan diantara

keduanya terdapat pada jenis gula dan basa pada monomernya serta

jumlah untai penyusunnya. DNA tidak terdapat gugus hidroksil pada

posisi karbon 2’ dari molekul gula (2-deoksiribosa) sementara pada RNA

molekul gulanya adalah ribosa. Basa nitrogen yang terdapat pada DNA

adalah adenin, guanin, sitosin dan timin, sedangkan pada RNA jenis

10


basanya adalah adenin, sitosin, guanin dan urasil. RNA merupakan

polinukleotida yang membentuk satu rantai/untai sedangkan DNA

merupakan polinukleotida yang membentuk 2 untai (heliks ganda) yang

memutar ke kanan. Kedua rantai polinukleotida memutar pada sumbu

yang sama dan bergabung satu dengan yang lainnya melalui ikatan

hidrogen antara basa-basanya (Gaffar, 2007).

Gambar 2.5. Ikatan Fosfodiester pada DNA dan RNA (Gaffar, 2007)

11


Pada DNA, basa guanin berpasangan dengan basa sitosin

membentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan basa adenin berpasangan

dengan basa tymin membentuk dua ikatan hidrogen. Sehingga dalam

molekul DNA jumlah basa G akan selalu sama dengan jumlah basa C,

sedangkan jumlah basa A sama dengan jumlah basa T. Kemudian jumlah

basa purin akan sama dengan jumlah basa pirimidin (Purves et al., 2004).

Gambar 2.6. Struktur DNA (Sumber: Purves et al., 2004)

Untai ganda DNA saling berkomplementasi melalui basa

penyusunnya dengan arah antiparalel (berlawanan 5’→ 3’ dan 3’→5’),

ujung yang mengandung gugus fosfat bebas disebut ujung 5’ sedangkan

pada ujung lainnya yang mengandung gugus hidroksil bebas disebut

ujung 3’. Kedua untai tersebut saling melilit satu sama lain membentuk

struktur heliks ganda. Gugus fosfat dan gula yang tersusun bergantian

menjadi tulang punggung (backbone) molekul DNA sementara pada

bagian dalam terdapat basa yang melekat pada molekul gula (Gaffar,

2007). Struktur helix ganda membentuk pilinan berjarak 3.4 nm dengan

sepuluh pasang basa setiap pilinan dan memiliki lebar sekitar 2 nm

(Stansfield, 2003).

2.2.1.2 Sifat Fisika DNA

Untai heliks DNA dapat memisah menjadi struktur untai tunggal

dengan adanya pemanasan dengan suhu tinggi (> 90oC), peristiwa ini

12


sering dikenal dengan denaturasi. Denaturasi DNA bersifat reversible.

Proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan

terdenaturasi disebut renaturasi. Proses renaturasi dapat berjalan jika suhu

mendekati suhu subdenaturasi (mendekati 60oC). DNA menyerap sinar

UV pada panjang gelombang 260 nm (Yuwono, 2009).

2.2.2 DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan organel sel yang berfungsi sebagai penghasil

energi dalam bentuk ATP yang akan dipergunakan untuk aktivitas seluruh

sel-sel tubuh manusia. Mitokondria memiliki diameter sebesar 1-2 μm

(Passarge, 2007). Sel eukariotik rata-rata terdiri dari 103-104 salinan

mitokondria yaitu mencapai 25% volume sel. Mitokondria dikelilingi oleh

dua membran yaitu membran dalam dan membran luar. Membran bagian

dalam membentuk lipatan-lipatan yang disebut kristae dimana terdapat

enzim-enzim oksidase. Membran dalam juga memiliki permukaan yang

besar yang mengelilingi ruang matriks. Matriks ini mengandung DNA,

RNA, ribosom, dan berbagai enzim yang berperan dalam oksidasi zat-zat

makanan. DNA yang terdapat pada mitokondria disebut DNA mitokondria

atau disingkat menjadi mtDNA (Koolman dan Roehm, 2005).

Gambar 2.7. Sruktur Mitokondria (Koolman dan Roehm, 2005).

Umumnya, mitokondria terdiri dari 2-10 molekul DNA. mtDNA

merupakan DNA rantai ganda yang berbentuk sirkuler dengan ukuran

genom mitokondria hewan berkisar 14000-39000 pasang basa. Ukuran

13


mtDNA relatif sangat kecil dibandingkan dengan ukuran DNA inti. DNA

mitokondria hewan secara umum memiliki jumlah dan jenis gen yang sama

yaitu 13 daerah yang mengkode protein (URF1, URF2, URF3, URF4,

URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrome Oxidase unit I, Cytochrome

Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase unit III, Cytochrome b dan ATPase 6);

2 gen pengkode rRNA yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA; dan 22 gen

pengkode tRNA (Sharma et al., 2005).

Gambar 2.8. Struktur DNA Mitokondria (www.bmb.leeds.ac.uk)

Karakteristik mtDNA dapat dijadikan alat yang signifikan untuk

keperluan analisis. mtDNA mempunyai jumlah copy yang tinggi, meskipun

di dalam sel yang tidak mengandung inti. Jumlah copy per sel yaitu sekitar

1000-10000 sehingga mtDNA dapat digunakan untuk analisis sampel

dengan jumlah DNA yang sangat terbatas, atau DNA yang mudah

terdegradasi, apabila analisis DNA inti tidak dapat dilakukan. mtDNA

manusia diturunkan secara maternal sehingga setiap individu pada garis

keturunan ibu yang sama akan mempunyai tipe mtDNA yang identik.

Ukuran DNA mitokondria relatif kecil (14-39 kb) sehingga dapat dipelajari

sebagai satu kesatuan yang utuh. mtDNA mempunyai laju polimorfisme

yang tinggi dengan laju evolusinya sekitar 5-10 kali lebih cepat dari DNA

inti (Hartati et al., 2004).

14


2.3 Ekstraksi dan Isolasi DNA

Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen-

komponen sel. Isolasi DNA dari organisme eukariotik dilakukan melalui

proses penghancuran membran sel (lisis), pemisahan DNA dari protein sel,

dan purifikasi DNA (Muladno, 2010). Berikut adalah uraian tahapan isolasi

DNA:

1. Penghancuran Membran Sel (lisis)

Untuk mendapatkan DNA, membran terlebih dahulu dilisiskan dengan

senyawa kimia seperti lisozim, EDTA, dan SDS. Lisozim merupakan

enzim yang dapat memakan dinding sel. Penggunaan Lisozim biasanya

untuk ekstraksi dan isolasi DNA dari sel tumbuhan. EDTA merupakan

zat yang dapat merusak membran sel dengan cara mengikat ion Mg2+

yang berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun

mempertahankan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam nukleat.

SDS (sodium dodesil sulfat) merupakan detergent yang dapat merusak

integritas membran sel dengan cara mengikat lipid yang terdapat pada

membran sel. Larutan pelisis sel umumnya terdiri atas satu atau lebih

detergent seperti SDS, NP-40, atau Triton X-100. Sel debris yang

ditimbulkan akibat cairan pelisis dilakukan setrifugasi sehingga hanya

tertinggal molekul nukleotida.

2. Pemisahan DNA dari Protein Sel

Protein pada sel dihancurkan dengan bantuan enzim proteinase K.

Enzim ini dapat memecahkan protein histon sehingga DNA terurai.

Untuk menghilangkan protein dari larutan, digunakan fenol (untuk

mengikat protein dan sebagian kecil RNA) dan kloroform (untuk

membersihkan protein dan polisakarida dari larutan). Umumnya

ditambahkan dengan perbandingan 1:1. Kemudian dilakukan

sentifugasi kembali untuk mengendapkan molekul yang berat, dan

dipisahkan DNA yang berada pada supernatant.

3. Purifikasi DNA

DNA yang telah dibersihkan dari protein masih tercampur dengan

RNA. Untuk membersihkan molekul RNA dari larutan, enzim RNAse

15


digunakan untuk mendegradasi molekul RNA. Dengan hilangnya

protein dan RNA, maka DNA dapat diisolasi secara utuh. Molekul

DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan cara

presipitasi menggunakan etanol absolut dan larutan garam. Dengan

adanya larutan garam (kation monovalen seperti Na+), pada suhu -20oC

etanol absolut dapat mengendapkan DNA dengan baik sehingga mudah

dipisahkan dengan cara sentrifugasi.

Gambar 2.9. Presipitasi DNA setelah Penambahan Etanol Absolut

(Sumber: www.learn.genetics.utah.edu)

Pada umumnya isolasi DNA dengan metode konvensional yang

dijelaskan sebelumnya cukup melelahkan karena membutuhkan waktu hingga

beberapa jam bahkan beberapa hari. Selain itu, berkembang pesatnya

kebutuhan di bidang diagnostik molelular dan filogeni molekular yang

menuntut kecepatan, prosedur yang sederhana, hasil yang akurat dalam

ekstraksi DNA dari berbagai jenis sampel, menciptakan pengembangan

teknologi baru untuk pengektraksian DNA yang mudah dan lebih cepat dari

sebelumnya.

Salah satu pengembangan teknik purifikasi DNA adalah dengan

bantuan spin column yang mengandung silicon dioxide sebagai filter yang

dapat mengabsorpsi asam nukleat (Chee Tan dan Chin Yiap, 2009). Prinsip

ekstraksi dan isolasi DNA dengan metode ini adalah berdasarkan tingginya

afinitas muatan negatif dari rantai utama DNA terhadap partikel silika yang

bermuatan positif. DNA dapat terikat dengan kuat pada silika dibawah

16


kondisi garam chaotropic seperti Guanidine-HCl. Garam ini dapat memecah

ikatan hidrogen antara ion oksigen pada DNA dengan ion hidrogen pada air.

DNA yang terabsorpsi oleh silika dapat dipisahkan dari protein dan sel debris

dengan pencucian. DNA murni kemudian dapat dielusi dari silika dengan

buffer Tris-EDTA atau Aquabidest (Gjerse et al., 2009).

2.4 Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi suatu

campuran berdasarkkan pergerakan partikel koloid yang bermuatan dibawah

pengaruh medan listrik. Cara elektroforesis telah digunakan untuk analisa

virus, asam nukleat, enzim, protein, serta molekul-molekul organik dengan

berat molekul rendah seperti asam amino (Westermeier, 2004).

Salah satu gel yang dapat digunakan pada elektroforesis adalah gel

agarosa. Agarosa digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

memurnikan fragmen-fragmen DNA dengan ukuran molekul lebih besar dari

100 pb dan dijalankan secara horizontal. Molekul DNA termasuk senyawa

bermuatan negatif. Sifat ini menjadikan molekul DNA yang ditempatkan

pada medan listrik akan bermigrasi menuju kutub positif

Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh

beberapa faktor (Sambrook et al., 2001), yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA

Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang DNA.

Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat

dibandingkan dengan fragmen DNA yang berukuran lebih besar.

Sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen berdasarkan

ukuran panjangnya.

2. Konsentrasi Agarosa

Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih

cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel

berkonsentrasi tinggi.

17


Tabel 1. Kisaran umum konsentrasi agarosa (Muladno, 2010)

Konsentrasi

Agarosa (%)

Efisiensi Pemisahan

DNA (kb)

0,3 5-60

0,6 1-20

0,7 0,8-10

0,9 0,5-7

1,2 0,4-6

1,5 0,2-3

2,0 0,1-2

3. Konformasi DNA

Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama

akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda. DNA dalam

bentuk sirkular akan lebih cepat bermigrasi dibandingkan dengan

DNA bentuk linier.

4. Voltase yang Digunakan

Kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang

digunakan. Akan tetapi, apabila penggunaan voltase terlalu tinggi,

mobilitas molekul DNA meningkat secara tajam. Hal ini

mengakibatkan efektifitas pemisahan molekul DNA menurun

dengan meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase

yang ideal untuk mendapatkan separasi molekul DNA berukuran

lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt per cm.

5. Etidium Bromida

Keberadaan etidium bromida di dalam gel dapat mengakibatkan

pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar

15%.

6. Komposisi Larutan Buffer

Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik

akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara

larutan buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas,

sehingga aliran listrik menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan

gel akan meleleh dan DNA dapat mengalami denaturasi.

18


Visualisasi fragment DNA dilakukan dengan penambahan larutan

etidium bromida yang akan masuk (interkalasi) di antara ikatan hidrogen pada

DNA, sehingga pita fragmen DNA akan terlihat di bawah lampu UV

Pita DNA yang berpendar pada gel agarosa menunjukkan hasil positif bahwa

terdapat DNA pada setiap lajur. Larutan etidium bromida sangat berbahaya

dan bersifat karsinogen, oleh karena itu semua larutan yang mengandung

etidium bromida harus didekontaminasi sebelum dibuang. Selain etidium

bromida, pewarnaan dapat dilakukan dengan larutan SYBR safe sebagai

penggantinya (Muladno, 2010; Sambrook dan Russel, 2001; Gaffar, 2007).

Gambar 2.10. Interkalasi Etidium Bromida pada DNA

(Sumber: www.sciencemag.org)

2.5 PCR

2.5.1 Pengertian PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu metode

amplifikasi DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh

dua buah primer oligonukleotida dengan bantuan enzim polymerase,

dimana potongan DNA tertentu dapat dilipat gandakan (Zyskind dan

Bernstain, 1992). Metode ini paling banyak dipelajari dan digunakan

secara luas. Dalam waktu sembilan tahun sejak pertama kali dikemukakan

oleh ilmuan dari Cetus Corporation, Kary Mullis, PCR telah berkembang

19


menjadi teknik utama dalam laboratorium biologi molekuler, antara lain

untuk transkripsi in vitro dari PCR template, PCR rekombinan, DNAse I

footprinting, sequencing dengan bantuan phage promoters, dan sebagainya

(Putra, 1999).

Teknik ini memungkinkan adanya amplifikasi antara dua region

DNA yang diketahui, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu

memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Primer yang digunakan sebagai

pembatas daerah yang diamplifikasi merupakan DNA untai tunggal yang

urutannya komplemen dengan DNA template-nya. Amplifikasi ini dapat

menghasilkan lebih dari satu kali DNA asli.

2.5.2 Tahapan PCR

Menurut Sambrook et al., (2001), tahapan yang terjadi dalam proses

amplifikasi DNA pada PCR yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA

template, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan

pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis

oleh DNA polimerase.

Gambar 2.12. Tahapan Proses PCR (Sumber: www.bioserv.fiu.edu)

1. Denaturasi DNA template

Pada tahap ini, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua

untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang

20


tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa

yang komplemen. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90-

95oC selama 3 menit untuk meyakinkan bahwa molekul DNA

target yang ingin dilipat gandakan jumlahnya benar-benar telah

terdenaturasi menjadi untai tunggal. Untuk denaturasi berikutnya,

waktu yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 95oC atau 15

detik pada suhu 97oC.

Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sekuen DNA target. Jika

DNA target kaya akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih

tinggi, hal ini dikarenakan ikatan hidrogen pada G-C lebih banyak

dibandingkan ikatan A-T. Selain itu, suhu denaturasi juga tidak

boleh terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama, karena

dapat mengakibatkan hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim

Taq polymerase.

2. Penempelan Primer (annealing)

Primer akan menuju daerah yang spesifik, dimana daerah

tersebut memiliki komplemen dengan primernya. Pada proses

annealing ini, ikatan hidrogen akan terbentuk. Selanjutnya, enzim

Taq DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen

tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali.

Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50-60oC. Spesifisitas PCR

sangat tergantung pada suhu melting (Tm) primer, yaitu suhu

dimana separuh jumlah primer menempel pada template.

Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5oC di bawah

Tm, dimana formula untuk menghitung Tm = 4oC (G+C) + 2oC

(A+T). Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi

temperaturnya.

3. Reaksi polimerisasi (extension)

Primer yang telah menempel tadi akan mengalami

perpanjangan pada sisi 3' nya dengan penambahan dNTP yang

komplemen dengan template oleh DNA polimerase. Umumnya

reaksi polimerisasi (extension) atau perpanjangan rantai, terjadi

21


pada suhu 72oC karena merupakan suhu optimum Taq polymerase.

Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu

72oC diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik,

bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA

target. Dengan demikian, untuk produk PCR sepanjang 2000

pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih dari cukup untuk tahap

pemanjangan primer ini.

Ketiga tahapan tersebut terjadi dalam satu siklus. Produk DNA pada

siklus amplifikasi pertama akan menjadi cetakan pada siklus berikutnya.

Produk yang dihasilkan bersifat eksponensial (2n), dengan n adalah jumlah

siklus yang dilakukan (Keller dan Manak, 1989). Ini mengakibatkan PCR

sangat efektif karena dapat menghasilkan DNA dalam jumlah mikrogram

dari jumlah DNA awal dalam pikogram (Zyskind dan Bernstain, 1992).

Gambar 2.13. Pelipatgandaan Molekul DNA Target

(Sumber: www.bioserv.fiu.edu)

2.5.3 Komponen PCR

Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam PCR adalah

DNA template, primer, enzim Taq DNA Polymerase, deoxyribonucleaside

triphosphate (dNTP’s), dan buffer PCR. DNA template merupakan DNA

yang akan diamplifikasi, dapat berupa untai tunggal atau untai ganda.

Primer yang digunakkan sebaiknya berukuran 20-26 pasang basa, dengan

22


komposisi 50-60% C+G, sekuens DNA kedua primer tidak saling

berkomplemen yang akan menyebabkan terjadinya penempelan antar

primer (primer-dimer), dan sekuens DNA dalam satu primer tidak saling

berkomplemen yang akan mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder

dan mengurangi efisiensi PCR. Deoxyribonucleaside triphosphate

(dNTP’s) merupakan bahan dasar pembentuk DNA yang terdiri dari

dATP, dTTP, dGTP, dan dCTP. Taq DNA Polymerase berfungsi sebagai

katalisator terjadinya pemanjangan primer. Buffer PCR yang biasanya

terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan

optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase. Ion Mg2+ yang

biasanya terdapat dalam buffer berfungsi sebagai kofaktor enzim.

Keberadaan ion ini sangat penting karena ion Mg2+ bebas akan mengikat

DNA template, primer dan membentuk kompleks terlarut dengan dNTP

untuk membuat subtrat yang akan dikenali oleh enzim Taq Polymerase

(Zyskind dan Bernstain, 1992).

2.6 Real-Time PCR

Real-Time PCR adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari

reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real-Time PCR (juga dikenal

sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR atau qPCR)

atau kinetic polymerase chain reaction) adalah suatu teknik pengerjaan PCR

di laboratorium untuk mengamplifikasi sekaligus mengkuantifikasi jumlah

target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut.

Instrumen Real-Time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur

peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan

untai ganda DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA

hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang

terbentuk semakin `tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan.

Alat ini dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga

hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang

sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva

23


amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial

atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Vaerman, 2004).

Gambar 2.14. Bentuk Kurva Real-Time PCR (Sumber: bio-rad.com)

2.6.1. Pewarna Fluoresensi

Real-time PCR menggunakan pewarna fluoresensi dan probe dengan

fluoresensi. Probe berupa oligonukleotida yang tersusun dari sekuen

spesifik dan akan berpasangan dengan sekuen DNA cetakan yang akan

diamplifikasi. Macam-macam fluoresensi yang umumnya digunakan

antara lain SYBR Green, Hydrolysis probes, Hybridization probes, dan

Molecular beacons. Fluoresensi akan berpendar hijau saat berikatan

dengan DNA cetakan (Kubista et al., 2006). Pewarna yang umum

digunakan adalah SYBR Green dan Hydrolysis Probe.

a. Hydrolysis Probe

Hydrolisis probe menggunakan oligonukleotida spesifik yang

berkomplemen dengan DNA target disebut Probe. Probe dilabeli

oleh dua molekul, yaitu reporter pada ujung 5’ probe yang

merupakan pewarna fluoresensi dan quencer pada ujung 3’ probe

yang merupakan molekul penerima sinyal fluoresensi. Hydrolysis

probe memiliki prinsip kerja, yaitu saat probe belum

berkomplemen dengan DNA target, molekul reporter akan

http://www.bio-rad.com/

24


mengeksitasikan sinyal fluoresensi ke molekul quencer karena

jarak antara kedua molekul berdekatan. Probe akan berkomplemen

dengan DNA target saat mencapai suhu annealing, lalu mekanisme

eksitasi sinyal fluoresensi dari reporter ke quencer terhenti karena

jarak kedua molekul berjauhan. DNA polimerase akan

mengelongasi DNA target sampai DNA polimerase dan probe

berdekatan maka 5’nuklease yang terdapat pada DNA polimerase

akan menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi sinyal

fluoresensi dapat tertangkap oleh detektor pada Real Time PCR

(Shipley, 2007). Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multiplex

pada qRT PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan

primer lebih dari satu dalam satu reaksi karena probe akan

berikatan secara spesifik dengan beberapa DNA target yang

berbeda (BioRad, 2006).

b. SYBR Green

Prinsip dari SYBR Green adalah pewarna fluoresensi akan mengikat

bagian minor dari untai ganda DNA sehingga menghasilkan

pendaran warna hijau pada akhir fase extension selama proses Real

Time PCR berlangsung (Shipley, 2007). Intensitas fluoresensi yang

semakin tinggi meenunjukkan peningkatan jumlah untai ganda

DNA yang terdeteksi oleh detektor. Intensitas fluoresensi yang

akan dihitung dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif pada

qRT PCR. SYBR Green umumnya digunakan dalam singleplex

pada Real Time PCR yang menggunakan satu DNA target dan

sepasang primer. SYBR Green lebih sering digunakan dibandingkan

Hydrolisis probe karena memiliki beberapa keunggulan, yaitu

dapat digunakan untuk beberapa pengujian karena mampu bekerja

pada semua jenis primer, teknik pengujian lebih sederhana karena

tidak perlu merancang probe, dan harga pewarna fluoresensi yang

relatif lebih rendah (Shipley, 2007). SYBR Green memiliki

kelemahan, yaitu SYBR Green dapat mengikat DNA untai ganda

25


pada bagian tidak spesifik sehingga primer-dimer juga akan diikat

oleh SYBR Green. Namun, produk tidak spesifik dapat dianalisis

keberadaannya dalam analisis melting curve (Valasek & Repa

,2005; Kubista et al., 2006).

Gambar 2.16. Mekanisme Hydrolysis Probe dan SYBR Green

(Sumber: Thermoscientificbio.com)

26


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisis Obat & Pangan

Halal; Laboratorium Penelitian 2; dan Laboratorium Biokimia/ Patologi

Klinis. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri


3.1.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Maret 2014

hingga September 2014.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Real Time PCR (Light Cycler® 480 - Roche), Multiwell Plate 96

(Roche), Sealing Foil (Roche), Mikropipet 0.5-10 μl (Biorad), Mikropipet

2-20 μl (Biorad), Mikropipet 20-200 μl (Biorad), Mikropipet 100-1000 μl

(Biorad), Microtips volume 10 μl; 200 μl; dan 1000 μl (Genfollower),

Spektrofotometri UV DNA (BioDrop), Gel Documentation (AE-6933

ATTO), satu set alat Elektroforesis Agarosa (Biorad), Digital Waterbath

(SB-100 Eyela), Vortex, Sentrifugator (5417R – Eppendorf), Filter Tube

dan Collection Tube (Kit High Pure PCR Template Preparation – Roche),

plastic wrap, alumunium foil, Microsentrifuge tube volume 1,5 ml

(Biogenix), pisau steril, kaca arloji, erlenmeyer 50 ml, dan spatula.

3.2.2 Bahan

Daging sapi segar, daging babi segar, gelatin sapi (Sigma Aldrich),

gelatin babi (Sigma Aldrich), Tris Base (SBS Genetech), asam asetat

glasial (Merck), EDTA (Merck), satu set reagen isolasi DNA meliputi

Tissue Lysis Buffer; Binding Buffer; Proteinase K; Inhibitor Removal

Buffer; Washing Buffer; dan Elution Buffer (Kit High Pure PCR Template

26

27


Preparation - Roche), Aquabidest (IKA Pharmindo), Etanol Absolut

(Merck), Isopropanol (Merck), Etidium Bromida 10 mg/ml (Bio Basic

Inc.), Agarosa (Fermentas), loading dye (Promega), SYBR Green I Master

(LC 480 - Roche), Probe Master (LC 480 - Roche), Aquadest (PCR Grade

- Roche) dan Primer-probe (Alpha DNA).

Tabel 3. Urutan Basa Primer dan Probe (Tanabe et al., 2007)

Nama Primer Runutan Basa

Babi Forward 5'-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3'

Reverse 5'-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3'

Probe 5'-(FAM)-ACAGCTTTCTCATCAGTTAC-(BHQ1)-3'

Sapi Forward 5'-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3'

Reverse 5'-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3'

Probe 5'-(FAM)-CATCATAGCAATTGCC-(BHQ1)-3'

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Ekstraksi dan Isolasi DNA

Proses ekstraksi dan isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan kit

komersial High Pure PCR Template Preparation (Roche).

1. Preparasi Sampel

a. Daging Segar (Rochea, 2012; Erwanto et al., 2012)

Sebanyak 50 mg masing-masing daging sapi segar dan daging babi

segar dicincang halus dengan pisau steril. Masing masing daging

tersebut dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian ke

dalam tube tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl Tissue Lysis

Buffer dan 40 μl larutan Proteinase K. Campuran divortex selama 1

menit dan diinkubasi pada suhu 57oC selama 20 jam dalam digital

waterbath. Larutan daging yang dihasilkan selanjutnya dilakukan

proses ekstraksi dan isolasi DNA.

b. Gelatin (Rochea, 2012; Erwanto et al., 2012)

Sebanyak 50 mg masing-masing gelatin sapi dan gelatin babi

ditimbang dan dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Kemudian

ke dalam tube tersebut masing-masing ditambahkan 100 μl

Aquabidest, 200 μl Tissue Lysis Buffer dan 40 μl larutan Proteinase K.

28


Campuran divortex selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 57oC

selama 20 jam dalam digital waterbath. Larutan daging yang

dihasilkan selanjutnya dilakukan proses ekstraksi dan isolasi DNA.

2. Proses Ekstraksi dan Isolasi DNA (Rochea, 2012 dengan modifikasi)

Larutan daging sapi, daging babi, gelatin sapi dan gelatin babi yang

telah dinkubasi sebelumnya selama 20 jam, masing-masing ditambahkan

200 μl larutan Binding Buffer. Campuran divortex segera selama 10 detik

dan diinkubasi kembali pada suhu ± 70oC selama 10 menit dalam digital

waterbath.

Ke dalam masing-masing tube tesebut kemudian ditambahkan 150

μl isopropanol absolut dan dihomogenkan dengan vortex selama 10 detik.

Campuran dipipet dan dimasukkan ke dalam Filter Tube yang telah

dipasangkan Collection Tube. Kemudian tube ditutup dan disentrifugasi

pada kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang

melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube

dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Kemudian 500 μl

Inhibitor Removal Buffer ditambahkan melalui penyangga atas Filter

Tube dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 8000 rpm selama 1

menit. Filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang

melewati filter dibuang bersamaan collection tube. Filter tube

dipasangkan kembali dengan collection tube yang baru. Kemudian 500 μl

Washing Buffer ditambahkan dan disentrifugasi kembali pada kecepatan

8000 rpm selama 1 menit. Pencucian dengan Washing Buffer dilakukan

sekali lagi. Setelah itu, filter tube dilepaskan dari collection tube dan

cairan yang melewati filter dibuang. Filter tube dipasang kembali dengan

collection tube dan disetrifugasi kembali selama 10 detik pada kecepatan

maksimum agar semua Washing Buffer tidak tertinggal pada filter.

3. Elusi DNA (Rochea, 2012 dengan modifikasi)

Filter tube dan Collection tube yang telah disentrifugasi pada

kecepatan maksimum kemudian Filter tube dipisahkan dengan collection

29


tube. Collection tube dibuang dan Filter tube tersebut kemudian

dipasangkan pada Microsentrifuge tube steril. Ke dalam filter yang

mengandung DNA daging sapi dan daging babi, masing-masing

ditambahkan 200 μl Elution Buffer hangat (70oC). Sedangkan ke dalam

filter yang mengandung DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi,

masing-masing ditambahkan 150 μl Elution Buffer hangat (70oC).

Filter dan Microsentrifuge tube yang telah ditambahkan Elution

Buffer kemudian disetrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 8000 rpm.

Filter tube dilepaskan dari Microsentrifuge tube. Pada Microsentrifuge

tube telah mengandung isolat DNA. Isolat DNA yang didapatkan

dianalisis keberadaannya dengan elektroforesis agarosa dan dianalisis

konsentrasi dan kemurnian DNA dengan spektrofotmetri UV.

3.3.2 Analisis Isolat DNA

3.3.2.1 Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa

a. Pembuatan Buffer Elektroforesis TAE 10x, 1 liter (Biorad, 2012)

Sebanyak 48,4 g Tris Base dilarutkan dalam 800 mL aquabidest.

Ke dalam larutan tersebut ditambahkan 11,4 mL asam asetat glasial dan

20 ml 0,5 M EDTA pH 8. Larutan dihomogenkan dan dimasukkan ke

dalam labu ukur 1000 ml. Kemudian ke dalam labu ukur tersebut

ditambahkan aquabidest sampai tanda batas.

b. Pembuatan Buffer Elektroforesis TAE 1x, 1 liter (Biorad, 2012)

Sebanyak 100 ml TAE 10x dimasukkan ke dalam labu ukur 1000

ml dan ditambahkan aquabidest sampai tanda batas. Larutan tersebut

kemudian dihomogenkan.

c. Pembuatan Gel Agarosa 1% (Sambrook et al., 2001)

Sebanyak 0,5 g agarosa dilarutkan dengan 50 mL TAE 1x di

dalam erlenmeyer. Erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil,

kemudian dipanaskan di atas hot plate sampai larutan menjadi bening

dan mendidih. Larutan agarosa didiamkan hingga suhu 60oC dan

ditambahkan 2,5 μL etidium bromida 10 mg/ml, kemudian larutan

diaduk hingga homogen. Larutan dituangkan pada gel caster dan comb

30


disisipkan untuk membuat well (sumur). Larutan agarosa dibiarkan

hingga mengeras. Setelah gel mengeras dan membentuk agar, gel

diletakkan pada chamber electrophoresis dengan posisi well pada

muatan negatif (warna hitam). Kemudian buffer TAE 1x dituang

hingga gel terendam dalam chamber electrophoresis namun tidak

melebihi garis batas maksimum buffer.

d. Loading Sampel (Sambrook et al., 2001 dengan modifikasi)

Plastic wrap direkatkan pada wadah mendatar sebagai tempat

melakukan pencampuran sampel yang akan dimasukkan ke dalam well

pada gel. Masing-masing sebanyak 5 μL isolat DNA dipipet dan ditaruh

di atas plastic wrap. Kemudian masing-masingnya ditambahkan 1 μL

loading dye dan dihomogenkan dengan menaik turunkan mikropipet.

Masing-masing campuran tersebut dipipet dan dimasukkan ke dalam

well agarosa yang telah dibuat sebelumnya dengan urutan dari kiri ke

kanan adalah; DNA daging sapi; DNA daging babi; DNA gelatin sapi;

DNA gelatin babi.

e. Running Sampel (Sambrook et al., 2001)

Chamber elektroforesis yang telah mengandung gel agarosa,

DNA, dan buffer TAE 1X kemudian ditutup rapat dan kabel chamber

dihubungkan dengan power supply. Kabel merah (muatan positif)

dipasangkan pada lubang merah dan kabel hitam (muatan negatif)

dipasangkan pada lubang hitam. Running sampel dilakukan selama 45

menit dengan voltase 90 Volt 400 mA.

f. Dokumentasi Gel Agarosa (Atto, 2009)

Gel agarosa yang telah mengandung DNA terelektroforesis

kemudian diletakkan pada Gel Doc untuk visulasi isolat DNA. Tombol

ON ditekan pada Saver, Printer dan Transluminator. Stand by LED

dipilih untuk melihat posisi Gel. Panjang gelombang dipilih, kemudian

exposure Time, Focus dan aperture cahaya diatur. Expose UV. Freeze

ditekan dan Save. Data gambar yang akan digunakan sebagai

dokumentasi dicetak dengan menekan tombol Print.

31


3.3.2.2 Analisis DNA Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri UV

Pada sistem layar, panel “Nucleic Acid” dipilih untuk penentuan

konsentrasi dan kemurnian DNA. Sample port dibersihkan dengan tisu

steril. Sebanyak 2 μL Elution Buffer ditaruh di atas Sample port dan

dianalisis sebagai blangko. Sample port kembali dibersihkan dengan tisu

steril. Identitas sampel dimasukkan pada kolom Sampel ID dan sebanyak 2

μL DNA sampel tersebut ditaruh di atas Sample port. Kemudian tombol

”Measure” diklik. DNA dianalis pada panjang gelombang 260 nm dan 280

nm. Hasil instrumentasi akan didapatkan data konsentrasi DNA dalam ng/μl

dan kemurnian DNA dengan perbandingan rasio A280 dan A260.

(Biodrop, 2012)

3.3.3 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

Uji spesifisitas primer dan probe dilakukan dengan melakukan

BLAST melalui database NCBI. Pada halaman “BLAST”, dipilih menu

“nucleotide blast”. Kemudian pada kolom “Enter Query Sequence”

dimasukkan urutan basa primer yang akan diuji. Tombol “BLAST”

kemudian diklik. Data hasil pengujian berupa daftar spesies yang memiliki

kemiripan 99%-100% dengan urutan basa primer yang diuji (NCBI).

3.3.4 Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR

3.3.4.1. Amplifikasi DNA dengan Metode SYBR Green

a. Pembuatan Larutan Primer 10 μM dari Larutan Induk Primer 100 μM

Sebanyak 10 μL larutan induk primer 100 μM dimasukkan ke

dalam Microsentrifuge tube volume 1,5 ml. Kemudian ke dalam tube

tesebut ditambahkan 90 μL aquadest. Larutan tersebut dihomogenkan

dengan menaik turunkan pegas pada mikropipet.

b. Pembuatan SYBR Green Mastermix (Rochec, 2005)

Mastermix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL

DNA yang diuji; 3 μL Aquabidest; 1 μL primer forward 10 μM; 1 μL

primer reverse 10 μM; dan 10 μL LightCycler® 480 SYBR Green I

32


master (enzim Taq DNA Polymerase, SYBR Green 1, dNTP mix, dan

6,4 mM MgCl2).

c. Loading Sampel dan SYBR Green Master Mix ke dalam Multiwell Plate

(Rochec, 2005)

Sebanyak 5 μL DNA yang akan diuji dan 15 μL Mastermix

dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan.

Campuran dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas mikropipet

secara perlahan. Multiwell plate kemudian ditutup dengan sealing foil.

d. Pengaturan Program Proses Amplifikasi (Rochec, 2005 dengan

modifikasi)

Pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR yang akan

digunakan untuk proses amplifikasi, dilakukan dengan percobaan sebagai

berikut:

Tabel 4. Pengaturan program amplifikasi dengan metode SYBR Green

Analisis dengan Primer Sapi

Perc. 1 Jumlah Siklus Suhu Waktu

Pre Incubation 1 Siklus 95oC 10 menit

Amplification

45 siklus

95oC

60oC

72oC

10 detik

20 detik

30 detik

Melting Curve

Analysis

1 Siklus

95oC

60oC

97oC/5oC

5 detik

1 menit

-

Cooling 1 Siklus 40oC 10 detik



Amplification

45 siklus

95oC

62oC

72oC

10 detik

20 detik

30 detik

Melting Curve

Analysis

1 Siklus

95oC

60oC

97oC/5oC

5 detik

1 menit

-



33



Amplification

45 siklus

95oC

64oC

72oC

10 detik

20 detik

30 detik

Melting Curve

Analysis

1 Siklus

95oC

60oC

97oC/5oC

5 detik

1 menit

-




Amplification

45 siklus

95oC

65oC

72oC

10 detik

20 detik

30 detik

Melting Curve

Analysis

1 Siklus

95oC

60oC

97oC/5oC

5 detik

1 menit

-


Analisis dengan Primer Babi

Perc. 1

Jumlah Siklus Suhu Waktu


Amplification

45 siklus

95oC

60oC

72oC

10 detik

10 detik

7 detik

Melting Curve

Analysis

1 Siklus

95oC

60oC

97oC/5oC

5 detik

1 menit

-




Amplification

45 siklus

95oC

60oC

72oC

10 detik

20 detik

30 detik

Melting Curve

Analysis

1 Siklus

95oC

5 detik

34


60oC

97oC/5oC

1 menit

-




Amplification

45 siklus

95oC

60oC

72oC

10 detik

20 detik

25 detik

Melting Curve

Analysis

1 Siklus

95oC

60oC

97oC/5oC

5 detik

1 menit

-


Keterangan: = Modifikasi yang dilakukan pada proses amplifikasi

Real Time PCR

3.3.4.2. Amplifikasi DNA dengan Metode Hydrolysis Probe

a. Pembuatan Primer dan Probe 10 μM dari Larutan Induk 100 μM

Sebanyak 10 μL larutan induk primer 100 μM dan probe 100 μM

masing-masing dimasukkan ke dalam Microsentrifuge tube volume 1,5

ml. Kemudian ke dalam tube tesebut masing-masing ditambahkan 90 μL

aquadest. Larutan tersebut masing-masing dihomogenkan dengan menaik

turunkan pegas pada mikropipet.

b. Pembuatan Hydrolysis Probe Mastermix (Roched, 2008)

Mastermix dibuat dengan volume total 20 μL yang terdiri dari 5 μL

DNA yang diuji; 1,4 μL Aquabidest; 1,6 μL primer forward 10 μM; 1,6

μL primer reverse 10 μM; 0,4 μL probe 10 μM; dan 10 μL LightCycler®

480 Probe master (enzim Taq DNA Polymerase, dNTP mix, dan 6,4 mM

MgCl2).

c. Loading Sampel dan Hydrolisis Probe Mastermix ke dalam Multiwell

Plate (Roched, 2008)

Sebanyak 5 μL DNA yang akan diuji dan 15 μL Mastermix

dimasukkan ke dalam multiwell plate pada well yang diinginkan.

Campuran dihomogenkan dengan menaik turunkan pegas mikropipet

secara perlahan. Multiwell plate kemudian ditutup dengan sealing foil.

35


d. Pengaturan Program Proses Amplifikasi (Roched, 2008)

Proses pengaturan program LightCycler® 480 Real-Time PCR

yang akan digunakan untuk proses amplifikasi dilakukan sebagai berikut:

Tabel 5. Pengaturan program amplifikasi dengan metode Hydrolysis Probe

Analisis dengan Primer-probe Sapi



Amplification

60 siklus

95oC

60oC

10 detik

1 menit


Analisis dengan Primer-probe Babi



Amplification

60 siklus

95oC

60oC

10 detik

1 menit


36


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini dilakukan perbandingan metode SYBR Green dan

metode Hydrolysis Probe dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi

dengan menggunakan Real Time PCR. Perbandingan metode SYBR Green dan

metode Hydrolysis Probe dilihat melalui hasil kurva amplifikasi apakah metode

tersebut dapat mengamplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi secara

spesifik.

4.1. Hasil Analisis Isolat DNA

Isolat DNA didapatkan dari proses ekstraksi dan isolasi DNA dengan

menggunakan kit komersial High Pure PCR Template Preparation. Prinsip

kit ini yaitu DNA diabsorpsi oleh Silikon Dioksida (SiO2) sehingga DNA

mudah dipisahkan dari protein dan sel debris hasil pelisisisan sel dengan cara

sentrifugasi (Rocheb, 2012). Reagen yang ditambahkan pada proses ekstraksi

dan isolasi DNA meliputi: Tissue lysis buffer sebagai pelisis membran sel,

proteinase K sebagai enzim pemecah makromolekul protein menjadi molekul

lebih kecil, Binding buffer sebagai chaotropic agent agar DNA dapat

terabsorbsi kuat dengan silikon dioksida yang terdapat pada filter, Inhibitor

Removal Buffer sebagai buffer yang dapat menghilangkan zat pengotor yang

mengganggu proses PCR, Washing buffer sebagai pencuci garam chaotropic

dan pengotor lainya, dan Elution Buffer sebagai pengelusi DNA dari silikon

dioksida (Rocheb, 2012).

Isolat DNA yang didapatkan dianalisis dengan Elektroforesis Agarosa

dan Spektrofotometer UV.

4.1.1. Hasil Analisis Isolat DNA dengan Elektroforesis Agarosa

Isolat DNA divisualisasi keberadaannya dengan elektroforesis gel

agarosa 1% seperti gambar sebagai berikut:

36

37


Gambar 4.1 Hasil elektroforesis isolat DNA

*Keterangan: (1) Daging Babi; (2) Daging Sapi; (3) Gelatin Babi; (4) Gelatin Sapi

Melalui elektroforesis agarosa, DNA dapat tervisualisasi karena

larutan Etidium Bromida yang ditambahkan ter-interkalasi dengan untai

ganda DNA, sehingga pita fragmen DNA dapat terlihat di bawah lampu UV

(Gaffar, 2007). Pada Gambar 4.1 menunjukkan pita yang jelas pada isolat

DNA sapi dibandingkan pada isolat DNA babi. Kedua pita tersebut

merupakan pita yang smear. Hasil pita yang smear pada gel elektroforesis

dapat disebabkan tidak utuhnya DNA yang terisolasi dimana fragmen-

fragmen DNA dengan ukuran yang berbeda tertahan pada gel sesuai dengan

ukuran pasang basa DNA (Lewis, 2001). Terjadinya fragmentasi DNA

daging dikarenakan DNA yang terisolasi mengalami degradasi saat proses

pencincangan atau selama proses isolasi berlangsung.

Hasil elektroforesis pada isolat DNA gelatin babi dan DNA gelatin

sapi menunjukkan tidak adanya pita. Tidak adanya pita pada gel agarosa,

bukanlah berarti DNA gelatin tidak berhasil diisolasi. Hal ini dapat

dikarenakan jumlah DNA hasil isolasi pada gelatin terlalu kecil dan banyak

yang terdegradasi akibat pengolahann sehingga tidak tervisualisasi pada gel

agarosa. Batas minimal konsentrasi DNA yang dapat terdeteksi pada

elektroforesis agarosa dengan pewarna etidium bromida adalah 25 ng

(Lewis, 2001).

38


4.1.2 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometri UV

Konsentrasi dan kemurnian isolat DNA dianalisis dengan

menggunakan spektrofotometri UV. Hasil analisis terlihat pada tabel 6.

Tabel 5. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil ekstraksi dan isolasi

No. Sampel Konsentrasi Kemurnian

(A280/A260)

1. Daging Sapi 85,99 ng/μl 1,804

2. Daging Babi 80,08 ng/μl 1,824

3. Gelatin Sapi 19,38 ng/μl 1,566

4. Gelatin Babi 13,63 ng/μl 1,573

Analisis konsentrasi dan kemurnian isolat DNA menggunakan

spektrofotometri UV dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280

nm. Konsentrasi DNA yang didapatkan pada daging berkisar antara 80 ng/μl

– 85 ng/μl dengan kemurnian kisaran 1,8. Sedangkan konsentrasi DNA yang

didapatkan pada gelatin berkisar antara 13 ng/μl – 19 ng/μl dengan

kemurnian kisaran 1,5. DNA dapat dikatakan murni dari protein apabila

nilai rasio A260/A280 yaitu berkisar antara 1,8 sampai 2,0

(Sambrook et al., 2001).

Konsentrasi isolat DNA daging yang didapatkan jauh lebih besar

dibandingkan DNA gelatin. Hal ini dikarenakan pada daging memiliki

jumlah sel yang banyak, sedangkan gelatin merupakan produk hasil olahan

dari kolagen sehingga isolat DNA gelatin yang didapatkan sedikit. Nilai

kemurnian hasil isolasi pada gelatin dengan nilai dibawah 1,8 menunjukkan

bahwa masih bayak pengotor protein pada hasil isolat DNA gelatin

(Sambrook et al., 2001). Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan Glasel

(1995), nilai kemurnian 1,5 memiliki perbandingan persentase teoritis

protein dan asam nukleat yaitu sekitar 80% dan 20%. Hal ini menunjukkan

bahwa kit komersial ekstraksi dan isolasi DNA yang digunakan belum

mampu memisahkan DNA gelatin dari pengotor protein dengan baik.

4.2 Hasil Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

Runutan basa primer dan probe yang diperoleh dari penelitian Tanabe

S. et al., (2007), dianalisa secara in silico dengan cara BLAST berdasarkan

39


informasi database NCBI melalui internet. Tujuan dari proses ini adalah

untuk mengetahui apakah primer dan probe yang digunakan merupakan

primer-probe spesifik yang hanya mengamplifikasi satu jenis spesies.

Gambar 4.2 Hasil uji spesifitas primer babi dengan BLAST melalui

database NCBI

*Keterangan: = primer forward babi; = Probe babi; = Primer reverse babi.

Hasil BLAST dari database NCBI pada primer forward babi, primer

reverse babi, dan probe babi menunjukkan bahwa primer–probe yang

digunakan spesifik untuk DNA babi dengan nilai maksimum identitas 100%.

DNA target yang akan diamplifikasi yaitu pada DNA mitokondria-sitokrom b

dengan panjang amplifikasi 131 pasang basa (Gambar 4.2).

Gambar 4.3 Hasil Uji Spesifitas Primer Sapi dengan BLAST Melalui

Database NCBI

*Keterangan: = primer forward sapi; = Probe sapi; = Primer reverse sapi.

40


Hasil BLAST dari database NCBI pada primer-probe sapi juga

menunjukkan bahwa primer-probe sapi yang digunakan spesifik untuk DNA

sapi digunakan spesifik untuk DNA sapi dengan nilai maksimum identitas

100%. DNA target yang akan diamplifikasi yaitu pada DNA mitokondria-

sitokrom b dengan panjang amplifikasi 120 pasang basa (Gambar 4.3).

4.3 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan

Real Time PCR

Amplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi menggunkan

Real Time PCR dilakukan dengan dua metode, yaitu metode SYBR Green

dan metode Hydrolysis Probe. Hasil amplifikasi dari kedua metode

dibandingkan satu sama lain dengan melihat spesifisitas dalam

mengamplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi.

4.3.1 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan

Real Time PCR dengan Metode SYBR Green

Konsentrasi DNA daging sapi; DNA daging babi; DNA gelatin sapi;

dan DNA gelatin babi yang digunakan dalam proses amplifikasi masing-

masing adalah 8,59 ng/μL; 8,0 ng/μL; 19,38 ng/μL; dan 13,63 ng/μL.

Konsentrasi DNA daging yang digunakan dilakukan pengenceran sebanyak

sepuluh kali dari isolat DNA agar mendapatkan kurva amplifikasi yang

optimal, yaitu kurva yang didapatkan tidak terlalu cepat mencapai fasa

plateau pada awal siklus (Roched, 2008). Analisis kurva amplifikasi dilihat

melalui kenaikan kurva dan nilai CP (Crossing Point) pada kurva

amplifikasi. Spesifisitas hasil amplifikasi dapat dilihat melalui nilai Tm

(Melting Temperature) pada melt curve.

CP adalah jumlah siklus dimana sampel mulai terbaca di atas

Arbitrary Fluorescence Level (AFL) yang menunjukkan awal mulainya fase

pertumbuhan eksponensial. Oleh karena itu, semakin rendah nilai CP

semakin tinggi jumlah DNA target. Tm adalah suhu dimana 50% bagian

dari DNA telah terbuka menjadi untai tunggal. Nilai Tm tergantung dari

jumlah basa A, G, T, dan C. Primer yang spesifik akan menghasilkan satu

puncak Tm pada DNA target (Sambrook et al., 2001).

41


a. Hasil Amplifikasi DNA Metode SYBR Green dengan Primer Sapi

Amplifikasi DNA dilakukan dengan beberapa percobaan dengan

cara memodifikasi program proses amplifikasi yang bertujuan untuk

mendapatkan kondisi optimal dalam amplifikasi. Pada penelitian ini

dilakukan modifikasi suhu annealing yaitu pada suhu 60oC, 62oC, 64oC,

dan 65oC. Dari percobaan tersebut didapatkan hasil amplifikasi DNA

yang terbaik yaitu pada suhu 65oC yang dapat dilihat pada gambar 4.4.

Gambar 4.4. Kurva Amplifikasi dengan Metode SYBR Green

Menggunakan Primer Sapi *Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB =

Daging Babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point

Pada gambar 4.4, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging sapi dan

DNA gelatin sapi masing-masing adalah 14,21 dan 20,01. Secara teoritis,

seharusnya nilai CP pada DNA gelatin sapi lebih kecil dibandingkan

DNA daging sapi karena konsentrasi DNA gelatin sapi yang digunakan

lebih tinggi dibanding DNA daging sapi. Hal ini dapat dikarenakan DNA

pada gelatin memiliki nilai kemurnian yang rendah yaitu 1,5 dimana

terlalu banyak pengotor protein pada isolat DNA gelatin. Nilai kemurnia

1,5 memiliki perbandingan persentase protein dan asam nukleat yaitu

80% dan 20% (Glasel, 1995). Oleh karena itu jumlah DNA yang

teramplifikasi pada DNA gelatin sapi lebih sedikit dibandingkan pada

DNA daging sapi. Selain itu, pada gelatin banyak DNA yang

terfragmentasi. Fragmentasi DNA dapat terjadi dikarenakan gelatin

merupakan produk olahan dari kolagen. Semakin banyak jumlah DNA

42


yang terfragmentasi, semakin kecil situs DNA target yang teramplifikasi

(Edward et al., 1996).

Berdasarkan hasil kurva amplifikasi yang terdapat pada gambar

4.4, DNA daging babi, DNA gelatin babi, dan NTC tidak mengalami

kenaikan kurva amplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa metode SYBR

Green dengan primer sapi dapat mengamplifikasi DNA sapi secara

spesifik. Spesifisitas proses amplifikasi menggunakan SYBR Green dapat

dianalisa melalui Melting peaks. Proses amplifikasi yang spesifik akan

menghasilkan satu jenis puncak dengan nilai Tm yang sama.

Pada gambar 4.5, DNA daging sapi dan DNA gelatin sapi memiliki

nilai Tm yang sama yaitu pada suhu 78oC. Nilai Tm tersebut merupakan

Tm DNA target amplifikasi. Namun, pada DNA daging sapi, muncul

puncak Tm lainnya yaitu 81,78 yang menunjukkann telah terbentuknya

produk amplifikasi yang nonspesifik. Pada daging babi, gelatin babi, dan

NTC tidak muncul puncak Tm yang menunjukkan bahwa tidak terjadi

mis-priming ataupun primer-dimer. Primer-dimer adalah terbentuknya

struktur sekunder yang disebabkan karena menempelnya sesama primer

sejenis ataupun primer yang tidak sejenis seperti antara primer forward

dengan komplemen primer reverse. Sedangkan mis-priming adalah

penempelan primer diluar sekuen DNA target (Ponchel, 2007).

Gambar 4.5. Melting Peaks Hasil Amplifikasi dengan Metode SYBR

Green Menggunakan Primer Sapi *Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging

Babi; NTC = No Template Control

43


Pada penelitian ini, proses amplifikasi dilakukan modifikasi suhu

annealing karena terdapat perbedaan jauh nilai Tm teoritis pada primer

forward sapi dan Tm pada primer reverse sapi sesuai dengan perhitungan

pada lampiran 4, yakni 60oC dan 70oC. Nilai Tm primer akan

mempengaruhi suhu annealing. Apabila suhu annealing yang terlalu

rendah dan tidak tepat, dapat menyebabkan primer menempel dengan

DNA secara tidak spesifik sehingga dapat menyebabkan kesalahan

analisis. Menurut Scmittgen (2007) pasangan primer yang baik adalah

kedua primer memiliki perbedaan nilai Tm tidak lebih dari 2oC.

Berdasarkan Rahmawati (2012), optimasi suhu annealing dengan

metode gradien PCR pada primer sapi yang sama dengan penelitian ini

didapatkan hasil suhu optimal 60oC (Lampiran 5). Namun, setelah

dilakukan amplifikasi dengan suhu annealing 60oC, terjadi amplifikasi

pada DNA nontarget seperti DNA yang mengandung babi maupun NTC

(No Template Control). Hal ini diduga terjadi karena suhu annealing

yang digunakan terlalu rendah bagi primer reverse yang memiliki Tm

70oC, sehingga terjadi mis-priming atau primer-dimer. Oleh karena itu

optimasi dilakukan dengan meninggikan suhu annealing. Setelah

dilakukan amplifikasi pada suhu annealing 62oC, 64oC, dan 65oC,

didapatkan suhu yang paling baik untuk amplifikasi DNA dengan metode

SYBR Green pada primer sapi ini adalah 65oC. Pada suhu ini, hanya

DNA yang mengandung sapi saja yang dapat teramplifikasi (Gambar

4.4). Sedangkan menggunakan suhu annealing 60oC, 62oC, dan 64oC

terjadi amplifikasi pada semua DNA baik DNA yang mengandung sapi,

mengandung babi, ataupun pada NTC (No Template Control) yang tidak

mengandung DNA (Lampiran 7-9).

b. Hasil Amplifikasi DNA Metode SYBR Green dengan Primer Babi

Pada penelitian ini, amplifikasi DNA dilakukan dengan modifikasi

waktu annealing dan extension dilakukan pada 10 detik (annealing) & 7

detik (extension); 20 detik & 25 detik; dan 20 detik & 30 detik. Hasil

amplifikasi DNA yang paling baik yaitu dengan modifikasi waktu

44


annealing 20 detik dan extension 25 detik. Hasil amplifikasi terlihat pada

gambar 4.6.

Gambar 4.6. Kurva Amplifikasi dengan Metode SYBR Green

Menggunakan Primer Babi *Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging

Babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point

Pada gambar 4.6, nilai CP hasil amplifikasi DNA daging babi dan

DNA gelatin babi masing-masing adalah 11,86 dan 43,71. Secara teoritis,

seharusnya nilai CP pada DNA gelatin babi lebih kecil dibandingkan

DNA daging babi, karena konsentrasi DNA gelatin babi yang digunakan

lebih tinggi dibanding DNA daging babi. Hasil ini sesuai dengan yang

terjadi pada amplifikasi metode SYBR Green dengan primer sapi yang

telah diuraikan sebelumnya, yaitu DNA gelatin yang digunakan memiliki

kemurnian yang rendah dan banyak yang terfragmentasi. Sehingga DNA

gelatin babi pada hasil kurva amplifikasi memiliki CP yang lebih besar

daripada DNA daging babi.

Berdasarkan gambar 4.6, terjadi kenaikan kurva amplifikasi DNA

daging sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC pada siklus di atas 50 yang

dimana seharusnya ketiga DNA tersebut tidak terjadi amplifikasi. Hal ini

menunjukkan bahwa terjadi amplifikasi nonspesifik yang dapat

disebabkan karena mis-priming atau primer-dimer seperti self dimer,

cross dimer, atau pembentukan formasi hairpin. Terjadinya amplifikasi

nonspesifik dianalisis melalui nilai Tm pada Melting Peaks seperti pada

gambar 4.7. Pada kurva tersebut menunjukkan bahwa pada DNA daging

45


sapi, gelatin sapi, NTC muncul puncak Tm yang seharusnya tidak ada.

Puncak pada ketiga DNA tersebut merupakan hasil amplifikasi

nonspesifik (Ponchel, 2007). Dari kurva amplifikasi dan Melting Peaks

menunjukkan bahwa analisis DNA gelatin babi dan DNA gelatin sapi

dengan metode Sybr Green pada primer babi yang di desain oleh Tanabe

et. al., 2007 tidak dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut pada

sampel.

Gambar 4.7 Melting Curve Sybr Green dengan menggunakan primer babi *Keterangan :DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging

Babi; NTC = No Template Control

Pada primer babi tidak dilakukan modifikasi suhu annealing karena

nilai Tm teoritis pada primer forward babi dan primer reverse babi

memiliki nilai yang sama, yakni 66oC (lampiran 3). Berbeda dengan yang

terjadi pada primer sapi yang memiliki perbedaan nilai Tm yang jauh dan

memungkinkan terjadinya mis-priming atau primer-dimer karena tidak

sesuainya suhu annealing. Oleh karena itu optimasi dilakukan hanya

dengan modifikasi waktu annealing dan extension.

Modifikasi waktu annealing dan extension diawali dengan waktu

terendah yaitu 10 detik & 7 detik. Kurva yang dihasilkan pada modifikasi

ini menunjukkan bahwa amplifikasi hanya terjadi pada DNA daging babi

saja dan tidak mampu mengamplifikasi DNA gelatin babi (lampiran 11).

Hal ini terjadi diduga karena waktu annealing dan extension yang terlalu

cepat, sehingga proses amplifikasi tidak optimal. Selanjutnya dilakukan

46


percobaan waktu annealing dan extension dengan durasi paling maksimal

yaitu pada 20 detik & 30 detik, diharapkan mendapatkan hasil

amplifikasi yang maksimal, sebagaimana yang berhasil dilakukan pada

primer sapi. Namun hasil percobaan menunjukkan terjadi amplifikasi

pada DNA dagang sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC yang seharusnya

tidak terjadi amplifikasi (lampiran 12). Terbentuknya produk amplifikasi

yang nonspesifik diduga terjadinya amplifikasi dikarenakan terbentuknya

primer-dimer atau mis-priming. Oleh karena itu diputuskan untuk

menurunkan waktu extension menjadi 25 detik untuk percobaan

selanjutnya.

Pada percobaan dengan waktu annealing 20 detik dan extension 25

detik, didapatkan hasil kurva amplifikasi yang lebih baik dibandingkan

dengan waktu 20 detik & 30 detik. Pada percobaan ini, di siklus 45, DNA

gelatin babi teramplifikasi tanpa diikuti teramplifikasinya DNA daging

sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC. Namun, hasil amplifikasi DNA gelatin

babi belum terbentuk kurva Plateau yang menunjukkan bahwa proses

amplifikasi belum selesai. Oleh karena itu, proses amplifikasi dilanjutnya

sampai didapatkan kurva yang plateau. Pada siklus 60, DNA gelatin sapi

sudah membentuk kurva amplifikasi yang plateau. Akan tetapi

penambahan siklus ini, juga menyebabkan teramplifikasinya DNA yang

tidak mengandung babi, yaitu DNA daging sapi, DNA gelatin sapi, dan

NTC yang sebelumnya tidak teramplifikasi (gambar 4.6). Peningkatan

kurva amplifikasi pada DNA daging sapi, DNA gelatin sapi, dan NTC

disebabkan karena terjadinya amplifikasi yang nonspesifik seperti mis-

priming atau primer-dimer.

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Menggunakan

Real Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe

a. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dengan Metode Hydrolysis Probe

Menggunakan Primer Sapi

Proses amplifikasi DNA dengan metode Hydrolysis Probe

dilakukan dalam tiga tahap, yaitu tahap inisial denaturasi, tahap

amplifikasi, dan tahap pendinginan. Konsentrasi DNA daging sapi; DNA

47


daging babi; DNA gelatin sapi; dan DNA gelatin babi yang digunakan

dalam proses amplifikasi masing-masing adalah 8,59 ng/μL; 8,0 ng/μL;

19,38 ng/μL; dan 13,63 ng/μL. Metode analisis menggunakan Hydrolysis

Probe tidak dilakukan optimasi suhu annealing terlebih dahulu. Suhu

annealing yang digunakan dipilih berdasarkan hasil optimasi yang telah

dilakukan Rahmawati (2012), yaitu 60oC. Hasil amplifikasi DNA gelatin

sapi dan DNA gelatin babi dengan primer sapi dapat dilihat melalui

gambar 4.8. dibawah ini.


Menggunakan Primer-Probe Sapi *Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging

Babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point

Pada gambar 4.8, daging sapi memberikan nilai CP lebih awal yaitu

pada 16,49 meskipun konsentrasi DNA daging sapi yang digunakan

hanya 8,59 ng/μL. Sedangkan gelatin sapi yang memiliki konsentrasi

lebih tinggi yaitu 19,38 ng/μL memberikan nilai CP lebih lama yaitu

pada 29,41. Secara teoritis, seharusnya nilai CP pada DNA gelatin sapi

lebih kecil dibandingkan DNA daging sapi. Hal ini sejalan dengan kurva

yang dihasilkan metode SYBR Green yaitu disebabkan karena kemurnian

DNA gelatin yang rendah dan DNA gelatin yang banyak terfragmentasi

(Glasel, 1995; Edward et al., 1996).

Spesifisitas amplifikasi dengan menggunakan Hydrolysis Probe

tidak dapat dianalisa melalui Melting Peaks, karena perbedaan prinsip

pewarnaan fluoresens antara metode SYBR Green dengan Hydrolysis

48


Probe. Spesifisitas metode Hydrolysis Probe dilihat berdasarkan

kenaikan kurva amplifikasi pada kontrol negatif. Pada gambar 4.8, DNA

daging babi, DNA gelatin babi, dan NTC yang merupakan kontrol

negatif, tidak terjadi kenaikan kurva amplifikasi. Hal ini menunjukkan

bahwa primer-probe sapi dapat mengamplifikasi DNA sapi secara

spesifik. Oleh karena hal tersebut, metode ini dapat digunakan untuk

analisa lebih lanjut pada sampel yang mengandung gelatin.

b. Hasil Amplifikasi DNA Gelatin dengan Metode Hydrolysis Probe

Menggunakan Primer Babi

Konsentrasi DNA daging sapi; DNA daging babi; DNA gelatin

sapi; dan DNA gelatin babi yang digunakan dalam proses amplifikasi

masing-masing adalah 8,59 ng/μL; 8,0 ng/μL; 19,38 ng/μL; dan 13,63

ng/μL. Suhu annealing yang digunakan dipilih berdasarkan hasil

optimasi yang telah dilakukan Rahmawati (2012), yaitu 60oC

(Lampiran 5). Hasil amplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi

dengan metode Hydrolysis Probe menggunakan primer babi dapat dilihat

melalui gambar 4.9 dibawah ini.

Gambar 4.9. Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis Probe

Menggunakan Primer-Probe Babi *Keterangan: DS= Daging sapi; GS= Gelatin Sapi; GB= Gelatin Babi; DB=

Daging Babi; NTC = No Template Control; dan CP = Crossing Point

Pada gambar 4.9, daging babi memberikan nilai CP lebih awal

yaitu pada 16,93, diikuti dengan gelatin babi dengan nilai CP 43,67.

49


Secara teoritis, seharusnya nilai CP pada DNA gelatin babi lebih kecil

dibandingkan DNA daging babi dimana konsentrasi DNA gelatin yang

digunakan dalam proses amplifikasi lebih tinggi dibandingkan DNA

daging. Hal ini dapat disebabkan kemurnian DNA gelatin yang rendah

dan DNA gelatin yang banyak terfragmentasi (Glasel, 1995; Edward et

al., 1996). Hasil kurva amplifikasi pada gambar 4.9 menunjukkan metode

analisa ini cukup spesifik untuk deteksi DNA babi yang ditandai dengan

tidak terjadinya amplifikasi pada DNA daging sapi, gelatin sapi, dan

NTC. Oleh karena hal tersebut, metode ini dapat digunakan untuk analisa

lebih lanjut pada sampel yang mengandung gelatin.

50


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan sebagai

berikut:

a. Analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan metode SYBR

Green menghasilkan amplifikasi yang nonspesifik, sehingga metode ini

kurang baik digunakan sebagai metode analisis DNA gelatin sapi dan

DNA gelatin babi khususnya pada produk yang mengandung gelatin.

b. Analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi dengan metode

Hydrolysis Probe dapat mengamplifikasi DNA gelatin sapi dan DNA

gelatin babi secara spesifik. Sehingga metode ini dapat digunakan

sebagai metode analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi

khususnya pada produk yang mengandung gelatin.

5.2 Saran

a. Diharapkan melakukan optimasi metode ekstraksi DNA pada gelatin

agar mendapatkan DNA dengan nilai kemurnian 1,8 sampai 2,0.

b. Diharapkan untuk melakukan optimasi lebih lanjut dalam analisis DNA

gelatin sapi dan DNA gelatin babi untuk mendapatkan kondisi optimal

dalam mendeteksi, sehingga dapat dijadikan sebagai metode untuk

pengujian kehalalan pada produk yang mengandung gelatin.

50

51


DAFTAR PUSTAKA

Aida, A. A., Che Man, Y. B., Raha, A. R., & Son, R. 2007. Detection of pig

derivatives in food products for halal authentication by polymerase chain

reaction–restriction fragment length polymorphism. Journal of the

Science of Food and Agriculture. Vol. 87. Hal: 569–572.

Ansel, Howard C. 2005. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Edisi keempat.

Jakarta: UI-Press.

Arya, M., Iqbal S. Shergill, Magali Wiliamson, Lyndon Gommersall, Neehar

Arya, dan Hitendra RH Patel. 2005. Basic Principle of Real-Time

Quantitative PCR. Future Drugs Review Article. Vol. 5 No. 2, Hal: 209–

219

Atto. 2008. ATTO Printgraph AE-6933 Operation Manual. Tokyo: ATTO

Corporation.

Azira, Nur T., Amin, I. dan Che Man, Y. B. 2012. Differentiation of bovine and

porcine gelatins in processed products via Sodium Dodecyl Sulphate-

Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and principal

component analysis (PCA) techniques. International Food Research

Journal. Vol. 19 (3). Hal: 1175-1180

Balti, Rafik., J. Mourad, A. Sila, N. Souissi, N. Nedjar-Arroume, D. Guillochon,

M. Nasri. 2010. Extraction and Functional Properties f Gelatin From The

Skin of Cuttlefish (Sepia Officinalis) usiing Smooth Hound Crude Acid

Protease-Aided Process. Artikel pada PressFood Hydrocolloids.

BioDrop. 2012. Quick Start Guide. http://www.biodrop.co.uk. Diakses pada

tanggal 30 September 2014 pukul 20.30.

Bio-Rad. 2012. Protocols: Nucleic Acid Electrophoresis. Buletin 6230 Rev A.

Bio-Rad Laboratories, Inc.

Cai, H., X. Gu, M.S. Scanlan, D.H. Ramatlapeng dan C.R. Lively. 2012. Realtime

PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in

gelatin mixtures and gelatin capsules. Journal of Food Composition and

Analysis. Vol. 25. Hal: 83-87.

Campbell, Nail A., Reece, Jane B., Mitchell, Lawrence G. 2002. Biologi. Edisi

Kelima Jilid 1, alih bahasa Rahayu Lestari. Jakarta: Erlangga

Carr, J. M., K. Sufferling, dan J. Poppe. 1995. Hydrocolloids and their use in the

confectionery Industry. Journal of Food Technology. Vol. 32 (7). Hal:

41-42

http://www.biodrop.co.uk/

52


Chee Tan, Siun, dan Beow Chin Yiap. 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction:

The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology.

Volume 2009, Article ID 574398.

Demirhan, Y., P. Ulca dan H.Z. Senyuva. 2012. Detection of porcine DNA in

gelatine and gelatine-containing processed food products-Halal/Kosher

authentication, Meat Science. Vol. 90. Hal: 686-689.

Edward, M. G., Ann Bickel dan Paul Weihs. 1996. Effect of highly fragmented

DNA on PCR. Nucleic Acids Research, Vol. 24, No. 24. Oxford

University Press.

Erwanto, Y., Abidin, M.Z., Sismindari, dan Rohman, A. 2012. Pig Species

Identification in Meatballs Using Polymerase Chain Reaction-

Restriction Fragment Length Polymorphism for Halal Authentication.

International Food Research Journal 19 (3): 901-906.

Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung:

FMIPA-Universitas Padjajaran

Gjerse, D. T., L. Hoang, and D. Hornby. 2009. RNA Purification and Analysis:

Sample Preparation, Extraction, Chromatography. Edisi ke-1. Germany:

Wiley VCH,Weinheim.

Guillen, Gómez M.C., Pérez-Mateos, M., Gómez-Estaca, J., López-Caballero, E.,

Giménez, B., & Montero, P. (2009). Fish gelatin: a renewable material

for the development of active biodegradable films. Trends in Food

Science and Technology. Vol. 20. Hal: 3-16.

Hartati, Yeni W., Maksum, Iman P. 2010. Amplifikasi 0,4 kb Daerah D-Loop

DNA Mitokondria dari Sel Epitel Rongga Mulut untuk Keperluan

Forensik. Bandung: FMIPA-Universitas Padjadjaran.

Hashim, D.M., Y.B.C. Man, R. Norakasha, M. Shuhaimi, Y. Salmah dan Z.A.

Syahariza. 2010. Potential use of Fourier transform infrared spectroscopy

for differentiation of bovine and porcine gelatin. Food Chemistry. Vol.

118. Hal: 856-860.

Hidaka, S. dan S.Y. Liu. 2003. Effects of gelatins on calcium phosphate

precipitation: A possible application for distinguishing bovine bone

gelatin from porcine skin gelatin. Journal of Food Composition and

Analysis. Vol. 16. Hal: 477-483.

Hinterwaldner, R. 1977. Technology of gelatin manufacture. The Science and

Technology of Gelatin. London: Academic Press. Hal: 315–361.

Horton, H. Robert, Laurence A. Moran, K. Gray Scrimgeour, Marc D. Perry, J.

David Rawn. 2006. Principles of Biochemistry. Edisi Keempat. USA:

Pearson Education, Inc.

53


Ikada, Y. 2002. Biological Materials. Integrated Biomaterials Science. USA:

Academic /Plenium Publishers.

Jamaludin, M. A., Mohd. Anuar Ramli, Dzulkifly Mat Hashim. 2012. Fiqh

Istihalah: Integration of Science and Islamic Law. Revelation and

Science. Vol. 02, No.02

Jannah, A. 2008. Gelatin: Tinjauan Kehalalan dan Alternatif Produksi. Malang:

UIN-Malang Press

Jones, B.E., 2004. The history of The Medicinal Capsule. Dalam: Podczeck, F.,

Jones, B.E. (Eds.). Pharmaceutical Capsules. USA: Pharmaceutical

Press. Hal: 1–22.

Koolman, Jan dan Klaus-Heinrich Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry.

Edisi Kelima. Germany: Georg Thieme Verlag

Lelana, Neo Endra, Sutarno dan Nita Etikawati. 2003. Identifikasi Polimorfisme

pada Fragmen ND-5 DNA Mitokondria Sapi Benggala dan Madura

dengan Teknik PCR-RFLP. Biodiversitas. Vol. 4 (1). Surakarta: FMIPA-

Universitas Sebelas Maret

Lewis, Matt. 2001. Agarose Gel Electrophoresis (Basic Method).

http://www.methodbook.net/. Diakses pada tanggal 1 Oktober 2014 pukul

14.15.

LPPOM MUI. 2008. Halal Menentramkan Umat. Jurnal Halal No.72.

Morrison TB, Weis JJ, dan Wittwer CT. 1998. Quantification of Low-copy

Transcripts Bay continuous SYBR Green I Monitoring During

Amplification. BioTechniques 24. Hal: 954–958.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. Bogor: IPB Press

Nemati, M., M.R. Oveisi, H. Abdollahi dan O. Sabzevari. 2004. Differentiation of

bovine and porcine gelatins using principal component analysis. Journal

of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Vol. 34. Hal: 485-492.

Nhari, R.M.H.R., A. Ismail and Y.B. Che Man. 2012. Analytical methods for

gelatin differentiation from bovine and porcine origins and food

products. Journal of Food Science. Vol. 71 Hal: 42-46.

Passarge, Ebenhard. 2007. Color Atlas of Genetics. Edisi Ketiga. New York:

Thieme

Purves, William K., David Sadava., Gordan H. Orians., & Craig Heller. 2004.

Life: The Science of Biology. Edisi Ketujuh. United States of America:

Sinauer Associates and W. H. Freeman

http://www.methodbook.net/

54


Putra, Suhartono. 1999. Biologi Molekuler Kedokteran, editor: Suhartono Taat

Putra. Surabaya : Airlangga University Press.

Rabadiya, Bhavisha dan Paresh Rabadiya. 2013. Capsule Shell Material From

Gelatin To Non Animal Origin Material. International Journal of

Pharmaceutical Research and Bio Science (IJPRBS). Vol. 2(3). Hal: 42-

71

Rachmawati, Putri. 2012. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Dendeng

Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA

Menggunakan Real-Time PCR. SKRIPSI. Program Studi Farmasi.

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri


Raven, Peter H., George B. Johnson, Kenneth A. Mason, Jonathan B. Losos,

Susan R. Singer. 2008. Biology. Edisi Kesembilan. New York: McGraw-

Hill Companies, Inc.

Republika. 2013. Ini Pernyataan Menkes Soal Obat Halal yang Disesalkan MUI

via www.republika.co.id. Diakses pada tanggal 28 Desember 2013

Republika. 2014. MUI: Menkes Langgar Hak Asasi Konsumen via

http://www.republika.co.id. Diakses pada tanggal 28 Desember 2013

Rochea. 2012. High Pure PCR Template Preparation Kit. http://www.roche-

applied-science.com. Diakses pada 13 Juni 2014 pukul 17.05

Rocheb. 2012. High Pure Technology and Silica Adsorption Kits.

http://lifescience.roche.com. Diakses pada 22 September 2014 pukul

04.17

Rochec. 2005. LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master. www.rocheapplied-

science.com. Diakses pada 2 September 2014 pukul 10.30

Roched. 2008. LightCycler® 480 Probes Master. www.rocheapplied-science.com.

Diakses pada 2 September 2014 pukul 12.30

Rochee. 2008. The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual.

www.rocheapplied-science.com. Diakses pada 10 Juni 2014 pukul 15.05

Rowe, Raymond C., Paul J. Sheskey, dan Marian E Quinn. 2009. Handbook of

Pharmaceutical Excipients. Edisi Keenam. London: Pharmaceutical

Press.

Riaz, M.N. dan M.M. Chaudry. 2004. Halal Food production. USA: CRC Press.

Sahilah, A. M., Mohd. Fadly, A. S. Norrakiah, A. Aminah, Wan Aida, W. M.

Ma’aruf, A. G dan Mohd. Khan, A. 2012. Halal market surveillance of

soft and hard gel capsules in pharmaceutical products using PCR and

http://www.republika.co.id/

http://www.republika.co.id/

http://www.roche-applied-science.com/

http://www.roche-applied-science.com/

http://lifescience.roche.com/

http://www.rocheapplied-science.com/




55


southern-hybridization on. International Food Research Journal 19(1):

371-375.

Sambrook, J., E.F. Fritsch dan T. Manuatis. 2001. Molecular Cloning, A

Laboratory Manual. Edisi ketiga. New York: Cold Spring Harbour Lab.

Press.

Schrieber, R., & Gareis, H. 2007. Gelatine Handbook: Theory dan Industrial

Practice. Jerman: Wiley VCH Verlag GmbH dan Co. KGaA

Sharma, Himani et al,. 2005. Mutations in the mitochondrial DNA D-loop region

are frequent in cervical cancer. Cancer Cell International 2005, 5:34.

Smith, Cindy J. dan A. Mark Osborn. 2008. Advantages and Limitations of

Quantitative PCR (Q-PCR)-based Approaches in Microbial Ecology.

Federation of European Microbiological Societies UK: Blackwell

Publishing Ltd.

Stanley, J.P. 1976. Capsule: The Theory and Practice of Industrial Pharmacy.

Diedit oleh L. Lachman, H.A. Lieberman, dan J.L. Kanig. Philadelphia,

Lea & Febiger. Hlm 404 - 420.

Stansfield, William D., Jaime S.Colomé., Raúl J.Cano. 2003. Shaum’s Easy

Outlines: Molecular and Cell Biology. USA: McGraw-Hill Companies,

Inc.

Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. 2004. Evaluation of Real-Time PCR

Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles

Venien, A. dan D. Levieux. 2005. Differentiation of gelatins using polyclonal

antibodies raised against tyrosylated bovine and porcine gelatins. J.

Immunoassay Immunochem., 26, 215-229.

Widyaninggar, A., Triwahyudi., Triyana, K., dan Ab.Rohman. 2012.

Differentiation between porcine and bovine gelatin in commercial

capsule shells based on amino acid profiles and principal component

analysis. Indonesian J.Pharm Vol. 23 No. 2: 96-101 ISSN-p : 0126-1037

Westermeier, 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice.

New-Jersey: John Wiley & Sons inc.

Wink, M. 2006. An Introduction to Molecular Biotechnology: Molecular

Fundamentals, Methods and Application in Modern Biotechnology,

Germany: Wiley-VCH,Weinheim.

Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga

Zhang, G.F., T. Liu, Q. Wang, J.D. Lei, G.H. Ma dan Z.G. Su. 2008.

Identification of marker peptides in digested gelatins by high

56


performance liquid chromatography/ mass spectrometry. Chin. J. Anal.

Chem., 36, 1499-1504.

Zhou, P. dan Regenstein, J. M. 2005. Effects of Alkaline and Acid Pretreatments

on Alaska Pollock Skin Gelatin Extraction. Journal of Food Science,

70(6): C392–C396.

Zyskind, J. W. dan S. I. Bernstain. 1992. Recombinant DNA Manual. Academic

Press, Inc. California

57


Lampiran 1. Kerangka Penelitian

Gelatin Standard Daging Segar

Ekstraksi dan isolasi

DNA

Analisa DNA hasil isolasi

dengan Elektroforesis Agarosa

dan Spektrofotometri

Amplifikasi dengan Real Time PCR

Analisa Hasil

DNA

terisolasi?

tidak

ya

Isolat DNA

Kesimpulan

Daging Sapi

Daging Babi

Gelatin Babi

Gelatin Sapi

Metode

SYBR Green

Metode

Hydrolysis Probe

58


Lampiran 2. Perhitungan pembuatan larutan primer dan probe

1. Membuat larutan primer dan probe 10 μM dari larutan induk 100 μM

V1 . M1 = V2 . M2

X . 100 μM = 100 μL . 10 μM

X = 1000

100

= 10 μL

Maka, 10 μL diambil dari masing-masing primer 100 μM dan di add 90 μL

PCR water grade

2. Mengetahui volume primer dan probe yang diambil dari larutan primer dan

probe 10 μM dalam pembuatan master mix

a) Rekomendasi konsentrasi untuk primer pada SYBR Green mastermix

adalah 0.3-1 μM (Roche), dipilih konsentrasi 0.5 μM untuk tiap primer.

V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 μM = 20 μL . 0,5 μM

X = 10

10

= 1 μL

Maka, diambil 1 μL dari larutan primer konsentrasi 10 μM

b) Rekomendasi konsentrasi untuk primer pada Hydrolysis Probe

mastermix adalah 0.3-1 μM (Roche), dipilih konsentrasi 0.8 μM untuk

tiap primer.

V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 μM = 20 μL . 0,8 μM

X = 16

10

= 1,6 μL

Maka, diambil 1,6 μL dari larutan primer konsentrasi 10 μM

59


c) Rekomendasi konsentrasi untuk primer pada Hydrolysis Probe adalah

0.05-0.2 μM (Roche), dipilih konsentrasi 0.2 μM untuk tiap primer.

V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 μM = 20 μL . 0,2 μM

X = 4

10

= 0,4 μL

Maka, diambil 0,4 μL dari larutan primer konsentrasi 10 μM

60


Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

Primer Sapi Primer Babi

Primer sapi forward

Tm = 2oC (2+8) + 4oC (2+8)

= 60oC

Primer babi forward

Tm = 2oC (6+5) + 4oC (4+7)

= 66oC

Primer sapi reverse

Tm = 2oC (5+8) + 4oC (6+5)

= 70oC

Primer babi reverse

Tm = 2oC (8+7) + 4oC (6+3)

= 66oC

Tm rata-rata Primer sapi:

Tm = (60 + 70) / 2

= 65oC

Ta* = 60oC

Tm rata-rata Primer babi:

Tm = (66 + 66) / 2

= 66oC

Ta* = 61oC

*) Suhu annealing yang digunakan biasanya 5oC di bawah Tm (Muladno, 2010)

Rumus Tm = 2oC (A+T) + 4oC (G+C)

61


Lampiran 4. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA

Tabel 7. Campuran reaksi SYBR Green mastermix

Konsentrasi Larutan

Induk

Jumlah yang

digunakan

Primer Forward 0,5 μM 10 μM 1 μL

Primer Reverse 0,5 μM 10 μM 1 μL

LightCycler® 480

SYBR Green I

- - 10 μL

ddH2O - - 3 μL

DNA template - - 5 μL

Total volume reaksi 20 μL

Tabel 8. Campuran reaksi Hydrolysis Probe mastermix

Konsentrasi Larutan

Induk

Jumlah yang

digunakan

Primer Forward 0,8 μM 10 μM 1,6 μL

Primer Reverse 0,8 μM 10 μM 1,6 μL

Probe 0,2 μM 10 μM 0,4 μL

LightCycler® 480

Probe Master

- - 10 μL

ddH2O - - 1,4 μL

DNA template - - 5 μL

Total volume reaksi 20 μL

62


Lampiran 5. Hasil Optimasi Suhu Annealing dengan Metode Gradien PCR

Gambar 1. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer sapi

pada DNA daging sapi dengan metode gradien PCR (Sumber:

Rahmawati, 2012)

Gambar 2. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer babi

pada DNA daging babi dengan metode gradien PCR (Sumber:

Rahmawati, 2012)

63


Lampiran 6. Spesifikasi kit ekstraksi dan isolasi DNA: High Pure PCR

Template Preparation Kit (Roche)

Tabel 9. Spesifikasi kit ekstraksi (Sumber: Rochea, 2012)

No.

Vial

Warna Tutup

Vial Label Kandungan

1 Putih Tissue Lysis Buffer

4 M urea, 200 mM Tris, 20

mM NaCl, 200 nM EDTA.

pH 7.4.

2 Hijau Binding Buffer

6 M guannidine-HCl, 10 mM

urea, 10 mM Tris-HCl, 20 %

Triton X-100 (v/v). pH 4.4

3 Merah muda Proteinase K Proteinase K (rekombinan,

PCR grade)

4a Hitam Inhibitor Removal Buffer

5M guanidine-HCl, 20 mM

Tris-HCl, 36% etanol absolut

(v/v). pH 6.6

4 Biru Washing Buffer

20 mM NaCl, 2 mM Tris-

HCl, 80% etanol absolut

(v/v). pH 7.5

5 Tidak Berwarna

(Bening) Elution Buffer 10 mM Tris-HCl, pH 8.5

- - High Pure Filter Tube

Tube berbahan polypropylene

dengan filter yang terbuat

dari kapas fiber glass. Dapat

menampung 700 μl volume

sampel.

- - Collection Tube

Tube berbahan

polypropylene. Dapat

menampung 2 ml volume

sampel.

64


Lampiran 7. Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan

Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi dengan

Suhu Annealing 60oC

*Keterangan : DS = Daging sapi; GS = Gelatin Sapi; GB = Gelatin Babi; DB = Daging Babi;

NTC = No Template Control; CP = Crossing Point; Tm = Melting Temperature

65




Suhu Annealing 62oC



66




Suhu Annealing 64oC



67




Suhu Annealing 65oC



68



Metode SYBR Green Menggunakan Primer Babi dengan

Waktu Annealing 10 detik dan Waktu Extension 7 detik



69







70







71


Lampiran 14. Hasil Kurva Amplifikasi dengan Metode Hydrolysis

Probe Menggunakan Primer Sapi


NTC = No Template Control; CP = Crossing Point

Lampiran 15. Hasil Kurva Amplifikasi dengan metode Hydrolysis

Probe Menggunakan Primer Sapi


NTC = No Template Control; CP = Crossing Point

72


Lampiran 16. Gambar alat alat yang digunakan dalam penelitian

Gambar 1. Mikropipet

(1) Vol 1000 ul; (2) Vol 200 ul; (3) Vol

20 ul; (4) Vol 10 ul

Gambar 2. Mikrotips

Gambar 3. Microsentrifuge tube

Gambar 4. Satu set alat elektroforesis

(1) Chamber; (2) Gel Caster; (3) Comb;

(4) Power Supply

Gambar 5. Gel Documentation

Gambar 6. Microsentrifugator

73


Gamabar 7. Vortex

Gambar 8. Water Bath

Gambar 9. Kit Ekstraksi

Gambar 10. Filter tube dan

Collection tube

Gambar 11. Spektrofotometri DNA

Gambar 12. Multiwell Plates

Gambar 13. Sealing Foil

Gambar 14. Real Time PCR

perbandingan antara metode sybr green dan metode...

Documents