PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

Oleh :

DOSEN PENGAMPU DAN TIM ASISTEN

FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH

SEMARANG

2014

ACARA I

PREPARASI ALAT DAN STERILISASI

Tujuan

1. Praktikan mengetahui jenis dan fungsi alat-alat dalam praktikum mikrobiologi

2. Praktikan dapat memahami bermacam-macam teknik sterilisasi

3. Praktikan dapat mengoprasikan alat-alat sterilisasi

Cara Kerja

1. Gambar secara skematis alat-alat sterilisasi

2. Jelaskan fungsi masing-masing alat

3. Jelaskan prinsip kerja dari masing-masing alat sterilisasi

4. Jelaskan bagaimana cara mengoprasikan alat-alat sterilisasi

Dasar teori

Mikrobiologi merupakan ilmu yang mempelajari organisme-organisme berukuran

mikroskopis. Untuk mempelajari sifat dan peranannya, mikroba perlu dibiakkan dan

diamati di dalam laboratorium. Meningat bahwa mikroba merupakan mahkluk hidup

dengan ukuran sangat kecil, maka kontaminasi merupakan hal yang perlu dihindari.

Untuk kepentingan mempelajari mikroba dipertlukan berbagai alat dengan berbagai

fungsi, antara lain peralatan sterilisasi, peralatan inkubasi, peralatan utnuk mengamatan

makroskopis maupun mikroskopis dan berbagai peralatan gelas untuk kegiatan kultivasi

mikroba.

I. PERALATAN GELAS.

Alat-alat gelas yang dipergunakan dalam pekerjaan mikrobiologi pada umumnya

berupa alat-alat gelas seperti yang digunakan dalam lab. Kimia, antara lain : tabung

reaksi, erlenmeyer, gelas piala, pipet ukur, gelas ukur, gelas obyek, kaca penutup, dll.

Gambar 1.1. Peralatan gelas dari kiri ke kanan : a) gelas ukur ; b) beaker glass ; c) cawan Petri ; d) Erlenmeyer ; e) Pipet ukur ; f) tabung reaksi.

Membersihkan peralatan gelas

Untuk mencegah terjadinya kontaminnasi peralatan gelas baru perlu dibersihkan sebelum

digunakan untuk menghilangkan spora yang kemungkinan melekat pada alat gelas selama

penyimpanan, sedangkan peralatan gelas yang telah digunakan perlu dibersihkan dari sisa-

sisa mikroba. Adapun cara membersihkan peralatan gelas adalah sbb:

1. Alat gelas baru

Alat gelas direbus dalam larutan Na3PO4 (trinatrium fosfat) 1% sampai mendidih

beberapa saat, selanjutnya dicuci dengan air hingga bersih dan direndam dalam larutan HCl

1% selama 24 jam untuk melarutkan lapisan fosfat pada alat gelas tersebut. Alat gelas

selanjutnya dicuci kembali dengan air dan dibilas bersih dengan akuades, selanjutnya

dikeringkan di dalam oven (hot air sterilizer) atau langsung dengan sinar matahari.

2. Alat-alat gelas yang sudah dipakai

Alat yang telah digunakan disterilkan beserta sisa medium/biakan dengan menggunakan

autoklaf pada tekanan 15 lbs (± 2 atm, suhu 121oC) selama 20 menit, untuk menghilangkan

mikroba patogen. Isi tabung dibuang dan selanjutnya tabung direndam dalam larutan Na3PO4

1% dan didihkan selama beberapa menit. Setelah dingin atau hangat-hangat kuku, alat gelas

disikat sampai bersih dan dibilas dengan air. Direndam dlam larutan HCl 1%, dicuci bersih

dengan air, kemudian dibilas dengan akuades. Alat gelas selanjutnya dikeringkan di dalam

oven atau dengan sinar matahari.

Sisa medium padat harus dibuang ke dalam tempat yang telah disediakan, dilarang

membuang medium agar yang masih cair, karena akan membeku dan menyumbat saluran

pembuangan.

3. Pipet yang sudah dipakai

ab

cd e f

Pipet yang telah selesai digunakan untuk mengambil suspensi mikroba harus didesinfeksi

dengan larutan fenol atau desinfektan lain selama waktu tertentu, slanjutnya dicuci dengan

sabun, dibilas bersih dan dikeringkan di dalam oven.

4. Gelas benda baru.

Gelas benda baru perlu direndam dalam larutan alkohol asam (mengandung HCl 3%)

selama beberapa jam. Dicuci dengan air, dan dibilas dengan akuades. Dikeringkan dengan

kain halus, selanjutnya disimpan dalam wadah yang bersih dan tertutup. untuk menghidari

menempelnya lemak dari jari tangan, gelas benda dipegang pada bagian sisinya.

5. Kaca penutup baru

Kaca penutup yang baru, direndam dalam alkohol asam selama beberapa jam. Dicuci

dengan air, kemudian dibilas dengan akuades. Dikeringkan dengan kain halus, selanjutnya

disimpan dalam wadah yang bersih dan tertutup.

6. Gelas benda dan gelas penutup yang telah dipakai.

Gelas benda dan kaca penutup yang selesai dipakai direndam dalam larutan Na3PO4 1%

selama 15 menit, dicuci dengan air, kemudian direndam dalam larutan HCl 1% untuk

melarutkan sisa fosfat yang melekat. Dicuci dengan air sampai bersih, kemudian dibilas

dengan akuades. Dikeringkan dengan kain halus, selanjutnya disimpan dalam wadah yang

bersih dan tertutup.

II. PERALATAN STERILISASI

Semua peralatan yang digunakan dalam mikrobiologi harus dijaga kebersihannya dan

disterilkan sebelum digunakan untuk menghindari terjadinya kontaminasi dengan mikroba

yang tidak diinginkan. Peralatan untuk sterilisasi antara lain : lampu spiritus, autoklaf,

disamping itu masih pula diperlukan lemari inokulasi (transfer-box / laminar air flow),

milipore filter, dll.

a b c d

Gambar 1.2. Peralatan sterilisasi: a) Lampu spiritus, b) Lampu bunsen, c) Autoklaf, d) Millipore filter apparatus , e) Laminar air flow, f) Oven

Selain itu diperlukan alat khusus untuk menanam mikroba yang disebut dengan jarum

tanam atau ose (Gambar 1.3.). Terdapat 2 jenis jarum tanam, yaitu jarum tanam tajam

yang digunakan untuk menanam / memindahkan biakan berfilamen (jamur), dan ose atau

jarum tanam bulat yang digunakan untuk menanam/memindahkan biakan mikroba yang

tidak berfilamen (bakteri dan khamir)

Gambar 1.3. jarum tanam tajam dan ose

III. PERALATAN INKUBASI

Untuk menumbuhkan mikroba di dalam laboratorium, diperlukan peralatan tertentu

berdasarkan sifat bakteri yang berkaitan dengan kondisi optimum pertumbuhannya. Menurut

suhu pertumbuhannya, mikroba dikelompokkan menjadi :

1. psikrofil : hidup pada suhu -10 -20oC, optimum pada suhu 10oC

2. mesofil : hidup pada suhu 10 - 50oC, optimum pada suhu 35oC

3. termofil : hidup pada suhu 40 - 70oC, optimum pada suhu 60oC

4. hipertermofil : hidup pada suhu 65 - 110oC, optimum pada suhu 90oC

Menurut kebutuhan akan oksigen, mikroba dikelompokkan menjadi:

ef

1. aerob

2. anaerob fakultatif

3. anaerob obligat

4. anaerob aerotoleran

5. mikroaerofil

Untuk menumbuhkan mikroba sesuai dengan kebutuhan suhu inkubasi dan oksigen, dapat

digunakan peralatan seperti pada Gambar 1.4.

Gambar 1.4. Peralatan inkubasi: a) Candle jar ; b) Anaerobic jar ; c) Inkubator

IV. MIKROSKOP

Perkembangan ilmu mikrobiologi, salah satunya ditentukan oleh penemuan dan

perkembangan mikroskop sebagai suatu alat utama untuk mengamati mikroba yang

berukuran mikrometer (μm = 10-3 mm) atau lebih kecil lagi. Beberapa jenis mikroskop telah

dikembangkan antara lain mikroskop cahaya yang mendapatkan sumber cahaya dari

gelombang cahaya dan mikroskop elektron yang sumber cahayanya berasal dari berkas sinar

elektron. Berbagai jenis mikroskop cahaya telah dikenal, yaitu mikroskop medan terang,

mikroskop medan gelap (dark field microscope), mikroskop fluorensensi (fluorecens

microscope) dan mikroskop fase kontras (phase contrast microscope). Mikroskop medan

terang, merupakan jenis mikroskop yang paling umum digunakan di dalam praktikum

mikrobiologi (Gambar 1.5.)

Mikroskop jenis ini umumnya mempunyai lensa obyektif perbesaran lemah ( 4x atau

10x), perbesaran sedang (40x) dan perbesaran kuat (100x).Total perbesaran pengamatan

obyek ditentukan dari hasil perkalian lensa obyektif dan lensa okuler yang digunakan.

a b c

Gambar 1. 5. Mikroskop medan terang dan bagian-bagiannya

Pengamatan obyek dengan menggunakan mikroskop, dimulai dengan perbesaran

lemah sampai ditemukan gambaran obyek yang fokus, selanjutnya lensa obyektif

dipindahkan ke perbesaran sedang sehingga diperoleh gambaran yang fokus, selanjutnya

lensa obyektif dipindahkan ke perbesaran kuat atur sampai terlihat gambaran yang jelas

(fokus). Untuk menurunkan indeks bias cahaya yang dapat mengaburkan pengamatan pada

penggunaan lensa okuler 100x, digunakan minyak imersi. Setelah penggunaan minyak

imersi, lensa obyektif 100x dibersihkan dengan larutan xylol atau alkohol 70%.

Cara penggunaan mikroskop:

Bersihkan meja preparat dengan kain halus.

1. Letakkan preparat di atas meja preparat dan jepit dengan penjepit agar preparat tidak

bergerak.

2. Mulailah mengamati preparat menggunakan lensa obyektif dengan perbesaran terkecil

(misalnya 4x). Putar revolver, sehingga lensa obyektif berada tepat satu poros / di atas

preparat.

3. Nyalakan sumber cahaya dan carilah fokus preparat dengan menaik-turunkan lensa dengan

cara memutar tombol fokus kasar secara perlahan-lahan. Hentikan apabila mulai terlihat

bayangan gambar pada bidang pandang mikroskop.

4. Lanjutkan pencarian fokus preparat pada bidang pandang dengan memutar tombol fokus

halus, sampai preparat terlihat jelas.

Lensa Okuler

Fokus Halus

Fokus Kasar

Penggerak Preparat

Tubus

Meja Preparat

Diafragma

Sumber Cahaya

Objektif 100x

Revolver

5. Setelah preparat terlihat jelas/detil, perbesar pengamatan dengan menempatkan obyektif

perbesaran yang selanjutnya (10X) tepat satu poros / di atas preparat.dengan memutar

revolver (lakukan dengan tidak mengubah posisi/meja preparat dan posisi tombol fokus

kasar/halus.

6. Lakukan langkah-langkah 4 s/d 6, sampai mendapatkan gambar yang fokus/detil.

7. Perbesar pengamatan menggunakan obyektif perbesaran yang lebih kuat (40x, selanjutnya

100x), dengan melakukan langkah-langkah seperti di atas.

8. Setelah selesai menggunakan, ambil preparat dan bersihkan meja preparat dengan

menggunakan lap atau kertas tisu yang bersih.

9. Sisa-sisa minyak imersi pada lensa obyektif dibersihkan secara hati-hati dengan larutan

xylol/ethanol 96% dengan menggunakan kertas lensa

10. Simpan kembali mikroskop dengan posisi lensa perbesaran lemah tepat di atas permukaan

meja preparat, meja preparat dan diturunkan dengan menggunakan tombol fokus sampai

lensa mencapai jarak terdekat dari permukaan meja preparat.

Catatan:

1. Untuk pengamatan yang lebih jelas, cobalah mengatur banyaknya sinar yang mengenai

preparat dengan cara mengubah-ubah bukaan diafragma yang terletak di bawah meja

preparat.

2. Pengamatan obyek/preparat menggunakan perbesaran kuat (obyektif 100x) seringkali

kabur, hal ini disebabkan karena jarak antara obyek dan lensa terlalu dekat. Gambaran

obyek dapat terlihat lebih jelas dengan menurunkan indeks bias cahaya, menggunakan

minyak imersi yang diteteskan di atas permukaan preparat (menjadi media antara

permukaan preparat dengan lensa).

STERILISASI

Sterilisasi yaitu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari

semua bentuk kehidupan. Sterilisasi adalah usaha untuk membebaskan alat-alat atau

bahan-bahan dari segala macam bentuk kehidupan terutama mikroba (terrmasuk spora

mikroba). Dalam mikrobiologi dimaksud sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan

semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Ketika untuk pertama

kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptic, sesungguhnya hal itu telah

menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran (Hadioetomo, 1985).

1. Macam-Macam Sterilisasi

Sterilisasi Secara Fisik

Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang

dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau

terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat

“bejana/ruang panas” (oven dengan temperatur 170o – 180oC dan waktu yang

digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas)(Suriawiria,

2005).Menurut referensi yang didapat sterilisasi secara pemanasan dibagi menjadi 2

yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering. Sterilisasi basah menggunakan Autoklaf

dengan suhu 121oC untuk mensterilkan media selama 15 menit, untuk mensterilkan

alat selama 20 menit. Karena titik didih air menjadi 1210C itu disebabkan oleh

tekanan 1 atmosfer pada ketinggian permukaan laut, maka daur sterilisasi tersebut

seringkali juga dinyatakan sebagai 1 atm 15 menit.

- Sterilisasi dengan pemijaran.

Digunakan untuk mensterilkan jarum preparat, ose dan alat lain yang terbuat

dari logam, dengan cara membakar langsung alat-alat tersebut di atas api lampu

spiritus atau bunsen (Gambar 1.6).

Gambar 1.6. Cara mensterilkan ose

- Sterilisasi dengan udara panas kering

Alat yang digunakan adalah hot air sterilizer atau oven. Alat-alat gelas seperti

erlenmeyer, petri dish, tabung reaksi dsb. disterilkan pada suhu 170 – 180oC selama 2

jam atau lebih, tergantung dari jumlah dan bahan yang disterilkan.

Gambar 1.7. Hot air sterilizer / Oven

- Sterilisasi dengan uap air panas.

Beberapa jenis bahan, misalnya senyawa gula, vitamin tidak tahan suhu yang

terlalu tinggi. Alat yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan yang bersifat seperti

ini, adalah Arnold steam sterilizer. Bahan yang akan disterilkan dimasukkan ke dalam

alat dan dipanaskan pada suhu 100oC selama 30 menit untuk membunuh sel-sel

vegetatif mikroba. Pemanasan diulang 3 kali dengan interval waktu 24 jam, untuk

memberi kesempatan spora yang ada tumbuh menjadi sel vegetatif.

Gambar 1.8. Arnold’s steam sterilizer

- Sterilisasi dengan uap panas bertekanan.

Cara ini merupakan cara sterilisasi yang terbaik, diantara berbagai cara

sterilisasi lain. Alat yang digunakan adalah autoklaf. Uap panas bertekanan tinggi

yang dihasilkan dalam alat ini akan mempermudah penetrasi uap air ke dalam sel

mikroba yang menyebabkan terjadinya koagulasi protein protoplasma, sehingga

mempercepat kematian mikroba

Gambar 1.9. Autoklaf

Bahan yang tahan panas dan tekanan tinggi, serta berbagai alat lain dapat

disterilkan dengan metode ini. Media atau Bahan yang disterilkan harus ditempatkan

dalam tabung/erlenmeyer yang tertutup rapat. Lama sterilisasi berkisar 15-30 menit

dengan tekanan 2 atm dan suhu 121oC, tergantung dari jenis dan sifat bahan yang

disterilkan .

Cara Penggunaan autoklaf :

1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air

kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut.

Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, makatutup

harus dikendorkan.

3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap

yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan

terlebihdahulu.

4. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC.

5. Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf

dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman

ditutup(dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’

dimulaisejak tekanan mencapai 2 atm.

6. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun

hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisuregauge

menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dankeluarkan isi

autoklaf dengan hati-hati.

Sterilisasi secara kimia

Menurut Hala (2009) bahan-bahan yang biasa digunakan dalam sterilisasi ini

misalnya penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin. Sterilisasi dengan

zat kimia menggunakan desinfektan. Disinfektan adalah bahan kimia yang digunakan

untuk mencegah terjadinya infeksi atau pencemaran oleh jasad renik atau obat untuk

membasmi kuman penyakit.

Sterilisasi Secara Mekanik

Dengan cara penyaringan larutan atau suspensi dibebaskan dari semua organisme

hidup dengan cara melakukannya lewat saringan dengan ukuran pori yang sedemikian

kecilnya sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan diatasnya, sedangkan

filtratnya ditampung didalam wadah yang steril (Hadioetomo, 1985). Sterilisasi

dengan penyaringan digunakan untuk bahan yang peka terhadap panas misalnya

serum, urea dan enzim (Lay dan hastowo, 1982).

Gambar 1.10. Millipore filter

Teknik Aseptis

Teknik aseptik adalah langkah-langkah yang diambil agar dalam percobaan di

laboratorium sehingga diperoleh hasil yang akurat. Teknik aseptik juga berfungsi

untuk melindungi diri dari infeksi dan pencemaran lingkungan. Langkah aseptik yang

diambil missal dengan menyemprotkan alkohol pada tangan dan mengelap meja

percobaan dengan desinfektan sebelum memulai percobaan.

EVALUASI :

1. a. Berapa total perbesaran yang diperoleh dengan perbesaran sedang?

b. Berapa total perbesaran yang diperoleh dengan pengamatan minyak imersi?

2. Apa fungsi penggunaan minyak imersi dalam pengamatan dengan lensa obyektif 100x?

3. Bagaimana cara Saudara mensterilkan larutan gula yang termo labil?

4. Bagaimana cara saudara menghilangkan spora bakteri dalam suatu bahan?

5. Kalau Saudara akan menggunakan pipet, bagaimana Saudara mensterilkannya?

6. Sebutkan 4. metode sterilisasi secara fisik, dan jelaskan keuntungan dan kerugian masing-

masing metode.