penuntun praktikum mikrobiologi hasil ternak

i

PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI HASIL TERNAK

Oleh:

Sri Anggreni Lindawati Martini Hartawan

I Nyoman Sumerta Miwada Ni Putu Mariani

PROGRAM STUDI ILMU PETERNAKAN

FAKULTAS PETERNAKAN UNIVERSITAS UDAYANA

2015

ii

KATA PENGANTAR

Penuntun praktikum ini disusun dalam rangka melaksanakan praktikum dalam mata kuliah Mikrobiologi Hasil Ternak Fakultas Peternakan Universitas Udayana. Tujuan dari penyusunan penuntun praktikum ini untuk menunjang mata kuliah Mikrobiologi Hasil Ternak yang diberikan pada mahasiswa semester V tentang cara-cara yang akan dikerjakan selama praktikum berlangsung.

Penuntun praktikum ini terdiri dari 7 BAB, yang meliputi: teknik penggunaan mikroskop untuk identifikasi mikroba hasil ternak, teknik sampling, teknik isolasi,teknik penghitungan, isolasi dan identifikasi mikroba, lipolitik, proteolitik, penghitungan coliform, fecal coliform dan E.coli pada bahan hasil ternak dan penghitungan kapang, khamir.

Penuntun praktikum ini disadari masih jauh dari sempurna.Materi yang disajikan hanya sebagian kecil, demikian pula jumlah acara praktikum masih sangat terbatas, disebabkan terbatasnya fasilitas peralatan dan ruang praktikum. Namun diharapkan penuntun ini dapat memberikan gambaran secara umum mengenai cara kerja pemeriksaan sampel bahan pangan hasil ternak. Tim penyusun juga berharap diwaktu yang akan datang buku penuntun ini dapat disempurnakan lagi.

Penyusun berharap, semoga “Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Hasil Ternak “ ini dapat bermanfaat bagi pihak yang memerlukan.

Denpasar, Desember 2015 Penyusun

iii

DAFTAR ISI JUDUL ............................................................................................................. i KATA PENGANTAR ..................................................................................... ii DAFTAR ISI .................................................................................................... iii PETUNJUK UMUM PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI HASIL TERNAK .. iv I. TEKNIK PENGGUNAAN MIKROSKOP ........................................... 1

1.1. Pendahuluan .................................................................................... 1 1.2. Tujuan Praktikum ............................................................................ 1 1.4. Prosedur ........................................................................................... 2 1.3. Peralatan dan Bahan ........................................................................ 1

1.4.1. Preparat basah ........................................................................ 2 1.4.2. Persiapan dan pengamatan Preparat Pewarnaan .................... 2 1.4.3. Hasil percobaan ..................................................................... 4

II. PERSIAPAN MEDIA DAN LARUTAN PENGENCER ...................... 6 2.1. Komposisi Media ............................................................................. 6 2.2. Bentuk dan Jumlah Media ............................................................... 7 2.3. Larutan Pengencer ........................................................................... 7 2.4. Cara Kerja ........................................................................................ 8 2.5. Hasil Percobaan ............................................................................... 10

III. ANALISA KUANTITATIF PADA BAHAN PANGAN HASIL

TERNAK ................................................................................................ 11 3.1. Pendahuluan .................................................................................... 11 3.2. Prosedur Pengambilan Sampel ........................................................ 11 3.3. Persiapan Pelarutan Sampel ............................................................ 12 3.4. Pemupukan ...................................................................................... 13 3.5. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan ........................... 13 3.6. Pelaksanaan Praktikum .................................................................... 13 3.7. Hasil Percobaan ............................................................................... 19

IV. PENGUJIAN KHAMIR DAN KAPANG PADA BAHAN PANGAN . 21 4.1. Pendahuluan ..................................................................................... 21 4.3. Kapang ............................................................................................. 22 4.4. Percobaan ......................................................................................... 22 4.5. Bahan Praktikum ............................................................................. 23 4.6. Hasil Praktikum ............................................................................... 24

V. PENGUJIAN AIR DAN BAHAN PANGAN HASIL TERNAK TERHADAP COLIFORM, FECAL COLIFORM DAN Escherichia coli .......................................................................................................... 26 5.1. Pendahuluan ..................................................................................... 26 5.2. Tujuan .............................................................................................. 26 5.3. Uji kualitatif coliform ...................................................................... 27

iv

5.4. Uji Jenis coliform ............................................................................ 28 5.5. Bahan Praktikum ............................................................................. 29 5.6. Pelaksanaan Praktikum ................................................................... 29 5.7. UJiKuantitatif coliform ................................................................... 31 5.8. Hasil Percobaan .............................................................................. 33

VI. MIKROBA PSIKOTROFIK, LIPOLITIK DAN PROTEOLITIK ........ 6.1. Pendahuluan .................................................................................... 36 6.2. Tujuan .............................................................................................. 6.3. Percobaan......................................................................................... 6.4.Hasil Percobaan ................................................................................ 38

VII. ISOLASI MIKROBA PATOGEN DARI BAHAN PANGAN HASIL TERNAK ................................................................................................ 40 7.1. Tahap Isolasi ................................................................................... 40 7.2. Percobaan......................................................................................... 40 7.3. Hasil Percobaan .............................................................................. 42

1

PETUNJUK UMUM PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI HASIL TERNAK

Mikroba yang berhubungan dengan bahan pangan hasil ternak ada yang dapatmenimbulkan penyakit atau keracunan, sedangkan dalam praktikum mikrobiologi hasil ternak ini, kita selalu bekerja dengan berbagai mikroba. Oleh karena itu cara bekerja di laboratorium mikrobiologi berbeda dengan cara belkerja dilaboratorium lainnya. Pekerjaan mikrobiologi harus selalu dilakukan dengan metoda aseptik.Jikalau ada kultur mikroba yang tertetes/tumpahke atas meja praktikum, harus segera dibersihkan dengan desinfektan.

Beberapa peraturan yang harus selalu diperhatikan dan ditaati sebelum mulai bekerja di laboratorium mikrobiologi adalah : 1. Dianjurkan untuk mengenakan baju/jas laboratorium berwarna putih ataupolos

lainnya untuk mencegah tertumpahnya contoh yang mengandungmikroba, zat warna, dan zat kimia lainnya pada baju.

2. Sebelum praktikum dimulai, setiapmahasiswa harus sudah membaca bukupenuntun praktikum, memahami dan membuat rencana pekerjaan yang akandilakukan pada hari itu.

3. Setiap praktikum dimulai dengan kuliahpendek dan petunjuk secara singkat mengenai apa yangakan dilakukan. Hal-hal yang tidak dimengertiharus segera ditanyakan kepada asisten.

4. Pergunakan alat-alat gelas, media, dan larutan-larutan kimia seefisienmungkin seperti yang diberikan dalam buku petunjuk.

5. Semua data-data hasil praktikum harus selalu dicatat dalam format sepertipada contoh, kemudian disusun dan dilaporkan dalam bentuk suatulaporan praktikum.

Untuk menjaga terjadinya hal-halyangtidakdiinginkan,beberapa peraturan laboratorium yang harus dijalankan adalah : 1. Meja laboratorium harus dibersihkan dengan desinfektan (misalnya lysol)

sebelum dan setelah praktikum. 2. Setiap selesai praktikum meja harus selalu bersih dari bahan-bahan dan alat-

alat bekas pakai. Semua kotoran dan alat-alat gelas bekaspakai harus diletakkan di tempat yang disediakan.

3. Tidak diperbolehkan makan, atau merokok di ruang laboratorium, disamping untuk menjaga kebersihan laboratorium, juga untuk mencegah tertelannya mikroba yang bersifat patogen.

4. Jika terjadi kecelakaan, tumpah, alat gelas pecah, atau kejadian lainnya yang tidakdiinginkan, harus segera dilaporkan kepada asisten yang sedang bertugas.

2

I. TEKNIK PENGGUNAAN MIKROSKOP Pendahuluan Mikroba yang ditemukan dalam bahan pangan hasil ternak sangat kecil sehingga tak dapat dilihat oteh mata telanjang.Untuk dapat mengamati keragaman bentuk dan ukurannya harus dilihat di bawah mikroskop. Mikroskop yang baik dapat digunakan untuk mengamati morfologi mikroba (bentuk sel, struktur rangkaian, dan ukuran) dapat diamati dibawah mikroskop dengan cara: (1) mengamati mikroba hidup tanpa pengecatan, (2) mengamati sel mati yang telah diwarnai. Sel mikroba hidup hampir tidak berwarna dan tidak menunjukkan warna yang kontras dengan media disekelilingnya sehingga tidak cukup jelas terlihat dibawah mikroskop ‘bright field’. Untuk itu harus digunakan mikroskop ‘phase contrast’ atau dengan cara memberi warna pada sel tercsebut sehingga contrast dengan warna media disekitarnya dan lebih mudah dilihat dibawah mikroskop dengan menggunakan lensa obyektif minyak imersi yang mempunyai tingkat pembesaran relative tinggi. Mikroskop yang bagus merupakan peralatan yang sangat esensial pada laboratorium mikrobiologi.Namun terlalu sering perannya dalam pengujian mikroba pada makanan terabaikan.Makanan atau minuman yang rusak/basi, umumnya mengandung 106 - 108 sel/gram atau ml, jumlah yang mencukupi untuk dapat dilihat dengan pengamatan mikroskopis secara langsung. Penilaian ekologi mikroba secara cepat: pada bahan pangan yang basi diperoleh dengan mudah melalui metode observasi mikroskopis terhadap sample yang diambil dengan teliti, secara langsung. Tujuan Praktikum 1. Mempelajari dan mengerti prosedur yang benar dalam setting mikroskop

untuk pengamatan sel mikroba. 2. Mengetahui cara mempersiapkan dan mengamati preparat sel mikroba nidup 3. Mengetahui cara mempersiapkan dan mengamati pewarnaan sel mikroba 4. Untuk membandingkan morfologiser mikroba pada bahan pangan hasil ternak

(bakteri, khamir, kapang) Peralatan dan Bahan Mikroskop Kultur Broth Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Saccharomyces cerevisieae. Gelas objek dan gelaspenutup yang bersih Loop, Lampu bunsen, tisu, parafin cair, reagen pewarnaan Gram, gelas beaker 500 mlberisi desinfektan.

3

Prosedur A. Persiapan dan Pengamatan Preparat Basah

1. Transfer satu ‘loop’ kaldubiakan yang diuji ke atas bagian tengah gelas

objek. 2. Perlahan-lahan letakkan gelas penutup diatasnya sehingga tidak ada udara

tersisa dibawah gelas penutup. Hindarkan terlalu banyakair dibawah gelas penutup karena akan menyebabkan kesulitan dalam pengamatan. Setelah itu preparat gelas diamati dibawah mikroskop. Pengamatan harus cepat dan singkat. Bila pengamatan makan waktu lama maka preparat dapat menjadi kering karena panas lampu mikroskop sehingga pengamatan detail sulit dilaksanakan. Untuk mengatasi masalah ini disekeliling antara gelas penutup dan gelas preparat diberi parafin cair.

3. Amati preparat pada kekuatan rendah, tinggi dan minyak imersi pada mikroskop medan terang.

6. Amati preparat dibawah mikroskop medan‘phase contrast’. 7. Amati preparat basah dan catat/gambar morfologi. Catat perbedaan bentuk

dan ukuran sel.

A. Persiapan dan Pengamatan Preparat Pewarnaan

1. Transper secara aseptis satu loop biakan kaldu ke atas gelas objek 2. Ratakan menjadi 1-2 cm2. Bila larutan yang diratakan terlalu tipis maka

akan sulit menemukan sel mikroba dibawah mikroskop. Bila preparat terlalu tebal maka sel akan bergerombol sehingga susah membedakan masing-masing sel yang diamati.

3. Biarkan preparat kering udara. 4. Fixasi preparat dengan melewatkannya beberapa kali diatas api bunsen.

Jangan biarkan preparat terlalu panas. Perlakuan ini bertujuan agar sel mikroba melekat pada gelas objek dan tidak tecuci selama proses pewarnaan.

5. Siapkan preparat Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Saccharomyces cerevisieae. Lakukan pewarnaan sesuai dengan prosedur pewarnaan gram. Lihat Lampiran I.

6. Amati preparat dibawah mikroskop minyak imersi. 7. Gambarlah dalam ruangan yang tersedia ini sketsa mikroba yang anda

amati pada tiap-tiap olesan dengan skala yang sesuai. Namailah mikroba serta reaksi Gram-nya. Warnailah mikroba dalam gambar sesuai dengan warna yang anda amati.

4

Lampiran 1. Pewarnaan Gram Dinding sel mikroba memiliki sifatyang berbeda, sehingga bila diwarnai dengan pewarnaan gram beberapa spesies akan mengikat zat pewarna pertama sementara yang lainnya akan melepaskan warna tersebut pada tahap proses penghilangan warna. Mikroba yang belakangan akan menyerap dan menampilkan zat pewarna kedua yang diberikan. Proses ini merupakan dua tahap awal dari identifikasi bakteri yaitu reaksi pewarnaan Gram dan morfologi set. Misalnya: Gram positif bulat, Gram negatif batang. Bahan 1. Larutan Crystal Violet

Siapkan larutan A dan B kemudian campur keduanya. A. 2,0 gram dilarutkan dalam 20 ml alkohol 95% B. 0,8 gram ammonium oxalateditarutkan dalam 80ml aquadestilata

2. Gram’s Iodine: Larutkan 2,0 gram kalium iodida dalam 300 mlaquadestilata. Tambahkan 1 gram iodine aduk sampai semua iodine larut.

3. Alkohol 95%. 4. Safranin: Larutkan 0,25 gram safranin 0 dalam 10,0 ml alkohol 95%,

kemudian tambahkan 100 ml aquadestilata. Prosedur Pewarnaan 1. Genangi preparat oles yang sudah difixasi dengan crystal violet. Biarkan

selama satu menit. Bilaslah olesan dengan air mengalir dari botol pijit. Tiriskan dengan menegakkan sisi-sisi yang sempit diatas kertas serap. Letakkan kembali preparat keatas rak pada bak pewarna.

2. Genangi olesan dengan iodium Gram selama 1-1,5 menit. Setelah itu bilaslah dengan air mengalir seperti pada butir 1.

3. Cucilah olesan dengan pemucat warna yaitu alkohol 95%, tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna crystal violet tidakterlihat lagi mengalir dari kaca objek. Bilas dengan air mengalir, tatu tiriskan dan letakkan diatas kawat bak pewarna.

4. Genangi preparat dengan pewarna tandingan, yaitu safranin selama 10 - 20 detik, kemudian miringkan kaca objek dan bilas dengan air mengalir.Tiriskan kaca objek dan seraplah kelebihan air dengan menekankan kertas serap secara hati-hati keatasnya.

5. Amatilah masing-masing preparat di bawah mikroskop dengan minyak imersi.

5

HASIL PERCOBAAN: Catat dan gambar hasil pengamatan anda pada lembar hasil berikut yang ditandatangani oleh pengawas. Judul Praktikum : ....................................... Hari/Tgl. : ....................................... A. Pengamatan Preparat Basah Gambar apa yang anda amati dari preparat basah tersebut pada perbesaran rendah dan tinggi.

Pembesaran Pembesaran

Pembesaran

6

B. Pengamatan Preparat yang Diwarnai Pembesaran : NamaBakteri : Morfologi Reaksi Gram :

Pembesaran : NamaBakteri : Morfologi Reaksi Gram :



7

II. PERSIAPAN MEDIA DAN LARUTAN PENGENCER Pupukan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba di laboratorium disebut medium (tunggal) atau media (jamak). Media dibedakan atas 3 (tiga) macam yaitu: (a) media cair yang dapat digunakan untuk berbagai tujuan diantaranya menumbuhkan atau membiakkan mikroba, fermentasi, dan uji-uji lainnya; contoh media cair adalah nutrient broth, glucose broth dan sebagainya, (b) media padat, misalnya Nutrient Agar, Plate Count Agar atau Potato Dextrose Agar, yang dapat digunakan untukmenumbuhkan mikroba pada permukaannya sehingga membentuk koloni yang dapat dihitung atau diisolasi, dan (c) media setengah padat (semi solid) yang mempunyai konsistensi di antara media cair dan media padat yang dapat digunakan untuk membuat suasana anaerob dengan teknik overlay. KOMPOSISI MEDIA Untuk menstimulir pertumbuhan mikroba, media yang digunakan harus mengandung nutrient yang dibutuhkan oleh mikroba tersebut.Kebutuhan pokok dari mikroba termasuk air, karbon,energi, nitrogen, mineral, dan faktor pertumbuhan sepertivitamin, dan beberapa asam amino.Mikroba juga mempunyai pH minimum, maksimum dan optimum untuk pertumbuhannya, oleh karena itu dalam mempersiapkan media perlu dilakukan pengaturan pH sehingga tercapai pH optimum untuk pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Media yang dipersiapkan dengan cara mencampurkan komponen-komponen kimia murni dalam jumlah tertentu sehingga komposisinya dapat diketahui dengan pasti disebut media sintetik.Media lainnya yang mengandung beberapa bahan dengan komposisi yang tidak tetap disebut media non-sintetik.Contoh media non-sintetik misalnya NutrintBroth yang mengandung ekstrak daging sapi (beef extrac) dan peptone dimana komposisi kimianya tidak tetap (Lampiran 2). Pembuatan media dapat dilakukan dengan cara menimbang masing-masing komponen bahan kimia secara teliti, kemudian mencampurkannya, melarutkannya di dalam air, mengatur pH-nya, memasukkannya ke dalam tabung, dan mensterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu dan waktu yang ditetapkan, misalnya suhu 121°C (tekanan 15 lb) selama 15-20 menit.Bermacam-macam media telah diperdagangkan dalam bentuk campuran lengkap dalam keadaan kering, sehingga dalam penggunaannya tinggal melarutkannya di dalam air dan mensterilisasi.Air yang digunakan untuk melarutkan media adalah air destilata, atau air yang telah dideionisasi. Media padat mengandung bahan pemadat seperti agar, gelatin atau silica gel.Yang paling sering dipakai adalah agar yang merupakan bahan yang diperoleh dari ganggang laut dan telah diperdagangkan dalam bentuk murni dan kering.Biasanya agar dicampurkan ke dalam media sebelum sterilisasi. Selama pemanasan agar akan mencair pada suhu 97 -100oC, dan setelah sterilisasi dan didinginkan, agar

8

akan mulai memadat pada suhu kira-kira 42°C. Media yang disimpan dalam keadaan telahmemadat, misalnya di lemari es dapat dicairkan kembali dengan cara memanasakan wadah yang berisi media di dalam wadah yang berisi air mendidih selama beberapa menit. Media yang akan diinokulasikan dengan mikroba tertentu sebelum memadat harus didinginkan terlebih dahulu sampai suhu 45-50°C. Jika media yang diinokulasikan terlalu panas, maka sebagian mikroba yang mungkin diinginkan untuk ditumbuhkan akan mati. Struktur kimia dari agar adalah galaktan, yaitu polimer dari molekul-molekul galaktosa yang tidak dapat dipecaholeh kebanyakan bakteri. Konsentrasiyang digunakan biasanya 1,5%, tetapi jika akan dilakukan goresan pada permukaan agar sebaiknya digunakan konsentrasi 1,8 - 2,0% sehingga dapat diperoleh agar yang lebih keras setelah memadat. Media setengah padat mengandung agar dalam jumlah lebih sedikit dari pada media padat, biasanya sekitar 0,5%, dan sering digunakan untuk uji pergerakan mikroba (motilitas).Di dalam media, agar tidak digunakan sebagai makanan oleh mikroba, melainkan hanya sebagaibahan pemadat. Bahan pemadat lainnya yaitu gelatin dengan konsentrasi 12 - 15%. Gelatin jarang digunakan karena akan mencair pada suhu diatas 25°C, sehingga tidak dapat diinkubasikan pada suhu tinggi. Selain itu, gelatin dapat dihidrolisa oleh berbagai jenis bakteri.Silika gel adalah suatu bahan pemadat yang digunakan di dalam media untuk menumbuhkan mikroba yang bersifat autotrof dimana bahan-bahan organik tidak boleh terdapat di dalam media. BENTUK DAN JUMLAH MEDIA Jumlah medium yang akan digunakan di dalam suatu percobaan harus diperhitungkan sedemikian rupa untuk menghindari pembuatan medium yang berlebihan karena pada umumnya media untuk .pekerfaan mikrobiologi mahal harganya. Jumlah medium yang dibutuhkan dapat ditentukan berdasarkan bentuk medium yang digunakan danjumlah pekerjaan/contohnya, sebagai berikut: Bentuk Medium Jumlah medium/wadah Agar cawan Agartegak Agar miring Agar cair

14 - 16 ml/cawan petri (10 cm) 7 -8 ml/tabungreaksi ( 10 cm) ± 5 ml/tabung reaksi ( 10 cm) 7-8 ml/tabungreaksi (10 cm)

LARUTAN PENGENCER Seperti halnya media, larutan yang digunakan untuk mengencerkan contoh biasanya mengandung bufer untuk menjaga keseimbangan ion dari mikroba. Bufer yang biasa digunakan dalam pembuatan media dan larutan pengencer adalah fosfat, karena merupakan satu-satunya komponen anorganik yang

9

mempunyai sifat bufer padakisaran pH yang dapat mempertahankan keseimbangan fisiologi dari mikroba.Selain dari itu, fosfat tidak bersifat racun bagi mikroba, dan dapat merupakan sumber fosfor untuk pertumbuhan mikroba.Garam fosfat yang sering digunakan sebagai bufer adalah kalium monohidrogen fosfat (K2HPO4) dan/atau kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4). Sebagai larutan pengencer, selain larutan yang mengandung bufe fosfat dapat juga digunakan larutan garam fisiologi (0,85%) atau larutan Ringer. Komposisi dari larutan-larutan pengencer tersebut dapat dilihat pada Lampiran 3. Larutan pengencer dapat ditempatkan di dalam tabung-tabung reaksi dalam jumlah 9 ml untuk membuat pengenceran 1:10 (1ml atau 1 gram di dalam 9 ml), di dalam botol pengencer dalam jumlah 90 ml untuk membuat pengenceran 1:10 (10 ml atau 10gr di dalam 90 ml), atau dalam jumlah 99 ml untuk membuat pengenceran 1:100 ( 1 ml atau 1 gr di dalam 99 ml) , atau dapat juga ditempatkan di dalam tabung Erlenmeyer dalam jumlah 450 ml untuk membuat pengenceran 1:10 (50 gr di dalam 450 ml)jika dibutuhkan contoh dalam jumlah besar. Sterilisasi di dalam tabung atau botol dilakukan seperti pada sterilisasi media. PERCOBAAN

Kelompok Bentuk Bahan Jumlah yang dibutuhkan *)

Jumlah larutan

I Agar cair (tabung reaksi) Nutrient Broth 16 x 7ml 125ml H Agar cawan EMB Agar 16 x 15 ml 250ml III Agar miring PCA 16 x 5 ml 100ml IV Larutan pengencer 0,65%NaCI 16 x 9 ml 150 ml *) Sebelum disterilisasi, tabung-tabung yang telah diisi media/larutan pengencer

dibagikan kepada 4 kelompok secara merata. Cara Kerja 1. Media

Timbanglah sejumlah media cair atau media agar seperti yang tertera pada botol, dan larutkan ke dalam air destilata yang ditetapkan di dalam tabung erlenmeyer atau gelas piala. Media cair tidak memerlukan pemanasan, sedangkan media agar memerlukan pemanasan untuk melarutkan , dengan selalu mengaduknya dengan batang gelas, atau pengaduk magnet. jika pemanasan ditakukan dTaCas “hotplate” yang dilengkapi dengan pengaduk. Dengan pengadukan, agar pada bagian bawah tabung tidak akan hangus. Setelah semua agar larut, ukurlah pH-nya dengan menggunakan kertas pH atau pH meter.AturpH yang dikehendaki menggunakan larutan NaOH atau HCl (1N atau 0,1N).Untuk membuat media cair dan agar miring masukkan media ke dalam tabung-tabung reaksi seperti yang ditetapkan di atas.Sterilisasi ditakukan di dalam otoklafpada suhu 121°C (15 lb) selama 15 menit.

10

Untuk membuat agar miring, letakkan tabung reaksi yang berisi media agar pada posisi miring yang dikehendaki, dan biarkan membeku. Untuk membuat agar cawan, sterilisasi media dilakukan di dalam tabung erlenmeyer, kemudian seteiah didinginkan sehingga mencapai suhu 45°C, dimasukkan ke dalam cawan petri steril dengan jumlah seperti tertera diatas, dan dibiarkan membeku. Media yang telah siap dan tidakakan segera digunakan, sebaiknya disimpan di dalam lemari/ruang pendingin dengan suhu 10°C untuk mencegah terjadinya kontaminasi.

2. Larutan pengencer Timbanglah bahan-bahan kimia yang dibutuhkan.Setelah dilarutkan di dalam air destilata dan diatur pH-nya, selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung-tabung reaksi dengan jumlah 9 ml. Lakukan sterilisasi seperti pada pembuatan media.

11

HASL PERCOBAAN Percobaan : PERSIAPAN MEDIA DAN Nama : .......................

LARUTAN PENGENCER N : ....................... Kelompok : .......................

Jawablah pertanyaan-pertanyaan dibawah ini: 1. Jelaskan fungsi dari masing-masing komponen dibawah ini di dalam media:

a. pepton d. Glukosa b. ekstraksapi e. NaCl c. agar f. Methylene blue

2. Jelaskan perbedaan masing-masing media di bawah ini berdasarkan

komposisinya(sintetik atau non-sintetik), dan fungsinya (pertumbuhan umum atau selektif) a. Plate Count Agar (PCA) b. Ebsih Methytene Blue (EMB) Agar c. Nutrient Agar d. Laktosa Broth e. Acidified Potato Dextrose Agar (APUA)

3. Berikan urutan-urutan yang tepat dari tahap-tahap di bawah ini jika saudara

akan membuat suatu agar miring. a. PengaturanpH b. Sterilisasi c. Penutupan tabung d. Penimbangan media e. Pengisian ke dalam tabung reaksi f. Pernanasan untuk melarutkan media g. Penambahan air h. Meletakkan tebungreaksi padaposisi miring

4. Sebutkan kegunaan dari masing-masing media dibawah ini :

a. Agarcawan; b. Agar miring; c. Agartegak; d. Media cair

12

III. ANALISA KUANTITATIF MIKROBA PADA BAHAN PANGAN HASIL TERNAK

TUJUAN PRAKTIKUM Tujuan dari praktikum iniadalah: a. Untuk memperoleh pengalaman dalam metode untuk mengetahui jumlah total

mikroba bahanpangan pada lempeng agar. b. Untuk dapat menginterpretasikan dalam praktik makna dari data mikroba yang

diperoleh dari masing-masing bahan pangan hasil ternak. c. Untuk mengetahui akurasi data yang diperoleh secara statistik. Pendahuluan Bahanpangan biasanya terkontaminasi oleh beragam spesies mikroba. Ahli mikrobioiogi pangan perlu mengetahui: (1) jumlah total lempeng set mikroba yang ada, (2) tingkat atau jumlah mikroba spesifik/tertentu (misalnya: Salmonella, Pseudomonas) yang menjadi bagian dari jumlah total lempeng tadi.Pengetahuan tentang dua masalah ini membutuhkan pengalaman yang mendasar tentang prosedur pembiakan mikroba, prosedur pengambilan sampel dan prosedur persiapan sampel. Metode yang dapat digunakan untuk menentukan jumlah mikroba di dalam bahan pangan terdiri dari metode hitungan lempeng (“plate count”), “Most Probable Number (MPN), dan “Direct Microscopio Count”(DMC).Metode lainnya yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam statu larutan adalah metode turbidimetri (kekeruhan) menggunakan spektrofotometer.Tetapi metode ini sukar diterapkan pada bahan pangan karena membutuhkan larutan medium yang bening, sedangkan ekstrak bahan pangan, biasanya mengandung komponen-komponen yang menyebabkan kekeruhan, sehingga kekeruhan larutan tidak sebanding denganjumlah mikroba yang terdapat di dalamnya. Prosedur Pengambilan Sampel Tahappertama dalam identifikasi danpenghitungan mikroba dalam bahanpangan hasil ternak adalah pengambilan sampel.Ada dua hal yang perlu diperhatikan dalam prosedur pengambilan sampel yaitu pemilihan sampel dan pelarutan sampel.Hal pertama yang menjadi bahan pertimbangan dalam pemilihan sampel adalah berapa banyak jumlah sampel (unit dalam populasi bahan) yang harus diuji dan berapa besar (gram, kg, liter, ml) sampel yang harus dianalisa.Tahap selanjutnya adalah persiapan pelarutan sampelyang bertujuan untuk mengeluarkan mikroba dari bahan pangan ke dalam bahan pelarutsteril yang sesuai untuk penghitungan mikroba.Ada bermacam-macam teknik pengambilan sampel tetapi prinsip utama yang tidak boleh ditinggalkan adalah teknik aseptis (lihat diktat Penuntun Praktikum Mikrobiologi).Dalam hal ini peralatan yang digunakan untuk

13

pengambilan sampel harus steril; kontaminasi dan perubahan jumlah mikroba sebelum pengujian sampel harus dijaga seminimal mungkin. Persiapan pelarutan sampel a. Peremasan/Maceration

Peremasan adalah cara pelarutan seluruh bagian sampel secara mekanis dihomogenkan dengan menggunakan blender atau stomaher. Maserasi dengan blender sangat baik untuk bahan pangan berbentuk padat.Kekurangannya adalah kemungkinan sel-sel mikroba mati karena perlakuan mekanis, menghancurkanproduk bahan pangan, dan membutuhkan peralatan (blender) yang steril. Problem pada pemakaian blender dapat diatasi dengan pemakaian ‘stomacher’.Pada metoda ini sampel bahan pangan dimasukkan kedalam kantong plastik steril yang sudah berisi bahan pelarut steril kemudian di remas selama 1 menit pada mesin ‘stomacher’. Dengan cara ini tidak dibutuhkan peralatan yang steril, waktu maserasi lebih singkat, biaya lebih murah. Kekurangannya kadang kantongplastik bocor sehingga tak semua bahan pangan dapat diaplikasikan dengan alat ini, seperti bahan pangan yang mengandung tulangyang mungkin akan membuat kantongplastik bocor. Kerugian yang lain adalah terbuangnya isi(bahan) pelarut.Karena terlalu banyak.

b. Pencucian Dalam beberapa hal mikroba bahan pangan hanya terdapatpada bagian permukaan sehingga pelarutan dapat dilakukan hanya dengan pencucian.Misalnya daging, ikan utuh dan karkas ayam. Pada metode ini sampel dimasukkan kedalam kantongplastik yang berisi bahan pelarut dengan jumlah sama dengan berat sampel, kemudian dikocok dengan tangan. Teknik ini tidak merusak sel mikroba, cepat, dan ekonomis. Namun kadang tidak semua mikroba lepas ke dalam bahan pelarut karena melekat terlalu kuat pada permukaan sampel namun cara ini paling disukai.

c. Metode swab dan kontak permukaan Pengambilan sampel dengan cara pengusapan bagian permukaan bahan pangan juga digunakan untuk memonitor keadaan sanitasi peralatan yang bersentuhan dengan bahan pangan dan alat makan. Sampel bahan pangan yang biasanya diambil dengan teknik ini adalah daging, ikan utuh, karkas ayam ataupun peralatan untuk penangan bahan pangan. Caranya: peraslah alat swab dengan menekannya sambil memutar pada dinding bagian atas tabung. Kemudian alat swab tersebut digunakan untuk menyeka seluruh permukaan alat atau karkas yang telah ditentukan luas permukaannya. Penyekaan dilakukan sampai 3 kali. Masukkan kembali swab kedalam tabung bahan pelarut steril dan dikocok, diperas dan dikeluarkan dari tabung. Cara ini sangat

14

mudah, ekonomis dan mudah.Kekurangannya adalah hanya sebagian kecil permukaan bahan pangan yang dapat di “swab” dan mungkin tak semua mikroba dapat menempel pada alat usap.

Pengenceran Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 set mikroba per ml, per gram atau per cm (jika dilakukan pengamatan di bagian luar bahan pangan), memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri, sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah diantara 30 sampai300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal berseri.(lihat penuntun praktikum mikrobiologi) Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa bufer fosfat, larutan garam fisibiogis 0,85% atau larutan ringer.Untuk bahan pangan yang sukar larut kedalam larutan pengencer pertama dapat ditambahkan pasir putih atau butir-butir gelas (glass beads) yang disterilisasi bersama dengan larutan pengencer tersebut. PEMUPUKAN Prinsip metode “Plate Count”(PC) adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sell mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode PC merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroba karena: (1) hanya selyang masih hidup yang dihitung, (2) beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus, (3) dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel mikroba dengan penampakan pertumbuhan yang spesifik. Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode PC juga mempunyai kelemahan-kelemahan yaitu: (1) hasil pehitungan tidak menunjukkan jumlah set mikroba yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni, (2) medium dan kondisi berbeda mungkin menghasilkan hasil yang berbeda, (3) mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar, (4) memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang lama sehingga sampai pertumbuhan koloni dapat dihitung. Metode PC dapat dibedakan atas dua cara yaitu metode tuang (pour plate) dan metode permukaan/sebar (surface/spread plate). Faktor-fakror yang mempengaruhi pertumbuhan Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhan dan jumlah mikroba pada media lempeng total, diantaranya: nutrien dalam media, waktu dan suhu inkubasi. Beberapa peneliti menemukan bahwa mikroba pada bahan pangan tumbuh lebih baik pada suhu antara 28 - 30°C dari pada suhu 37°C dan

15

perkembangan koloni akan maksimum pada lama inkubasi 48 - 72 jam. Total hitungan lempeng.Agar lebih rendah pada lama inkubasi 24 jam. PELAKSANAAN PRAKTIKUM Setiap grup praktikum akan melaksanakan penghitungan total mikroba pada sampel bahan pangan hasil ternak yang dibeli dari pasar/swalayan disekitar kota Denpasar. Pelarutan dan Pengenceran Sampel Maserasi 1. Sterilkan pisau dan forcep dengan mencelupkannya kedalam ethanol dan

membakarnya diatas lampu bunsen. Ambil 10 gram sampel bahan pangan dengan pisau tadi, dan masukkan ke dalam kantong plastik steril. Pengambilan bahan hendaknya dari beberapa lokasi bahan tersebut (sekeliling permukaan, bagian dalam).

2. Tambahkan 90 ml larutan pepton steril dari botol ke dalam kantong tadi secara aseptis.

3. Kocok pada alat stomacher selama 30 detik - 1 menit. Kembalikan larutan ini ke dalam botol tadi.

4. Lakukan pengenceran berseri sampai 10-2 -10-4 dengan menggunakan pipet steril.

5. Lakukan pemupukan duplo dengan metode tuang, sebar dan drop ke cawan agar yang telah disediakan.

6. Inkubasi cawan tadi pada suhu 30°C selama 48 jam, hitung jumlah kolom dan buat perhitungan jumlah mikroba per gram bahan pangan.

Blender 1. Masukkan 10 gram bahan pangan kedalam 90ml larutan pepton steril dan

botol. 2. Blender selama 20 - 30 detik dengan kecepatan tinggi, kemudian homogenkan

kembali didalam botol. 3. Buat pengenceran berseri sampai 10-2- 10-4. Dari pengenceran tersebut

dipupukkan pada lempeng agar secara duplo dengan metoda tuang, sebar dan drop.

4. Inkubasi cawan tadi pada suhu 30°C seiama 48 jam, hitung jumlah koloni cian buat perhitungan jumlah mikroba per gram bahan pangan.

NB: cuci blender dengan air setelah atau kalau mau pakai, kemudian sterilkan

dengan alkohol 70% dan cuci kembali dengan air steril. Metode Swab 1. Ambil alat untuk swabdari tabung yang tersedia 2. Sekakan sambil diputar keseluruh permukaan area dari bahan pangan

16

3. Masukkan alat swab ke dalam 10 ml larutan pepton steril dan kocok sehingga semua bagian alat swab terendam. Peras alat swab dan keluarkan dari tabung.

4. Buat pengenceran berseri sampai 10-1 -10-4. Dari pengenceran tersebutdipupukkan pada lempeng agar secara duplo dengan metoda tuang, sebar dandrop.

5. Inkubasi cawan tadipadasuhu30°Cselama48jam,hitungjumlahkolonidanbuat perhitungan jumlah mikroba per cm2 bahan pangan.

Pencucian 1. Masukkan bahan pangan hasil ternak ke dalam kantong plastik steril. Timbang

berat sampel. 2. Tambahkan 250 ml larutan pepton steril dari botol. Kocok dan remas sampel

selama 1 –2 menit 3. Masukkan kembali filtrat sampel ke dalam botol. 4. Buat pengenceran berseri sampai 10-1- 1-4. Dari pengenceran tersebut

dipersiapkan untuk dipupukkan pada lempeng agar secara dupto dengan metoda tuang, sebar dan drop

5. Inkubasi cawan tadipadasuhu30°Cselama48jam,hitungjumlahkolonidan buat perhitungan jumlah mikroba per gram bahan pangan.

Membuat Pengenceran Berseri 1. Di atas meja anda telah disediakan tabung reaksi yang berisi 9 ml larutan

pepton steril. 2. Pindahkan 1 ml filtrat sampel yang telah dihomogenkan dengan pipet ke

dalam tabung reaksi pertama. Kocok sampai homogen (kocok sampai 25 kali agar sel-sel mikroba terlepas dari sampel atau gumpalan)

3. Dengan pipet steril yang baru, pindahkan 1 ml filtrat pada tabung reaksi pertama ke tabung reaksi kedua. Kocok hingga homogen.

4. Lakukan hal serupa untuk tabung ketiga dan keempat Dengan demikian akan diperoleh serial pengenceran sbb: Nomor Tabung Reaksi 1 2 3 4

Pengenceran 1 : 10 (10-1) 1:100 (10-2) 1:1000(10-3) 1:10000 (10-4)

Note: Bila pada persiapan sampel telah dilakukan pengenceran 1:10 maka

pengenceranpada tabung reaksi pertama menjadi 10-2.

PEMUPUKAN Metoda Tuang 1. Pipet 1 ml larutan pengenceran yang dipilih, masukkan ke dalam cawan petri

dan tambahkan 15 - 20 ml agar cair steril(45-50oC). Waktu antara dimulainya pengenceran sampai menuangkan kedalam cawan petri tidak boleh lebih dari 30 menit Homogenkan dengan cara memutar cawan petribeberapa kali searah jarum jam dan sebaliknya, dari kanan ke kiri dan dari dan ke arah anda. Pemutaran harus cukup kuat sehingga sampel tercampur merata dalam agar.

17

2. Biarkan agar mengental. Balikkan dan inkubasi pada suhu 30°C selama 48 jam.

3. Lakukan hal serupa pada pengenceran lain yang dipilih dalam duplo. 4. Hitung jumlah koloni pada cawan petri yang berisi 30-300 koloni. Metoda sebar 1. Dengan pipet steril transfer 0,1ml filtrat sampelyang telah dihomogenkan ke

permukaan cawan petri yang telah berisi agar steril yang sudah beku dan diberi label kode sampel, pengenceran seri, tgl pemupukan. Lakukan metoda duplo.

2. Sebarkan inokulum keseluruh permukaan agar dengan batang gelas bengkok steril. Batang gelas disterilkan dengan cara mencelupkan ke dalam alkohol 95% dan dibakar dan didinginkan sebelum dipakai.

3. Biarkan biakan mengering, kemudian dibalik dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 48 jam.

Metoda Drop 1. Bagi area pada cawan berisi agar steril yang sudah beku menjadi 4 bagian. 2. Inokulasi setiap bagian dengan setetes filtrat sampel (0,02 ml) dengan

menggunakan pipet pasteur steril. Setiap cawan dapat dipakai untuk 2 seri pengenceran.

3. Biarkan mengering dan inkubasi pada suhu 30°C selama 48 jam. 4. Hitung jumlah koloni di area tetesan. Jumlah koloni dalam satu tetesan

memberikan jumlah bakteri dalam 0,02 ml. Dan ini harus dikalikan 50 dan dengan faktor pengenceran.

Penghitungan Hasil Pilihlah cawan petri duplo yang memperlihatkan jumlah koloni antara 30 - 300 per cawan.Catat seri pengenceran dari cawan tersebut dan hitung jumlah koloninya.Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besardimana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni.Suatu deretan (rantai) koloni yangterlihat sebagai suatu garistebaldihitung sebagai satu koloni.Untuk cawan petri dengan metoda tuang jumlah koloni yang dihitung dikalikan dengan faktor pengencer merupakan jumlah cell mikroba per ml filtrat sampel. Sedangkan untuk cawan dengan metoda sebar jumlah set mikroba per ml filtrat sampel perlu dikalikan 10 karena yang diinokulasikan ke cawan agar hanya 0,1 ml. Data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan-peraturan sebagai berikut: 1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka.yaitu angka pertama dan

kedua. Jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua.

18

Jumlah koloni per pengenceran

“Standard Plate Count” Keterangan

10-2 10-3 10-4 243 29 1 2,4x 104 29 dan1 < 30 700 125 10 1,3 x 104 700 >300; 10 < 30

TBUD TBUD 197 2,0 x 105 TBUD > 300 TBUD = terlalu banyak untuk dihitung

2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan kurang dari 30 koloni pada cawanpetri (<30), hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.



10-2 10-3 10-4 16 1 0 < 30 >103

(1,6 x 103) Hitung pengenceran 10-2

3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih

dari 300 koloni pada cawan petri (>300), hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung, misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada ¼ bagian cawan petri, kemudian hasilnya dikalikan 4. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per

pengenceran “Standard Plate Count” Keterangan

10-2 10-3 10-4 TBUD TBUD 355 >3,0 x 106


TBUD TBUD 20 >3,0 x 105


4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah

antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasff tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antarahasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil.

19



10-2 10-3 10-4 293 41 4 3,5 x 104 Hitung rata-ratanya

karena 41000/29300 = 1,4 (<2)

140 32 2 1,4 x 104 Hitung pengenceran 10-2 karena 32000/14000 = 2,3

5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil satah satu. Jumlah koloni per

pengenceran “Standard Plate Count” Keterangan

10-2 10-3 10-4 175 208

16 17

1 0

1,9 x 104 Rata-rata dari pengenceran 10-2

138 162

42 43

2 4

1,5 x 104 Rata-rata dari pengenceran 10-2 karena perbandinganantara pengenceran 10-3 dan 10-2 adalah 2,4

290 280

36 32

4 1

3,1 x 104 Rata-rata dari pengenceran10-2 dan10-3 karena perbandingan antara keduapengenceran adalah 1,2

291 305

25 27

3 0

3,0 x 104 Rata-rata dari pengenceran 10-2 meskipun 305>300

Contoh untuk beragam metode inokulasi a. Hasil pemupukan pada cawan dengan metoda tuang(volume inokulum 1

ml/cawan) Pengenceran Jumlah koloni sel/ml 10-7 256; 268 (rata2 262) 262 x 107 = 2,6 x 109

10-8 20; 22 (rata2 21) 21 x 108 = 2,1 x 109

20

b. Hasil pemupukan pada cawan dengan metoda sebar (volume inokulum 0,1

ml/cawan) Pengenceran Jumlah koloni sel/ml 10-6 285; 295 (rata2 290) 290x106x10* = 2,9 x 109

10-7 20; 22 (rata2 21) 35x107x108 = 3,5 x 109

* : pengalian dengan faktor ekstra 10 karena koloni yang dihitung berasal dari

volume inokulum hanya 0,1 ml sedangkan hasil penghitungan harus dinyatakan per ml

NB. Hasil perhitungan ini adalah per mlfiltratsampel bahan pangan. Jadi kalau

filtrat tersebut berasal dari 5 gram sampel maka jumlah sel/ml tadi perlu dikalikan dengan 1/5 sehingga diperoleh jumlah sel/gram sampel bahan pangan

Bahan Praktikum

Per Grup Mahasiswa Kelas A Persiapan

Sampel Larutan pepton steril Larutan pepton steril Pipet mulut besar Pipet 10 ml Pipet 1ml

1 x 45 ml 1 x 10 ml 1 x 10 ml 2 2

B Pengenceran Larutan pepton steril 9 ml (dalam tabung reaksi) Pipet 10 ml Pipet 1ml Rak tabung reaksi

6 2 6 1

C Pemupukan Cawanagar beku steril Pipet pasteur Pipet 1 ml Bolakaretpencet Alkohol dan batang gelas bengkok

8 2 1 1

D Peralatan Api bunsen Loop Desinfektanuntuk pipet

1 2 1

Inkubator 36°C dan 37°C 2 Bola karet penyedot Forcep 8 Pisau

21

19 HASIL PERCOBAAN JudulPercobaan : Tanggal : Catat hasil observasi secara detil pada lembar dibawah ini. Hasil pengamatan dan perhitungan yang selesai pada hari itu harus di tanda tangani oleh dosen pengawas praktikum pada hari itu juga atau sebelumpraktikum berikutnya dimulai. Topik Praktikum: Pengujian Bahan pangan untuk total mikroba Hari/Tanggal : Maserasi

Pengenceran Metoda pemupukan

Jumlah koloni/cawan cfu/gr atau ml-1

10-2 10-3 10-4

1. Tunjukkan cara perhitungannya Di Blender



10-2 10-3 10-4

1. Tunjukkan cara perhitungannya Pencucian



10-2 10-3 10-4

1. Tunjukkan cara perhitungannya

22

IV. PENGUJIANKHAMIR DAN KAPANG PADABAHAN PANGAN

TUJUAN Tujuan dari praktikum ini adalah: untuk mempelajari dan memahami teknik untuk mengisolasi dan menghitung khamir dan kapang dalam bahan pangan. PENDAHULUAN Khamir merupakan kelompok mikroba yang sering ditemukan pada bahan pangan.Keberadaanya dalam bahan pangan dapat sebagai bakteri perusak, yang dapat menghasilkan bau dan flavor yang tak diinginkan, membentuk gas, tepung, lendir, zat warna, kekeruhan dan endapan. Bahan pangan yang biasanya dapat rusak oleh khamir adalah bahanpangan yang memiliki komposisi kimia yang menekan pertumbuhan bakteri, misalnya bahan pangan yang mempunyai pH rendah (pH <4,0) atau memiliki kadar gula tinggi (>20%) atau kadar garam tinggi (>10%) adalah rentan terhadap kerusakan oleh khamir. Industri makanan secara luas sudah mengeksploitasi pemakaian khamir karena memiliki sifat fermentatif, seperti dalam pembuatan “beer”, “wine”.Khamir yang banyak digunakan dalam pembuatan roti adalah Saccharomyces cerevisiae yaitu untuk pengembang adonan roti. Selain untuk pengembang adonan roti, khamir juga banyak dimanfaatkan sebagai sumber protein (single cell protein) dan grup vitamin B, misalnya :Saccharomyces cerevisiae, Candida utilisdan C Tropicalis. Khamir juga banyak digunakan dalam produksi makanan tradisional di negara-negara berkembang.Belum ada laporan bahwa khamir menyebabkan keracunan. Melihat dan kenyataan bahwa khamir memiliki peran penting pada bahan pangan, maka pengetahuan mengenai teknik isolasi, penghitungan dan identifikasi khamfr pada bahan pangan.Dari 500 spesies khamir yang telah diketahui, hanya beberapa saja memiliki peran dalam industri makanan.Selain ketiga spesies tersebut diatas terdapat b spesies Kluyveromycesfragilis yangdimanfaatkan sebagai produksi protein sel tunggal. Beberapa spesies yang dapat menyebabkan kerusakan pada makanan berkadar gula tinggi seperti madu, syrup, kembanggula, selai diantaranya: Zygosaccharomyces rouxiidan Schizosaccharomyces octoporus. Debaromyces hansenii menyebabkan kerusakan makanan yang diasinkan. Genus Hanseniapora dan Kloeckera menyebabkan kerusakan buah-buahan dengan proses fermentasi. Zygosaccharomyces bailii dan C krusei adalah dua spesies khamir yang menyebabkan kerusakan pada soft drinks yang memiliki pH sangat rendah dan tetap tumbuh walaupun minuman tersebut mengandung bahan pengawet sorbat dan benzoat terutama Z Bailiimerupakan khamir yang dapat menyebabkan kerusakan pada makanan yang mengandung sorbat dan benzoat.

23

Khamir dapattumbuh pada hampirsemua media namun pertumbuhannya lebih lambat daribakteri.Jadi bila makanan terkontaminasi khamir dan bakteri dibiakkan pada media agar maka koloni yang tumbuh di dominasi oleh bakteri. Oleh karena itu untuk mengisolasi khamir dari bahan pangan harus menggunakan media selektif yang dapat menekan pertumbuhan bakteri tetapimenunjang pertumbuhan khamir. Kondisi ini dapat dicapai dengan menurunkan pH media menjadi sekitar3,5 (pada pH ini sebagian besar bakteri tak dapat tumbuh). Media yang dapat digunakan adalah Acid Malt Extract Agar (AMEA) atau Acid Potato Dextrose Agar (APDA) untuk mengisolasi khamir. Media yang lebih bagus adalah Oxytetracyclin Malt Extract Agar (OMEA) (pH 5,5) dapat menghambat pertumbuhan bakteri pada kadar oxytetracyclin 100 mg/liter. KAPANG Kapang merupakan mikroba yang menyebabkan kerusakanpada bahan pangan terutama bahan pangan kering seperti kacang-kacangan, biji-bijian, produk cereal dan makan an dengan kadar gula tinggi. Kapang juga menghasilkan racun “mycotoxin” yang bersifat meracun terhadap ternak dan manusia.Mycotoxin merupakan senyawa heterocyclic dengan BM kecil sangat resistan terhadap pemanasan dan sangat sulit untuk dihilangkan dari bahan pangan.Namun tidak semua kapang menghasilkan senyawa beracun. Namun terdapatjuga beberapa genus kapang yang bermanfaat dalam produk pangan fermentasi di Asia, misalnya dalam pembuatan kecap, tempe dan tape digunakan kapang dar spesies Rhizopus dan Aspergillus. Kesulitan dalam menghitung populasi kapang dalam bahan pangan adalah karena pertumbuhan vegetatif dari kapang yang membentuk filamen. Kapang, seperti halnya khamir, tumbuha lambat dibandingkan dengan bakteri sehingga untuk isolasi dan penghitungan dibutuhkan media slektif khusus.Media tersebut harus mengandung antibiotik untuk menghambat pertumbuhan bakteri.Beberapa koloni kapang merambat dengan cepatdipermukaan cawan agar, dan menutup atau menghambat pertumbuhan kapang yang lainnya. Untuk mencegah rambatan miselium kapang kedalam media perlu ditambahkan senyawa yang mencegah rambatan namun tidak mempengaruhi pembentukan koloni yaitu: Rose Bengal, Dichloran. Dua jenis media yang digunakan untuk tujuan ini adalah agar dichloran rose bengalchloramphenicol(DRBC) dan agar dichloran 18% glycerol (DG18).Media belakangan ini terutama untuk pengujian kapang xeropphilic pada bahan pangan. PERCOBAAN 1. Siapkan dan beri label laratan pengencer sterit dan cawan agar OMEA (atau

APDA) steril. 2. Buat larutan bahan pangan dengan melarutkan 5 gram sampelke dalam 45 mt

larutan pepton steril. Kocok sebanyak 25 kali, atau dengan porstek.

24

3. Buat pengenceran berseri 10-1 -10-4 dari larutan no 2. 4. Buat pemupukan dengan metode sebar/permukaan pada permukaan agar

OMEA atau APDA dan inkubasi dengan posisi terbaik pada suhu kamar atau suhu 25°C selama 1-4 hari.

5. Hitung jumlah koloni yang tumbuh dan dilaporkan sebagai jumlah kapang dan khamir per ml atau gram contoh.

6. Amati koloni untuk melihat morfologi sel dengan menggunakan mikroskop. Terutamaperhatikanlah bentuk dan ukuran set mikroba.

Bahan Praktikum Per Grup Mahasiswa Kelas A Persiapan

Sampel Larutan pepton steril Larutan pepton steril Pipet mulut besar Pipet 10 ml Pipet 1ml

1 x 45 ml 1 x 10 ml 1 x 10 ml 2 2

B Pengenceran Larutan pepton steril 9 ml (dalam tabung reaksi) Pipet 10 ml Pipet 1ml Rak tabung reaksi

6 2 6 1

C Pemupukan Cawanagar OMEA/ABDAbeku steril Pipet pasteur Pipet 1 ml Bolakaretpencet Alkohol dan batang gelas bengkok

8 2 1 1

D Peralatan Api bunsen Loop Desinfektanuntuk pipet Jarum-ose Forceps

1 2 1

Inkubator 36°C dan 37°C 2 Bola karet penyedot Forcep 8 Pisau Mikroskop

25

HASIL PRAKTIKUM Judul Percobaan : Tanggal : Total kapang Pengenceran Jumlah kolomi/cawan

petri duplo Total kapang dan khamir/ml/gram

Kalkulasi jumlah kapang dan khamir : cfu/g atau ml Morfologi sel

Ukuran sel : Bentuk sel : Pengawas Praktikum :

Total khamir : Pengenceran Jumlah kolomi/cawan

petri duplo Total kapang dan khamir/ml/gram

26

Kalkulasi jumlah kapang dan khamir : cfu/gatau ml Morfologi sel

Ukuran sel : Bentuk sel : Pengawas Praktikum :

27

V. PENGUJIAN AIR DAN BAHAN PANGAN HASIL TERNAK TERHADAP COLIFORMFAECAL COLIFORM

DAN ESCHERICHIA COLI TUJUAN Tujuan dari praktikum ini adalah: 1. Untuk mempelajari, memahami dan melakukan prosedur yang benar dalam

isolasi dan penghitungan coliform,faecalcoliform dan Escherichia colidengan metoda MPN (Most Probable Number).

2. Untuk mengevaluasi makna mikrobiologis dari mikroba indikator dalam bahan pangan basil ternak.

PENDAHULUAN Bahan makanan hasil ternak dapat terkontaminasi mikroba patogen yang berasal dari faeses manusia, ternak dan unggas atau sumber lain. Penyakit yang disebabkan oleh bakteri yang mungkin dapat ditularkan melalui bahan pangan hasilternak diantaranya: demam typhoid (Salmonella tuphii) dansalmonellosisyang lainya, kolera (Vibrio cholerae) dan basil desentri (Shigella dysenteriae). Virus penyebab penyakit hepatitis dan polio mungkin dapat juga ditularkan melalui bahan basil ternak dan faeses orang yang terinfeksi penyakit ini mengandung mikroba ini dalam jumlah yang tinggi.Produk hasil ternak dapat terkontaminasi melalui air yang tercemar oleh faeces. Secara ekonomis tidaklah mungkin dilakukan pengujian bahan makanan hasil ternak secara rutin terhadap patogen spesifik.Dan juga jumlah spesies patogen pada produk hasil ternak sangat kecil sehingga sulit dideteksi dengan metoda pemupukan biasa.Oleh karena itu, pengujian mikroba patogen pada bahan makanan hasil ternak biasanya dilakukan berdasarkan adanya bakteri indikator seperti E.coli.Adanya Exoli sangat mudah diketahui dan karena bakteri ini berasal dari faeses maka keberadaanya di dalam bahan makanan hasil ternak mengindikasikan kontaminasi oleh faeses dan kemungkinan adanya (namun tidak selalu ada) spesies bakteri patogen seperti diatas.Biasanya pengujian baktericoliform – (dimana salah satunya adalah Ecoli).pada bahan makanan hasil ternak adalah untuk mengetahui kualitas sanitasi dalam penanganan atau proses produksi bahan makanan tersebut Coliform adalah bakteri Gram-negatif, berbentuk batang, fakultafif anaerob, tidak membentuk spora, dan memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas. Mereka terdapat dalam saluran usus manusia dan mengkontaminasi produk hasil ternak melalui air yang tercemar oleh faeses. Beberapa uji mikrobiologi dapat dilakukan terhadap air dan bahan makanan hasil ternak diantaranya adalah: (1) uji jumlah mikroba (total count), (2) uji kualitatif koliform, (3) uji terhadap jenis koliform, dan (4) ujikuantitatif koliform. Bakteri koliform yang terdapat dalam air dapat dibedakan dalam dua grup yaitu fekal koliform yaitu bakteri yang berasal dari kotoran, misalnya Escherichia coli, dan

28

grup nonfekal koliform yaitu bakteri yang berasal dari hewan atau tanaman yang telah mati, misalnyaEnterobacter aerogenes. UjiKualitatif Uji kualitatif kolifonn dapat dilakukan dalam tiga tahap yaitu: (1) uji penduga (presumptive test), (2) uji penguat (confirmed test), dan (3) uji lengkap (complete test). Analisa air tidak selalu harus melaui ketiga tahap tersebut tetapi tergantung dari macam atau komposisi air, serta tujuan penggunaan air tersebut. Sebagai contoh, uji penduga biasanya dilakukan terhadap air buangan atau air kotor lainnya, uji penguat dilakukan terhadap air yang diklorinasi, sedangkan uji lengkap dilakukan terhadap air minum atau air yang dikonsumsi masyarakat. (1) Uji Penduga

Pengujian terhadap coliform dilaksanakan dengan mengmokulasikan sampel ke dalam tabung reaksi berisi kaldu laktosa dan tabung Durham. Pengamatan terhadap indikasi terbentuknya gas dan asam dilakukan setelah inkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC. Hanya sedikit spesies bakteri selain coliform dapat memfermentasilaktosa dengan cepat dan membentuk gas (Buckle et at 1982).

Hasil positif pada tahap ini belum memberi simpulan bahwa coliform ada dalam produk, sehingga hasilini disebut hasil, “presumptive” (penduga).Hasil positif pada uji ini membutuhkan konfirmasi lebih lanjut.

(2) Uji Penguat

Beberapa coliform tidak berasal dan faeses, sehingga hasil positif yang diberikannya pada uji diatas memberikan hasil positif yang salah terhadap kontaminasi produk oleh faeses.Untuk mengurangi kesalahan tersebut dapat dilakukan uji penguat yaituuji Eiijkman atau uji EC.Pada ujipenguat ini kaldu laktosa ekstra yang telah diinokulasi sampel pada butir (i) diinkubasi pada suhu 44-45°C.Hasil positif yang ditunjukkan oleh terbentuknya gas menunjukkan kontaminasi oleh coliform fekal.Selanjutnya hasil positif tadi dibiakkan pada Ebsin Methylene Blue Agar(EMBA), atau Endo Agar. Jika digunakan EMB Agar, ada tiga macam koloni yang mungkin tumbuh yaitu: (a) koloni typical yaitu koloni dari E.coli yangberwarna hijau metalik, (b) koloni typikal yaitu koloni dari E. Aerogenes yang berwarna merah muda dengan titik hitam di tengah seperti mata ikan, dan (c) koloni lainnya yang tidak seperti kedua koloni di atas. Di atas Endo Agar, koloni koliform akan berwarna merah, sedangkan koloni dari bakteri lainnya yang tidak dapat memfermentasf laktosa akan berwarna .pucat atau tidak berwarna dan bening.

(3) Uji Lengkap

Uji lengkap dilakukan terhadap semua contoh yang menghasilkan uji penguat positif. Tujuan dari uji lengkap adalah untuk: (a) mengetahui reaksi uji IMViC koloni koliform yang terbentuk pada EMB Agar atau Endo yaitu: pembentukan indole pada 44,5°C,produksi asam darigtukosa, pembentukan

29

acetoin, dan penggunaan sitrat di dalam medium, (b) melihat secara mikroskopis bentuk dan sifat bakteri yang tumbuh, yaitu dengan cara melakukan pewaraaan Gram. Bakteri yang termasuk koliform berbentuk batang/gram negatif, dan tidak membentuk spora.

Uji Terhadap Jenis Koliform

Perbedaan jenis bakteri koliform dapat diketahuidengan menggunakan empat macam uji yaitu: (a) uji pembentukan senyawa indole, (b)reaksi dengan methyl red, (c) uji Voges Proskauer, dan (d) reaksi sitrat. Keempat macam uji ini biasanya disingkat dengan nama uji IMViC (Indole, Methyl red, Voges Froskauer, and Citrate). Uji IMViC ini dapat membedakan apakah bakteri koli yang tumbuh termasuk dalam grup fekal yang hidup dalam usus manusia atau hewan, misalnya E.coli, atau termasuk dalam grup nonfekal yang hidup pada tanaman atau hewan mati, misalnya Escherichiafreundii dan Enterobacter aerogenes.

(a) Uji Indol

Bakteri yang tergolong dalam grup fekal dapat memecah asam amino tryptophan, dan menghailkan suatu senyawa berbau busuk yang disebut indol. Bakteri yangtelah diinkubasikan di dalam medium yang mengandung tryptophan, kemudian diberi tetesan pereaksi Kovacs yang mengandung amit alkohol, atau diberi kristal asam oksalat Adanya Indoi akan menyebabkan amil alkohol berubah warnanya menjadi merah tua, atau warna kristal asam oksalat berubah menjadi merah jambu (merah muda).

Uji yang menggunakan penunjukamil alkohol disebut metode Kovacs, sedangkan yang menggunakan penunjuk asam oksalat disebut metoda Gnesda.

(b) Uji Methyl Red

Selama fermentasi, E.coli (fekal) akan menghasilkan asam lebih banyak daripada E.Aerogenes (nonfekal). Asam yang dihasilkan oleh E.colidapat menurunkan pH medium yang mengandung 0,5% glukosa sampai mencapai pH 5,0, yang menyebabkan methyl red yang dimasukkan ke dalam medium tersebut akan berwarna merah. Asam yang dihasitkan oleh E.aerogenes hanya dapat menurunkan pH sampai sekitar pH 6,0 atau lebih, sehingga methyl red akan berwarna kuning.

(c) Uji Voges Proskauer

Uji ini didasarkan atas pembentukan asetilmetilkarbinol (asetoin) oleh Eaerogenes, yaitu suatu hasitsampmg dari metaboHsme karbohidrat E.collitidak membentuk asetoin.

Asetoin dengan nadanya KOH dan udara akan teroksidasi menjadi asetil. Kemudian diasefil dengan adanya alfanaftol dan asam amino yang terdapat di dalam medium akan membentuk warna merah.

(d) Uji Sitrat

Uji ini didasarkan atas penggunaan sitrat di dalam medium oleh E.aerogenes, dimana sitrat merupakan satu satunya sumber karbon di dalam

30

medium tersebut E.Coli tidak dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon.Adanya pertumbuhan dapat dilihat dengan timbulnya kekeruhan setelah 3- 4 hari.

Klasifikasi koliform berdasarkan uji IMViC dapat diiihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Kalsifikasi koliform berdasarkan Uji IMViC *)

Bakteri Indol Methyl Red Voges

Proskauer Sitrat Klasifikasi

E.coli Var.I + + - - Fekal Var. II - + - - Fekal

E. Freundii Var. I + + + ± Nonfekal Vap. II + - + Nonfekal

E. aerogenes Var. I - - + ± Nonfekal Var. II + - + + Nonfekal

*) Salle (1961) Uji coliform, fecal coliform dan E.coli secara kuantitatif dapat dilakukan dengan metoda most probable number (MPN). Adanya E.coli dalam produk basil ternak segar tidak secara absolut mengindikasikan bahwa produk tersebut telah tercemar oleh feeses atau tercemar oleh bakteri patogen. Adanya E.coli pada produk hasil ternak yang diolah menunjukkan bahwa proses pengolahan belum sempurna atau terjadi kontaminasi silang. Beberapa negara memiliki standar coliform, fecal coliform dan E.coli dalam produk bahan pangan yang sangat penting dalam pelaksanaan keamanan pangan untuk pasar eksport. BAHAN PRAKTIKUM Alcohol, batang gelas Bangkok, ose, loop, water-bath 44-45°C, inkubator 37°C, Untuk setiap grup mahasiswa: 5 Tabung reaksi berisi 9 ml larutan pepton steril 1 Botol berisi 90 ml pepton steril 14 Tabung reaksi berisi kaldu laktosa dan tabung Durham steril 14 CawanAgar EMBsteril 12 Pipet 1 ml steril

31

PELAKSANAAN PRAKTIKUM Persiapan Sampel 1. Ambil sampel produk hasil ternak dan tempatkan dalam wadah steril. Bawa ke

laboratorium untuk diperiksa sesegera mungkin. Bila sampel harus disimpan (tidak langsung diperiksa) dalam waktu sampai 3 jam maka sampel harus disimpan dalam lemari pendingin.

2. Untuk produk hasil ternak padat, timbang 10 gram sampel dan masukkan kedalam botol berisi 90 ml pepton steril kemudian diremas-remas atau diblender. Ini merupakan larutan 10-1. Buatpengenceranberseri 10-2,10-3.

Coliform MPN 1. Dengan metodia aseptis mokulasi kaldu laktose yang telah disediakan dengan

1 ml larutan sampel dari masing-masing pengenceran (10°, 10-1, 10-2,10-3) ke dalam masing-masing 3 tabung yang berisi kaldu laktosa dan tabung durham steril.

2. Semua tabung diinkubasi pada suhu 37oCselama 24 jam, kemudian amati dan catat perubahan warna dari ungu menjadi kuning (berarti terbentuk asam) dan pembentukan gas dalam tabung Durham. Untuk tabung yang tidak menunjukkan pembentukan gas diinkuibasi lagisetama 24 jam kemudian dicatat hasilnya.

3. Tumbuhkan biakan kaldu yang positif (maksimum 4)ke atas cawan agar EMB dengan metode gores (Bagi area setiap cawan menjadi2bagian). Goreskan juga biakan control positif dan negatif ke atas agar EMB.

4. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C. Amati dan catat adanya koloni tipikal koliform. Koliform memfermentasi laktosa dan medium EMB sehingga menunjukkan warna ungu gelap kemerahan ditutupi warna hijau petalik berkilau. Koloni yang positif menegaskan keberadaan koliform di dalam kaldu laktosa.

5. Hitung total koliform dengan metode MPN. Koliform Fekal 1. Pindahkan 1 loop inokulum dari kaldu laktosa positif ke dalam kaldu laktosa

baru (kaldu EC) 2. Inkubasi selama 24 - 48 jam pada suhu 44-45°C. Amati dan catat

pembentukan gas didalam tabung Durham sebagai hasil positif. 3. Tumbuhkan inokulum dari tabung yang positif ke atas cawan agar EMB

dengan metode gores, demikian pula halnya dengan kontrol positif dan negatif. Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Tumbuhnya koloni tipikal pada agar EMB menunjukkan adanya fekal koliform pada bahan pangan yang diuji.

4. Hitung jumlah fekal koliform dengan mefode MPN.

32

Escherichia coli, MPN 1. Ada tidaknya E.Coli di dalam bahan pangan dipertegas lagi dengan

melakukan uji indole terhadap kolni tipikal yang diperoleh dari biakan agar EMB diatas. Ambil satu loop koloni tipikaltadi dan inokulasikan ke dalam tabung reaksi larutan tryptone steril.

2. Inkubasikan selama 24 jam pada suhu 44-45°C kemudian lakukan uji indole dengan menambahkan 0,2 ml reagen kovac’s ke dalam biakan lalu dikocok. Biarkan selama 10 menit. Kemudian diamati perubahan warna yangterjadi.

3. Hasil positif ditunjukkan oleh terbentuknya warna merah gelap pada lapisan atas. Sedangkan hasil negatif ditunjukkan oleh tidakterjadinya perubahan warna.

Uji Kuantitatif coliform Penghitungan MPN Pilih tabung biakan dengan faktor pengenceran tertinggi yang semua hasilnya positif untuk pembentukan asam dan gas setelah masa inkubasi 48 jam dan catat hasil positif untuk 2 (dua) faktor pengenceran berikutnya yang lebih tinggi. Bila hal ini tidak mungkin, maka catat hasil positif dari setiap tabung dari tiga faktor pengencer terakhir.Kemudian cocokkan dengan tabel MPN.

33

Gambar: Cara pengujian air dan bahan pangan dengan metode MPN

34

HASIL PERCOBAAN Judul Praktikum : Pengujian koliform, koliform fekaldan E.Colipada Air dan

Bahan pangan Tanggal : Koliform Total Produksi Gas (+ /-)

Faktor Pengenceran

Tabung Kaldu Laktosa 24 jam 48 jam

1 2 3 1 2 3 10° 10-1 10-2 10-3

Pupukan metode gores pada EMBA Pengamatan pada cawan EMBA Sampel : .................................................................................................................... ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... Kontrol Positif ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... Kontrol Negatif ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... Hitungan MPN:

35

Koliform Fekal Jumlah tabung katdu laktosa reaksi positif

Reaksi positif pada katdu EC

Reaksi negatif pada kaldu EC

Kontrol positif

Tumbuhkan pada EMBA dengan metode gores. Amatikoloni morfologi SampelTindakan : ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... Kontrol Positif : ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... ...................................................................................................................... Perhitungan MPN: Escherichia coli: Reaksi indol(+/-) Cawan nomor: 1 4 7 10 2 5 8 11 3 6 9 12 Pertanyaan: Kesalahan apayang biasanya terjadi pada teknik MPN? ....................................................................................................................................

............................................................................................................................. ............................................................................................................................. .............................................................................................................................

36

Bagaimana cara meminimalisasi kesalahan tersebut? ....................................................................................................................................

............................................................................................................................. ............................................................................................................................. .............................................................................................................................

Bagaimana cara meningkatkan keakuratan metode MPN. ....................................................................................................................................

............................................................................................................................. ............................................................................................................................. .............................................................................................................................

Pengawas :

37

VI. MIKROBA PSIKROTROPIK, LIPOLITIK, DAN PROTEOLITIK

TUJUAN Tujuan praktikum adalah: 1. Untuk mempelajari dan memahami kelompok-kelompok mikrobapsikrotropik,

lipolitik dan proteolitik 2. Untuk menghitung jumlah dan masing-masing kelompok mikroba pada bahan

pangan Pendahuluan

Mikroba menggunakan komponen kimia dalam substrat sebagai sumber enersi dan untuk berkembang biak serta membentuk sel-sel baru. Semua aktifitas sel tersebut dilakukan oleh berbagai enzim yang terdapat di dalam sel mikroba. Reaksi-reaksi oleh enzim yang terdapat di dalam mikroba dapat diketahui dengan beberapa cara, diantaranya adatah dengan melihat produk akhir dari reaksi enzim tersebut atau dengan melihat berkurangnya komponen-komponen yang dipecah oleh enzim tersebut.

Mikroba lipolitik

Beberapa bakteri, khamir, kapang memiliki enzym lipolitik sehingga mampu menguraikan Tlmak yang terdapat di dalam bahan pangan.Degradasilemak menjadi gliserol dan asam lemak ini dapat menyebabkan perubahan pada bau dan cita rasa bahan pangan.Bahan pangan yang sering mengalami problem lipolisis diantaranya adalah mentega, cream, dan bahan pangan dengan kandungan lemak tinggi lainnya.Karkas ayam atau ternak lainnya yang mengalami penyimpanan dapat ditumbuhi oleh mikroba lopilitik. Mikroba lipolitik tersebut diantaranya adalah: Pseudomonas, Alcaligenes, Staphylococcus, Rhyzopus,Aspergillus, Penicillium, Candida dan Rhodotorulla.

Pengujian mikroba lipoiitik dilakukan dengan menumbuhkan mikroba pada media yang mengandung larutan lemak dan mengamati terjadinya lipolisis.Media yang paling sederhana yang mudah digunakan adalah Agar Tributyrin. Larutan lemak lainyang dapat dipakai adalah mentega, minyak olive namun ini membutuhkan penambahan zat pewarna sebagai indikator hidrolisis lemak. Zat pewarna yang sering dipakai adalah: victoria blue, spirit blue, nile blue sulfate atau night btue.

Sampel bahan pangan setelah dihomogenkan dan diencerkan diinokulasikan diatas cawan agar dengan metode sebar, diinkuibasi pada suhu 20-30°C (temperatur optimum untuk aktifitas enzym lipase) selama 2-3 hari. Koloni positiflipolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zone bening atau zona perubahan warna tergantung pada jenis media yang digunakan dan warna yang ditambahkan pada media.

Mikroba Proteotitik

Mikroba proteolitik pada bahan pangan dapat menyebabkan hidrolisis protein oleh enzym proeolifik extraceluler yang dimilikinya.Hidrolisis protein ini menghasilkan senyawa peptida dan oligopeptida yang selanjutnya dipecah

38

menjadi asam amino yang menyebabkan rasa pahit; amonia, meningkatkan pH; dan sulfur yang mudah menguap menghasilkan bau tidak sedap.Disamping perubahan-perubahan tadi, tekstur bahan pangan juga mengalami perubahan.

Mikroba proteolitik misalnya adalah genera Bacillus, Clostridium, Pseudomonas dan Proteus, disampihg kapang dan khamin.

Untuk menguji keberadaan mikroba proteolitik pada bahan pangan hasil ternak biasanya digunakan Agar Susu Skim. Enzym proteolitik yang dimiliki oleh mikroba profeolitik akan menghidrolisis casein dari agar susu skim. Ini ditunjukkan oleh terbentuknya zona bening disekeiiling koloni pada pupukan dengan metoda sebar di atas agar susu skim sebagai akibat terurainya casein menjadi senyawa nitrogen terlarut.

PERCOBAAN MIKROBA PSIKROTROPIK (Untuk percobaan ini digunakan agar nutrien) 1. Siapkan 10 gram sampel bahan pangan dan hogenkan dalam blender dengan

90ml larutan pepton sterit(ini menjadi pengenceran 10-1). 2. Dari larutan tadi kemudian dibuat pengenceran berseri sampai 10-4

(tergantungkepada jenis bahan pangan yang diuji). 3. Pupukkan dengan menggunakan metode sebar pada agar nutrien secara duplo 4. Inkubasi pada suhu 7°C ± 1o selama 7-8 hari. 5. Koloni dapat dihitung sebagai mikroba psikrotropik per ml atau gram sampel. MIKROBA LIPOLITIK (Untuk percobaan ini digunakan agar tribtyrin) 1. Siapkan 10 gram sampel bahan pangan dan hogenkan dalam blender dengan

90ml larutan pepton sterit(ini menjadi pengenceran 10-1). 2. Dari larutan tadi kemudian dibuat pengenceran berseri sampai 10-4

(tergantungkepada jenis bahan pangan yang diuji). 3. Pupukkan dengan menggunakan metode sebar pada agar tributyrin secara

duplo. 4. Inkubasi pada suhu 25°C selama 3 hari. 5. Identifikasi koloni mikroba lipolitik:

a. Pada agar tanpa zatpewarna mikroba lipolitik ditunjukkan oleh adanya zona bening di sekeliling koloni di atas latar belakang yang keruh.

b. Pada cawan agar dengan zat pewarna, koloni mikroba lipolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zona biru tua disekelilingkoloni di atas agar yang berwarna biru muda.

c. Koloni dengan ciri-ciri tersebut diatas dapat dihitung sebagai mikroba ikipolitik per ml ataugram sampel.

39

MIKROBA PROTEOLITIK (Untuk percobaan ini digunakan agar skim milk) a. Siapkan 10 gram sampel bahan pangan dan hogenkan dalam blender dengan

90 ml larutan pepton steril(ini menjadi pengenceran 10-1). b. Dari larutan tadi kemudian dibuat pengenceran berseri sampai 10-4 (tergantung

kepada jenis bahan pangan yang diuji). c. Pupukkan dengan menggunakan metode sebarpada agar tributyrin secara

duplo. d. Inkubasi pada suhu 21oC selama 3 hari. e. Setelah inikubasi genangi dengan larutan HCL 1,0% atau asam aseta 10%

selama 1 menit, kemudian sisa rarutan asam dibuang. f. Pada cawan agar skim milk, koloni mikroba proteolitik dikeliiingi oleh zona

bening di atas latar belakang agar keruh. g. Koloni dengan ciri-ciri tersebut diatas dapat dihitung sebagai mikroba

proteolitik per ml atau gram sampel. HASIL PERCOBAAN Juduf Percobaan: Mikroba psikrotropic, lipolitik, proteolitik Tanggal: Mikroba psikrotropik Pengenceran Jumlah koloni 10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Penghitungan jumlah mikroba; cfu/g atau ml : Mikroba lipolitik Pengenceran Jumlah koloni 10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Penghitungan jumlah mikroba; cfu/g atau ml :

40

Mikroba proteolitik Pengenceran Jumlah koloni 10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Penghitungan jumlah mikroba; cfu/g atau ml : Soal : 1. Bagaimanakah reaksi biokimia ddari proses lipolisis. 2. Mengapa pada uji proteolisis cawan pupukan digenangi dengan asam.

Pengawas praktikum : -----------------------------------

41

VII. ISOLASI MIKROBA PATOGEN DARI BAHAN PANGAN HASIL TERNAK

Bahan makanan hasil ternak, baikyang segar ataupun olahan, seringkali

ditemukan mengandung mikroba kontaminan. Penanganan dan penyimpanan bahan makanan dengan metode yang baik sangat dianjurkan untuk menekan pertumbuhan mikroba pada bahan makanan sehingga mengurangi pertumbuhan mikroba pembusuk, namun bukan tidak mungkin mendorong pertumbuhan mikroba patogen sehingga menyebabkan penyakit.Waktu dan suhu merupakan faktor yang sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba selama penyimpanan dan penanganan bahan makanan hasil ternak.Pertumbuhan beberapa mikroba penyebab patogen, terutama yang menyebabkan keracunan akan dihambat pada suhu kurang dari 5°C dan lebih tinggi dari 60°C.Jadi mikroba kontaminan termasuk patogen dapat dengan mudah tumbuh jika bahan makanan hasil ternak disimpan pada suhu antara 5 - 60°C.

Mikroba penyebab penyakit dapat dibedakan menjadi bakteri penyebab

infeksi.LIPOLITIK, PROTEOLITIKdan mikroba penyebab intoksikasi yangmemproduksi racun (toksin).Bakteri-bakteri penyebab infeksi diantaranya adalah Salmonella, Shigelta, Vibrio, dan sebagainya, sedangkan bakteri penyebab intoksikasi misainya Staphylococcus aureus dan Clostridium botulinum.Bakteri yang dapat menyebabkan intoksikasi tetapijuga termasuk dalam grup penyebab infeksi misalnya Efaciffus cereus dan Clostridium perfringens.

TAHAP ISOLASI

Bakteri-bakteri penyebab penyakit pada umumnya terdapat datam jumlah kecil dalam bahan makanan, oleh karena itu dalam proses isolasinya dibutuhkan beberapa tahap yaitu: (a) tahap “preenrichment” dan “enrichment”, dan(2) tahap seleksi, dan (c) tahap identifikasi.

Pada tahap “preenrichment” dan “enrichment” digunakan media yang

dapat mestimulir pertumbuhan bakteri tertentu yang diinginkan, tetapi bakteri lainnya masih mungkin tumbuh.Media “enrichment” bersifat lebih spesifik daripada media “preenrichment”.Pada tahap seleksi digunakan media selektif yang dapat menstimulir pertumbuhan bakteri yang diinginkan dan menghambat pertumbuhan bakteri lainnya.Pertumbuhan bakteri tertentu pada media selektif ini biasanya ditandai dengan terbentuknya koloni yang menampilkan ciri-ciri spesifik. Tahap identifikasi bakteri pada umumnya memerlukan beberapa tahap yaitu: (a) uji penduga, (2) uji penguat dan (3) uji lengkap.

42

PERCOBAAN A. Deteksi Salmonella dalam makanan 1. Prapengayaan (“preenrichment”)

Siapkan 10gram sampel bahan makanan secara aseptis dalam kantong plastik dan tambahkan 90 ml larutan pepton bufer steril.Homogenkan dan tuang kembali kedalam botol pengencer.Inkubasi pada suhu 37°C selama 18 - 24 jam.

2. Pengayaan Kocok pupukanpra pengayaan, dan inokulasikan 1 ml kedalam 10 ml larutanSelenite-dystein Broth, inkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam. Lakukan hal yangsama terhadap biakan Salmonella kontrol.

3. AgarSelekfif Inokuiasikan satu loop substrat dari pengayaan diatas ke cawan Agar Salmonella-Shigella. Salmonella akan membentuk koloni yang bening tak berwarna, akan tetapi dapat juga berwarna coklat muda, sedikit merah jambu maupun kekuning-kuningan. Ambil lima koloni dan pupukkan ke agar miring Tripel Sugar Iron (TSI) Agar dengan metoda tusuk dan gores. Cara lain adalah dengan menginokulasikan satu loop substrat dari media pengaya ke atas cawan agar Bismuth Sulfit (BS) dengan metoda gores. Semua pupukan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 - 48 jam.

4. Pengamatan Pada Agar miring TSI koloni Salmonella positif menunjukkan reaksi basa abu-abu keunguan pada agarnya, sedangkan pada tempat tusukan akan bereaksi asam (kuning). Koloni positif pada BS agar setelah 48 jam menunjukkan koloni berwarna hitam sering dengan penyebaran warna berkilau metalik pada media.

43

HASIL PERCOBAAN JUDUL PERCOBAAN : Tanggal :

44

Lampiran :

1. Gambar morfologi sel

2. Komposisi media

45

DAFTAR PUSTAKA Fardiaz, S. 1992. Petunjuk Laboratorium Amikrobiologi Pengolahan Pangan.

DIKTI-PAU Pangan dan Gizi, IPB, Bogor

Jenie, B.S. L. dan S. Fardiaz.1989. Petunjuk Laboratorium Uji Sanitasi dalam Industri Pangan DIKTI-PAU Pangan dan Gizi IPB, Bogor.

Swanson, K.M.J., F.F. Busta., E.H., Peterson and M.G. Johson. 1992. Colony Count Methods in Compendium of Methods for the Microbiologycal. Examination of Food, 3 rd Ed. Edited by C. Vanderzent., D.F. Spfittsorser, Complied by the APHA Technical Committee on Microbiological Methods for Food.

penuntun praktikum mikrobiologi hasil ternak

Documents