Untuk :

Semester III

Tingkat II TPHP

Oleh :

KRESNA E. RENJAAN, S. Pi

NIP. 19721206 199803 2 003

KEMENTERIAN KELAUTAN DAN PERIKANAN

BADAN PENGEMBANGAN SDM KELAUTAN DAN PERIKANAN

SEKOLAH USAHA PERIKANAN MENENGAH NEGERI WAIHERU AMBON

2012

Standar Kompetensi 1 :

MENGHITUNG JUMLAH MIKROBA

SECARA TIDAK LANGSUNG

Kompetensi Dasar 1 :

MENGHITUNG BAKTERI DENGAN METODE TPC

TIK : Siswa dapat mehitung bakteri dengan metode tpc sesuai prosedur.

1. Prinsip Penghitungan Dengan TPC

Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan termofilik) setelah contoh diinkubasi dalam media agar pada suhu 35 °C ± 1 °C selama 24 jam – 48 jam ± 1 jam mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media agar, maka mikroorganisme tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung. Penentuan Angka Lempeng Total dapat dilakukan dengan 2 (dua) cara. Pertama, metode cawan agar tuang/pour plate, yaitu dengan menambahkan contoh ke dalam cawan petri terlebih dahulu kemudian ditambahkan media agar. Kedua, metode cawan agar sebar/spread plate yaitu dengan menuangkan terlebih dahulu media agar ke dalam cawan petri kemudian contoh diratakan pada permukaan agar dengan menggunakan batang gelas bengkok. 2. Pengenceran

Salah satu tahapan utama dalam analisa TPC adalah pengenceran selain pembuatan media dan penanaman bakteri. Pengenceran biasanya menggunakan larutan berupa larutan fosfat buffer, larutan garam fisiologis 0,9 % atau larutan ringer. Dengan pengenceran dapat mengurangi kepadatan bakteri yang ditanam. Secara umum, metode penanaman dapat dibedakan atas dua macam yaitu metode tuang (pour plate) dan metode sebar (spread plate). 3. Inokulasi MEDIA ISOLASI INOKULASI MIKROBA

Media adalah suatu substrat dimana mikroorganisme dapat tumbuh yang disesuaikan dengan lingkungan hidupnya. Media kultur berasarkan konsistensinya dibedakan atas tiga macam, yaitu media cair, media semi padat, dan media padat. Total Plate Count (TPC) merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam bahan pangan. Metode

hitungan cawan (TPC) merupakan metode yang paling banyak digunakan dalam analisa, karena koloni dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Untuk menghitung total bakteri dengan metode cawan digunakan Nutrient Agar (NA) Tahap–tahap utama dalam analisa TPC meliputi pembuatan media, pengenceran dan penanaman bakteri. Dalam pembuatan media ini, media biakan diperlukan untuk tumbuhnya bakteri yang ditanam. Sehingga media biakan yang baik harus dapat menyediakan nutrisi, tempat inkubasi, dan terpenuhinya kebutuhan oksigen yang diperlukan oleh mikroba. Secara umum, metode penanaman dapat dibedakan atas dua macam yaitu metode tuang (pour plate) dan metode sebar (spread plate).

Pengertian dan Fungsi Media

Media adalah suatu substrat untuk menumbuhkan bakteri yang menjadi padat dan tetap tembus pandang pada suhu inkubasi (Pelczar et al, 1986). Medium adalah suatu bahan nutrisi tempat menubuhkan bakteri di laboratorium (Tortora, 2007).

Macam Metode Penanaman beserta Kelebihan dan Kekurangannya

Menurut Fais (2009), metode penanaman ada dua yaitu : Dari deskripsi yang singkat ini mengenai ciri – ciri nutrisi bakteri haruslah dikenal dua langkah penting bagi intensitasnya. Di laboratorium (1) inokulasi penanaman penting bagi suatu medium dengan kandungan nutrisi yang sesuai (2) inkubasi medium yang sudah diinokulasi pada keadaan fisik (Waluyo, 2005).

Pada penanaman, diambil 1 ml dari masing – masing sampel dan dituang pada cawan petri. Perlakuan duplo bertujuan sebagai pembanding. Pada masing – masing cawan petri ditambah media NA hingga sampel tertutup media. Cawan petri digoyang membentuk angka 8 agar homogen. Ke enam cawan ditunggu hingga beku Dekat dengan Bunsen untuk pengondisian aseptis. Setelah membeku, cawan dibalik agar tidak ada uap air yang jatuh saat sterilisasi. Cawan petri dibungkus koran untuk menyerap air. Kemudian diikat dengan tali agar rapat setelah itu di inkubasi selama semalam di dalam incase.

Kompetensi Dasar 2 :

MENGHITUNG BAKTERI DENGAN METODE APM

TIK : Siswa dapat menghitung mikroba dengan metode APM.

1. Metode Penghitungan Dengan APM

Prinsip yang digunakan dalam metode MPN

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.

Contoh : Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.

MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah

kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok coliform dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan coliform untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli diperlukan media EC (Escherichia coli) broth. Berdasarkan prinsip diatas apakah mungkin metode MPN dapat untuk menghitung jenis bakteri selain jenis-jenis coliform ? Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan hasil yang PALING MUNGKIN. 2. Pengenceran Aspek peluang dalam metode MPN

Berdasarkan prinsip diatas maka “seharusnya/sebaiknya” jumlah tabung positif pada pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceran mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210 (lihat tabel dibawah). Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna.

Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga

menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (digaris bawah) pada tabel dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama

dengan sel/ml). Namun perlu diingat, jumlah sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka paling mungkin.

Perbandingannya dengan Plate Count

Telah disebutkan diatas bahwa MPN cocok untuk sampel dengan konsentrasi mikroorganisme rendah khususnya dari jenis sampel air, susu, atau makanan terutama yang memiliki partikel-partikel yang larut didalamnya. Partikel-partikel tersebut dimungkinkan mampu mempengaruhi keakuratan perhitungan bakteri jika menggunakan metode penanaman pada cawan petri. Hal ini karena sel bakteri yang terpisah dapat mengelompok pada partikel makanan dan mungkin tidak terpisah pada proses homogenisasi dalam pengenceran bertingkat sehingga saat diplating satu kumpulan tersebut menjadi satu koloni dan membuat data plate count menjadi bias. Metode MPN dapat mengeliminasi kekurangan ini.

Jumlah seri tabung dan pengenceran yang disarankan

Menurut USDA dan FSIS untuk mengantisipasi jika jumlah mikroorganisme dalam sampel >10 CFU/g atau ml maka disarankan menanam sampel 10 ml pada 3 seri tabung, 1 ml pada 3 seri tabung lalu selanjutnya dilakukan pengenceran sampai 104 dan tiap pengenceran ditanam 1 ml pada 3 seri tabung seperti skema di bawah ini.

Standar Kompetensi 2 :

MENGHITUNG JUMLAH MIKROBA

SECARA LANGSUNG

Kompetensi Dasar 1 :

MENGHITUNG BAKTERI DENGAN METODE PEWARNAAN

TIK : Siswa dapat mehitung bakteri dengan metode pewarnaan sesuai prosedur.

1. Prinsip Penghitungan Dengan Pewarnaan

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Kunci Awal Identifikasi Bakteri (Morfologi Koloni, Morfologi Sel & Pewarnaan)

Pada saat kita mendapatkan tugas untuk mencari tahu jenis suatu isolat bakteri, maka hal pertama yang dilakukan adalah mengamati ciri-ciri morfologi koloni, morfologi sel dan sifat gramnya.

Pastikan isolat yang akan diuji adalah kultur murni, benar-benar murni dan telah yakin tentang kemurniannya. Jadi jika diperoleh suatu kultur murni dari suatu lingkungan dan diyakini belum murni maka haruslah diisolasi ulang, maksudnya dimurnikan lagi sampai benar-benar pasti.

1) jika tidak yakin benar ini kultur murni atau tidak. 2) lakukan streak kuadran, minimal ke dua cawan (karena kalau salah satu gagal Membentuk koloni tunggal, maka masih ada cadangannya). 3) lihat hasil streak kuadran, apakah tampak koloni tunggal?, koloni tunggal adalah koloni yang timbul/tumbuh dari satu sel atau beberapa kumpulan sel (untuk staphylococcus misalnya), bukan dari beberapa ratus sel. Istilah yang paling mendekati adalah CFU’s. Jadi dipastikan satu koloni itu adalah satu jenis bahkan satu strain. Umumnya koloni tunggal itu kecil-kecil(misalnya

E.coli,1-2mm), ada juga yang besar. Faktor-faktornya mungkin adalah kecepatan pertumbuhannya dan stuktur sel itu sendiri (bayangkan sel E.coli yang sendiri-sendiri akan mudah terpisah saat digoreskan ke permukaan agar dibanding sel streptococcus. 4) jika didapatkan koloni tunggal, segera diamankan dengan menumbuhkan pada media baru (minimal 5). Kenapa harus banyak?, karena untuk menanggulangi cawan yang kontaminan, membuat stok kultur dan mencegah kejadian yang tidak diinginkan (kehilangan cawan

misalnya). 5) setiap menumbuhkan ke medium baru, sebaiknya harus dicek koloninya,

apakah sama dengan cawan induknya atau tidak. Jika perlu cek juga morfologi selnya.

6) sekarang kita telah memiliki beberapa kultur murni dan siap untuk diidentifikasi.

Kompetensi Dasar 2 :

MENGHITUNG BAKTERI DENGAN METODE HAEMOCYTOMETER

TIK : Siswa dapat menghitung mikroba dengan metode Haemocytometer.

1. Metode Penghitungan Dengan Haemocytometer

Hemositometer atau haemocytometer adalah perangkat awalnya

dirancang untuk penghitungan sel darah. Sekarang juga digunakan untuk

menghitung jenis sel serta partikel mikroskopis lainnya. Haemositometer ini

ditemukan oleh Louis-Charles Malassez dan terdiri dari sebuah slide mikroskop

kaca tebal dengan lekukan persegi panjang yang menciptakan sebuah kamar.

Ruangan ini adalah diukir dengan laser-grid tergores garis tegak lurus. Perangkat

ini dibuat dengan hati-hati sehingga daerah yang dibatasi oleh garis diketahui,

dan kedalaman ruang ini juga dikenal. Oleh karena itu mungkin untuk

menghitung jumlah sel atau partikel dalam suatu volume tertentu cairan, dan

dengan demikian menghitung konsentrasi sel dalam cairan secara keseluruhan.

2. Prinsip

Hemositometer terdiri dari beberapa, besar, 1 x 1 mm (1 mm2). Ini dibagi dalam 3 cara; 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm2), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm2) dan 0,20 x 0,20 mm (0,04mm2). Pusat, 0,20 x 0,20 mm ditandai, 1 x 1 mm persegi yang kemudian dibagi lagi menjadi 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm2). Tepi-tepi mengangkat dari hemositometer yang terus cover slip 0,1 mm dari grid ditandai. Hal ini memberikan setiap persegi volume yang ditetapkan.

Dimension Area Volume at 0,1 mm depth

1 x 1 mm 1 mm2 100 nl

0,25 x 0,25 mm 0,0625 mm2 6,25 nl

0,25 x 0,20 mm 0,05 mm2 5 nl

0,20 x 0,20 mm 0,04 mm2 4 nl

0,05 x 0,05 mm 0,0025 mm2 0,25 nl

Struktur sel-ukuran yang akan dihitung adalah yang terletak antara

tengah tiga baris di atas dan kanan alun-alun dan dari tiga baris di bagian bawah

dan kiri alun-alun.Dalam hemositometer Neubauer diperbaiki (umum media),

jumlah sel per ml dapatditemukan hanya dengan mengalikan jumlah sel

ditemukan di grid hemositometer (daerah sama dengan kotak merah pada

gambar di sebelah kanan) dengan 104 (10000) .

Hemositometer grid :

merah = 1 mm2, 100 nl

hijau = 0,0625 mm2, 6,25 nl

kuning = 0,04 mm2, 4 nl

biru = 0,0025 mm2, 0,25 nl

pada kedalaman 0,1 mm.

3. Penggunaan

Ketika sebuah sampel cair yang mengandung sel amobil ditempatkan

pada ruangan, itu ditutup dengan kaca penutup, dan kapiler sepenuhnya mengisi

ruang dengan sampel. Melihat kamar melalui mikroskop, jumlah sel dalam ruang

dapat ditentukan dengan menghitung.Berbagai jenis sel dapat dihitung secara

terpisah selama mereka bisa dibedakan secara visual. Jumlah sel di dalam ruang

yang digunakan untuk menghitung konsentrasi atau kepadatan seldalam

campuran dari mana sampel diambil: itu adalah jumlah sel di dalam ruang dibagi

dengan volume ruang itu (volume ruang yang diketahui dari mulai),

memperhitungkan setiap pengenceran dan menghitung pintas : konsentrasi sel

dalam campuran asli.

Hemocytometers sering digunakan untuk menghitung sel-sel darah,

organel dalam sel, sel-seldarah dalam cairan tulang punggung ke otak setelah

melakukan tusukan lumbal, atau jenis sel lain di suspensi. Menggunakan

hemositometer untuk menghitung hasil bakteri dalam 'jumlahtotal' karena sulit

untuk membedakan antara organisme hidup dan mati kecuali Trypan biru

digunakan untuk noda sel non-layak.