05/07/2020

1

PERAN AHLI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK

(ATLM) DALAM TES MOLEKULER

VIRUS SARS CoV-2

Biografi

Nama : ASRYADIN, S.ST., M.Si

Agama : Islam

Riwayat Tempat Tugas : - ATLM Puskesmas Asakota (2006-2009)

- ATLM Seksie PL Dikes Kota Bima (2009-2015)

- Kabag. QC CV. Sinar Mas Lestari (2009-present)

- ATLM RS PKU Muhammadyah Bima (2010)

- ATLM UPT. Labkesda Kota Bima (2015-present)

- ATLM RSKB Jatiwinangun Purwokerto (2016-2018)

Riwayat Pendidikan : - SMAK Mataram (2002)

- DIII Analis Kesehatan Poltekkes KEMENKES Mataram (2005)

- DIV Analis Kesehatan Poltekkes KEMENKES Surabaya (2012)

- S2 Mikrobiologi (Virologi dan Molekuler) Universitas Jenderal

Soedirman Purwokerto Jawa Tengah (2018)

Riwayat Organisasi : - Bidang Pelayanan Kesehatan BSMI DPC Kota Bima, periode

2014-2019 dan 2019-2023.

- Wakil Ketua Patelki DPC Kota Bima, Periode 2016-2020

- Ketua Patelki DPC Kota Bima, Periode 2020-2024.

Email : baekadhin@yahoo.co.id

05/07/2020

2

Overview

Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019

Metode Diagnosa

MIKROSKOPIS

KULTIVASI

BIOTESTING

METODE IMUNOLOGIK

AL

METODE BIOKEMIKAL

METODE MOLEKULER

Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019

05/07/2020

3

Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019

05/07/2020

4

Ahli Teknologi Laboratorium Medik (ATLM)

Tenaga Keteknisian Medis yang bekerja pada sarana

kesehatan (laboratorium) yang melaksanakan

pelayanan pemeriksaan, pengukuran, penetapan, dan

pengujian terhadap bahan yang berasal dari manusia

atau bahan bukan berasal dari manusia untuk

penentuan jenis penyakit, penyebab penyakit, kondisi

kesehatan atau faktor-faktor yang dapat berpengaruh

pada kesehatan perorangan dan masyarakat (UU

No.36 tahun 20 14)

Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019

ATLM dalam One PATELKI COMBAT COVID-19

1. Seruan Internal

2. Advokasi Kebijakan

3. Tetap Melayani secara

Profesional & Ikhlas

Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019

05/07/2020

5

Pelayanan ATLM = Profesional

UU No 36 TAHUN 2014 pasal 11Tenaga Kesehatan Lain

1.Radiografer2.Elektromedis3.Fisikawan Medik4.Radioterapi5.Ortotis Prostetis6.Teknisi Gigi7.Tenaga Bidan

7. Apoteker8. Teknisi Farmasi9. Tenaga Prom Kes10. Sanitasi11. Nutrisionis12. Fisioterapis13. Okupasi Terapis

15. Terapis Wicara16. Akupunktur17. Rekam Medis18. TTD19. Penata Anesthesi20. Psikolog

21. ATLM

05/07/2020

6

Ahli Teknologi Laboratorium Medis

Mempunyai :

1. Body of knowledge2. Bersifat altruistik3. Memiliki kompetensi4. Etika profesi

Peran ATLM dalam Uji Molekuler SARS CoV-2

05/07/2020

7

Peran ATLM dalam Uji Molekuler SARS CoV-2

Pemeriksaan laboratorium

Molekuler

Peran Serta ATLM Melawan COVID-19

Sampling darah untuk pasien COVID-19,

Beberapa dilatih melakukan sampling swab

nasopharing

Penangan Spesimen COVID-19

Pengiriman Spesimen COVID-19

Pemeriksaan Baik di Lab maupun diluar Lab

terkait COVID-19

Memilih reagen terkait COVID-19 dilab masing

masing

05/07/2020

8

TES MOLEKULER VIRUS SARS CoV-2

Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019

SARS CoV-2

Single stranded RNA virus

Genome terdiri dari ≥ 27.000 basa

Zoonosis

Tipe virus Alfa dan Beta menyebabkan

penyakit

pada manusia

SARS-CoV-2 memiliki 96% kesamaan asam

nukleat dengan coronavirus pada kelelawar

(RaTG13)

Perlman, et al., Nat Rev Microbiol 7, 439–450 (2009)

Zhang et al., Current Biology 30, 1346-1351 (2020)

05/07/2020

9

Metode Pemeriksaan

Rapid Test

Molecular test : Polymerase Chain Reaction

Immunofluorescence Assay

Test Serologi

Kultur virus

05/07/2020

10

Proporsi Kesalahan Pemeriksaan Laboratorium

Post Analitik(18-47% )

Analitik(7-13%)

Pre Analitik(46-68%)

Plebani, et al.,Clin Chem Lab Med 2006: 44(6): 750-59

Sensitifitas dan Spesifisitas Pemeriksaan

Sensitifitas dan spesifisitas deteksi virus dalam spesimendipengaruhi :

• Jenis pemeriksaan• Pengambilan spesimen sejak onset• Kualitas spesimen• Jenis spesimen• Penanganan spesimen• Waktu dari pengambilan spesimen hingga pemeriksaan

05/07/2020

11

Jenis Spesimen

Jenis Spesimen

05/07/2020

12

Viral Transport Medium (VTM)

• Steril

• Larutan Isotonik

• Mengandung Protein, Mengandung Antibiotik

• Buffer pH, • Indikator (Phenol Red)*

Contoh VTM :

Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Virocult, MEM, UTM, dll

• Di Simpan dalam Freezer -20oC (Dalam kondisi Beku,

VTM berwarna Kuning = Normal)

• Dicairkan terlebih dahulu jika akan digunakan

• Hindari Beku-Cair (FrezzeThaw) VTM Rusak

• Tidak Bisa digunakan bila berwarna kuning keruh

Alat/Bahan Pengambilan Spesimen

05/07/2020

13

Pengambilan Spesimen Swab

Yang perlu diperhatikan:• Putuskan tangkai plastik di daerah mulut cryotube agar cryotube

dapat ditutup dengan rapat

Pengambilan Spesimen Swab

• Cryotube kemudian dililit parafilm.• Cryotube yang sudah berisi swab dibungkus dalam tissue bersih

lalu dimasukan ke dalam plastik klip• Simpan dalam suhu 4-8°C sebelum dikirim.

Jangan dibekukan dalam Freezer.

05/07/2020

14

Pengepakan dan Pengiriman Spesimen

• Semua spesimen dikemas untukmencegah kerusakan dantumpahan

• Spesimen pasien harus dilakukantatalaksana sebagai UN3373, "Substansi Biologis, Kategori B", ketika akandiangkut/ditransportasikandengan tujuan diagnostik atauinvestigasi

• System yang digunakan adalahdengan menggunakan tiga lapis (Three Layer Packaging) sesuai dengan pedoman WHO danInternational Air Transport Association (IATA).

Pengepakan dan Pengiriman Spesimen

Masing-masing spesimen dimasukkan ke dalam plastik klip berisi tissue sebagaiabsorban secara terpisah (per pasien/spesimen)

05/07/2020

15

Uji Molekuler SARS CoV-2

WHO :

1. IN AREA WITH NO KNOWN COVID -19 VIRUS CIRCULATION

- Hasil PCR positive untuk minimal 2 target gen yang berbeda , dimana salah satu

spesifik untuk COVID 19 atau

- Hasil PCR positive untuk adanya beta corona virus yang kemudian diidentifikasi

dengan sequencing

2. IN AREA WITH ESTABLISHED COVID-19 VIRUS CIRCULATION

- Screening of a single discriminatory target is considered sufficient

Perbedaan Jenis Gen Target Yang Digunakan

05/07/2020

16

Uji Molekuler SARS CoV-2

Mendeteksi antigen atau materi genetik

virus

Sensitif dan spesifik

Cepat

Memerlukan tahapan persiapan sampel

Memerlukan peralatan khusus

Memerlukan fasilitas lab khusus BSL2

Workflow Uji Molekuler SARS CoV-2

RNAIsolation

PCRReaction

DataAnalysis

05/07/2020

17

Ekstraksi RNA

Mengisolasi asam nukleat dari berbagai

material selular di dalam spesimen

Dilakukan di BSL II

Menghilangkan materialnpenghambat yang

tidak diperlukan dalam reaksi PCR

Inaktivasi virus (lysis buffer) HARUS

dilakukan di dalam BSC (Biosafety Cabinet)

II

PCR (Polimerase Chain Reaction)

In 1983 PCR ditemukan oleh Kary Mullis dari Cetus Corporation

PCRMetode yang cepat dan sederhana, untuk memperbanyak urutan

DNA spesifik yang diinginkan tanpa membutuhkan sel bakteri

PCR dapat digunakan untuk amplifikasi DNA maupun RNA (cDNA)

Tahapan utama PCR :

1. Denaturasi (Suhu 95°C)

2. Annealing (Suhu 50-60°C), sesuai hasil optimasi

3. Ekstensi/Elongasi (Suhu 72°C)

05/07/2020

18

Jenis – Jenis PCR

PCR

Konvensional

Real Time (Quantitative)

Reverse Transcription

(RT-PCR)

Konvensional

Real Time (Quantitative)

DNA Replication VS PCR

• PCR is a laboratory version of DNA replication in cells

• The laboratory version is commonly called “in vitro” since it occurs in a test tube while “in vivo” signifies occurring in a living cell.

05/07/2020

19

Komponen PCR

1. Primer (oligonukleotida)

2. DNA Template

3. Water

4. Buffer mengandung ion Mg

5. Enzim (DNA Polymerase) termostabil

6. Buffer

7. Ion Mg2+

Komponen PCR

05/07/2020

20

Tahapan Utama PCR

Tahapan Utama PCR

05/07/2020

21

Tahapan Utama PCR

Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

• Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction, bukan realtime-PCR

• Amplifikasi DNA dengan template RNA

• Terdiri dari 2 tahap:

RT : Reverse Transcription cDNA Synthesis

PCR : Amplifikasi DNA

05/07/2020

22

1. Primer (oligonukleotida)

2. RNA Template

3. Water

4. Buffer mengandung ion Mg

5. Enzim DNA Polymerase termostabil

6. Enzim Reverse Transcriptase

7. Buffer

8. Ion Mg2+

Komponen RT-PCR

Tahapan RT-PCR

1. Reverse Transcripsi RNA

2. Amplifikasi PCR

05/07/2020

23

Tahapan PCR / RT-PCR

Real Time PCR / Quantitative PCR (qPCR)

It is a technique used to monitor the

progress of a PCR reaction in real-time

It is based on the detection of the

fluorescence produced

a relatively small amount of PCR product

can be quantified

Faster than normal PCR

It gives a look in to the reaction that is

help to decide which reactions have

worked well and which have failed

05/07/2020

24

Komponen Real Time PCR / Quantitative PCR (qPCR)

1. Primer (oligonukleotida)

2. Probe

3. DNA Template

4. Water

5. Buffer mengandung ion Mg

6. Enzim (DNA Polymerase) termostabil

7. Buffer

8. Ion Mg2+

Sekuen oligonukleotida pendek yang didesain untuk berhibridisasi dengan sekuen target

Probe qPCR

• Kelebihan TaqMan Probe dibandingkan dengan Sybr green :Menempel pada target yang lebih spesifik

Sybr Green Probe TaqMan Probe

05/07/2020

25

Multiplex PCR In One Step RT-PCR

Contoh Platform Kerja qPCR

44 siklus

2. Optimasi pasangan primer dan probe

Komponen qRT-PCR:

• Primer (40µM)

• Probe (10µM)

• DNA Template

• Reagen kit

Tahapan Suhu Waktu

Reverse transkripsi

Predenaturasi

Denaturasi

Annealing dan ekstensi

50oC

95oC

95oC

• 50oC

• 55oC

• 60oC

30 menit

2 menit

15 detik

1 menit

Sampel dikatakan positif apabila nilai Ct 18-38

05/07/2020

26

Real Time PCR Workflow

Real Time PCR Workflow

05/07/2020

27

Threshold

Threshold berada diatas baseline sinyal fluorescence. Sinyal yangterdeteksi diatas threshold adalah sinyal yang digunakan dalam menentukannilai threshold cycle (Ct).

Pengaturan threshold manual diletakkan diatas noise atau background kurva amplifikasi

Validasi Hasil

1. Pemeriksaan RP gene yang merupakan gen yang terdapat

di dalam sel epitel manusia

2. Hasil RP positif menunjukkan bahwa proses ekstraksi asam

nukleat dan proses pengambilan spesimen telah dilakukan

dengan benar

05/07/2020

28

Fasilitas Laboratorium PCR

Fasilitas Laboratorium PCR

05/07/2020

29

Lay out untuk Lab PCR

Setiap area memiliki alat lab, reagen, bahan habis pakai, dan APDmasing-masing, TIDAK untuk dipindahkan ke ruangan lain

Pemilihan Reagensia PCR

Dipilih berdasarkan kebutuhan

Perhatikan spesifitas dan sensitivitas reagensia (terutama bila primer

probe dari manufacture)

Sesuaikan chemistry reagensia dengan alat PCR yang ada di lab

05/07/2020

30

Refference

Lorenz, T.C. 2012. Polymerase Chain Reaction : Basic protocol Plus Troubleshooting

and Optimization Strategy. Journal of Visualized Experiments, pp. 1-15.Marantina

SS., 2008. Deteksi Fragmen Produk PCR. FMIPA UI, pp. 30-46

Thermofisher, 2016. Real-time PCR handbook. Appliedbiosystem, pp. 2-68.

Viljoen, G.J., L.H. Nel and J.R. Crowther. 2005. Molecular Diagnostic PCR

Handbook. Springer, pp. 1-260.

Terimakasih

Evaluasi Narasumber

http://bit.ly/kuisionerPNTP