TUGAS AKHIR (SB-09 1358)

Presented by:

Noor Nailis Sa’adah

1506 100 701

Pembimbing :

1. Awik Puji D.N., S.Si,M.Si

2. Dr. rer.nat. Maya Shovitri, M.Si

Pengaruh Senyawa Antikanker dari Spons Laut Aaptos

suberitoides Terhadap Profil Protein Plasma Darah Mencit (Mus

musculus) Penderita Kanker

1

Proposal TA

BAB 1: PENDAHULUAN

Indonesia�negara Kepulauan

1.1 Latar Belakang

Kaya Spons laut �

Aaptos suberitoides

Spons memiliki Senyawa

bioaktif

Senyawa Antikanker

Pengujian Aktivitas Senyawa

Antikanker secara In vivo

2

Pengujian Aktivitas Senyawa

Antikanker Secara In vivo

3

Hewan uji (induksi karsinogenik Benzo(a)piren pada mencit)

Mengkode protein khusus

+ Senyawa Antikanker

Analisa profil proteinAdanya perubahan profil protein

Mencit yang menderita kanker

1.2 Perumusan Masalah

Bagaimana profil protein dengan metode elektroforesis SDS-PAGE

dari plasma darah mencit (M. musculus) penderita kanker setelah

dilakukan terapi dengan ekstrak spons laut A. suberitoides dengan

dosis 500, 1000 dan 1500 mg/kg BB.

1.3 Batasan Masalah

Analisis profil protein dilakukan secara deskriptif yang meliputi ada/

tidak kehadiran pita protein, berat molekul (BM) dan tebal tipis pita

protein. Analisis profil protein hanya dilakukan pada pita protein yang

konsisten, yaitu pita protein yang hadir pada semua ulangan (ulangan

running dan individu) dan pita protein yang memiliki ketebalan

relatif sama.

1.4 Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui profil protein dengan metode elektroforesis SDS-

PAGE dari plasma darah mencit (M. musculus) penderita kanker

setelah dilakukan terapi dengan ekstrak spons laut A. suberitoides

dengan dosis 500, 1000 dan 1500 mg/kg BB.

1.5 Manfaat Penelitian

Mengetahui profil protein yang muncul pada mencit (M. musculus)

penderita kanker setelah diterapi menggunakan rude extract dari

spons laut A. suberitoides sehingga dapat digunakan sebagai pengem-

bangan untuk pengobatan penyakit kanker dengan menggunakan

kemoterapi protein.

BAB 3: METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

�Pelaksanaan penelitian pada bulan Oktober 2009 - Maret 2010

� Sampel spons diambil dari perairan Pasir Putih, Situbondo

� Penginduksian zat karsinogenik dan pemberian zat antikanker

kepada mencit (Mus musculus) dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi Fakultas Farmasi UNAIR Surabaya

� Analisa profil protein pada mencit (Mus musculus) dilakukan di

Laboratorium Pengujian dan Pelayanan Terpadu (LPPT) unit 3

UGM Yogyakarta

6

3.2 Prosedur Kerja

� Persiapan Hewan Uji

– Hewan uji yang digunakan adalah mencit (M. musculus) jantan strain B Albino

clone (BALB/c) berumur 2 bulan

– Sebelum dilakukan perlakuan � mencit diaklimasi dalam kandang selama 1

minggu dan diberi pakan Par G produksi Comfeed dan air minum aquades

� Induksi Karsinogenik terhadap Hewan Uji dengan Benzo(a)piren

� Benzo(a)piren 0,3 gr dilarutkan dalam 0,2 ml oleum olivarum. Injeksi melalui

jaringan sub kutan dilakukan 2 hari sekali selama 10 hari (5 kali).

� Pertumbuhan kanker ditunggu selama ± 2 bulan.

� Uji Antikanker Ekstrak Spons A. suberitoides terhadap Hewan Uji

� Dilakukan pada minggu ke-15 selama ± 2 minggu

� Pengamatan Profil Protein Plasma Darah Mencit

7

Tidak diinjeksi

Benzo(a)piren

SakitSehat

Kontrol

Benzo(a)piren

Sehat

kontrol

Cyclophos

phamide

500

mg/kg

BB

1000

mg/kg

BB

1500

mg/kg

BB

Diberi Ekstrak spons Aaptos suberitoides

Induksi Karsinogenikterhadap Hewan Ujidengan Benzo(a)piren

Uji Antikanker Spons A. suberitoides terhadap

Hewan Uji

K1 K2 K3 K4 K5

8

Pengamatan Profil Protein Plasma Darah Mencit

Pelet

Darah mencit

Ditambah EDTA

Sentrifugasi pada 3000 rpm ± 10 menit

Supernatan

(Plasma darah)

a. Preparasi Sampel

9

Plasma darah dipipet sebanyak 5 µL

Dilarutkan dalam 145 µL aquades (Pengenceran 30x)

Sampel ditambahkan loading buffer (Lampiran 1d) sebanyak 50 µL

Sampel dipanaskan pada suhu 95 °C selama 4 menit

Sampel siap digunakan dalam Elektroforesis

10

b. Persiapan Perangkaian Alat Elektroforesis

Perangkat elektroforesis (Biorad®, Jerman) dirangkai

Didiamkan 15 menit supaya memadat

± 6,0 ml larutan gel pemisah 12% (Lampiran 1.g) diisikan pada plat

dan dilapisi dengan 1 ml butanol

Lapisan butanol dibuang

Ditambahkan larutan gel penumpuk 3% (Lampiran 1.h) di atas gel pemisah

Sisir pembentuk sumuran dimasukkan di antara plat dan didiamkan 10

menit, setelah padat sisir diambil

11

Laemmli (1970) dalam Maron et al., (2008)

— Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam kotak elektroforesis — Diisi dengan buffer elektroda sampai ke permukaan kotak elektroforesis— Sampel dimasukkan ke dalam sumuran gel dengan volume 10 µl/sumuran. — Perangkat elektroforesis dihubungkan dengan penghantar arus listrik 120V

selama 1,5-2 jam. — Elektroforesis dihentikan sampai warna biru menyentuh dasar gel— Gel dilepas dan dimasukkan ke kotak pewarna biru komasi (lampiran 1.e)— Diinkubasi selama 24 jam dengan goyangan 42 rpm— Gel dipindah ke kotak yang berisi larutan destainer untuk membuang sisa

pewarna (lampiran 1.f) selama 30-60 menit— Larutan destainer dibuang dan diganti dengan larutan asam asetat 10%

untuk penyimpanan gel elektroforesis— Pita protein diamati&difoto secara langsung menggunakan kamera digital— Analisis Hasil Perhitungan berat molekul dilakukan dengan membanding-

kan standartmarker, yaitu Prestained SDS PAGE (Biorad®, Jerman)

c. Denaturasi Gel Elektroforesis (SDS PAGE 12%)

Hasil

Plasma darah mencit

12

Analisis Hasil ElektroforesisPembuatan Kurva Standar

Nilai berat molekul protein yang dicari dihitung dengan

menggunakan kurva standar

x = Jarak pita-pita dari sumuran

y = nilai log dari berat molekul pita marker yang telah diketahui

sebelumnya

Dari nilai absis dan ordinat yang telah diperoleh, maka dibuat

kurva Fitted Line Plot menggunakan program Minitab (Durrani

et al., 2008).

y = ax + b

13

Analisa Data

• Analisa data dilakukan secara deskriptif yang meliputi

ada/tidak kehadiran pita protein, BM pita protein dan

tebal tipis pita protein.

• Analisis profil protein hanya dilakukan pada pita protein

yang konsisten, yaitu pita protein yang hadir pada semua

ulangan (ulangan running dan individu) dan pita protein

yang memiliki ketebalan relatif sama.

14

4.1Konsistensi Profil Protein Plasma Darah Mencit Berdasarkan Metode SDS-PAGE

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil ulangan running dan individu

Pita protein konsisten Pita protein tidak konsisten

protein V (104 kD) dan W (49 kDa) (Gambar 4.1)

protein X (9 kDa) (Gambar 4.1)

Faktor yang mempengaruhikonsistensi pita protein plasma darah

konsumsi pakan respon imun yang spesifik terhadap patogen

Peningkatan konsumsi pakan �karbohidrat, lemak dan protein

yang masuk ke tubuh jugameningkat

kondisi fisiologis individu yang bersangkutan

A.Karbohidrat

Asam lemak bebas dengan kadar rendah ditemukan dalam keadaan setelah makan yang kemudian akan naik sekitar 0,5 µeq/mL pada keadaan pasca absorpsi (Murray, 2003)

Karbohidrat jika jumlahnya lebih banyak daripada yang digunakan sebagai sumber energi

disimpan dalam bentuk glikogen

Diubah menjadi triasilgliserol dan disimpan dalam jaringan adiposa

asam lemak dan gliserol Dihidrolisis

Lipase

Asam lemak bebas dilepaskan ke dalam plasma dan bergabung dengan albumin plasma

(Murray, 2003)

(Isdadiyanto, 2008)

B. Lemak

• Lemak � diangkut ke berbagai jaringan dan organ tubuh �

untuk digunakan serta disimpan.

• Proses pengangkutan lipid di dalam plasma �

Penggabungan lipid non-polar dengan lipid amfipatik dan

protein untuk membentuk lipoprotein (Murray, 2003).

C. Protein

• Peningkatan konsumsi makan � meningkatkan asam amino

esensial

• Asam amino berlebih � tidak disimpan dalam tubuh, tetapi

akan diuraikan dengan cepat (Murray, 2003).

Infeksi suatu patogen pada tubuh mencit

Aktivasi sel B�

berdiferensiasi menjadi

sel plasma dan sel memoriSel plasma �membentuk

antibodi spesifik

�Hewan pertama kali terserang suatu

patogen �mengekspresikan IgM

�Hewan yang sudah pernah terserang

patogen yang sama�mengekspresikan

IgG

� BM IgM adalah 900 kDa sedangkan

IgG 150 kDa (Murray, 2003).

� Perbedaan berat molekul �

perbedaan profil protein

Respon imun yang spesifik terhadap patogen

(Murray, 2003)

4.2 Analisis Profil Protein Plasma Setelah Perlakuan SenyawaKarsiogen dan Antikarsinogen

• Mencit diinjeksi senyawa benzo(a)piren selama 10 hari � memperlihatkan benjolan kanker pada leher (cerviks) (Gambar 4.2).

Profil protein plasma darah kelompok mencit normal � terdiri dari

pita-pita protein dengan BM 7, 9, 11, 27, 34, 49, 56, 66, 82, 104, 121, 145

dan 162 kDa (Gambar 4.3).

Dibandingkan dengan kontrol,

kelompok 3, 4, 5 dan 6 kehilangan

satu protein dengan BM 7 kDa

� Kelompok 2, 3 dan 4�muncul dua protein baru

dengan BM 41 dan 115 kDa

� Kelompok 5 dan 6� hanya muncul satu

protein baru dengan BM 41 kDa (Gambar 4.3).

• Penelitian Yang and Page, (1995) � protein 7 kDa

merupakan protein membran yang terekspresi secara

berlebihan pada sel kanker ovarium.

• Protein 7 kDa � diduga terlibat dalam proliferasi sel

kanker ovarium sehingga resisten terhadap berbagai

jenis obat (multidrug resistant).

• Pada penelitian ini � protein 7 kDa ditemukan pada

kelompok mencit sehat (Kelompok 1) dan mencit sakit

kanker fibrosarkoma (Kelompok 2) dengan ketebalan

yang hampir sama.

• Kelompok 3,4, 5 dan 6� protein 7 kDa tidak terdeteksi.

Kemungkinan-kemungkinan penyebab muncul dan hilangnya protein 7 kDa dalam penelitian ini adalah:

1. Sel normal � proliferasi sel.

Protein 7 kDa� berperan

dalam proliferasi sel tersebut

2. Protein 7 kDa� proliferasi sel kanker fibrosarkoma

Tidak terekspresi� akibat pemberian obat cyclophosphamide

dan ekstrak spons laut A. suberitoides.

�Cyclophosphamide � zat pengalkil � apabila bereaksi

dengan DNA � menyebabkan perubahan struktur DNA �

fungsi DNA tersebut terganggu (Rasad, 2009) � diduga

menurunkan kemampuan proliferasi sel.

�Ekstrak spons A. suberitoides �mengandung senyawa

aaptamin� golongan alkaloid (Larghi, et al., 2008).

�Senyawa alkaloid � antimitosis �mampu mengikat tubulin

(protein penyususn mikrotubulus)�menghambat polimerasi

protein ke dalam mikrotubulus (Murniasih, 2005).

�Hambatan polimerasi protein �mengganggu proliferasi sel.

� Theilgaard et al., (2005) � protein 41 kDa (α1-acid glycoprotein)

� protein fase akut sebagai respon infeksi/kerusakan sel.

� Respon kerusakan sel � meningkatnya jenis sintesis protein plasma

di hati� protein fase akut (APPs) �berfungsi untuk koagulasi,

penghambat protese dan mengatur respon imun.

� Apabila injeksi benzo(a)piren menyebabkan kerusakan sel�

diduga bahwa protein 41 kDa yang terdeteksi dalam penelitian

ini adalah protein α1-acid glycoprotein

�Kelompok mencit normal � tidak terdeteksi protein 41 kDa

karena tidak diinjeksi senyawa benzo(a)piren sehingga tidak

terjadi kerusakan sel.

• Pytela et al., (1985) � protein 115 kDa spesifik untuk vitronektin

dalam proses adhesi/migrasi sel.

• Menurut Bandaso (2006), sel tumor dapat menembus Extra

Cellular Matrix (ECM) dengan melekat pada ECM �

kemungkinan sel tumor mempunyai reseptor terhadap molekul

ECM yang berperan dalam adhesi sel.

• Diasumsikan bahwa protein 115 kDa pada fibrosarkoma sama dengan

protein 115 kDa pada sel osteosarkoma � hilangnya protein 115 kDa

� pengaruh dosis ekstrak spons laut A. suberitoides.

• Pemberian cyclophosphamide dan ekstrak spons laut A. suberitoides

500 mg/kg BB � diduga belum mampu menyembuhkan kanker

• Pemberian ekstrak spons laut A. suberitoides 1000 dan 1500 mg/kg

BB � diduga lebih efektif dalam menyembuhkan sel kanker

1. Terdapat perbedaan profil protein plasma darah mencit (M.

musculus) penderita kanker yang telah diterapi dengan ekstrak

spons A. suberitoides dengan konsentrasi 500, 1000 dan 1500

mg/kg BB.

2. Dibandingkan dengan kontrol, muncul protein baru dengan BM

41 dan 115 kDa. Protein dengan BM 7 kDa hanya muncul pada

kelompok yang tidak diterapi (kelompok 1 dan 2) dan tidak

terekspresi pada kelompok yang diterapi dengan ekstrak spons

laut A. suberitoides dan obat cyclophosphamide (kelompok 3,4,5

dan 6). Protein dengan BM 41 kDa muncul pada kelompok yang

diinjeksi benzo(a)piren (kelompok 2, 3, 4, 5 dan 6). Protein

dengan BM 115 kDa muncul pada kelompok 2,3 dan 4, sedangkan

pada kelompok lainnya (kelompok 1, 5 dan 6) tidak terekspresi.

BAB 5: Kesimpulan dan Saran

Saran

• Ekstrak spons Aaptos suberitoides yang digunakan untuk

terapi perlu dimurnikan terlebih dahulu menjadi bentuk

senyawa murni sehingga memiliki aktivitas biologi yang

lebih tinggi.

• Selain itu, perlu dilakukan evaluasi terhadap konsentrasi

ekstrak yang diberikan.

1.C Buffer Elektroda• Tris 2,8 gram• Glisin 14,4 gram• SDS 1 gram• Aquades sampai dengan 1000

ml

1.D Loading Buffer•DBS (larutan stok) 10,0 ml•Bromofenol Brilian Blue 0,05 gr•Β-mercapto etanol 500 µl

1.E Pewarna Gel (Biru Komasi)•Comassie Brillian Blue R-250

0,2gr•Asam Asetat Glasial 10 ml•Metanol 40 ml•Aquades 50 ml

1.F Larutan destainer•Asam Asetat Glasial 100 ml•Metanol 400 ml•Aquades 500 ml

1.G Gel Pemisah 12% (Separating Gel)•Aquadest 3350 µl•LGB 2500 µl•30% Bis-Acrylamid 4000 µl•10% APS(Amonium persulfat) 50 µl•TEMED 5 µl•SDS 10% 100 µl

1.H Gel Penumpuk 3% (Stacking Gel)•Aquades 3200 µl•UGB 1250 µl•30% Bis-Acrylamid 500 µl•10% APS(Amonium persulfat) 25 µl•TEMED 5 µl•SDS 10% 50 µl

Lampiran

31

DAFTAR PUSTAKA• Bandoso, Randanan. 2006. Aspek Biologi Molekuler Metastasis.

http://med.unhas.ac.id/index2.php?option=com_conten&dopdf=1&id=153

Diakses pada tanggal 1 April 2010

• Coutinho, A., Chanas, B., Souza, T. Frugrulhetti, I., dan Epifanio. 2002.

Anti HSV-1 Alkaloids from a Feeding Deterrent Marine Spongse of The

Genus Aaptos.Heterocycles, vol. 57. 2002. Pp. 1265-1272

• Durrani, R. Abubakar, M. Arshed, M.J. Saleha, S. Ullah, dan Ali, Q. 2008.

Biological Characterization and Protein Profiles of Two Model

Bacteria by SDS-PAGE and Ftir. Vol 3.no 5&6, journal of Agricultural

and Biological Science

• Isdadiyanto, Sri. 2008. Lemak Abdominal Mencit (mus musculus) Setelah

Pemberian Kitin Per-oral. J. Sains & Mat. Vol. 16 No. 3 Juli 2008: 150-

152

Proposal TA

32

• Larghi, E., Obrist, B., and Kaufman, T. 2008. A formal total synthesis of the marine

alkaloid aaptamine. Tetrahedron Volume 64, Issue 22

• Maron, P.A., Maitre, M., Mercier, A., Lejon, D.P.H., Nowak, V., and Ranjard, L. 2008.

Protein and DNA Fingerprinting of a Soil Bacterial Community Inoculated into Three

Different Steril Soil. Research in Microbiology 159 (2008) 231-236

• Pytela, R., Michel D., Pierschbacher and Erkki R. 1985. A 125/115-kDa Cell Surface

Receptor Specific for Vitronectin Interacts with the Arginine-glycine-aspartic acid

Adhesion Sequence Derived from Fibronectin. Cell Biology Proc. Natl. Acad. Sci.

USA Vol 82, pp. 5766-5770, September 1985

• Theilgaard, K., Lars C., Thomas R., Carsten U., Lene U., Rehannah B., Maged G.,

Peter D., Adrian F., Jero C., Bo T. dan Neils B. 2005. Highly glycosylated α1-acid

glycoprotein is synthesized in myelocytes, stored in secondary granules, and released

by activated neutrophils. Uncorrected Version. Published on June 7, 2005 as

DOI:10.1189/jlb. 0105042

• Yang, Xiaowei and Michel P. 1995. An Mr 7 kDa Membrane Protein Overexpressed in

human multidrug-resistant ovarian cancer cell. Cancer Letters 88 (1995) 171-178

TERIMA KASIH

Proposal TA

34