PENENTUAN WAKTU OPTIMUM AKTIVITAS ENZIM KITINASE DANKITIN DEASETILASE DARI ISOLAT Mucor miehei DALAM

DEGRADASI KITIN

(Skripsi)

Oleh

J. JULIANSER NICHO

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG2016

ABSTRACT

DETERMINATION OPTIMUM TIME OF CHITINASE AND CHITINDEACETYLASE ENZYME FROM Mucor miehei ISOLATE IN

DEGRADING CHITIN

By

J. Julianser Nicho

This research was conducted to measure the amount of glucosamine product onthe working of chitinase and chitin deacetylase enzyme which is produced byMucor miehei. Degradation from chitin to glucosamine by 2 enzymes occurthrough fermentation reaction. Fermentation process was observed at 1, 2, 3, 4, 8,12 and 24 hours. The highest amount of glucosamine product as freeze-dryfraction was obtained for 82,2% at 2 hours incubation time. The glucosaminelevel from fermentation yield was determined with spectrophotometry UV-Vismethod. The results of the analysis in spectrophotometry UV-Vis were showedthat the highest glucosamine level was obtained for 0,01667% at 3 hoursincubation time.

Key words : Mucor miehei, spectrophotometer UV-Vis, Chitin, Glucosamine,Chitinase, Chitin Deacetylase

ABSTRAK

PENENTUAN WAKTU OPTIMUM AKTIVITAS ENZIM KITINASE DANKITIN DEASETILASE DARI ISOLAT Mucor Miehei DALAM

DEGRADASI KITIN

Oleh

J. Julianser Nicho

Penelitian ini dilakukan untuk melihat jumlah produk glukosamin dari kerja enzimkitinase dan kitin deasetilase yang dihasilkan Mucor miehei. Degradasi kitinmenjadi glukosamin oleh 2 enzim tersebut berlangsung melalui reaksi fermentasi.Proses fermentasi diamati 1, 2, 3, 4, 8, 12 dan 24 jam. Jumlah produk glukosaminhasil fermentasi tertinggi dari fraksi freeze-dry didapatkan pada waktu inkubasi 2jam sebesar 82,2%. Kadar glukosamin dari hasil fermentasi ditentukan denganmetode spektrofotometri UV-Vis. Hasil analisis secara spektrofotometri UV-Vismenunjukkan bahwa kadar glukosamin tertinggi didapatkan pada waktu inkubasi3 jam sebesar 0,01667%.

Kata kunci : Mucor miehei, spektrofotometer UV-Vis, Kitin, Glukosamin,Kitinase, Kitin Deasetilase

PENENTUAN WAKTU OPTIMUM AKTIVITAS ENZIM KITINASE DAN

KITIN DEASETILASE DARI ISOLAT Mucor miehei DALAM

DEGRADASI KITIN

Oleh

J. JULIANSER NICHO

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar

SARJANA SAINS

pada

Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG

2016

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Palembang, pada tanggal 1 Juli

1993, yang merupakan anak pertama dari tiga

bersaudara dari Bapak Rolly P. dan Ibu Ayen.

Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD

Immanuel Bandar Lampung pada tahun 2005,

pendidikan tingkat menengah di SMP Immanuel

Bandar Lampung pada tahun 2008 dan penulis melanjutkan pendidikan tingkat

atas di SMA Immanuel Bandar Lampung dan selesai pada tahun 2011. Pada tahun

yang sama, penulis diterima sebagai mahasiswa jurusan kimia FMIPA Universitas

Lampung melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri

(SNMPTN) tertulis.

Selama menjadi mahasiwa, penulis mendapatkan beasiswa PPA dari tahun 2013-

2015. Aktivitas organisasi penulis dimulai dari menjadi Kader Muda HIMAKI

(Himpunan Mahasiswa Kimia) tahun 2011-2012. Penulis juga pernah menjadi

anggota Bidang Sains dan Penalaran Ilmu Kimia (SPIK) tahun 2012-2013 dan

anggota Biro Penerbitan HIMAKI FMIPA UNILA pada tahun 2013-2014. Selain

itu, penulis juga pernah menjadi asisten pratikum sains dasar jurusan matematika

pada tahun 2014 dan pada tahun 2015 menjadi asisten praktikum kimia dalam

kehidupan jurusan kimia, asisten praktikum biokimia jurusan biologi, asisten

praktikum kimia dasar teknik geofisika dan asisten sains dasar jurusan ilmu

komputer. Penulis pernah melalukan kerja praktik yang berjudul “Isolasi Kitin

dari Kulit Udang dan Peremajaan Mucor miehei” di UPT. Laboratrium

Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi Universitas Lampung.

MOTTO

“janganlah takut, sebab Aku menyertai engkau, janganlah bimbang,sebab Aku ini Allahmu; aku akan meneguhkan, bahkan akanmenolong engkau; Aku akan memegang engkau dengan tangankanan-Ku yang membawa kemenangan.” (Yesaya 41:10)

“Karena itu Aku berkata kepadamu: apa saja yang kamuminta dan doakan, percayalah bahwa kamu telahmenerimanya, maka hal itu akan diberikan kepadamu.”

(Markus 11:24)

“Sebab Aku ini mengetahui rancangan-rancangan apa yang ada pada-Kumengenai kamu, demikianlah firman TUHAN, yaitu rancangan damaisejahtera dan bukan rancangan kecelakaan, untuk memberikankepadamu hari depan yang penuh harapan.” (Yeremia 29:11)

“Serahkanlah segala kekuatiranmu kepada-Nya, sebab Iayang memelihara kamu.” (1 Petrus 5:7)

“Mengucap syukurlah dalam segala hal, sebab itulah yang

dikehendaki Allah di dalam Yesus Kristus bagi kamu.”

(1 Tesalonika 5:18)

Kupersembahkan karyaku ini sebagai tanda rasa cinta-kasih, bakti dan tanggung jawabku

Kepada

TUHAN YESUS KRISTUS atas segala berkat, kebaikan, kasih, anugrah dan semuanya yang

telah Engkau berikan kepadaku sampai terselesaikan karya ini

PAPA DAN MAMA yang terus memberi semangat dan motivasi untuk menyelesaikan

karya ini serta kesabaran sampai karya ini terselesaikan

ADIK-ADIKKU atas kebersamaan dan dukungan yang telah diberikan untuk menyelesaikan karya

ini

SAHABAT-SAHABAT TERBAIKKU DAN TEMAN-TEMAN yang selalu membantu, berbagi

kebersamaan serta keceriaan

Serta

ALMAMATER TERCINTA

SANWACANA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala kasih

karunia, kesanggupan dan berkat-Nya yang telah diberikan kepada penulis untuk

menyelesaikan skripsi yang berjudul “Penentuan Waktu Optimum Aktivitas

Enzim Kitinase dan Kitin Deasetilase dari Isolat Mucor miehei dalam

Degradasi Kitin”. Skripsi ini adalah salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains pada Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Lampung.

Dalam pelaksanaan dan penyelesaian ini tidak terlepas dari adanya kesulitan dan

rintangan, tetapi semua dapat terlewati karena penyertaan Tuhan Yesus Kristus

serta bimbingan, arahan dan bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini

penulis ingin mengucapkan terima kasih dan penghargaan kepada:

1. Ibu Dra. Aspita Laila, M.S., selaku pembimbing utama yang telah

membimbing penulis dengan penuh kesabaran, memberikan banyak ilmu

pengetahuan dan arahan sampai terselesaikannya penulisan skripsi ini.

2. Bapak Prof. Dr. John Hendri, M.S., selaku pembimbing kedua yang telah

membimbing penulis dengan sabar, memberikan waktu, banyak ilmu

pengetahuan, saran, dukungan dan nasehat hingga penulis menyelesaikan

skripsi ini.

3. Bapak Mulyono, Ph.D., selaku pembahas yang telah memberikan kritik dan

saran demi terselesainya skripsi ini.

4. Bapak Prof. Dr. Sutopo Hadi, M.Sc., selaku Pembimbing Akademik atas

bimbingan dan dukungannya selama ini kepada penulis.

5. Bapak Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T., selaku ketua jurusan kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

6. Bapak Prof. Warsito, S.Si., DEA, Ph.D. selaku Dekan Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

7. Bapak Andi Setiawan, Ph.D., Selaku dosen yang telah membantu dan

membimbing penulis.

8. Kedua orang tuaku, Rolly P. dan Ayen untuk setiap motivasi, dukungan,

semangat, nasihat dan doa yang terus diberikan kepada penulis serta dana

selama penulis menyelesaikan studi.

9. Bapak Ir. Yohanes C. Ginting, M.P. dan Ibu Suyati atas semua bantuan secara

materi dan moril kepada penulis selama ini.

10. Sahabat baik, Ivan H. Aritonang, S.Si., yang telah banyak membantu penulis

dalam berbagai hal serta kebersamaan, motivasi, dukungan sampai penulis

dapat menyelesaikan skripsi ini, selalu sukses dan terus maju, God Bless You.

11. Sahabat-sahabat dekat grup diskusi, kak Yuridhani Rahman, S.H., Devi

Kathina Rani, S.Kom., Yusuf, S.E., Christin Dian P. (CDP), Dimas A. Y.

Pratama dan Ananda atas kebersamaan yang sudah terjalin sampai sekarang,

canda, tawa, keceriaan dan motivasi sehingga penulis dapat menyelesaikan

skripsi ini.

12. Jelita Purnamasari S., S.Si. dan kak Juliana Mariana, S.E. atas kebersamaan,

dukungan, semangat dan motivasi yang telah diberikan kepada penulis.

13. Teman-teman dekat sehobi, Ari A., Asyiva A., Yosie Aulianissa, Husna

Nabila Z., Fendy H., Gunawan W., Hershintayati P., Fenda, Rega R., Divka

Ayu D., Erica, Yulius atas kebersamaan, keceriaan dan dukungan kepada

penulis.

14. Sahabat-Sahabat dekat, ko Henry T., Onny (Oni-chan), Isyraf Almar, A.Md.

atas kebersamaan, keceriaan, dukungan sampai sekarang kepada penulis

hingga skripsi ini selesai.

15. Kakak tingkatku, cece Chintia Yolanda, S.Si. dan kak Nur Robiah S.Si. atas

bimbingan, arahan, dukungan, motivasi dan kebersamaan yang sudah terjalin

serta kak Putri Amalia, M.Si. yang telah memberikan bantuan sampai skripsi

ini dapat diselesaikan.

16. Anggota Peer Group Biokimia, Febri Windi Asmoro, S.Si., partner yang

sabar dan banyak memberi bantuan kepada penulis. Peer Group Biokimia

2012, Erlita Aisyah, S.Si., Maria Ulfa, S.Si., Ruwaidah Muliana, S.Si., adik-

adik yang telah banyak membantu, memberi dukungan, motivasi kepada

penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. Ajeng A. Miranti, S.Si., Ayu

Berliana, S.Si., Azies N. Dwiyansyah, Aprilia Isma Denila, S.Si., Ana

Febrianti Wulandari, S.Si. dan Uswatun Hasanah, S.Si. yang memberikan

bantuan dan dukungan kepada penulis.

17. Teman-teman Laboratorium Biopolimer, kak Raffel Stevano, M.Si., pak Iip

Sugiharta, M.Si., Ramos Vicher, S.Si., Sofian Sumilat Rizki, S.Si., Arya

Rifansyah, S.Si., Edi Suryadi, S.Si. dan Suwarda Dua Imatu Dela, S.Si. atas

dukungan, motivasi dan kebersamaan yang sudah terjalin selama ini.

18. Teman-teman POM MIPA, bang Aventus Pande Samosir, bang Nando P.

Siagian, S.Si., bang Berry Sinaga, S.Si., kak Riri Napitupulu S.Si., serta adik-

adik POM MIPA atas dukungan, semangat dan kebersamaan yang telah

terjalin selama ini

19. Teman-teman Cheven (Chemistry Eleven), Ajeng Ayu Miranti, S.Si., Ana

Febrianti Wulandari, S.Si., Anggino Saputra, S.Si., Aprilia Isma Denila, S.Si.,

Ari Susanto, Arik Irawan, Asti Nurul Aini, S.Si., Ayu Berliana, S.Si., Ayu

Fitriani, S.Si., Azies Nur Dwiyansyah, Cindy Moyna Clara L.A., S.Si.,

Daniar Febriliani P., S.Si., Dewi Karlina, S.Si., Dia Tamara, S.Si., Endah

Pratiwi, S.Si., Eva Dewi Noviyanthi Sirait, S.Si., Fatimah Milasari, S.Si.,

Fatma Maharani, S.Si., Febri Windi Asmoro, S.Si., Frederica Giofany T.S.,

S.Si., Irkham Bariklana, Ivan Halomoan, S.Si., Jelita Purnamasari

Saroinsong, S.Si., Jelita Siahaan, S.Si., Junaidi Permana, S.Si., Lewi Puji

Lestari Meratandani, S.Si., Lusi Meliyana S.Si., Mardian Bagus Saputra,

S.Si., Mega Suci Hanifa Putri, S.Si., Melli Novita Windiyani, S.Si., Melly

Antika, S.Si., Miftahur Rahman, S.Si., Mirfat Salim Abdat, S.Si., M. Andri

Nosya, S.Si., M. Yusry Ahmadhani, Nico Mei Chandra, S.Si., Nira Dwi

Puspita, S.Si., Nopitasari, S.Si., Pandegani Paratmadja, Ramos Vicher, S.Si.,

Ridho Nahrowi, S.Si., Rina Wijayanti, S.Si., Rio Febriansyah, Rio

Wicaksono, S.Si., Sanjaya Yudha Gautama, S.Si., Umi Fadilah, S.Si.,

Uswatun Hasanah, S.Si., Vevi Aristiani, S.Si., Wagiran, S.Si., Yulia Ningsih

S.Si., Yunia Hartina, S.Si. atas kebersamaan dan persaudaraan yang terjalin

selama menempuh studi di Universitas Lampung.

20. Teman-teman KKN di Desa Aji Jaya, Mesuji atas kebersamaannya selama 39

hari.

21. Keluarga GKPB MDC Bandar Lampung khususnya Kesan Citra Garden

(Kesan Teluk) atas kebersamaan, doa, semangat dan motivasi yang telah

diberikan kepada penulis.

22. Seluruh staf jurusan kimia yang telah membantu penulis.

23. Seluruh staf GSG pahoman yang telah membantu penulis.

24. Keluarga besar kimia angkatan 2008, 2009, 2010, 2012, 2013, 2014 dan

2015.

25. Seluruh pihak yang telah membantu penulis sampai terselesaikannya skripsi

ini yang tidak dapat disebutkan satu per satu.

Semoga Tuhan selalu memberikan yang terbaik dan membalas segala kebaikan

yang telah diberikan kepada penulis. Mohon maaf jika masih terdapat kekurangan

dalam penulisan skripsi ini. Tetapi, penulis berharap agar skripsi ini bermanfaat

bagi penulis secara pribadi dan orang lain yang membaca.

Bandar lampung, November 2016

Penulis

J. Julianser Nicho

DAFTAR ISI

HalamanLEMBAR PENGESAHAN ..................................................................... i

DAFTAR ISI............................................................................................ ii

DAFTAR TABEL .................................................................................. iv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................... v

I. PENDAHULUANA. Latar Belakang............................................................................ 1B. Tujuan Penelitian ........................................................................ 4C. Manfaat Penelitian ..................................................................... 4

II. TINJAUAN PUSTAKAA. Kitin dan Kitosan ....................................................................... 5B. Glukosamin ................................................................................ 8C. Enzim .......................................................................................... 9D. Enzim Kitinase.......................................................................... 13

1. Sumber Kitinase ............................................................... 142. Klasifikasi Kitinase .......................................................... 163. Aplikasi Kitinase .............................................................. 19

E. Enzim Kitin Deasetilase ............................................................ 19F. Jamur Mucor miehei .................................................................. 22G. Fermentasi................................................................................. 23

1. Pengertian Fermentasi ...................................................... 232. Klasifikasi Fermentasi...................................................... 243. Fermentasi Sistem Batch .................................................. 27

H. Fourier Transformed Infra Red (FTIR).................................... 28I. Spektrofotometer UV-Vis .......................................................... 31

III. METODOLOGI PENELITIANA. Waktu dan Tempat ................................................................... 37B. Alat dan Bahan ......................................................................... 37C. Prosedur Penelitian .................................................................. 38

1. Pembuatan Kitin............................................................... 38a) Preparasi Sampel.................................................... 38

iii

b) Deproteinasi ........................................................... 38c) Demineralisasi........................................................ 39

2. Karakterisasi Kitin dengan FTIR ..................................... 393. Persiapan Isolat Mucor miehei ......................................... 40

a) Pembuatan Potato Extract ..................................... 40b) Media PDA (Potato Dextrose Agar) dan

Pertumbuhan Mucor miehei pada Media PDA ...... 40c) Media PDL (Potato Dextrose Liquid) dan

Pertumbuhan Mucor miehei pada Media PDL....... 404. Larutan Buffer Sitrat pH 4................................................ 415. Pembuatan Media Inokulum Mucor miehei ..................... 416. Fermentasi Cair Tertutup (Batch) .................................... 427. Analisis Glukosamin dengan Spektrofotometer UV-Vis . 43

a) Pembuatan Blanko ................................................. 43b) Pembuatan Standar Glukosamin ............................ 43c) Pembuatan Kurva Standar Glukosamin ................. 44d) Pembuatan Sampel Glukosamin ............................ 44e) Analisis Kadar Glukosamin ................................... 44

IV. HASIL DAN PEMBAHASANA. Pembuatan Kitin ....................................................................... 46

1. Deproteinasi ..................................................................... 462. Demineralisasi .................................................................. 47

B. Karakterisasi Kitin dengan FTIR .............................................. 49C. Fermentasi Kitin dengan Mucor miehei.................................... 51D. Analisis Glukosamin dengan Spektrofotometer UV-Vis ......... 56

V. SIMPULAN DAN SARANA. Simpulan ................................................................................... 62B. Saran.......................................................................................... 62

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................ 63

LAMPIRAN........................................................................................... 71

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman1. Perbedaan Fermentasi Solid-state dan Fermentasi Submerged ....... 27

2. Frekuensi Inframerah pada Beberapa Jenis Ikatan .......................... 30

3. Hasil Fermentasi .............................................................................. 73

4. Absorbansi Larutan Glukosamin Standar ........................................ 74

5. Absorbansi Larutan Glukosamin Hasil Fermentasi ......................... 74

6. Konsentrasi Terukur Glukosamin Hasil Fermentasi........................ 75

7. Jumlah Bobot Glukosamin Hasil Fermentasi................................... 76

8. Persentase Kadar Glukosamin Hasil Fermentasi ............................. 77

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman1. Struktur Kitin ..................................................................................... 5

2. Struktur Kitosan ................................................................................. 7

3. Struktur Glukosamin.......................................................................... 8

4. Reaksi Kitin dengan Enzim Eksokitinase ....................................... 16

5. Reaksi Kitin dengan Enzim Endokitinase........................................ 17

6. Reaksi Diasetilkitobiose, Kitotriose, Kitotetraose dengan Enzimβ-1,4-N-asetilglukosamidase ........................................................... 17

7. Jamur Mucor miehei ........................................................................ 23

8. Alat Spektrofotometer UV-Vis ........................................................ 32

9. Skema Alat Spektrofotometer UV-Vis ............................................ 33

10. Filtrat Hasil Deproteinasi ................................................................. 47

11. Filtrat Hasil Demineralisasi ............................................................. 48

12. Kitin Hasil Isolasi ............................................................................ 49

13. Spektrum IR Kitin Hasil Isolasi ....................................................... 50

14. Spektrum IR Kitin Standar............................................................... 51

15. Grafik Hasil Fermentasi (Berat Glukosamin vs Waktu Inkubasi) ... 53

16. Glukosamin Hasil Fermentasi .......................................................... 55

17. Reaksi antara Glukosamin dengan Ninhidrin .................................. 56

18. Kurva Standar Glukosamin.............................................................. 58

vi

19. Grafik Kadar Glukosamin Berbanding Waktu Inkubasi.................. 59

20. Kurva Pertumbuhan Fungi ............................................................... 60

21. Isolat Mucor miehei dengan Media PDA......................................... 78

22. Isolat Mucor miehei dengan Media PDL ......................................... 78

23. Media Inokulum Mucor miehei ....................................................... 78

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Polimer sudah menarik banyak perhatian dikarenakan berbagai manfaatnya

yang membantu kehidupan manusia, contohnya plastik yang digunakan sebagai

plastik kemasan. Plastik termasuk jenis polimer sintentik. Selain itu, terdapat

juga jenis polimer berasal dari alam yang mempunyai banyak fungsi. Contoh

polimer alam yang saat ini sudah banyak diteliti adalah kitin.

Kitin banyak ditemukan pada kulit dari udang, cumi-cumi, kepiting dan

golongan crustaceae lainnya. Udang memiliki kandungan kitin yang cukup

tinggi pada kulitnya sekitar 25-30% (Kurniasih dan Dwiasi, 2007). Di

Indonesia, limbah kulit udang sangat berlimpah dan menimbulkan dampak

negatif seperti pencemaran lingkungan. Limbah kulit udang ini mencemari

banyak perairan yang menyebabkan biota air mati. Pemanfaatan limbah yang

kurang baik mengakibatkan pencemaran yang berkepanjangan. Masyarakat

hanya memanfaatkan sebagian kecil limbah kulit udang sebagai penambah cita

rasa pada kerupuk dan terasi. Hal ini perlu penanganan lebih serius untuk

mengurangi dampak tersebut dengan cara mengonversi kulit udang menjadi

kitin dan turunannya (Arif dkk., 2013).

2

Kitin merupakan polisakarida yang terbuat dari unit N-asetil-D-glukosamin dan

dihubungkan oleh ikatan β-1,4 dan biopolimer yang paling berlimpah di bumi

setelah selulosa (Uno et al., 2012). Kitin dapat didegradasi menjadi produk

turunannya seperti kitosan dan glukosamin yang diketahui bahwa glukosamin

memiliki fungsi untuk mencegah pergeseran struktur tulang persendian pada

manusia yang terkena penyakit osteoarthritis (Sitanggang et al., 2012).

Degradasi kitin dapat dilakukan dengan dua metode yaitu secara konvensional

menggunakan zat kimia atau juga dapat dilakukan secara enzimatik. Metode

secara enzimatik lebih sering digunakan karena lebih ramah lingkungan

dibandingkan dengan metode konvensional. Enzim yang digunakan untuk

mendegradasi kitin adalah enzim kitinase dan enzim kitin deasetilase.

Enzim kitinase adalah enzim yang mampu menghidrolisis polimer linier kitin

yang terdiri atas N-asetilglukosamin dengan ikatan β-1,4 (Arakane dan

Muthukrishnan, 2010). Enzim ini termasuk kelompok enzim hidrolase yang

secara langsung dapat mendegradasi kitin menjadi produk yang berat

molekulnya rendah (Noviendri dkk., 2008). Sedangkan enzim kitin deasetilase

adalah enzim yang dapat mendeasetilasi homopolimer N-asetilglukosamin

dengan ikatan β-1,4 membentuk kitosan yang termasuk polimer dari residu D-

glukosamin ikatan β-1,4 (Dixit et al., 2008). Kedua enzim ini memiliki

aktivitas kitinolitik yang mampu mengonversi kitin menjadi produk

turunannya. Kombinasi dari enzim kitinase dan kitin deasetilase mampu

menghasilkan glukosamin sebagai produk. Enzim-enzim ini dapat ditemukan

pada berbagai sumber seperti bakteri, ragi, tanaman, fungi, dan lain-lain

3

(Bhattacharya et al., 2007). Pada penelitian ini, sumber yang digunakan untuk

menghasilkan enzim kitinase dan enzim kitin deasetilase yaitu fungi.

Fungi yang digunakan termasuk ke dalam ordo Mucorales dengan genus

Mucor. Diketahui bahwa spesies Mucor memiliki sistem enzim kitinolitik yang

dapat membantu hidrolisis kitin seperti enzim kitinase (Inokuma et al., 2013).

Mucor banyak tumbuh di tanah dan serasah tumbuhan secara saprotrop dan

berkembang biak secara aseksual. Spesies Mucor miehei mampu menghasilkan

enzim yang dapat mendegradasi kitin sehingga terbentuk produk turunannya

yaitu glukosamin (Hendri, 2013). Win dan Stevens (2001) melaporkan bahwa

enzim dari spesies Mucor rouxii tidak efektif dalam mendeasetilasi kitin

menjadi produk turunannya sehingga pada penelitian ini digunakan Mucor

miehei untuk membentuk produk turunan kitin dengan kondisi yang sudah

diatur.

Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Yolanda (2014), yaitu

penetapan inkubasi optimum degradasi kitin secara enzimatik oleh Mucor

miehei dengan metode ultraviolet-visible spectrophotometry didapat

glukosamin dengan rendemen 90% sejak 24 jam waktu fermentasi selama 7

hari dengan kemurnian 97% yang diukur pada hari keempat. Hal ini

menunjukkan rendemen dan kemurnian yang didapatkan cukup baik dalam

waktu yang singkat tetapi perlu penelitian lebih lanjut untuk melihat hasil yang

diperoleh jika waktu lebih diperpendek.

Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk menentukan waktu optimum

aktivitas enzim kitinase dan enzim kitin deasetilase dalam mendegradasi kitin

4

dengan waktu fermentasi setiap 1, 2, 3, 4, 8, 12, dan 24 jam. Perlakuan ini

dicoba untuk mengetahui waktu kinerja enzim yang optimum serta rendemen

dan kemurnian glukosamin yang dihasilkan. Selanjutnya, kadar glukosamin

hasil fermentasi dan rendemennya akan dianalisis menggunakan

spektrofotometer UV-Vis.

B. Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dilakukannya penelitian ini adalah

1. Mempelajari aktivitas enzim kitinase dan kitin deasetilase dari Mucor

miehei dalam mendegradasi kitin dengan waktu setiap 1, 2, 3, 4, 8, 12, dan

24 jam fermentasi.

2. Mengetahui jumlah glukosamin dan kemurnian yang terbentuk dalam

waktu setiap 1, 2, 3, 4, 8, 12, dan 24 jam fermentasi menggunakan metode

spektrofotometri UV-Vis.

C. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang waktu aktivitas

enzim kitinase dan kitin deasetilase dari Mucor miehei yang efektif dalam

mendegradasi kitin dengan waktu 1, 2, 3, 4, 8, 12 dan 24 jam fermentasi dan

kadar glukosamin yang diperoleh dari substrat kitin dengan waktu fermentasi

yang singkat.

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Kitin dan Kitosan

Nama kitin diturunkan dari bahasa yunani dari kata ‘chiton’ yang artinya coat

of mail, dan untuk pertama kalinya digunakan secara nyata oleh Bradconnot

tahun 1881. Kitin termasuk biopolimer yang paling berlimpah di bumi setelah

selulosa dan glikan dengan ikatan β(1-4), dan tersusun atas 2-asetamida-2-

deoksi-β-D-glukosa atau yang sering disebut N-asetilglukosamin (Shahidi et

al., 1999). Berikut struktur dari kitin pada Gambar 1.

Gambar 1. Struktur kitin (Nelson et al., 2004)

Kitin yang merupakan komponen utama terbesar dalam cangkang udang,

kepiting, tulang muda cumi-cumi, dan kulit terluar dari serangga, juga terjadi

sebagai komponen struktural yang berbentuk kristalin mikrofibril dalam rangka

luar dari arthropoda atau dinding sel fungi dan ragi. Kitin juga diekstraksi dari

6

sejumlah makhluk hidup yang lain pada tanaman kelas bawah dan kingdom

hewan (Abdulkarim et al., 2013).

Sifat fisik kitin adalah berbentuk kristal dengan warna putih, tidak berasa, dan

tidak berbau, sedangkan sifat kimia kitin adalah tidak dapat larut oleh pelarut

alkohol, heksana, aseton serta dalam asam atau basa encer dan pekat,

contohnya HCl, HNO3, H2SO4 tetapi larut dalam asam-asam kuat seperti N,N-

diasetamida dan fluoroalkohol. Kelarutan kitin dipengaruhi oleh berat molekul,

kelengkapan gugus asetil, sumbernya, dan pemakaian metode isolasi (Savitri,

2010; Kurniasih dan Dwiasi, 2007).

Isolasi kitin dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kimia atau

fermentasi. Secara kimiawi, digunakan larutan NaOH pekat 40-50% pada suhu

115°C. Pada metode fermentasi digunakan mikroba yang dapat menghasilkan

suatu enzim tertentu yang dapat mengubah kitin menjadi turunannya. Isolasi

kitin secara fermentasi disebut metode pengganti metode konvensional yang

menyebabkan masalah lingkungan (Hendri, 2013).

Kitosan adalah senyawa polimer alam yang strukturnya lurus dan disusun oleh

monomer-monomer N-glukosamin dengan jumlah 2000-3000 unit dan

dihubungkan dengan ikatan β-(1,4) glikosidik. Kitosan dapat diperoleh dengan

proses deasetilasi kitin menggunakan larutan NaOH atau KOH (Hendri, 2013).

Struktur kitosan ditunjukkan pada Gambar 2.

7

Gambar 2. Struktur Kitosan

Kitosan dapat diisolasi dengan cara membuat kitin terlebih dahulu lalu

dihilangkan gugus asetil pada kitin menjadi gugus amina menggunakan basa

kuat. Proses deasetilasinya menggunakan larutan NaOH 40-60% dengan suhu

diatas 100°C, Ini disebabkan struktur kitin yang panjang dan ikatan kuat yang

terjadi antara ion nitrogen dan gugus asetil (Pramudita, 2013).

Sifat-sifat kitosan diantaranya tidak larut dalam air, tetapi dapat larut dalam

larutan asam organik seperti asam format, asam asetat, dan asam sitrat

(Mekawati dkk, 2000). Kitosan juga tidak larut dalam basa kuat, asam mineral,

dan beberapa pelarut organik (alkohol, aseton, dimetil formamida, dan dimetil

sulfoksida) (Hendri, 2013). Kitosan dapat larut dalam larutan asam organik

dengan kondisi pH dibawah 6. Rendahnya nilai pH membuat kelarutan kitosan

meningkat. Sebaliknya, meningkatnya nilai pH akan terbentuk polimer yang

tidak larut dan bermuatan netral yang diakibatkan gugus amino kitosan

mengalami deprotonasi (Zhang et al., 2004).

Kitin dan turunannya mempunyai beberapa aplikasi dalam banyak bidang

termasuk biomedikal, makanan, agen pengemulsi, pengolahan limbah air,

biokatalis, agrikultur, tekstil, dan juga industri kertas (Isa et al., 2012).

8

B. Glukosamin

Glukosamin (2-amino-2-deoksi-D-glukosa) adalah monosakarida amino yang

merupakan komponen esensial dari mukopolisakarida dan kitin (Anderson et

al., 2005) serta menjadi prekursor penting untuk beberapa molekul yang akan

dibiosintesis, termasuk glikoprotein, glikolipid, proteoglikan, dan

glukosaminoglikan (mukopolisakarida) (Purnomo dkk, 2012). Berikut struktur

glukosamin ditunjukkan pada Gambar 3.

Gambar 3. Struktur Glukosamin

Sumber alami dari glukosamin dapat ditemukan pada limbah dari cangkang

crustaceae seperti udang, kepiting, dan lobster (Sitanggang et al., 2012).

Secara struktural, glukosamin adalah molekul gula amino dengan rumus kimia

C6H13NO5 HCl dan massa molekulnya 215,63 Da. Glukosamin murni

berbentuk kristal putih dengan titik leleh 190-194ºC. Glukosamin sangat

mudah larut dalam air, dengan kelarutan 100 mg/ml pada 20ºC. Glukosamin

dapat diekstraksi dengan berbagai cara yang berbeda-beda, termasuk hidrolisis

secara kimia, proses enzimatik, fermentasi, dan kombinasi beberapa metode-

metode ini (Cahyono dkk, 2014). Sekarang ini pembuatan glukosamin sering

dilakukan dengan cara hidrolisis dan deasetilasi eksoskeleton kerang, kepiting

9

yang kulitnya mengandung kitin dengan menggunakan asam klorida pekat

(Mojarrad et al., 2007). Tetapi, pembuatan glukosamin menggunakan metode

ini memiliki beberapa kekurangan, yaitu kontaminasi logam berat,

menyebabkan alergi, produksi yang bersifat musiman serta faktor yang

menyebabkan penurunan sumber daya laut dunia (Purnomo dkk, 2012). Karena

kelemahan ini, produksi glukosamin dilakukan dengan sistem menggunakan

mikroba, sumber utama untuk produksi alternatif glukosamin adalah bakteri

dan fungi. Bakteri yang digunakan untuk produksi glukosamin adalah E. Coli

(Deng et al., 2005) sedangkan fungi yang digunakan umumnya adalah

Aspergillus, Rhizopus, dan Mucor dengan metode fermentasi (Sitanggang et

al., 2012).

Aplikasi dari glukosamin sangat luas seperti biomedikal, makanan, dan

industri-industri kosmetik. Glukosamin juga telah digunakan untuk mengatasi

gejala-gejala osteoarthritis pada manusia karena glukosamin ada di dalam

tulang rawan sebagai komponen dari glukosaminoglikan dan menunjukkan

efek modifikasi gejala osteoarthritis dengan menormalkan metabolisme tulang

rawan (Liu et al., 2013). Selain itu, glukosamin juga sebagai makromolekul

yang berperan dalam sintesis membran lapisan sel, osteoid, tulang matriks, dan

kolagen dan juga diperlukan untuk membentuk agen perlindungan dan cairan

pelumas (Purnomo dkk, 2012).

C. Enzim

Enzim merupakan katalisator yang termasuk ke dalam golongan protein yang

membantu reaksi-reaksi kimia pada sistem biologis. Katalisator berfungsi

10

untuk mempercepat reaksi kimia. Walaupun dalam reaksi kimia katalisator ini

ikut bereaksi, ia akan kembali ke keadaan awal bila reaksi yang berlangsung

telah selesai (Indah, 2004). Secara biokimia, enzim memiliki peran yang sangat

penting dalam proses aktivitas biologis. Di dalam sel, enzim bertugas sebagai

katalisator dan sifatnya khas. Umumnya, kerja enzim menurunkan energi

aktivasi untuk mempercepat reaksi (Wibisono, 2010). Penamaan untuk enzim

kebanyakan diberi penambahan akhiran –ase pada kata yang menunjukkan

pengubahan senyawa asal oleh enzim atau pada nama jenis reaksi kimia

dimana enzim mengkatalisis reaksi tersebut.

Pengklasifikasian enzim diusulkan oleh The International Union of

Biochemistry pada tahun 1956 beserta nomenklaturnya. Usulan resmi pada

tahun 1961, Penamaan tersebut prinsipnya berdasarkan tipe reaksi yang

dikatalisis dan enzim terbagi menjadi enam golongan utama, yaitu

a. Oksidoreduktase

Enzim oksidoreduktase adalah enzim yang mampu untuk mengkatalisis

reaksi oksidasi atau reduksi suatu bahan. Contoh enzim dari golongan ini

adalah oksidase dan dehidrogenase.

b. Transferase

Enzim transferase adalah enzim yang bekerja dalam reaksi pemindahan

(transfer) suatu gugus atau radikal. Contoh enzim dalam golongan ini adalah

transfosforilase, transaminase, dan lain-lain.

11

c. Hidrolase

Enzim hidrolase adalah enzim yang mengkatalis reaksi hidrolisis suatu

pemecahan substrat yang dibantu dengan molekul air, enzim pada golongan

ini sangat penting pada pengolahan makanan. Contoh enzim dari golongan

ini adalah lipase, glikosidase, selulase, dan lain-lain.

d. Enzim liase

Enzim liase merupakan enzim yang bekerja aktif untuk memecah ikatan C-

C dan C-O dan tidak menggunakan molekul air. Contoh enzim dari

golongan ini adalah enzim dekarboksilase.

e. Isomerase

Enzim isomerase merupakan enzim yang mengkatalisis suatu reaksi dengan

merubah konfigurasi molekul substrat dan menghasilkan produk isomer dari

substrat tersebut atau produk dari perubahan isomer posisinya. Contoh

enzim dari golongan ini adalah fosfoheksosa isomerase.

f. Ligase

Enzim ligase merupakan enzim yang bertindak sebagai katalisator untuk

membentuk ikatan-ikatan tertentu, contohnya pada pembentukkan ikatan C-

O, C-C, dan C-S dalam biosintesis ko-enzim A (Siregar, 2012).

Enzim memiliki sifat-sifat yang khas, salah satunya adalah spesifitas, terdapat

beratus-ratus enzim yang mempunyai kekhasannya tersendiri. Maksudnya

12

adalah suatu enzim hanya mampu mengkatalis untuk tidak semua reaksi

melainkan hanya untuk beberapa reaksi saja. Beberapa enzim juga bisa

memiliki sifat khusus untuk suatu kelompok substrat, sehingga dapat dikatakan

bahwa enzim sifatnya sangat spesifik dalam mengkatalisis suatu reaksi. Selain

itu, sifat kerja enzim dipengaruhi oleh pH dan suhu karena enzim bekerja

secara optimum jika pH dan suhu yang dipakai sesuai serta enzim juga

memerlukan kofaktor dan aktivator sebagai komponen yang mengaktifkan

kerjanya.

Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor-faktor diantaranya adalah

a. Suhu enzim

Umumnya suhu akan mempengaruhi reaksi kimia, begitu juga dengan

katalis enzim. Pada suhu rendah reaksi kimia yang terjadi akan berlangsung

lambat. Sebaliknya, pada suhu tinggi reaksi kimia akan berlangsung cepat.

Tetapi, karena enzim adalah golongan protein, maka dengan suhu yang

tinggi menyebabkan terjadinya denaturasi pada enzim.

Naiknya temperatur sebelum terjadinya denaturasi membuat kecepatan

reaksi meningkat. Namun dengan naiknya temperatur pada saat proses

denaturasi dimulai akan mengurangi kecepatan reaksi. Kebanyakan enzim

akan mudah terdenaturasi pada temperatur 60°C.

13

b. Nilai pH

Nilai pH juga mempengaruhi kerja enzim karena pH rendah atau pH tinggi

dapat mengakibatkan terjadinya denaturasi dan aktivitas enzim akan

menurun. Setiap enzim mempunyai nilai pH optimumnya masing-masing

yang tergantung pada jenis enzim dan substratnya.

c. Konsentrasi substrat

Berdasarkan hasil eksperimen, konsentrasi enzim yang tetap dengan adanya

kenaikkan konsentrasi substrat akan meningkatkan kecepatan reaksi. Tetapi,

kecepatan reaksi tidak mengalami kenaikan walaupun konsentrasi substrat

ditambah pada batas konsentrasi tertentu (didasari pada persamaan

Michaelis-Menten).

d. Konsentrasi enzim

Kecepatan suatu reaksi enzimatis tergantung pada konsentrasi enzim. Pada

suatu konsentrasi substrat tertentu, bertambahnya konsentrasi enzim akan

menyebabkan bertambahnya kecepatan reaksi (Nst, 2012).

D. Enzim Kitinase

Kitinase adalah enzim glikosil hidrolase yang mengkatalisis degradasi senyawa

polimer N-asetilglukosamin dengan ikatan linier β-1,4 atau yang disebut

dengan kitin (Herdyastuti dkk, 2009). Mekanisme dari kerja enzim kitinase

adalah hidrolisis kitin pada limbah kulit udang dan jamur patogen, yang

14

berkaitan dengan adanya kitin pada limbah kulit udang dan dinding sel jamur

yang dapat dipakai oleh enzim kitinase sebagai substratnya (Natsir dkk, 2012).

1. Sumber Kitinase

Sumber penghasil kitinase dapat disintesis dari berbagai organisme termasuk

virus, bakteri, jamur, serangga, tumbuh-tumbuhan kelas atas, dan mamalia.

Kebanyakan organisme (bakteri, tumbuh-tumbuhan, dan serangga) mempunyai

famili kitinase yang luas dengan fungsi yang berbeda-beda, termasuk

pencernaan, perlindungan terhadap patogen, pergantian kutikula, dan

penurunan sel. Sumber penghasil enzim kitinase adalah sebagai berikut:

a. Pada tanaman, kitinase diproduksi sebagai patogenesis mirip protein yang

ditimbulkan oleh serangan pitopatogen dan memberikan tanaman tersebut

kemampuan perlindungan diri terhadap patogen. Kitinase pada tanaman

umumnya endokitinase yang berat molekulnya lebih kecil dari kitinase yang

terdapat pada serangga. Rentang ukurannya dari 25-40 kDa.

b. Pada serangga, kitinase atau kitinase yang mirip protein telah ditemukan

pada semua spesies serangga yang mempunyai tipe berbeda termasuk

dipteran, lepidopteran, coleopteran, hemipteran, dan hymnoteran. Produksi

enzim pada serangga diatur oleh hormon selama transformasi larva. Enzim

ini memainkan peranan penting sebagai enzim pendegradasi selama ekdisis,

dimana kutikula didegradasi ke kitooligosakarida oleh endokitinase, yang

dihidrolisis lebih jauh oleh eksoenzim ke N-asetil-glukosamin. Kemudian

15

ditutupi dengan mensintesis kutikula baru. Berat molekul dari kitinase ini

rentangnya dari 40-85 kDa.

c. Pada mamalia, semua kitinase pada mamalia yang diketahui termasuk ke

dalam family GH18 dan lebih jauh dibagi lagi sebagai kitinase yang nyata

dengan aktivitas kitinolitik dan kitinase seperti protein yang hanya memiliki

kemampuan ikatan kitin tanpa aktivitas enzimatik. Kitotriosidase adalah

kitinase pada manusia yang pertama kali diidentifikasi yang diproduksi oleh

makrofag pada pasien Gaucher dan mempunyai sifat antijamur, kemudian

diusulkan bahwa enzim ini dapat dilibatkan untuk pertahanan terhadap kitin

yang mengandung patogen.

d. Pada mikroorganisme, kitinase secara luas terdistribusi pada bakteri seperti

Chromobacterium, Clostridium, Vibrio, Bacillus, Actinomycetes, etc.

produksi enzim kitinolitik telah diidentifikasi pada berbagai Streptomyces

sp., termasuk S. antibioticus, S. Griseus, S. plicatus, etc. Ragi dan jamur

yang mirip ragi mempunyai jumlah kitinase yang rendah. Gen-gen kitinase

yang telah diidentifikasi terdapat pada saccharomyces cerevisiae, Candida

albicans, Kluyveromyces lactis, etc. Kitinase ditemukan pada jamur

berfilamen termasuk Trichoderma, Penicillium, Mucor, Neurospora,

Aspergillus, etc (Karthik et al., 2014).

Mikroorganisme kitinolitik mampu menghasilkan enzim kitinase yang

potensinya cukup tinggi untuk mendegradasi limbah yang mengandung kitin,

dengan enzim kitinase dapat membuat limbah yang mengandung kitin

dikonversi menjadi bahan yang lebih bermanfaat (Muharni, 2009).

16

2. Klasifikasi Kitinase

Penggolongan kitinase berdasarkan cara kerja dalam mendegradasi kitin dibagi

menjadi tiga tipe, yaitu

a. Eksokitinase (nomor entry dalam Enzyme Nomenclature) adalah enzim yang

secara aktif mengkatalisis reaksi pembebasan unit-unit diasetilkitobiose

tanpa terbentuknya unit monosakarida atau oligosakarida. Enzim ini hanya

memotong ujung nonreduksi mikrofibril secara tidak acak. Reaksi

eksokitinase ditunjukkan pada Gambar 4.

Gambar 4. Reaksi kitin dengan enzim eksokitinase

b. Endokitinase (EC. 3.2.1.14) adalah enzim yang bekerja dengan cara

memotong acak ikatan β-1,4 bagian internal mikrofibril kitin. Oligomer

pendek N-asetilglukosamin merupakan produk akhir yang terbentuk setelah

pemotongan dengan berat molekul yang rendah seperti kitotriose, kitotetrose

yang didominasi oleh diasetilkitobiose. Produk yang terbentuk bersifat

mudah larut dalam air. Reaksi endokitinase ditunjukkan pada Gambar 5.

17

Gambar 5. Reaksi kitin dengan enzim Endokitinase

c. β-1,4-N-asetilglukosamidase (EC. 3.2.1.30) adalah enzim kitinolitik

penghasil monomer-monomer GlcNAc yang bekerja dengan cara memutus

diasetilkitobiose, kitotriose dan kitotetraose. Reaksi β-1,4-N-

asetilglukosamidase ditunjukkan pada Gambar 6. (Dewi, 2008).

Gambar 6. Reaksi diasetilkitobiose, kitotriose, kitotetraose dengan enzim β-1,4-asetilglukosamidase

18

Penggolongan kitinase berdasarkan homolog sekuen asam aminonya dibagi

menjadi tiga tipe, yaitu

a. Famili 18

Famili 18 mempunyai tiga sub famili yaitu A, B, dan C. Famili 18 termasuk

kitinase yang didapatkan dari virus, bakteri, jamur, dan hewan. Kelas III dan

V, kitinase berasal dari tumbuh-tumbuhan.

b. Famili 19

Kelas I, II, dan IV berada pada family 19 yang juga berasal dari tumbuhan.

Kitinase yang dikeluarkan oleh tanaman digunakan untuk mempertahankan

diri dari serangan patogen. Kitinase kelas IV untuk family 19 tersebar pada

tanaman dan ditemukan juga pada mikroorganisme Streptomyces sp.

Kitinase pada tanaman kelas I dan II memiliki struktur homolog, tetapi

kitinase kelas II berbeda dari kitinase kelas I karena tidak memiliki domain

yang kaya akan cystein. Untuk kitinase kelas III dan V tidak memiliki

kesamaan dengan kitinase pada kelas I, II, IV (Rostinawati, 2008).

c. Famili 20

Kitinase pada famili ini berasal dari Vibrio harveyi (N-

asetilglukosaminidase), Dictyostelum discoideum, dan juga ditemukan pada

manusia (N-asetilheksosaminidase) (Patil et al., 2000).

19

3. Aplikasi Kitinase

Kitinase umumnya banyak digunakan untuk biokontrol hama tanaman dan juga

digunakan industri-industri yang mengolah limbah yang mengandung kitin,

contohnya pabrik pembekuan kepiting, udang, dan kerang. Limbah cangkang

udang yang dihasilkan oleh pabrik pembekuan akan menimbulkan pencemaran

lingkungan. Dengan enzim kitinase, membuat limbah yang mengandung kitin

dapat diuraikan dan tidak menimbulkan pencemaran. Pada bidang pertanian,

kitinase berfungsi sebagai agen biokontrol pada serangga dan fungi patogen

yang dinding selnya mengandung komponen kitin. Kitinase berperan dalam

proses pembunuhan larva dengan mendegradasi dan melisiskan dinding sel

kulit larva cacing. Pada tanaman, enzim kitinase disemprotkan langsung pada

daun dan buahnya. Setelah diamati, terbukti ditunjukkan pada tanaman

strawberry yang menunjukkan tidak ada hama serangga ataupun fungi patogen

(Pratiwi, 2014). Pada bidang medis, kitinase banyak digunakan untuk berbagai

penyakit yang disebabkan oleh jamur (Muharni, 2009).

E. Enzim Kitin Deasetilase

Kitin deasetilase termasuk ke dalam enzim yang berperan dalam mengubah

kitin menjadi turunannya yang lebih bermanfaat secara enzimatis yaitu

mengkonversi kitin menjadi kitosan dengan proses deasetilase N-asetil-

glukosamin. Enzim ini mampu membuat kitin terhidrolisis dengan memutus

ikatan N-asetamido pada kitin dan mengubahnya menjadi kitosan (Setyahadi

dkk, 2006). Kitin deasetilase banyak digunakan sebagai alternatif untuk

20

mengubah kitin menjadi kitosan karena dapat dikontrol, non degradatif, dan

prosesnya lebih baik dibandingkan dengan secara kimiawi yang prosesnya

tidak ramah lingkungan dan sulit untuk dikendalikan serta mengarah ke

berbagai produk yang berbeda-beda (Kim et al., 2008). Kitin deasetilase adalah

glikoprotein yang memiliki massa molekul pada rentang dari 24 sampai 150

kDa dengan aktivitas enzim yang optimum pada suhu 50°C serta pH optimum

yang bervariasi diantara 4,5 sampai 8,5 (Jeraj et al., 2006). Enzim ini dapat

ditemukan pada beberapa sumber yang telah diteliti diantaranya adalah

a. Deasetilase pada fungi

Kitin deasetilase telah ditemukan pada beberapa fungi. Berdasarkan lokasi

(DIVERSE), kitin deasetilase dibagi ke dalam dua subtipe yaitu M. rouxii

dan A. coerulea yang kitin deasetilasenya tersembunyi dalam periplasma,

dan karena itu disebut kitin deasetilase interseluler, sedangkan kitin

deasetilase pada C. lindemuthianum dan A. nidulans tersembunyi ke dalam

media kultur, karena itu disebut kitin deasetilase ekstraseluler. Enzim ini

juga terdapat pada fungi yang berada di lautan, pada famili Metarrhizium

sp., Trichoderma sp., Fusarium sp., Cladosporium sp., Phoma sp.,

Aspergillus sp., dan lain-lain.

b. Deasetilase pada serangga

Kitin deasetilase juga dideteksi pada serangga, termasuk Anopheles

gambiae, Apis mellifera, Helicorvepa armigera, Mamestra configurata,

Tribolium castaneum dan Trichoplusia ni. Kitin deasetilase pada serangga

21

berhubungan dengan membran peritrophic midgut (PM) dan terdistribusi

merata di seluruh panjang PM, seperti yang ditunjukkan oleh kitin

deasetilase dari T. ni, H. armigera, dan M. configurata.

c. Deasetilase dari bakteri laut

Bakteri laut yang terdistribusi dengan luas di samudra dan muara air adalah

Vibrionaceae, terutama bertanggung jawab atas daur ulang nitrogen yang

terdapat di bahan-bahan yang mengandung kitin dan bersedimentasi lambat

pada air. Vibrionaceae diketahui dapat tumbuh pada N-asetilglukosamin,

kebanyakan tumbuh pada cangkang kepiting dan kitin pada cumi-cumi dan

mengandung gen kitinase. Jadi, kitin termasuk ke dalam fungsi utama pada

metabolisme Vibrionaceae (Zhao et al., 2010).

Kitin deasetilase (EC 3.5.1.41) salah satu anggota dari esterase karbohidrat

family 4, yang telah diidentifikasikan dalam database CAZY (http://afmb.crns-

mrs.fr/~cazy/CAZY). anggota-anggota dari famili ini terbagi ke wilayah yang

dijaga dalam struktur primernya, yang ditetapkan sebagai “domain NodB

homologi” atau “domain polisakarida deasetilase”. Disamping kitin deasetilase,

terdapat beberapa anggota lainnya dalam famili ini, termasuk asetil xilan

esterase (EC 3.1.1.72), kitooligosakarida deasetilase (EC 3.5.1.-),

peptidoglikan GlcNAc deasetilase (EC 3.5.1.-) dan xilanase A, C, D, E (EC

3.2.1.8) (Zhao et al., 2011).

22

F. Jamur Mucor miehei

Mikroorganisme merupakan organisme hidup dengan ukuran yang sangat kecil

dan hanya dapat dilihat dengan bantuan alat seperti mikroskop.

Mikroorganisme dibagi ke dalam 5 tipe yaitu bakteri, protozoa, alga, jamur

mikroskopis dan virus. Umumnya, jamur termasuk ke dalam organisme

eukariotik, mempunyai spora, tidak mempunyai klorofil, berbentuk sel atau

benang yang bercabang-cabang, dindingnya tersusun atas selulosa atau kitin,

atau kedua-duanya, dan dapat berkembang biak secara aseksual maupun

seksual (Mardiana, 2002). Sifat-sifat yang dimiliki jamur adalah heterotrof,

tidak berfotosintesis, tidak berplastid, tidak bersifat fagotrof, umumnya hifa

yang berdinding dapat berinti banyak (multinukleat), atau berinti tunggal

(mononukleat), dan untuk memperoleh nutrisi dengan cara absorpsi

(Mugiyanto, 2012).

Mucor adalah jamur yang berasal dari ordo Mucorales dan bertipikal saprotrof

yang hidup di tanah dan serasah tumbuhan. Jamur ini bersifat mesofilik dan

tumbuh baik pada suhu kamar sekitar 25-30°C. Mucor bersifat aerobik, untuk

pertumbuhannya dibutuhkan O2. Kebanyakan genus Mucor mempunyai

rentang pH yang luas untuk tumbuh yaitu 2-8,5. Tetapi, biasanya akan tumbuh

sangat baik pada pH rendah (asam). Jamur ini adalah multiselular dengan

filamen dan terdiri dari satu talus yang tersusun atas filamen bercabang yang

disebut sebagai hifa. Kumpulan dari hifa-hifa yang terbentuk ini disebut

miselium. Mucor juga disebut jamur dimorfik karena filamen yang dimiliki

23

dapat berubah bentuk seperti khamir. Pertumbuhan yang mirip dengan khamir,

pertumbuhannya berada di kondisi anaerobik dan ada CO2 (Razi, 2012).

Mucor miehei termasuk ke dalam ordo Mucorales dengan talus yang berbentuk

miselium lebat. Secara aseksual, Mucor miehei berkembang biak dengan spora

yang tidak berflagel atau yang disebut aplanospora. Sporangium membentuk

aplanospora ini, sporangium terletak pada ujung sporangiofor atau pada ujung

cabang-cabangnya. Sedangkan secara seksual, pembiakkan Mucorales

melibatkan gametangium yang berinti banyak dan berlangsung ketika dua

gametangium bersatu. Gametangium dibentuk di ujung hifa atau ujung cabang

hifa (Yolanda, 2014). Jamur Mucor miehei dapat dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7. Jamur Mucor miehei

G. Fermentasi

1. Pengertian Fermentasi

Fermentasi, dalam bahasa latin berasal dari kata fervere yang artinya mendidih,

menggambarkan ekstrak buah dengan aksi ragi dalam pembuatan minuman

24

yang mengandung alkohol. Fermentasi memiliki pengertian yang berbeda

antara ahli mikrobiologi dengan ahli biokimia. Fermentasi menurut ahli

biokimia adalah proses perombakkan senyawa organik yang menghasilkan

energi. Ahli mikrobiologi memperluas arti fermentasi menjadi semua proses

menggunakan kultur organisme dan menghasilkan suatu produk dari kultur

tersebut. Fermentasi juga bisa berarti senyawa-senyawa organik yang

mengalami disimilasi akibat adanya aktivitas mikroorganisme

(Sulistyaningrum, 2008). Prinsip dasar dari fermentasi adalah kegiatan mikroba

tertentu yang aktif dengan tujuan mendapatkan sifat bahan yang lebih baik dan

menjadi lebih bermanfaat (Haloho, 2001).

2. Klasifikasi Fermentasi

Fermentasi berdasarkan substrat yang dipakai dapat dibedakan menjadi dua

tipe, yaitu

a. Fermentasi Solid-state

Fermentasi solid-state didefinisikan sebagai proses fermentasi dimana

mikroorganisme tumbuh berkembang di material padat tanpa adanya cairan.

Fermentasi metode ini menawarkan kelebihan yang sangat baik ketika fungi

digunakan. Tidak seperti mikroorganisme lainnya, jenis-jenis fungi tumbuh

di alam pada substrat padat seperti kayu, biji-bijian, tangkai, akar, dan

bagian kering dari hewan-hewan seperti kulit, tulang dan feses yaitu dalam

kelembaban yang rendah. Pada fermentasi ini, kelembaban diperlukan untuk

pertumbuhan mikroba yang ada dalam kondisi terserap atau dalam

25

kompleks dengan matriks padat. Salah satu aplikasi dari fermentasi solid-

state yang paling penting adalah produksi enzim. Selain itu, keuntungan dari

fermentasi solid-state dibandingkan dengan submerged adalah produktivitas

volumetrik yang tinggi, melibatkan perlengkapan yang murah, rendemen

produk lebih baik, dan lain-lain (Bhargav, 2008).

b. Fermentasi Submerged

Fermentasi submerged memanfaatkan cairan substrat yang mengalir bebas

seperti molase dan broth. Komponen bioaktif yang tersembunyi di dalam

broth fermentasi. Substrat tersebut dipakai dengan cukup cepat. Oleh karena

itu, perlu ditempatkan kembali/diberi suplemen dengan nutrisi-nutrisi secara

konstan. Teknik fermentasi ini paling cocok untuk mikroorganisme seperti

bakteri yang memerlukan kadar kelembaban yang tinggi. Teknik ini juga

membuat pemurnian produk enzim menjadi lebih mudah (Subramaniyam,

2012). Fermentasi submerged juga memiliki keuntungan tersendiri jika

dibandingkan dengan fermentasi solid-state, keuntungannya adalah

1. Komponen-komponen dari medium yang dipakai, jenis dan

konsentrasinya dapat diatur sesuai keinginan,

2. Pertumbuhan mikroorganisme dapat dikondisikan dengan optimum,

3. Medium yang dipakai menjadi lebih efisien (Sulistyaningrum, 2008).

26

Fermentasi yang menggunakan substrat cair dibagi menjadi tiga, yaitu:

1. Batch

Dalam proses batch, kultur medium batch dalam fermentor diinokulasikan

dengan mikroorganisme (kultur starter). Hasil fermentasi untuk durasi

tertentu (waktu fermentasi atau waktu batch), dan produk diambil.

Fermentasi batch biasanya berlangsung selama 4 – 5 hari, tetapi untuk

fermentasi makanan tradisional mungkin berlangsung sampai 1 bulan.

2. Fed-batch

Dalam fermentasi fed-batch, media kultur yang steril ditambahkan secara

terus-menerus atau berkala ke fermentasi batch yang terinokulasi. Volum

broth fermentasi dinaikkan setiap penambahan media, dan fermentor

diambil setelah waktu batch.

3. Kontinyu

Dalam fermentasi kontinyu, media steril ditambahkan secara kontinyu ke

dalam fermentor dan produk terfermentasi secara terus-menerus

dikeluarkan, jadi volum fermentasi yang tersisa tidak berubah. Biasanya,

fermentasi kontinyu dimulai sebagai kultur batch dan penambahan dimulai

setelah populasi mikroba telah mencapai konsentrasi tertentu (Chisti, 1999).

Perbedaan antara fermentasi solid-state dan fermentasi submerged dapat dilihat

pada Tabel 1. (Riadi, 2013).

27

Tabel 1. Perbedaan fermentasi solid-state dan fermentasi submerged

Karakteristik Fermentasi Solid-state

Fermentasi Submerged

Kondisi mikroorganisme dan substrat Statis TeradukStatus substrat Mentah MurniKeadaan alami dari mikroorganisme Sistem fungi -Keberadaan air Terbatas TinggiSuplai oksigen Difusi Menyemburkan atau

menggelembungkanKontak dengan oksigen Langsung Oksigen terlarutKebutuhan media fermentasi Kecil BesarKebutuhan energy Rendah TinggiStudi kinetika Kompleks MudahPerubahan suhu dan konsentrasi Fungsi step SmoothPengendalian reaksi Sulit MudahPotensi kontaminasi Kecil TinggiMasalah Polusi Rendah Tinggi

3. Fermentasi Sistem Batch

Penelitian ini dilakukan dengan cara fermentasi sistem tertutup (batch),

Tahapan-tahapan proses fermentasi fase cair sistem ini secara umum, antara

lain:

1. Substrat yang disiapkan, harus dibuat terlebih dahulu menjadi butiran-

butiran kecil disertai dengan penambahan air dan nutrisi, penambahan ini

berfungsi untuk menambah ketersediaan gizi pada substrat.

2. Inokulum yang dipakai, cara persiapan dan tipenya tergantung dari

mikroorganisme yang digunakan. Proses fermentasi batch banyak yang

melibatkan bakteri dan jamur sehingga digunakan spora hasil inokulasi.

Fungsinya adalah membuat kualitas inokulum menjadi lebih baik dengan

kelangsungan hidup mikroorganisme yang panjang.

28

3. Wadah yang digunakan harus bersih dan steril baik setelah fermentasi

maupun sebelumnya, sebelum ditambahkan substrat.

4. Proses inokulasi dan pengerjaannya, tahapnya adalah dengan disebarkannya

substrat pada media yang sudah steril dengan hati-hati untuk menghindari

kontaminasi.

5. Proses fermentasi batch, ada beberapa hal yang perlu diperhatikan yaitu

suhu, pH medium, dan waktu inkubasi. Aerasi atau penambahan oksigen

dapat dilakukan jika diperlukan.

6. Kultivasi, untuk memisahkan substrat padat dari medium diperlukan

bantuan mekanis seperti penggunaan kertas saring dan sentrifugasi

(Yolanda, 2014).

H. Fourier Transformed Infra Red (FTIR)

FTIR adalah metode analisis yang digunakan dengan mengamati interaksi yang

terjadi antara molekul dengan radiasi elektromagnetik pada daerah panjang

gelombang 0,75 – 1000 µm atau pada bilangan gelombang 13.000 – 10 cm-1

(Hasanah, 2014). Pada dasarnya, alat spektrofotometer FTIR sama dengan

spektrofotometer IR disperse, yang menjadi pembedanya berada pada

pengembangan sistem optik sebelum berkas sinar infra merah melewati sampel

yang dianalisis (Fannyda, 2014).

Panjang gelombang IR yaitu 0,75 – 1000 µm tergolong pendek sehingga

elektron tidak dapat mengalami transisi, melainkan molekul hanya mampu

29

bervibrasi atau bergetar (Prameswari, 2013). Vibrasi yang terjadi terdiri dari

vibrasi tekuk dan vibrasi ulur. Vibrasi ini dikenal beberapa istilah seperti

rocking, twisting, scissoring, dan wagging. (Soleh dkk., 2008). Prinsip kerja

dari FTIR adalah interaksi yang terjadi antara sinar inframerah dan sampel

mengakibatkan adanya karakteristik vibrasi yang dapat dideteksi untuk

menentukan gugus-gugus fungsi yang terdapat pada suatu molekul

(Prameswari, 2013).

Frekuensi inframerah memiliki satuan bilangan gelombang (wavenumber) dan

diartikan sebagai banyaknya gelombang per sentimeter. Spektrum inframerah

suatu senyawa didapat dengan mudah dan waktunya singkat melalui sedikit

senyawa yang diletakkan ke dalam instrumen dengan sumber radiasi

inframerah. Spektrofotometer akan membaca sejumlah radiasi yang menembus

sampel pada frekuensi tertentu dan merekam radiasi yang ditransmisikan dalam

persen secara otomatis. Pita serapan pada spektrum yang dihasilkan merupakan

radiasi yang diserap oleh molekul. Radiasi spektrofotometer IR memiliki

daerah pada panjang gelombang 12.800 – 10 cm-1. Daerah yang khusus untuk

identifikasi gugus-gugus fungsional ditunjukkan pada daerah 4000 – 1400 cm-1

sedangkan pada daerah 1500 – 800 cm-1 disebut sebagai daerah sidik jari

(fingerprint region) (Soleh dkk., 2008). Adapun frekuensi inframerah dari

berbagai jenis ikatan ditunjukkan pada Tabel 2.

30

Tabel 2. Frekuensi inframerah pada beberapa jenis ikatan (Fannyda, 2014)

Jenis ikatan Gugus Golongan senyawa Rentang frekuensi (cm-1)Ikatan tunggaldenganhidrogen

C-H Alkana 2850 – 3000

=C-HAlkena dan senyawaaromatik

3030 – 3140

O-H Alkohol dan Fenol 3500 – 3700 (bebas)3200 – 3500 (berikatan

hidrogen)Asam karboksilat 2500 – 3000

N-H Amina 3200 – 3600S-H Tiol 2550 – 2600

Ikatan rangkap C=C Alkena 1600 – 1680C=N Imina, oksim 1500 – 1650

Aldehid, keton, ester,asam karboksilat

1650 – 1780

Ikatan rangkaptiga

C≡C Alkuna 2100 – 2260

C≡N Nitril 2200 – 2400

Komponen-komponen pokok penyusun spektrofotometer infra merah tidak

berbeda jauh dari spektrofotometer UV-Vis yang terdiri dari sumber sinar,

monokromator, sel tempat cuplikan, detektor, amplifier dan alat perekam atau

skala pembacaan spektra atau yang disebut recorder (Evrianni, 2009).

Penggunaan spektrofotometer FTIR dapat digunakan untuk analisis secara

kualitatif dan kuantitatif dari suatu sampel. Spektrum inframerah mempunyai

hubungan yang erat dengan ikatan kovalen dalam senyawa organik. Gugus-

gugus fungsi yang terdapat dalam suatu sampel dapat diidentifikasi dengan

membandingkan nilai bilangan gelombang yang muncul pada spektrum dengan

spektrum standarnya (Paramasyanti, 2014). Hal ini disebabkan spektrum yang

muncul pada setiap senyawa mempunyai sifat yang khas. Hampir semua

31

gugus-gugus ini akan muncul sebagai pita serapan pada spektrum di rentang

4.000 – 400 cm-1 (Nasution, 2010).

Pada analisis menggunakan alat spektrofotometer FTIR ini diharapkan muncul

pita serapan melebar dengan intensitas yang kuat pada daerah 3500-3000 cm-1

yang menunjukkan karakteristik vibrasi ulur OH, pita serapan di atas 3300 cm-1

menunjukkan karakteristik vibrasi ulur NH amina. Pita serapan yang lain yang

menunjukkan vibrasi NH amina berada pada daerah 1650-1550 cm-1

menunjukkan vibrasi tekuk NH2 (amina primer), diharapkan juga pita serapan

muncul pada daerah 1250-1000 cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur CN,

pita serapan pada daerah 3000-2850 cm-1 menunjukkan karakteristik vibrasi

ulur CH, pita serapan lainnya pada daerah 1470-1350 cm-1 menunjukkan

vibrasi tekuk CH, dan vibrasi tekuk C-O ditunjukkan pada daerah 1250-970

cm-1 (Hendri, 2013).

1. Spektrofotometer UV-Vis

Spektroskopi merupakan ilmu yang berhubungan dengan radiasi sinar tampak

yang berinteraksi dengan suatu molekul pada panjang gelombang tertentu dan

terbentuk suatu spektra, yang merupakan hasil dari interaksi antara energi

radian dengan frekuensi atau panjang gelombang. Sedangkan, ilmu yang

mempelajari tentang pengukuran spektra disebut spektrofotometer.

Spektrofotometer UV-Vis adalah instrumen yang berfungsi untuk mengukur

serapan yang diperoleh dari interaksi kimia antara radiasi elektromagnetik

dengan atom atau molekul dari zat kimia yang diamati pada daerah UV-Vis.

Alat spektrofotometer UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 8.

32

Gambar 8. Alat Spektrofotometer UV-Vis.

Rentang panjang gelombang yang digunakan untuk pengukuran dimulai dari

panjang gelombang pendek ultraviolet hingga garis inframerah. Secara garis

besar daerah spektrum dibagi ke beberapa daerah, yaitu :

a. Daerah ultraviolet jauh : 100 nm – 190 nm

b. Daerah ultraviolet dekat : 190 nm – 380 nm

c. Daerah cahaya tampak : 380 nm – 780 nm

d. Daerah inframerah dekat : 780 nm – 3000 nm

e. Daerah inframerah : 2,5 µm – 40 µm atau 4000 cm-1 – 250 cm(Rusli, 2010).

Prinsip dasar dari spektrofotometer UV-Vis adalah hasil interaksi antara

gelombang elektromagnetik dengan molekul yang menghasilkan spektrum-

spektrum tertentu yang berbeda pada setiap senyawa. Pengukuran ini dapat

terjadi apabila energi tersebut ditransmisikan, diemisikan atau direfleksikan

sebagai fungsi dari panjang gelombang (Fajria, 2011). Skema kerja dari alat ini

dapat pada Gambar 9.

33

yy

Gambar 9. Skema alat spektrofotometer UV-Vis (Wardani, 2012).

Komponen alat spektrofotometer UV-Vis terdiri dari:

a. Sumber radiasi

Sumber cahaya pada alat spektrofotometer berasal dari lampu khusus seperti

untuk UV dengan panjang gelombang 180 nm – 400 nm berasal dari lampu

Deuterium (D2) dan untuk Vis dengan panjang gelombang 400 nm – 800 nm

berasal dari lampu Tungsten/Wolfram (W).

b. Monokromator

Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menyeleksi cahaya yang

masuk dari sumber radiasi dengan panjang gelombang tertentu. Radiasi

cahaya putih yang polikromatis dipisahkan oleh monokromator menjadi

cahaya monokromatis.

c. Kuvet

Alat pada spektrofotometer yang berfungsi sebagai tempat untuk

meletakkan sampel, pada umumnya sampel melibatkan larutan sehingga

diperlukan wadah untuk menempatkan larutan tersebut.

SumberRadiasi

Monokromator SampelKompartemen

Detektor

Visual Display

jjjjjjj

Amplifier

34

d. Detektor

Alat yang berfungsi untuk mendapatkan suatu besaran yang dapat diukur

dengan mengubah energi radiasi yang jatuh mengenainya.

e. Amplifier

Alat yang berfungsi untuk memperkuat sinyal listrik. Tujuannya agar sinyal

listrik dapat dibaca oleh recorder.

f. Recorder

Alat untuk mencatat dan menampilkan hasil analisis, dapat berupa gambar

atau angka-angka.

Analisis dengan spektrofotometer UV-Vis terdapat beberapa syarat, yaitu:

a. Bahan tidak berwarna wajib memiliki gugus kromofor

b. Bahan yang digunakan berwarna

c. Bahan yang tidak berwarna dan tidak memiliki gugus kromofor, maka

ditambahkan pereaksi warna (Vis)

d. Bahan yang tidak ada gugus kromofor, dibuat turunannya untuk mempunyai

gugus kromofor (UV) (Azas, 2013).

Selain persyaratan sampel yang harus dipenuhi, terdapat juga beberapa hal

yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometer UV-Vis terutama

senyawa tak berwarna, yaitu:

35

a. Molekul yang dibentuk dapat menyerap sinar UV-Vis

Hal ini dilakukan dengan mereaksikan senyawa tersebut terhadap pereaksi

tertentu atau diubah ke senyawa lain agar dapat menyerap sinar UV-Vis.

b. Waktu kerja (operating time)

Fungsinya adalah untuk mengetahui waktu yang tepat untuk pengukuran

yang stabil. Waktu kerjanya diatur dengan mengukur hubungan antara

absorbansi larutan dan waktu pengukuran.

c. Pemilihan panjang gelombang

Pada analisis kuantitatif, panjang gelombang yang digunakan mempunyai

absorbansi maksimal.

d. Pembuatan kurva baku

Caranya adalah pertama dibuat larutan baku yang berseri dalam berbagai

konsentrasi, kedua dilakukan pengukuran absorbansi untuk setiap

konsentrasi, dan terakhir hasil absorbansi yang didapat dihubungkan dengan

konsentrasi sampel dalam bentuk kurva.

e. Pembacaan absorbansi sampel

Pada spektrofotometer, absorbansi yang terbaca diharapkan berada di antara

0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika terbaca sebagai transmitan. Ini

disebabkan kesalahan fotometrik yang terjadi pada rentang nilai absorbansi

tersebut paling maksimal (Robiah, 2015).

36

Penggunaan spektrofometer UV-Vis pada penelitian ini dilakukan untuk

mengetahui rendemen glukosamin yang dihasilkan dari proses fermentasi

secara akurat. Hasil yang diharapkan yaitu sebesar diatas 90% dan kemurnian

yang terukur dari glukosamin yang diperoleh hasilnya mendekati 100%.

III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Agustus 2015 sampai dengan November

2015 dengan tahapan kegiatan, yaitu pengambilan sampel di Gudang Lelang

Teluk Betung, pembuatan kitin, dan fermentasi kitin di UPT. Laboratorium

Terpadu Sentra Inovasi dan Teknologi Universitas Lampung, karakterisasi

kitin dengan FTIR di Laboratorium Kimia Organik Universitas Gajah Mada

serta analisis produk fermentasi menggunakan Spektrofotometer UV-Vis di

Laboratorium Kimia Anorganik dan Fisik Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas Pyrex,

termometer, oven, kertas saring, neraca digital Wiggen Houser, Heating

Magnetic Stirrer, Laminar Air Flow, autoclave, Incubator Memmer-

Germany/INCO2, Shaker Incubator Biosan/ES-20/60, FTIR Shimadzu,

Centrifuge Hitachi/CF 16 RX II, Freeze-dryer Scanvac Coolsafe,

Spektrofotometer Ultraviolet-Visible Varian 50 Probe.

Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk kulit

udang, kitin standar produk WAKO Jepang, glukosamin standar produk

38

WAKO Jepang, kentang, agar for microbiology, dekstrosa, laktosa, bakto

pepton, amonium sulfat ((NH4)2SO4), urea, kalium hidrogen sulfat (KHSO4),

besi (II) sulfat heptahidrat (FeSO4.7H2O), seng (II) sulfat heptahidrat

(ZnSO4.7H2O), asam sitrat, natrium sitrat, monosodium fosfat (NaH2PO4),

disodium fosfat (Na2HPO4), isolat Mucor miehei, NaOH, HCl, natrium asetat,

kalsium klorida, ninhidrin, dan indikator pH universal.

C. Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Kitin

Proses untuk membuat kitin dari kulit udang dilakukan dengan cara

mengumpulkan limbah kulit udang dari Gudang Lelang Kecamatan Teluk

Betung, Bandar Lampung dan dibuat secara kimiawi melalui tahapan

deproteinasi menggunakan basa kuat dan demineralisasi menggunakan asam

kuat (Sari, 2010).

a. Persiapan Sampel

Limbah kulit dan kepala udang yang telah dikumpulkan untuk bahan baku

pembuatan kitin, dibersihkan, direbus, dan dikeringkan lalu dihaluskan

menggunakan blender. Setelah itu, diayak menggunakan ayakan sehingga

diperoleh serbuk kulit udang yang akan digunakan sebagai sampel.

b. Deproteinasi

Sebanyak 100 gram sampel serbuk kulit udang ditambahkan 1000 mL

NaOH 20% ditempatkan dalam bejana tahan asam dan basa yang dilengkapi

39

pengaduk dan termometer lalu diletakkan dalam penangas air dan

dipanaskan selama 1 jam pada suhu 90ºC (Pariera, 2004). Setelah kondisi

tercapai, dilakukan penyaringan sehingga diperoleh filtrat dan residu. Filtrat

yang diperoleh kemudian diuji dengan CuSO4. Adapun residunya dicuci

dengan aquades hingga pH 7 yang diukur dengan indikator pH universal dan

dikeringkan dalam suhu 60ºC selama 24 jam (Sari, 2010).

c. Demineralisasi

Kitin kasar hasil deproteinasi ditambahkan HCl 1,25 N dengan

perbandingan 1:10 (w/v) dalam bejana tahan asam dan basa dilengkapi

dengan pengaduk dan termometer dan dipanaskan di atas penangas air

selama 1 jam pada suhu 90ºC (Pariera, 2004). Setelah kondisi tercapai,

dilakukan penyaringan sehingga diperoleh filtrat dan residu. Filtrat yang

diperoleh kemudian diuji dengan (NH4)2C2O4. Adapun residunya dicuci

dengan aquades hingga pH 7 yang diukur dengan indikator pH universal dan

dikeringkan dalam oven pada suhu 60ºC selama 24 jam (Sari, 2010).

2. Karakterisasi Kitin dengan FTIR

Kitin yang dihasilkan, dikarakterisasi gugus fungsinya dengan alat Fourier

Transform Infrared (FT-IR). Kitin dibuat pelet dengan KBr, kemudian

dilakukan scanning pada daerah frekuensi antara 4000 cm-1 sampai dengan 400

cm-1. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan kitin standar (Mardiana,

2002).

40

3. Persiapan Isolat Mucor miehei

a. Pembuatan Potato Extract

Sebanyak 200 gram kentang dikupas kulitnya lalu dipotong seperti dadu dan

direbus dalam 1000 mL aquades selama 1-1,5 jam. Setelah kondisi tercapai,

disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh ekstrak kentang yang

bening. Ekstrak kentang disimpan dalam botol reagen lalu disterilisasi

dengan autoclave pada suhu 121ºC dan tekanan 2 atm selama 20 menit.

Ekstrak kentang yang telah disterilisasi, didinginkan pada suhu kamar

kemudian disimpan dalam lemari pendingin (kulkas) (DZMZ, 2013).

b. Media PDA (Potato Dextrose Agar) dan Pertumbuhan Mucor miehei

pada Media PDA

Sebanyak 100 mL potato extract ditambahkan 4 gram dekstrosa dan 3 gram

agar dalam labu Erlenmeyer 250 mL lalu disterilisasikan dengan autoclave

pada suhu 121ºC dan tekanan 2 atm selama 20 menit (DZMZ, 2013).

Setelah itu media PDA di-UV selama 10 menit dalam Laminar Air Flow

dan dituang ke dalam cawan petri. Strain jamur Mucor Miehei ditumbuhkan

kurang lebih selama 5 hari sampai spora jamur tumbuh (Alves et al., 2005).

c. Media PDL (Potato Dextrose Liquid) dan Petumbuhan Mucor miehei

pada Media PDL

Sebanyak 100 mL potato extract ditambahkan 4 gram dekstrosa dalam labu

Erlenmeyer 250 mL lalu disterilisasikan dengan autoclave pada suhu 121ºC

41

dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Setelah itu media PDL di-UV selama 10

menit dalam Laminar Air Flow. Spora kultur 5 hari dipisahkan dan

dimasukkan dalam media PDL dan diletakkan dalam shaker incubator

dengan kecepatan 175 rpm pada suhu 30ºC selama 5 hari (Alves et al.,

2005).

4. Larutan Buffer pH 4

Asam sitrat seberat 0,96 gram dilarutkan dalam 50 mL aquades dalam labu

takar 50 mL dan dikocok sampai homogen. Larutan ini digunakan sebagai

larutan stok A. lalu dilarutkan natrium sitrat seberat 0,65 gram dalam 25 mL

aquades dalam labu volumetrik 25 mL dan dikocok sampai homogen. Larutan

ini digunakan sebagai larutan stok B.

Pembuatan larutan buffer sitrat pH 4 dilakukan dengan cara sebanyak 33 mL

larutan stok A (asam sitrat 0,10 M) dan 17 mL larutan stok B (natrium sitrat

0,10 M) dilarutkan dalam 100 mL aquades dalam labu volumetrik 100 mL dan

selanjutnya dicek pH-nya (Mardiana, 2002).

5. Pembuatan Media Inokulum Mucor miehei

Substrat yang digunakan adalah kitin yang telah dicuci terlebih dahulu dengan

NaOH 0,5% selama 1 jam berdasarkan metode Gray et al. (1978). Kemudian

kitin disaring, dibilas dengan aquades, dan dikeringkan dalam oven pada suhu

60ºC selama 24 jam.

42

Substrat kitin seberat 0,1 gram dimasukkan ke dalam 7 labu Erlenmeyer 100

mL, lalu ditambahkan 0,01 gram laktosa; 0,03 gram bakto pepton; 0,14 gram

amonium sulfat; 0,03 gram urea; 0,2 gram kalium hidrogen sulfat; 0,03 gram

besi (II) sulfat heptahidrat; 0,03 gram kalsium klorida; dan 0,029 gram seng

(II) sulfat heptahidrat, serta dilarutkan dalam 10 mL larutan buffer sitrat pH 4.

Kemudian campuran diaduk sampai homogen dan disterilisasi dalam autoclave

pada suhu 121ºC dengan tekanan 2 atm selama 20 menit. Selanjutnya media

didinginkan pada suhu ruang dalam Laminar Air Flow. Sebanyak 1 mL kultur

awal dari media PDL diinokulasikan ke dalam media ini dan difermentasi pada

suhu 30ºC dalam shaker incubator dengan kecepatan 250 rpm selama 7 hari

(Chahal et al., 2001).

6. Fermentasi Cair Tertutup (Batch)

Substrat kitin seberat 1,00 gram dimasukkan masing-masing ke dalam 7 labu

Erlenmeyer 100 mL, kemudian ditambahkan 0,02 gram laktosa; 0,06 gram

bakto pepton; 0,28 gram amonium sulfat; 0,06 gram urea; 0,4 gram kalium

hidrogen sulfat; 0,06 gram besi (II) sulfat heptahidrat; 0,06 gram kalsium

klorida; dan 0,057 gram seng (II) sulfat heptahidrat, serta dilarutkan dalam 10

mL larutan buffer sitrat pH 4. Kemudian campuran diaduk hingga homogen

dan disterilisasi dalam autoclave pada suhu 121ºC dengan tekanan 2 atm

selama 20 menit. Selanjutnya media didinginkan pada suhu ruang dalam

Laminar Air Flow. Sebanyak 10 mL starter diinokulasikan ke dalam media ini

dan difermentasi pada suhu 30ºC dalam shaker incubator dengan kecepatan

250 rpm dengan waktu 1, 2, 3, 4, 8, 12, dan 24 jam (Chahal et al., 2001).

43

Hasil yang diperoleh dari fermentasi batch setiap 1, 2, 3, 4, 8, 12, dan 24 jam

fermentasi dipanaskan dengan waterbath pada suhu 70ºC selama 45 menit.

Kemudian dicampurkan dengan 5 mL aquades dengan membiarkan labu

Erlenmeyer pada rotary shaker selama 1 jam pada 200 rpm. Campuran disaring

dengan kertas saring dan filtratnya disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm

selama 20 menit pada suhu 4ºC. Semua supernatan (filtrat) yang diperoleh

dibekukan di dalam lemari pendingin/freezer selama 24 jam, lalu diliofilisasi

dengan menggunakan freeze-dryer sampai terbentuk kristal glukosamin.

7. Analisis Glukosamin dengan Spektrofotometer UV-Vis

Glukosamin dianalisis dengan alat spektrofotometer UV-Vis dilakukan setelah

didapat kristal glukosamin kering hasil freeze-dryer.

a. Pembuatan Blanko

Aquades sebanyak 10 mL ditambahkan dengan ninhidrin 0,8% dan buffer

fosfat pH 6 sebanyak 25 tetes dan dipanaskan selama kurang lebih 30 menit

sampai 1 jam.

b. Pembuatan Standar Glukosamin

Glukosamin standar seberat 10 mg dilarutkan dalam 100 mL aquades

sehingga didapat konsentrasi akhir 100 mg/L. Selanjutnya larutan

glukosamin standar 100 mg/L ini diencerkan hingga didapat konsentrasi

akhir masing-masing 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 130, 140 dan 150

mg/L.

44

c. Pembuatan Kurva Standar Glukosamin

Larutan glukosamin standar dengan konsentrasi 50, 60, 70 ,80 ,90 ,100, 110,

120, 130, 140 dan 150 mg/L masing-masing ditambahkan ninhidrin 0,8%

dan buffer fosfat pH 6 sebanyak 0,5 mL (untuk setiap 4 mL larutan).

Kemudian larutan dikocok hingga homogen dan dipanaskan kurang lebih

selama 30 menit sampai 1 jam hingga terjadi perubahan warna larutan

menjadi ungu. Lalu larutan tersebut diukur absorbansinya dengan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 570 nm (wu et al., 2005)

dan nilai absorbansi tersebut diplotkan terhadap konsentrasi untuk

mendapatkan kurva standar dan persamaan garis yang menunjukkan

hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi glukosamin.

d. Pembuatan Sampel Glukosamin

Kristal-kristal glukosamin yang diperoleh dari proses fermentasi yang telah

dikeringkan dengan freeze-dryer masing-masing dilarutkan sedikit

glukosamin dengan ninhidrin 0,8% dan buffer fosfat pH 6 sebanyak 15 – 20

tetes. Kemudian dipanaskan selama kurang lebih 30 menit sampai 1 jam

hingga larutan terjadi perubahan warna menjadi ungu.

e. Analisis Kadar Glukosamin

Sebanyak 1 mL sampel glukosamin yang telah berubah menjadi ungu

diencerkan hingga menyerupai warna ungu yang sesuai dengan salah satu

konsentrasi larutan glukosamin standar yang telah dibuat sebelumnya.

kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada

45

panjang gelombang 570 nm. Hasil absorbansi yang diperoleh kemudian

dimasukkan dalam persamaan regresi linier dari kurva standar glukosamin

dan diperoleh konsentrasi sampel glukosamin.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan sebagai

berikut.

1. Efektivitas Mucor miehei dalam mendegradasi kitin dengan waktu 1 jam

hasilnya sebesar 63%.

2. Waktu inkubasi optimum Mucor miehei berdasarkan hasil freeze dried

adalah jam kedua dengan rendemen 82%.

3. Waktu inkubasi optimum Mucor miehei berdasarkan hasil spektrofotometer

UV-Vis adalah jam ketiga dengan kadar 0,01667%.

B. Saran

Dari hasil penelitian yang diperoleh, ada saran untuk penelitian selanjutnya

yaitu

1. Perlu dicari senyawa lain yang dapat mengikat glukosamin untuk dilakukan

analisis menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

2. Perlu dilakukan pengembangan metode, untuk membuat hasil analisis

dengan spektrofotometer UV-Vis lebih baik.

DAFTAR PUSTAKA

Abdulkarim, A., M. T. Isa., S. Abdulsalam, A. J. Muhammad, A. O. Ameh. 2013.Extraction and Characterisation of Chitin and Chitosan from Mussel Shell.J. of Civil and Environmental Research. 3: 108-114.

Alves, M. H., G. M. D. Campos-Takaki, K. Okada, I. H. F. Pessoa, dan A. I.Milanez. 2005. Detection of Extracellular Protease in Mucor Species. J. ofRev. Iberoam Micol. 22: 114-117.

Anderson, J. W., R. J. Nicolosi, J. F. Borzelleca. 2005. Glucosamine Effects inHumans: a Review of Effects on Glucose Metabolism, Side Effects, SafetyConsiderations and Efficacy. J. of Food and Chemical Toxicology 43: 187-201.

Arakane, Y. dan S. Muthukrishnan. 2010. Review: Insect Chitinase andChitinase-like Proteins. J. of Cellular and Molecular Life Sciences 67: 201-216.

Arif, A. R., Ischaidar, Hasnah Natsir, dan Seniwati Dali. 2013. Isolasi Kitin dariLimbah Udang Putih (Penaeus Merguiensis) Secara Enzimatis. SeminarNasional 2013. 10-16.

Ariyanta, Yahya. 2014. Pengaruh Penambahan Konsentrasi Inokulum dan MediaFermentasi terhadap Efektivitas Fermentasi Kitin dengan Mucor mieheiumtuk Pembuatan Glukosamin (Skripsi). Universitas Lampung. BandarLampung.

Azas, Q. S. 2013. Analisis Kadar Boraks pada Kurma yang Beredar di PasarTanah Abang dengan Menggunakan Spektrofotometri UV-Vis (Skripsi).Universitas Negeri Islam Syarif Hidayatullah. Jakarta. 57 pp.

64

Bhargav, S., B. P. Panda, M. Ali, dan S. Javed. 2008. Solid-state Fermentation:an Overview. J. of Chem. Biochem. Eng. Q. 22: 49-70.

Bhattacharya, D., A. Nagpure, dan R. K. Gupta. 2007. Bacterial Chitinases:Properties and Potential. J. of Critical Reviews in Biotechnology 27: 21-28.

Cahyono, E., P. Suptijah, I. Wientarsih. 2014. Development of a PressurizedHydrolisis Method for Producing Glucosamine. J. of Asian Journal ofAgriculture and Food Science. 2: 390-396.

Chahal, P.S., D.S. Chahal, dan G. B. B. Lee. 2001. Production of Cellulose inSolid State Fermentation with Trichordema reesi MCG 80 on Wheat Straw.J. of Applied Biochemistry and Biotechnology. 57-58: 433-441.

Chisti, Yusuf. 1999. Fermentation (Industrial). Encyclopedia of FoodMicrobiology. 663-674.

Deng, Ming-De, D. K. Severson, A. D. Grund, S. L. Wassink, R. P. Burlingame,A. Berry, J. A. Running, C. A. Kunesh, L. Song, T. A. Jerrell, R. A. Rosson.2005. Metabolic Engineering of Escherichia coli for Industrial Productionof Glucosamine and N-acetylglucosamine. J. of Metabolic Engineering 7:201-214.

Dewi, I. M.. 2008. Isolasi Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase dari Sumber AirPanas Danau Ranau Sumatera Selatan (Tesis). Universitas Sumatera Utara.Medan.

Dixit, R., Y. Arakane, C. A. Specht, C. Richard, K. J. Kramer, R. W. Beeman, danS. Muthukrishnan. 2008.Domain Organization and Phylogenetic Analysisof Proteins from the Chitin Deacetylase Gene Family of Triboliumcastaneum and Three Other Species of Insects. J. of Insect Biochemistry andMolecular Biology 38: 440-451.

DSMZ. 2013. DSMZ: List of Media for Microorganisms.https://www.dsmz.de/catalogue-microorganisms/culture-technology/list-of-media-for-microorganisms.html. Diakses pada tanggal 28 Mei 2015 Pukul22.25.

65

Evrianni, S. 2009. Reaksi Grating Maleat Anhidrida pada Polipropilena denganInisiator Benzoil Peroksida (Skripsi). Universitas Sumatera Utara. Medan.

Fajria, M. A. 2011. Pengukuran Zat Besi dalam Bayam Merah dan SuplemenPenambah Darah serta Pengaruhnya terhadap Peningkatan Hemoglobindan Zat Besi dalam Darah (Skripsi). Universitas Indonesia. Depok.

Fannyda, R. 2014. Pengaruh Ekstrak Daun Merang Perawas (Litsea odoriferaVal.) terhadap Tukak Lambung Mus muculus dan Karakterisasi GugusFungsi dengan Spektroskopi FTIR. Universitas Bengkulu. Bengkulu.

Gray, P., N. Hendy, dan W. Dunn. 1978. Digestion by Cellulolytic Enzymes ofAlkali Pretreated Bagasse. J. Aust. Inst. Agric. Sci. 210-212.

Haloho, N. 2001. Pengaruh Pemberian Dried Poultry Waste Hasil FermentasiStarbio dalam Ransum terhadap Boneless dan Panjang Usus Kelinci Umur16 Minggu (Skripsi). Universitas Sumatera Utara. Medan.

Hasanah, L. 2014. Pembuatan dan Karakterisasi Plastik Campuran Pati dariTepung Tapioka dan LDPE Menggunakan Single Screw Extruder (Skripsi).Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Hendri, J. dan Aspita Laila. 2013. Kitin Kitosan. Lembaga Penelitian UniversitasLampung. Bandar Lampung.

Herdyastuti, N., T. J. Raharjo, Mudasir, dan S. Matsjeh. 2009. Kitinase danMikroorganisme Kitinolitik: Isolasi, Karakterisasi dan Manfaatnya. J. Indo.Chem. 9 (1): 37-47.

Indah, Mutiara. 2004. Enzim. Universitas Sumatera Utara. Medan.

Inokuma, K., M. Takano, dan K. Hoshino. 2013. Direct Ethanol Production fromN-acetylglucosamine and Chitin Substrates by Mucor Species. J. ofBiochemical Engineering Journal 72: 24-32.

Isa, M. T., A. O. Ameh, J. O. Gabriel. 2012. Extraction and Characterization ofChitin from Nigerian Sources. Leonardo Electronic Journal of Practicesand Technologies. 73-81.

66

Ismail, Ilmir A., Jutti Levita, dan Ida Musfiroh. 2010. Analisis Kuantitatif Kitosandan Hasil Hidrolisisnya Dihitung sebagai Glukosamin denganSpektrofotometri Ultraviolet Orde Nol dan Orde Dua. UniversitasPadjajaran. Bandung.

Jeraj, N., B. Kunič., H. Lenasi, K. Breskvar. 2006. Purification and MolecularCharacterization of Chitin Deacetylase from Rhizopus nigricans. J. ofEnzyme and Microbial Technology 39: 1294-1299.

Karthik, N., K. Akankhsa, P. Binod, dan A. Pandey. 2014. Production,Purification, and Properties of Fungal Chitinases – a Review. IndianJournal of Experimental Biology. 52: 1025-1035.

Kim, Young-Ju, Y. Zhao, Kyung-Taek Oh, Van-Nam Nguyen, dan Ro-DongPark. 2008. Enzymatic Deacetylation of Chitin by Extracellular ChitinDeacetylase from a Newly Screened Mortierella sp. DY-52. J. Microbiol.Biotechnol 18(4): 759-766.

Kuniasih, M. dan Dian Windy Dwiasi. 2007. Preparasi dan Karakterisasi Kitindari Kulit Udang Putih (Litophanaeus vannamei). J. Molekul 2: 79-87.

Liu, L., Y. Liu, Hyun-dong Shin, R. Chen, J. Li, G. Du, J. Chen. 2013. MicrobialProduction of Glucosamine and N-acetylglucosamine: Advances andPerspectives. J. of Appl. Microbiol. Biotechnol. 97: 6149-6158.

Mardiana. 2002. Studi Pendahuluan Pembuatan Kitosan secara FermentasiMenggunakan Mucor miehei pada Media Kitin dan Kulit Udang Windu(Penaeus monodon) (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Mekawati, Fachriyah E.dan Sumardjo. 2000. Aplikasi Kitosan Hasil tranformasiKitin Limbah Udang (Penaeus merguiensis) untuk Adsorpsi Ion LogamTimbal. Jurnal Sains dan Matematika. 2: 51-54.

Mojarrad, J. S., M. Nemati, H. Valizadeh, M. Ansarin, dan S. Bourbour. 2007.Preparation of Glucosamine from Exoskeleton of Shrimp and PredictingProduction Yield by Response Surface Methodology. J. Agric. Food Chem.55: 2246-2250.

67

Mugiyanto, P. 2012. Uji Efektivitas Fermentasi Kitin Secara Bertahap denganIsolat Actinomycetes ANL-4 dan Mucor miehei untuk PembuatanGlukosamin (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Muharni. 2009. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penghasil Kitinase dari SumberAir Panas Danau Ranau Sumatera Selatan. Jurnal Penelitian Sains 09: 12-15.

Nasution, R. S.. 2010. Pengaruh Konsentrasi Maleat Anhidrida terhadap DerajatGrafting Maleat Anhidrida pada Propilena Terdegradasi dengan InisiatorBenzoil Peroksida (Skripsi). Universitas Sumatera Utara. Medan.

Natsir, H., A. R. Patong, M. T. Suhartono, dan A. Ahmad. 2012. Produksi DanAplikasi Kitinase Dari B. licheniformis HSA3-1a dalam MenghidrolisisKitin dari Limbah Udang dan Dinding Sel Jamur Ganoderma sp. SeminarJember 2012. 1-5.

Nelson, David L., Michael M. Cox. 2004. Lehninger Principles of Biochemistry.W. H. Freeman.

Noviendri, D., Y. N. Fawzya, dan E. Chasanah. 2008. Karakteristik dan SifatKinetika Enzim Kitinase dari Isolat Bakteri T5a1 Asal Terasi. JurnalPascapanen dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan. 3: 123-129.

Nst, R. A. 2012. Penentuan pH dan Suhu Optimum untuk Aktivitas Ekstrak KasarEnzim Lipase dari Kecambah Biji Karet (Hevea brasiliensis) terhadapHidrolisis PKO (Palm Kernel Oil) (Skripsi). Universitas Sumatera Utara.Medan.

Paramasyanti, F. 2014. Pengaruh Lama Sonikasi pada Pembuatan Film Pani-Ag/Ni terhadap Kristalinitas dan Kondutivitasnya (Skripsi). UniversitasNegeri Malang. Malang.

Pariera, B. M. 2004. Limbah Cangkang Udang menjadi Kitosan.http://www.chem-is-try.org/ diakses pada tanggal 26 Mei 2015 Pukul 21.03.

Patil, R. S., V. Ghormade, M. V. Deshpande. 2000. Chitinolytic Enzymes: anExploration. J. of Enzyme and Microbial Technology. 26: 473-483.

68

Prameswari, T. 2013. Sintesis Membran Kitosan-silika Abu Sekam Padi untukDekolorasi Zat Warna Congo Red (Skripsi). Universitas Negeri Semarang.Semarang.

Pramudita, I. R. N. 2013. Pembuatan dan karakterisasi Plastik BiodegradableDari Campuran Limbah Plastik Polipropilen dan Kitosan MenggunakanMetode Tanpa Pelarut (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Pratiwi, R. S., T. E. Susanto, Y. A. K. Wardani, A. Sutrisno. 2014. Enzim Kitinasedan Aplikasi di Bidang Industri: Kajian Pustaka. Jurnal Pangan danAgroindustri. 3: 878-887.

Purnomo, E. H., A. B. Sitanggang, D. Indrasti. 2012. Studi Kinetika ProduksiGlukosamin dalam Water-miscible Solvent dan Proses Separasinya.Prosiding Seminar Hasil-hasil Penelitian IPB. 247-261.

Purwanti, Ani. 2014. Evaluasi Proses Pengolahan Limbah Kulit Udang untukMeningkatkan Mutu Kitosan yang Dihasilkan. Jurnal Teknologi. 7 (1): 83-90.

Razi, 2012. Mucor. http: //zaidanalrazi.blogspot.com/2012/04/Mucor.html.diakses pada tanggal 24 April 2015 Pukul 05.45 WIB.

Riadi, L. 2013. Teknologi Fermentasi Ed. 2. Graha Ilmu. Yogyakarta.

Robiah, N. 2015. Mapping Aktivitas Enzim Kitinase dan Kitin Deasetilase dariIsolat Actinomycetes ANL-4 dalam Degradasi Kitin Selama 24 Jam WaktuInkubasi (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Rostinawati, Tina. 2008. Skrining dan Identifikasi Bakteri Penghasil EnzimKitinase dari Air Laut di Perairan Pantai Pondok Bali (Penelitian Mandiri).Universitas Padjajaran. Bandung.

Rusli, R. 2009. Penetapan Kadar Boraks pada Mie Basah yang Beredar di PasarCiputat dengan Metode Spektrofotometri UV-Vis menggunakan PereaksiKurkumin (Skripsi). Universitas Negeri Islam (UIN) Syarif Hidayatullah.Jakarta.

69

Sari, I. M. 2010. Pembuatan Glukosamin dari Kitosan dengan Bantuan EnzimLisozim (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Savitri, E., N. Soeseno, T. Adiarto. 2010. Sintesis Kitosan, Poli(2-amino-2-deoksi-D-Glukosa), Skala Pilot Project dari Limbah Kulit Udang sebagai BahanBaku Alternatif Pembuatan Biopolimer. Prosiding Seminar Nasional TeknikKimia “Kejuangan”. 1-9.

Setyahadi, S., T. K. Bunasor, dan D. Hendarsyah. 2006. Karakterisasi KitinDeasetilase Termostabil Isolat Bakteri Asal Pancuran Tujuh, BaturadenJawa Tengah. Jurnal Teknol. dan Industri Pangan. 17: 44-49.

Shahidi, F., J. K. V. Arachchi, You-Jin Jeon. 1999. Food Applications of Chitinand Chitosan. Trends in Food Science and Technology 10: 37-51.

Siregar, N. A. 2011. Penentuan pH dan Suhu Optimum untuk Aktivitas EkstrakKasar Enzim Lipase dari Kecambah Biji Jarak Kepyar (Ricinus CommunisL) terhadap Hidrolisis Minyak Wijen (Skripsi). Universitas Sumatera Utara.Medan.

Sitanggang, A. B., L. Sophia, H. S. Wu. 2012. MiniReview: Aspects ofGlucosamine Production Using Microorganisms. International FoodResearch Journal 19 (2): 393-404.

Soleh, A. M., L. K. Darusman, dan M. Rafi. 2008. Model Otentikasi KomposisiObat Bahan Alam Berdasarkan Spektra Infra Merah dan Komponen UtamaStudi Kasus: Obat Bahan Alam/Fitofarmaka Penurun Tekanan Darah.Forum Statistika dan Komputasi. 13: 1-6.

Subramaniyam, R. dan R. Vimala. 2012. Solid State and Submerged Fermentationfor The Production of Bioactive Substances: a Comparative Study.International Journal Science and Nature Vol. 3 (3): 480-486.

Sulistyaningrum, L. S. 2008. Optimasi Fermentasi Asam Kojat oleh Galur MutanAspergillus Flavus NTGA7A4UVE10 (Skripsi). Universitas Indonesia.Depok.

70

Uno, K., Y. Higashimoto, T. Chaweepack, dan L. Ruangpan. 2012. Effect ofChitin Extraction Processes on Residual Antimicrobials in Shrimp Shells.Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 12: 89-94.

Wardani, L. A. 2012. Validasi Metode Analisis dan Penentuan Kadar Vitamin Cpada Minuman Buah Kemasan dengan Spektrofotometri UV-Visible(Skripsi). Universitas Indonesia. Depok.

Wibisono, E. 2010. Imobilisasi Enzim Papain yang Diisolasi dari Getah BuahPepaya (Carica papaya L) dengan Menggunakan Kappa Karagenan danKitosan Aktifitas dan Stabilitasnya (Skripsi). Universitas Sumatera. Medan.

Win, N. N. dan W. F. Stevens. 2001. Shrimp Chitin as Substrate for FungalChitin Deacetylase. J. of Appl Microbiol Biotechnol 57: 334-341.

Wu, Y., M. Hussain, dan R. Fassihi. 2005. Development of a Simple AnalyticalMethodology for Determination of Glucosamine Release from ModifiedRelease Matrix Tablets. Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis 38: 263-269.

Yolanda, C. 2014. Penetapan Waktu Inkubasi Optimum Degradasi Kitin secaraEnzimatik oleh Mucor miehei dengan Metode Ultraviolet-VisibleSpectrophotometry (Skripsi). Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Zhang, H., Oh M., Allen C. 2004. Monodisperse Chitosan Nanoparticles forMucosal Drug Delivery. Biomacromolecules. 2461-8.

Zhao, Yong, Ro-Dong Park, dan Riccardo A. A. Muzzarelli. 2010. ChitinDeacetylases: Properties and Applications. Marine Drugs 8: 24-46.

Zhao, Yong, Wun-Taek Ju, Gyun-Hyun Jo, Woo Jin-Jung, dan Ro-Dong Park.2011. Perspectives of Chitin Deacetylase Research. InTech. Rijeka.