penelitian unggulan perguruan tinggi
TRANSCRIPT
1
LAPORAN TAHUNAN
PENELITIAN UNGGULAN PERGURUAN TINGGI
Teknologi Biosensing DNA Untuk Deteksi Patogenik M. tuberculosis
Secara Elektrokimia Menggunakan Modified Electrode
Tahun ke-1 dari rencana 2 tahun
Ketua Peneliti
Dr. Yeni Wahyuni Hartati (NIDN: 0024097101)
Anggota Peneliti
Dr. Shabarni Gaffar, M.Si. (NIDN: 0025047105)
Santhy Wyantuti, S.Si. M.Si (NIDN: 0026107301)
UNIVERSITAS PADJADJARAN
Oktober 2014
Kode/Nama Rumpun Ilmu: 112/Kimia
Tema : Kesehatan
2
3
RINGKASAN
Biosensor adalah suatu alat yang menggabungkan lapisan senyawa biologi ke dalam
sinyal yang dapat diukur secara analitik. Suatu biosensor DNA (atau genosensor) menggunakan
suatu DNA yang diamobilisasi sebagai elemen yang dikenal (probe). Biosensor secara
elektrokimia mengandalkan konversi pengenalan pasangan basa ke dalam suatu signal elektrik.
Kelompok penelitian kami telah berhasil mengembangkan metode biosensor DNA secara
voltammetri untuk menentukan beberapa urutan spesifik DNA
Pada penelitian ini kami melakukan pengembangan teknologi biosensing ini untuk
mendeteksi patogenik Mycobacterium tuberculosis, penginfeksi penyakit tuberkulosis (TB),
menggunakan elektrode emas termodifikasi. Dalam penelitian ini telah dilakukan isolasi DNA
dan PCR terhadap isolat, disain DNA probe dari gen insersi IS6110 M. tuberculosis, studi
modifikasi elektrode emas secara self assembly monolayer menggunakan senyawa thiol dan
karakterisasinya secara elektrokimia. Reaksi hibridisasi pada permukaan elektrode diamati dari
sinyal guanin pada potensial +0,21 V. Nilai sensitivitas yang diperoleh sebesar 0,52, dan batas
deteksi 3,47 µg mL-1
.
4
PRAKATA
Segala puji bagi Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya kepada
kami tim peneliti untuk melaksanakan penelitian dan menyelesaikan penulisan Laporan Akhir
Tahun ke-1 Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi tahun 2014 yang berjudul ‖Teknologi
Biosensing DNA Untuk Deteksi Patogenik M. tuberculosis Secara Elektrokimia Menggunakan
Modified Electrode‖.
Pada kesempatan ini perkenankanlah peneliti mengucapkan terima kasih yang sebesar-
besarnya kepada :
1. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional atas dana yang
telah disediakan sehingga penelitian ini dapat terlaksana.
2. Universitas Padjadjaran dan Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat
Unpad atas pengelolaan administrasi yang baik bagi proyek penelitian ini.
3. Dekan Fakultas MIPA, Ketua Jurusan Kimia, serta kepala Laboratorium Penelitian
Jurusan Kimia, yang telah menyediakan fasilitas bagi peneliti untuk melaksanakan
penelitian ini.
4. Semua pihak yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian ini.
Akhir kata dengan penuh harapan dan rasa optimis, mudah-mudahan hasil penelitian ini
dapat memberikan kontribusi ilmu pengetahuan di bidang kimia analitik khususnya dalam kajian
biosensor DNA secara elektrokimia.
Bandung, Oktober 2014
Penulis
5
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL .......................................................................................... 1
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ 2
RINGKASAN ......................................................................................................... 3
PRAKATA .............................................................................................................. 4
DAFTAR ISI .......................................................................................................... 5
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. 6
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... 7
BAB 1. PENDAHULUAN .................................................................................... 8
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 10
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN ............................................ 20
BAB 4. METODE PENELITIAN ......................................................................... 22
BAB 5. HASIL YANG DICAPAI ........................................................................ 27
BAB 6. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA ............................................... 31
BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 32
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 33
LAMPIRAN
6
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Gambar SEM M.tuberculosis, Mag 15549X. CDC (Todar, 2013) ................11
Gambar 2.2 Skema umum biosensor DNA. DNA target ditangkap pada lapisan pengenalan
dan menghasilkan sinyal hibridisasi yang ditransduksi ke dalam sinyal listrik
yang berguna untuk pembacaan dan analisis (Drummond et al., 2003) ............13
Gambar 2.3. Skema tahap analisis lucutan adsorptif DNA. Tahap pertama: adsorpsi/akumulasi
asam nukleat pada permukaan elektrode, tahap kedua: pelucutan secara
elektrokimia asam nukleat yang terakumulasi (Rivas et al., 2005)…………...15
Gambar 2.4 Beberapa strategi pendekatan amobilisasi oligonukleotida sebagai probe untuk
pengembangan biosensor hibridisasi berdasarkan DNA ...................................16
Gambar 2.5 Elektrode screen printed ....................................................................................17
Gambar 4.1 Bagan alir penelitian ..........................................................................................19
Gambar 5.1 Isolat DNA ............................................................................ ............................20
Gambar 5.2 Elektroforegram hasil PCR .................................................................................21
Gambar 5.3 Urutan DNA probe dipilih dalam amplikon PCR 192 pb gen
M. tuberculosis ...................................................................................................26
Gambar 5.4 Elektrode emas..................................................................................................27
Gambar 5.5. Formation of the thiol-based monolayer ongold surface for DNA
immobilization and hybridization (Silva et al., 2010)......................................28
Gambar 5.6. Voltammogram siklis. Keterangan: merah dan biru : Au bare, , orange :
Au- modifikasi (cysteamin – glutaraldehid)…………………………………..29
Gambar 5.7. Voltamogram pulsa diferensial larutan blanko, ssDNA probe, ssDNA
target,hibridisasi ssDNA probe- ssDNA target, pada Au - SAM dalam larutan
bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan
pemindaian 50 mVs-1
………………………………………………………….30
Gambar 5.8. Voltammogram DPV sinyal guanin menggunakan Au – SAM dalam larutan
bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. (a) Au - SAM (b) Au - SAM - ssDNA probe- non
DNA komplementer; (c) Au - SAM - ssDNA probe- komplementer ssDNA.
Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1
........31
7
Gambar 5.9. Kalibrasi arus puncak vs konsentrasi ssDNA target. Digunakan konsentrasi
ssDNA Target 0, 5, 10, 15, 20 μgmL-1
secara DPV dengan Au - SAM dalam
larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V.
Kecepatan pemindaian 50 mVs-1
, (n=3)............................................................32
Gambar 5.10. Voltammogram DPV variasi konsentrasi DNA target pada Au – SAM
dalam larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari
-1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1
……………………………....33
8
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Evaluasi Capaian Luaran Kegiatan ...................................................................40
Lampiran 2. Foto-foto Kegiatan ..........................................................................................42
Lampiran 3. Biodata Personalia Penelitianbiodata Ketua Dan Anggota Peneliti…………...43
Lampiran 4. Seminar/Publikasi……………………………………………………………..58
9
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) adalah bakteri patogenik yang
menyebabkan penyakit penyakit tuberculosis (TB) – salah satu yang dapat menyebabkan
kematian dari penyakit infeksi. Akhir-akhir ini sekitar satu dari tiga populasi manusia terinfeksi
TB yang mendunia. Infeksi TB merupakan masalah kesehatan masyarakat yang serius karena
dapat bersamaan/bergabung dengan komplikasi infeksi sindrom defisiensi imun. Diagnosis dan
penanganan yang cepat dari infektor merupakan hal yang penting untuk pengendalian yang
efektif penyakit ini, karena satu pasien diketahui dapat menularkan penyakit terhadap rata-
rata12-15 orang per tahun melalui infeksi pernafasan (WHO, 2004). Treat Asia Report (2009)
menyatakan Indonesia merupakan negara dengan tingkat penderita TB terbanyak ketiga setelah
India dan Cina, dengan setengah juta kasus.
Dalam pengelolaan kasus TB, selain diperlukan metode pengobatan yang tepat dan
penemuan obat baru yang mencegah terjadinya resistensi juga diperlukan metode diagnostik
yang akurat, tepat dan cepat. Pendeteksian yang sensitif terhadap M. tuberculosis meliputi
diagnosis klinis, analisis air dan lingkungan, makanan dan biodefense menjadi hal yang sangat
penting. Selanjutnya menjadi sangat penting untuk proteksi kesehatan masyarakat untuk
mendeteksi, mengidentifikasi, dan mengkuantitasi M. tuberculosis. Metodologi pengujian yang
paling umum adalah berbasis kultur mikroba (Torres-Chavolla and Alocilja, 2009). Biasanya
metode ini meliputi kultur sel, penghitungan sel, pengayaan sel, membutuhkan waktu yang
relatif lama terutama untuk bakteri yang pertumbuhannnya lambat seperti M.tuberculosis. Oleh
sebab itu, metode yang lebih cepat dan sensitif terus dikembangkan untuk pendeteksian TB.
Hingga saat ini, beberapa metode telah dikembangkan untuk deteksi M.tuberculosis yang cepat,
di antaranya polymerase chain reaction (PCR) (Thomson et al, 2005; Choi et al, 1996; Durmaz
et al, 1997), aglutinasi lateks (Krambovitis et al, 1984), enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) (Tamminen et al, 2004; Nassau et al, 1976; Delacourt et al, 1993), deteksi radiometrik
(Middlebrook et al, 1977), genprobe amplified M. Tuberculosis direct test (AMTDT) (Gamboa
et al, 1997), TB rapid cultivation detection technique, seperti MB/Bact system, BactecMGIT
960 system (Liu et al, 2001; Cambau et al, 1999) dan flowcitometri (Qin et al, 2008). Metode-
metode tersebut lebih sensitif dan cepat dibanding metode kultur bakteri, akan tetapi kebanyakan
metode tersebut memerlukan instrumen laboratorium yang kompleks dan keahlian staf yang
10
kualifikasinya tinggi. Oleh karena itu telah dikembangkan pula metode biosensing untuk
pendeteksian M. tuberculosis sehingga dapat efektif untuk pencegahan infeksi TB (Griffiths and
Hall, 1993; Owen, 1994), dengan spektrum matriks analit yang kompleks (saliva, serum, dan
urin) (Turner, 1986).
Berdasarkan penemuan terbaru dan pengetahuan mendalam mengenai gen spesifik pada
Mycobacterium tuberculosis, dikembangkan berbagai sistem amplifikasi gen dan gen probe yang
dapat digunakan sebagai konfirmasi identitas isolat, deteksi langsung spesimen klinis
berdasarkan urutan gen spesifik, dan juga deteksi molekular terhadap resistensi obat. Salah satu
metode diagnostik Mycobacterium tuberculosis yang paling luas digunakan adalah deteksi
terhadap insersi IS 6110.
Kelompok penelitian kami telah mengembangkan biosensor berbasis DNA menggunakan
elektrode berbasis grafit untuk kuantitasi mutasi DNA (Hartati dkk., 2009) dan pendeteksian
bakteri patogen S. typhi dalam sampel darah. Dalam penelitian ini telah dikembangkan
pengembangan biosensor berbasis DNA ini untuk mendeteksi M. tuberculosis dalam gen insersi
IS6110 menggunakan elektrode baik berbasis logam yaitu emas yang dimodifikasi, untuk
mendapatkan sensitivitas yang lebih baik. Selain itu akan dicoba menggunakan screen printed
carbon electrode (SPCE) sehingga dapat dirancang atau diaplikasikan menjadi suatu ‗kit‘ atau
‗lab on chip‘ yang sederhana.
1.2 Tujuan Khusus
Tujuan khusus dalam penelitian tahun ke-1 ini adalah untuk menghasilkan teknologi
biosensing berdasarkan urutan spesifik DNA M. tubercolusis secara elektrokimia, menggunakan
elektrode berbasis logam yang dimodifikasi, sehingga dapat diperoleh suatu metode
pendeteksian yang cepat, akurat, dan sensitif terhadap bakteri patogen tersebut. Studi
penggunaan SPCE akan dicoba juga untuk memperoleh suatu kit yang sederhana, untuk tahun
ke-2.
1.3 Luaran yang ditargetkan
a. Pada tahun pertama diharapkan mendapatkan kondisi yang cocok untuk analisis menggunakan
biosensor, dimulai dari preparasi sampel bakteri, amplifikasi, pemilihan elektrode dan studi
modifikasinya, serta pengujian parameter-parameter analitiknya.
11
b. Pada tahun kedua diharapkan apat dikembangkan terhadap pembuatan lab on chip, sehingga
dihasilkan suatu kit biosensor DNA untuk deteksi M tuberculosis.
Hasil penelitian ini akan dipublikasikan pada jurnal internasional atau jurnal nasional
terakreditasi.
12
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Bakteri M. tubercolusis
Bakteri Mycobacterium tuberculosis adalah patogenik penyebab penyakit Tuberkulosis
atau TB. Mycobacteria termasuk dalam famili Mycobacteriaceae dan termasuk dalam ordo
Actinomycetales. kompleks Mycobacterium tuberculosis meliputi M. tuberculosis, M. bovis, M.
africanum, M. microti, dan M. canettii. Dari beberapa kompleks tersebut, M. tuberculosis
merupakan jenis yang terpenting dan paling sering dijumpai.
M.tuberculosis berbentuk batang, berukuran panjang 5µ dan lebar 3µ (Gambar 2.1), tidak
membentuk spora, dan termasuk bakteri aerob. Mycobacteria dapat diberi pewarnaan seperti
bakteri lainnya, misalnya dengan Pewarnaan Gram. Namun, sekali mycobacteria diberi warna
oleh pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena
itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa mikroorganisme
lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nocardia, Rhodococcus, Legionella
micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada dinding sel mycobacteria, lemak
berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan di bawahnya. Struktur ini menurunkan
permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan,
suatu molekul lain dalam dinding sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan
patogen, menjadikan M. tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga (Todar, 2013).
Gambar 2.1 Gambar SEM M.tuberculosis, Mag 15549X. CDC (Todar, 2013).
13
Pada tahun 1992 WHO telah mencanangkan penyakit tuberkulosis sebagai Global
Emergency. Laporan WHO tahun 2004 menyatakan bahwa terdapat 8,8 juta kasus baru
tuberkulosis pada tahun 2002, sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi kuman tuberkulosis dan
menurut regional WHO jumlah terbesar kasus ini terjadi di Asia Tenggara yaitu 33% dari
seluruh kasus di dunia.
Indonesia berada dalam peringkat ketiga terburuk di dunia untuk jumlah penderita TB.
Setiap tahun muncul 500 ribu kasus baru dan lebih dari 140 ribu lainnya meninggal. Seratus
tahun yang lalu, satu dari lima kematian di Amerika Serikat disebabkan oleh tuberkulosis.
Tuberkulosis masih merupakan penyakit infeksi saluran napas yang tersering di
Indonesia. Keterlambatan dalam menegakkan diagnosa dan ketidakpatuhan dalam menjalani
pengobatan mempunyai dampak yang besar karena pasien Tuberkulosis akan menularkan
penyakitnya pada lingkungan,sehingga jumlah penderita semakin bertambah.
Pengobatan Tuberkulosis berlangsung cukup lama yaitu setidaknya 6 bulan pengobatan
dan selanjutnya dievaluasi oleh dokter apakah perlu dilanjutkan atau berhenti, karena
pengobatan yang cukup lama seringkali membuat pasien putus berobat atau menjalankan
pengobatan secara tidak teratur, kedua hal ini ini fatal akibatnya yaitu pengobatan tidak berhasil
dan kuman menjadi kebal disebut MDR (multi drugs resistance), kasus ini memerlukan biaya
berlipat dan lebih sulit dalam pengobatannya sehingga diharapkan pasien disiplin dalam berobat
setiap waktu demi pengentasan tuberkulosis di Indonesia (Wikipedia, 2013).
2.2 Biosensor DNA
Sensor kimia adalah suatu piranti yang dapat mentransformasi informasi kimia ke dalam
suatu sinyal analitik yang dapat diukur. Sensor kimia biasanya terdiri dari dua komponen dasar
yang dihubungkan secara berurutan: suatu sistem pengenal kimia dan transduser fisika.
Biosensor adalah sensor kimia di mana sistem pengenalannya memanfaatkan mekanisme reaksi
biokimia (Turner et al., 1987).
Biosensor mengombinasikan spesifisitas mekanisme pengenalan secara biologi dengan
teknik transduksi fisika, yang dapat berdasarkan pada prinsip sensing elektrokimia, mekanika,
termal, atau optis. Peranan penting sensor adalah memiliki cetakan yang cocok yang mampu
memfasilitasi pembentukan kompleks probe-target dalam cara tertentu hingga peristiwa
pengikatan dapat menghasilkan sinyal untuk pembacaan pada perangkat elektroniknya.
14
Perangkat biosensor paling tidak harus mengandung molekul yang memungkinkan
terjadinya pertemuan antarpermukaan, dan suatu transduser sinyal kontinu yang berbanding
lurus dengan jumlah molekul yang terikat atau bereaksi pada permukaan sensor, yang dapat
dihubungkan dengan alat pembacaan. DNA pada khususnya cocok untuk aplikasi biosensor ini,
karena interaksi pasangan basa di antara urutan komplementernya yang spesifik dan kuat
(Drummond et al., 2003, Ulker, 2005).
Suatu ssDNA diamobilisasi pada permukaan lapisan transduser, selanjutnya akan terjadi
interaksi pasangan basa dengan DNA target pada permukaannya (hibridisasi). Bagaimana proses
hibridisasi ini dilaporkan atau dianalisis akhirnya bergantung pada metode transduksi sinyal
yang digunakan apakah melalui optis, mekanis, atau elektrokimia.
Amobilisasi probe pada permukaan dapat dilakukan secara pengikatan kovalen maupun
nonkovalen. Macam-macam pengikatan probe secara kovalen telah banyak dikembangkan pada
permukaan elektrode emas (Kelley et al., 1998). Gaya adsorpsi (Wang et al., 1997; Wang et al.,
1998), interaksi hidrofobik basa-basa dengan permukaan raksa (Cai et al., 1997), pengikatan
elektrostatis DNA dengan permukaan positif elektrode karbon (Wang et al., 1996; Wang et al.,
1997)
adalah beberapa metode yang digunakan untuk pengikatan probe nonkovalen.
Terjadinya hibridisasi dapat dideteksi menggunakan indikator redoks yang berinteraksi
dengan dsDNA, seperti suatu interkalator dan pengikatan dalam minor-groove (Hashimoto et al.,
1994)
atau yang berikatan kovalen dengan DNA (Ihara et al., 1997), atau secara langsung
mengukur sinyal oksidasi guanin yang terdapat dalam struktur DNA (label-free electrochemical
detection) (Kara et al., 2002; Napier et al., 1997).
Model amobilisasi pada permukaan transduser dalam biosensor dan hibridisasinya dengan
urutan DNA target ditunjukkan pada Gambar 2.3 berikut:
15
Gambar 2.2 Skema umum biosensor DNA. DNA target ditangkap pada lapisan pengenalan dan
menghasilkan sinyal hibridisasi yang ditransduksi ke dalam sinyal listrik yang
berguna untuk pembacaan dan analisis (Drummond et al., 2003).
Biosensor DNA secara Elektrokimia
Dalam biosensor DNA elektrokimia, suatu urutan pendek (20-40 mer) oligonukleotida
sintetis (probe) diamobilisasi pada permukaan elektrode untuk membuat lapisan pengenal.
Elektrode yang mengandung probe teramobilisasi kemudian dicelupkan ke dalam suatu larutan
sampel hasil amplifikasi PCR yang mengandung oligonukleotida target yang akan diuji. Ketika
urutan target berpasangan secara tepat dengan probe, terbentuk hibrid pada permukaan elektrode.
Terjadinya hibridisasi spesifik antara DNA probe dan target komplementernya dideteksi
menggunakan transduser elektrokimia di bawah kondisi pH, kekuatan ion, dan temperatur
tertentu (Thevenot et al., 1999).
Beberapa teknik elektrokimia sebagai teknik yang cocok dalam pendeteksian hibridisasi
dan adanya kerusakan DNA telah banyak dipublikasikan. Hibridisasi dapat dideteksi dengan
kompleks logam aktif-redoks yang berasosiasi secara selektif dan reversibel dengan DNA rantai
ganda yang diamobilisasi. Metode elektrokimia cocok digunakan untuk diagnosis berdasarkan
DNA. Karena reaksi elektrokimia memberikan sinyal listrik langsung, di sini tidak dibutuhkan
peralatan transduksi sinyalnya. Lebih jauh, karena urutan DNA probe dapat teramobilisasi
dengan cepat untuk bermacam-macam substrat elektrodenya, pendeteksian dapat dihasilkan
dengan penganalisis elektrokimia yang tidak mahal. Tentu saja, sistem portabel untuk pengujian
klinis dan pendeteksian lingkungan saat ini sedang dikembangkan. Strategi sinyal elektrokimia
yang sensitif ini, didasarkan pada proses oksidasi basa DNA baik secara langsung ataupun
16
katalitik, yang diikatkan pada permukaan elektrode oleh interaksi spesifik DNA probe-target dan
maupun dengan reaksi transfer muatan yang dimediakan oleh pasangan basa DNA (Drummond
et al., 2003).
Berbagai teknik elektrokimia dapat dikembangkan sebagai proses transduksi, untuk
mendeteksi terjadinya hibridisasi. Pada tahun 1980-an, teknik lucutan (stripping) dalam
elektrokimia telah didemonstrasikan untuk penentuan logam-logam, yang selanjutnya diterapkan
juga untuk analisis asam nukleat (Palecek, 2002). Skema tahapan analisis stripping ini
ditunjukkan pada Gambar 2.4.
Tahap pertama dari teknik lucutan terdiri dari prakonsentrasi asam nukleat dengan cara
adsorpsi pada permukaan elektrode. Tahap kedua adalah berdasarkan penentuan elektrokimia
(oksidasi dan reduksi) asam nukleat yang diprakonsentrasi. Tahap ini dilakukan dalam larutan
mengandung elektrolit yang bebas asam nukleat dengan sebelumnya dilakukan pembilasan
elektrode dengan larutan bufer untuk menghilangkan molekul yang teradsorpsi lemah atau
nonadsorpsi. Teknik ini disebut lucutan adsorptif. Peningkatan sensitivitas yang tinggi diperoleh
dari konsekuensi prakonsentrasi asam nukleat selama tahap adsorpsi, menghasilkan peningkatan
besar dalam limit deteksi (atau mempertinggi sensitivitas), suatu parameter yang diperlukan
dalam kuantifikasi DNA (Rivas et al., 2005).
Gambar 2.3 Skema tahap analisis lucutan adsorptif DNA. Tahap pertama: adsorpsi/akumulasi
asam nukleat pada permukaan elektrode, tahap kedua: pelucutan secara
elektrokimia asam nukleat yang terakumulasi (Rivas et al., 2005).
Kelompok Palecek (Jelen et al., 1997) mendemonstrasikan untuk pertama kali penggunaan
teknik voltammetri lucutan adsorptif untuk mendeteksi kerusakan DNA yang diinduksi oleh
deaminasi dan depurinasi DNA. Wang et al. (1995) mendemonstrasikan keuntungan
menggunakan teknik analisis lucutan kronopotensiometri arus konstan untuk mempelajari
oksidasi asam nukleat, pertama pada elektrode karbon dan selanjutnya pada elektrode raksa
(Palecek et al., 1997; Wang et al., 1997). Penggunaan software khusus memungkinkan untuk
17
memperoleh sinyal turunan (dt/dE vs E) sebagai sinyal analitik sebagai pengganti aslinya (E vs
t), untuk meningkatkan sensitivitas. Penggunaan koreksi mode baseline yang menyimpang juga
memungkinkan untuk memperoleh puncak yang sangat baik bahkan untuk proses yang
mendekati oksidasi pelarut dan sinyal voltammetri yang kurang baik.
Modifikasi elektrode banyak dilakukan untuk meningkatkan sensitivitas pengukuran
dalam beberapa pengembangan biosensor, termasuk biosensor DNA. Beberapa teknik modifikasi
elektrode dikaitkan dengan kepentingan amobilisasi DNA probe sebagai pengenal urutan DNA
pasangannya, ditunjukkan pada Gambar 2.4.
Elektrode grafit screen-printed (Gambar 2.5) juga telah digunakan untuk mengakumulasi
asam nukleat dan perilakunya mirip dengan yang diamati pada elektrode pasta karbon (Wang et
al., 1996; Marrazza et al., 1999).
Gambar 2.4 Beberapa strategi pendekatan amobilisasi oligonukleotida sebagai probe untuk
pengembangan biosensor hibridisasi berdasarkan DNA.
A. Self-assembling pada oligonukleotida bertiolasi atau oligonukleotida reguler
pada permukaan emas;
B. Amobilisasi oligonukleotida terbiotinilasi pada permukaan yang dimodifikasi
avidin;
C. Ikatan kovalen oligonukleotida pada permukaan derivatisasi;
D. Akumulasi adsortif oligonukleotida pada permukaan elektrode;
E. Amobilisasi melalui matriks polimer
(Rivas et al., 2005).
18
Gambar 2.5 Elektrode screen printed
2.3 Peta Jalan Penelitian
TAHUN 1
• Isolasi DNA kultur bakteri M. tuberculosis
•Disain urutan DNA probe
•PCR
•Preparasi dan karakterisasi elektrode
•Penentuan parameter analitk
TAHUN 2
•Perbandingan dengan metode lain (elektroforesis)
•Pengujian elektrode SPCE
•Disain kit/miniatur biosensor DNA
•Pengujian parameter analitik
Teknologi biosensing DNA untuk deteksi
M.tuberculosis
19
BAB 3. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1 Tujuan Khusus Penelitian
1). Pengembangan metode analisis yang cocok untuk penggunaan rutin untuk pendeteksian
bakteri patogen M.tuberculosis dalam sampel darah dengan lebih cepat dan ekonomis, juga
mengeliminasi teknik elektroforesis yang menggunakan bahan berbahaya (karsinogenik).
2). Menstandarisasi dan membandingkannya dengan metode lain seperti elektroforesis atau
serologi, memvalidasi metode.
3). Mengembangkan teknologi lab on chip.
3.2 Urgensi (keutamaan) Penelitian
Indonesia, sebagai salah satu negara yang sedang ber-kembang, mempunyai berbagai
macam masalah kesehatan, antara lain penyakit-penyakit infeksi yang mengenai jaringan paru-
paru yang disebabkan oleh M.tuberculosis. Penyakit Tuberkulosis (TB) merupakan salah satu
penyakit tertua yang pernah dialami manusia dan masih menjadi salah satu penyakit menular
pembunuh terbesar didunia, meskipun telah ditemukan vaksin dan antibiotik. Karena itu
penemuan vaksin dan obat baru menjadi sangat penting untuk mencegah epidemi TB yang dapat
membunuh dua juta orang setiap tahun di seluruh dunia. Secara rasional, untuk mengembangkan
agen anti-TB baru, menjadi penting untuk mempelajari genetika dan fisiologi Mycobacterium
tuberculosis dan mikobakteria terkait. Sama pentingnya juga untuk memahami interaksi inang
dengan M. tuberculosis untuk mempelajari bagaimana interaksi bakteri ini menghindari
pertahanan tubuh dan kemudian dapat menyebabkan penyakit. Beberapa studi mengidentifikasi
bahwa beberapa gen M. tuberculosis paling berpotensi sebagai penyebab virulensi. Dengan
mempelajari beberapa gen dan protein yang dikode oleh gen tersebut dapat memberikan target
baru untuk pengembangan vaksin dan obat baru, serta pengembangan metode diagnostik yang
lebih sensitif (Smith, 2003).
Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian yang dikembangkan oleh kelompok
biosensor elektrokimia Jurusan Kimia Unpad. Dalam rangka pengembangan biosensor
elektrokimia untuk uji-uji berbasis interaksi basa-basa komplementer DNA, maka dibutuhkan
20
urutan DNA probe yang sangat spesifik agar hanya mengenali urutan target yang dikehendaki.
Disain urutan DNA probe ini dirancang sedemikian rupa agar tidak menempel dengan urutan
DNA yang lain, sehingga diuji selektivitasnya menggunakan urutan-urutan yang lain. Biosensor
ini dapat menggunakan elektrode grafit/emas, untuk deteksi penyakit infeksi. Elektrode-
elektrode itu dimodifikasi untuk mendapatkan sensitivitas yang tinggi. Deteksi dini bahkan
sebelum antibodi dalam tubuh banyak terbentuk dapat terdeteksi dari urutan penginfeksi.
Pengembangan metode biosensor berbasis interaksi urutan basa DNA meliputi pemilihan
elektrode yang cocok, pemilihan metode untuk ammobilisasi DNA probe ke elektrode dan
metode pendeteksiannya. Metode-metode ini perlu dikaji dan diuji supaya bisa diaplikasikan ke
sampel nyata.
21
BAB 4. METODE PENELITIAN
4.1 Desain Penelitian
Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 3.1. Untuk mencapai tujuan penelitian,
maka rangkaian penelitian meliputi enam tahap yang dibagi dalam dua tahun penelitian.
Penelitian Tahun ke-1
1. Isolasi DNA, PCR
2. Perancangan urutan DNA probe, studi elektrode: amobilisasi DNA probe dan hibridisasi
probe- target.
3. Standarisasi biosensor DNA.
Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium penelitian Jurusan Kimia FMIPA Unpad.
Penelitian Tahun ke-2
4. Studi aplikasi SPCE.
5. Standarisasi biosensor dengan SPCE untuk tujuan pembuatan kit biosensor DNA.
6. Aplikasi biosensor terhadap sampel nyata.
Penelitian akan dilakukan di Laboratorium penelitian Jurusan Kimia FMIPA Unpad.
Luaran per Tahun
Hasil penelitian tahun pertama diharapkan dapat menghasilkan standarisasi metode biosensor
DNA untuk deteksi M.tuberculosis, dan artikel ilmiah yang dapat dipublikasikan di jurnal
nasional.
Luaran tahun kedua diharapkan dihasilkan metode dan kit pengujian biosensor DNA yang teruji
untuk deteksi M.tuberculosis, dan artikel ilmiah yang dapat dipublikasikan di jurnal
internasional.
22
4.2 Diagram Alir Penelitian
di
Gambar 4.1. Bagan rencana penelitian
Modifikasi Elektrode
- Studi amobilisasi DNA probe pada permukaan elektrode
- Hibridisasikan dengan urutan DNA target standar
- Studi sinyal guanin probe-target
- Studi selektivitas
- Lisis, isolasi DNA
- PCR
Kinerja elektrode yang dioptimasi:
batas deteksi, linieritas, keterulangan, akurasi
- Aplikasi terhadap standar
- Aplikasi terhadap sampel nyata
- Standarisasi metode
- Uji statistik
Aplikasi menggunakan SPCE
Tahun ke-1
Perancangan
urutan DNA
probe, dan
standarisasi
biosensor DNA,
Persiapan sampel
dan
penerapan metode
PCR-biosensor
DNA terhadap
M.tuberculosis
Tahun Ke-2
Studi aplikasi
SPCE,
standarisasi
untuk tujuan
pembuatan kit
biosensor,
aplikasi terhadap
sampel nyata
Kultur M.tuberculosis
Amplikon PCR
Kit biosensor DNA teruji untuk M.tuberculosis
- Hibridisasi probe- amplikon PCR
- Analisis data
Metode biosensor DNA M.tuberculosis
23
Indikator Capaian yang Terukur
Indikator capaian yang terukur adalah data yang diperoleh serta analisisnya, pelaksanaan
seminar, dan publikasi.
4.3 Metode Penelitian
Bahan Penelitian
Bahan Kimia
Oligonukleotida sintetis 23-mer (target dan probe komplemennya). Probe tersubstitusi
inosin mengikuti urutan target. Semua larutan stok DNA (100 mg/L) dibuat dengan air steril
deionisasi, dan dijaga tetap dingin. Larutan probe yang lebih encer dibuat menggunakan bufer
asetat 0,50 M yang mengandung: 20 mM NaCl, pH 4.80 (ABS). Larutan target yang lebih encer
akan dibuat menggunakan bufer fosfat 50 mM yang mengandung 20 mM NaCl, pH 7,4 (PBS).
Dua pasang primer M.tuberculosis, Reagen lisis, Taq polimerase, dll. Bahan kimia lain dengan
grade analitik.
Tahapan Penelitian
Penelitian terdiri dari 4 tahap, yaitu :
1). Persiapan sampel dan penerapan metode PCR-biosensor DNA terhadap sampel.
Penyiapan sampel bakteri M.tuberculosis dilakukan isolasi DNA genomik dari biakan
M.tuberculosis menggunakan reagen lisis sel. Untuk sampel darah meliputi pemisahan plasma
dan sel darah merah, dilanjutkan dengan lisis sel menggunakan reagen lisis untuk mengisolasi
DNA. Penerapan metode PCR-biosensor DNA dilakukan seperti terhadap senyawa standar, akan
tetapi produk PCR harus didenaturasi beberapa detik sebelum dihibridisasikan dengan DNA
probe.
Isolasi DNA
a. Isolasi DNA dari kultur cair
Bakteri M. tuberculosis ditumbuhkan dalam media cair Sauton 5 mL pada 37°C selama 4
minggu, kemudian dilakukan sentrifugasi pada 10.000 x g selama 10 menit, diambil pelet
selnya dan supernatan dibuang. DNA genom bakteri kemudian diisolasi dari pelet sel
mengikuti manual High Pure DNA PCR preparation kit Roche.
24
b. Isolasi DNA dari sampel sputum dan cairan pleura
Sebanyak 200 μL sampel didekontaminasi dengan metode N-asetil L-Sistein (NALC)-
NaOH, dilanjutkan dengan setrifugasi pada 8.000 rpm selama 15 menit, diambil pelet
selnya dan supernatan dibuang. DNA genom bakteri kemudian diisolasi dari pelet sel
mengikuti manual High Pure DNA PCR preparation kit Roche.
PCR dan Elektroforesis
PCR dilakukan dengan menggunakan FastStart PCR 2x Master Mix Roche, dengan
menambahkan air bebas nuclease, primer spesifik dan hasil isolat DNA. Primer yang digunakan
pada penelitian ini adalah :
F:GAACTGGGCTTCGACATGAT (20bp)
R:ATCAGGTGGGCTACCAAATG (20bp)
Primer ini mengamplifikasi urutan insersi pada gen IS6110 (Bhacmann et al, 2008; Raza et al.,
2009). Kondisi PCR yang digunakan adalah pre-denaturasi pada 95ºC selama 5 menit, diikuti
oleh 35 siklus denaturasi pada 95ºC selama 1 menit, annealing pada 55ºC selama 1 menit, dan
perpanjangan pada 72ºC selama 1 menit, dan terakhir perpanjangan akhir pada 72ºC selama 10
menit. Elektroforesis dilakukan dengan agarosa 1.5%, Sybergreen staining, buffer TAE (tris,
asetat, EDTA) dan dijalankan pada 80 Volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi
diatas UN transiluminator.
3). Perancangan urutan DNA probe, studi elektrode: amobilisasi DNA probe dan hibridisasi
probe- target. Dengan menggunakan software DNA star, urutan DNA probe dirancang pada
daerah gen insersi IS6110 spesifik M.tuberculosis.
4). Modifikasi elektrode emas-thiol dengan metode self assembly monolayer, dan studi
voltammetri.
a. Pretreatment dan Modifikasi Elektrode Emas
Elektrode emas digosok dengan alumina slurry pada microcloth selama 5 menit, dibilas
dengan akuabides lalu disonikasi dalam etanol dan air masing-masing selama 2 menit. Setelah
dibersihkan, elektrode emas direndam dalam larutan piranha (H2SO4/H2O2, 1:3, v/v) selama 10
menit pada suhu ruang. Elektrode emas dicelupkan ke dalam larutan 0,1 M buffer fosfat pH 7,0,
25
kemudian diberi potensial 0,2 - 1,5 V sebanyak 10 siklus pada laju pemindaian 50 mV.s-1
.
Setelah itu elektrode direndam dengan akuabides selama 10 menit dan disinari dengan sinar UV
selama 15 menit.
Elektrode emas yang telah di-pretreatment direndam dalam 25 mM larutan etanolik Cys
selama 2 jam pada suhu ruang untuk memungkinkan interaksi antara emas dan gugus tiol
(Au/Cys). Setelah itu elektrode dicuci dengan akuabides, dan diinkubasi dalam larutan Glu
(2,5% Glu dalam 0,1 M bufer fosfat pH 7,0 pada suhu 4°C selama 50 menit. Setelah itu
elektrode dicuci dengan akuabides steril.
b. Amobilisasi dan Hibridisasi DNA dengan Menggunakan Elektrode Emas termodifikasi Tiol
Elektrode emas termodifikasi gugus tiol (Au/Cys/Glu) diinkubasi dengan larutan ssDNA
probe (0,1 M buffer fosfat pH 7,0 pada 10 μg/ml) selama 1 jam pada suhu ruang. Kemudian
elektrode dicuci selama 2 x 2 menit dengan buffer fosfat untuk menghilangkan ssDNA probe
yang tidak terikat. Kemudian dikarakterisasi secara voltammetri siklik dalam larutan 0,1 M
buffer fosfat pH 7,0.
Elektrode Au/Cys/Glu yang sudah termodifikasi oleh ssDNA probe diinkubasi pada
larutan yang mengandung ssDNA target komplemen / non-komplemen sehingga terbentuk
dsDNA pada permukaan elektrode emas termodifikasi. Setelah itu elektrode emas dicuci dua kali
dengan larutan buffer fosfat pH 7,0 untuk menghilangkan DNA target yang tidak terhibridisasi.
26
BAB 5. HASIL YANG DICAPAI
5.1 Isolasi DNA dan PCR
Isolat DNA (Gambar 5.1) diperoleh dari isolasi kultur cair bakteri M. tuberculosis yang
ditumbuhkan dalam media cair Sauton, sentrifugasi, diambil pelet selnya dan supernatan
dibuang. DNA genom bakteri kemudian diisolasi dari pelet sel mengikuti manual High Pure
DNA PCR preparation kit Roche.Sedangkan Isolasi DNA dari sampel sputum dan cairan pleura
dilakukan dengan metode N-asetil L-Sistein (NALC)-NaOH, dilanjutkan dengan setrifugasi,
diambil pelet selnya dan supernatan dibuang. DNA genom bakteri kemudian diisolasi dari pelet
sel mengikuti manual High Pure DNA PCR preparation kit Roche.
Gambar 5.1 Isolat DNA
Tahapan PCR dilakukan dengan menggunakan FastStart PCR 2x Master Mix Roche,
dengan menambahkan air bebas nuclease, primer spesifik dan hasil isolat DNA. Primer yang
digunakan pada penelitian ini adalah :
F:GAACTGGGCTTCGACATGAT (20bp)
R:ATCAGGTGGGCTACCAAATG (20bp)
Primer ini mengamplifikasi urutan insersi pada gen IS6110 (Bhacmann et al, 2008; Raza et al.,
2009). Dari analisis dengan Blast diperoleh informasi bahwa urutan primer ini terdapat pada
hypothetical protein CFBR 0529 dari genom Mycobacterium tuberculosis. Urutan ini lestari
pada beberapa strain M. tuberculosis, M. bovis dan M. africanum. Panjang amplikon yang
dihasilkan adalah 192 pb.
Gambar 5.2 menunjukan elektroforegram hasil elektroforesis amplikon PCR bakteri M.
tuberculosis H37Rv dari ATCC, dan isolat DNA dari sampel sputum dan cairan pleura
penderita TB.
27
Gambar 5.2 Elektroforegram hasil PCR. Keterangan: Lajur 1-6 Sampel, 7. Marker, 8. ddH2O,
9-14 Sampel, 15 Kontrol positif dari isolat M. tuberculosis. Kondisi PCR:
denaturasi 1 T= 95 oC selama 5 menit, denaturasi 2 T= 95
oC selama 30 menit, Tm
58 oC 1 menit, ekstensi T- 72
oC 1 menit diulang 34 siklus.
5.2 Disain Probe
Probe merupakan oligonukleotida pendek sepanjang 20-25 mer yang digunakan pada
biosensor DNA secara voltammetri sebagai lapisan pengenal yang dapat berhibridisasi dengan
DNA target sintesis maupun target sampel. Urutan DNA probe sepanjang 20 mer didesain
spesifik berdasarkan urutan fragmen DNA gen IS6110 M. tuberculosis hasil amplifikasi dari
metode PCR. Desain urutan probe yang bagus memiliki nilai identities sebesar 100% artinya
probe komplemen dengan urutan DNA target sintesis ataupun dengan amplikon PCR. Selain itu,
probe harus memiliki persen homologi nol yang berarti probe berikatan spesifik pada daerah
tertentu dari urutan amplikon PCR dan probe tidak menempel didaerah urutan yang lain. Dengan
demikian, untuk mengetahui bahwa probe yang dirancang telah memenuhi syarat-syarat tersebut
maka digunakan software NCBI (www.ncbi.nlm.gov.nih) melalui metode BLAST® (Basic
Local Alignment Search Tool®) (Gambar 5.3).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
28
5‘-GAACTGGGCT TCGACATGAT GACGATCGAC GTCGATGTCG CGGCGTCGAC
GGGCAATCCA GGGCTGCGAG CTGAGTTTGG CGATCGGTTG CCGGTGGTCC
TGCTGGACGG CCGCGAGCAC AGCTACTGGG AGGTCGACGA GCACCGGCTG
CGTGCGGATA TAGCCCGCAG CACATTTGGT AGCCCACCTG AT-3‘
Gambar 5.3. Urutan DNA probe dipilih dalam amplikon PCR 192 pb gen M. tuberculosis
5.3 Studi modifikasi elektrode
Elektrode emas yang digunakan berdiameter 0,5 mm dan panjang 1,5 cm, dihubungkan
dengan kawat tembaga, seperti ditunjukkan pada Gambar 5.4.
Gambar 5.4 Elektrode emas
Elektrode emas dimodifikasi menggunakan cysteamin dan glutaraldehida, untuk
membentuk self assembly monolayer. Pretretment permukaan emas sebelum derivatisasi dengan
tiol dimulai dengan tahap penghalusan menggunalkan Al2O3, diikuti dengan treatment drastis
yaitu menggunakan larutan oksidatif, larutan Piranha (suatu campuran asam sulfat pekat dan
larutan hidrogen peroksida 70:30 V/V) yang dididihkan pada temperatur ruang. Tahap ketiga
adalah regenerasi dengan siklus potensial dengan mencelupkan elektrode dalam larutan asam
sulfat hingga profil yang diharapkan tercapai. Amobilisasi urutan probe dilakukan juga secara
self assembling senyawa yang bertiolasi yaitu cysteamin, sebagai suatu platform untuk
selanjutnya bergabung dengan oligonukleotida, secara interaksi elektrostatik atau ikatan kovalen.
Terakhir adalah dilakukan melalui tiolasi senyawa yang mengandung gugus fungsi hidroksil,
amino, atau karboksil yang akan berikatan kovalen dengan asam nukleat, dalam hal ini
digunakan glutaraldehida (Gambar 5.5).
29
Gambar 5.5. Formation of the thiol-based monolayer ongold surface for DNA immobilization
and hybridization (Silva et al., 2010).
Karakterisasi elektrode setelah modifikasi dilakukan secara voltammetri sklis (Gambar
5.6). Dari voltammogram yang ditunjukkan pada Gambar 5.5, elektrode emas yang telah
dimodifikasi thiol secara SAM memberikan arus puncak yang paling tinggi untuk rekasi reduksi-
oksidasi Fe2+
, dibandingkan dengan elektrode yang tanpa modifikasi.
Gambar 5.6. Voltammogram siklis. Keterangan: merah dan biru : Au bare, , orange : Au-
modifikasi (cysteamin – glutaraldehid)
30
Elektrode emas di-pretreatmen untuk menghilangkan pengotor pada permukaannya,
mengikuti metode yeng dikemukakan Silva et.al. Permukaan yang tidak terkontaminasi penting
untuk chemisorpsi yang baik dari gugus thiol dan permukaan emas. Metode SAM menyebabkan
terbentuknya ikatan antara thiol di permukaan emas dengan DNA probe yang terikat pada ligan
aldehid. DNA target kemudian akan berhibridisasi pada DNA probe tanpa guanin, dan terdeteksi
dari sinyal guanin DNA target.
Modifikasi elektrode dapat dilakukan dengan dua cara: adsorpsi thiol pada permukaan
emas diikuti oleh adsorpsi reseptor spesifik pada monolayer thiol monolayer, atau adsorpsi thiol
difungsikan pada permukaan emas, dimana thiol berperan sebagai reseptor. Dalam kedua kasus,
kinerja modifikasi tergantung pada kualitas permukaan emas. Jika permukaan emas sangat halus,
derajat sampulnya lebih tinggi, monolayer diperoleh terbentuk dengan baik, dan elektrode
memiliki kinerja analitis yang baik.
5.4 Studi Voltammetri
Dalam deteksi secara elektrokimia bebas label, peristiwa hibridisasi menghasilkan
perubahan sinyal listrik . Teknik deteksi ini menghilangkan penggunaan indikator dan langkah-
langkah tambahan lainnya. Dalam deteksi bebas label ini, dapat dilakukan dengan memonitor
perubahan aktivitas redoks intrinsik dari target asam nukleat. Di antara empat asam basa nukleat,
basa Guanin merupakan basa yang paling mudah teroksidasi dan yang paling cocok untuk
deteksi hibridisasi tanpa label/indikator. Untuk menghilangkan sinyal Guanin di urutan probe,
guanin pada urutan probe disubstitusi dengan Inosin yang dapat berkomplemen dengan sitosin
dan memiliki sinyal oksidasi yang rendah, sehingga sinyal oksidasi hanya datang dari Guanin
dari urutan DNA target yang berhibridisasi dengan DNA probe.
Gambar 5.7 menunjukkan voltamogram differensial pulsa untuk elektrode emas
dengan blanko,( Au - SAM ), Au - SAM – DNA target, Au - SAM -probe DNA dan Au - SAM –
hibrid ssDNA probe- ssDNA target.
31
Gambar 5.7. Voltamogram pulsa diferensial larutan blanko, ssDNA probe, ssDNA target,
hibridisasi ssDNA probe- ssDNA target, pada Au - SAM dalam larutan bufer
fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan
pemindaian 50 mVs-1
.
Seperti ditunjukkan dalam Gambar 5.6, tidak ada arus puncak oksidasi guanin yang
dapat diamati pada 0,1 M larutan PB (blanko), dan begitu pula halnya untuk ssDNA probe
karena substitusi guanin dengan inosin. Voltamogram dari target ssDNA dan hibrid ssDNA
probe-target menunjukkan sinyal pada 0,21 V dan arus puncak yang 11,7 dan 3,65 μA, masing-
masing. Hibrid dsDNA memberikan puncak oksidasi lebih rendah dari ssDNA karena basa
nitrogen di dsDNA tampaknya disembunyikan ke dalam struktur heliks dari dsDNA dan
kekakuan struktur membuat basa nitrogen jauh dari permukaan elektroda, oleh karena itu proses
oksidasi adalah diblokir. Sinyal target ssDNA lebih tinggi karena fleksibilitas guanin pada
permukaan elektroda.
5.5 Spesifisitas DNA probe
Spesifisitas DNA probe untuk deteksi M. tuberkulosis dengan menggunakan biosensor
Au - SAM diuji dengan menganalisis sinyal oksidasi dari campuran hibrid DNA probe- target
dan DNA probe- non komplementer pada Au - SAM. Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 5.8.
32
Gambar 5.8. Voltammogram DPV sinyal guanin menggunakan Au – SAM dalam larutan bufer
fosfat 0,1 M pH 7,0. (a) Au - SAM (b) Au - SAM - ssDNA probe- non DNA
komplementer; (c) Au - SAM - ssDNA probe- komplementer ssDNA. Pemindaian
potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian 50 mVs-1
.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5.7, tidak ada puncak arus yang dapat diamati
pada 0,21 V untuk hibrid ssDNA - non komplementer, karena hibridisasi antara ssDNA probe
dan ssDNA non komplementer tidak terjadi. Sedangkan hibrid probe- target terdeteksi pada 0,21
V. Oleh karena itu, urutan DNA probe yang dirancang dalam biosensor DNA secara
elektrokimia ini memiliki spesifisitas yang baik untuk urutan oligonukleotida spesifik
5.6 Kurva Kalibrasi
Kurva kalibrasi diperoleh dengan hibridisasi 10 mg mL-1
ssDNA probe dengan 0,
5,10,15 dan 20 mg mL-1
ssDNA target. Masing-masing konsentrasi diukur tiga kali untuk
mendapatkan standar deviasi pengukuran. Kurva kalibrasi ditunjukkan pada Gambar 5.9. Arus
puncak yang dihasilkan oleh masing-masing konsentrasi bervariasi, dan ada hubungan linear
antara peningkatan konsentrasi terhadap tinggi arus puncak. Gambar voltammogram ditunjukkan
pada Gambar 5.9.
33
Gambar 5.9. Kalibrasi arus puncak vs konsentrasi ssDNA target. Digunakan konsentrasi ssDNA
Target 0, 5, 10, 15, 20 μgmL-1
secara DPV dengan Au - SAM dalam larutan bufer
fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V. Kecepatan pemindaian
50 mVs-1
, (n=3).
Seperti yang terlihat pada Gambar 5.9, dan voltammogram Gambar 5.10, linieritas
sinyal antara 0 dan 20 mg mL-1
belum memberikan nilai yang baik dengan koefisien korelasi
0,986. Persamaan regresinya adalah y = 0,489 x + 0,383. Kita harus menghitung interval
kepercayaan untuk untuk menguji kesalahan sistematis dalam pengukuran dan dalam interval
kepercayaan 95 % nilai intersep adalah dari -0,90359 sampai 1,67016, menunjukkan bahwa
persamaan melalui titik nol, sehingga persamaan regresi memiliki penyesuaian untuk Y = 0,5152
X. Batas deteksi dan batas kuantifikasi nilai dihitung menggunakan persamaan: YLOD = yb + 3
Sb dan YLOQ = yb + 10 Sb. Nilai batas deteksi diperoleh 3,47 μg mL-1
dan nilai batas
kuantifikasi adalah 11,56 µg mL-1
.
34
Gambar 5.10. Voltammogram DPV variasi konsentrasi DNA target pada Au - SAM dalam
larutan bufer fosfat 0,1 M pH 7,0. Pemindaian potensial dari -1,0 - 1,0 V.
Kecepatan pemindaian 50 mVs-1
.
35
BAB 6. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA
Tahun ke-1
No KEGIATAN BULAN
1 2 3 4 5 6 7 8
1. Isolasi DNA, PCR
2. Perancangan urutan DNA probe, studi elektrode:
amobilisasi DNA probe dan hibridisasi probe- target
3. Standarisasi metode biosensor DNA
4. Penyusunan publikasi nasional untuk tahun pertama
5. Pembuatan laporan tahunan
Tahun ke-2
No KEGIATAN BULAN
1 2 3 4 5 6 7 8
1. Aplikasi menggunakan SPCE
2. Standarisasi penggunaan SPCE
3. Aplikasi terhadap sampel nyata
4. Uji statistik
5. Penyusunan publikasi internasional
6. Pembuatan laporan tahunan
36
BAB 7. KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
- Primer PCR menghasilkan pita amplikon yang sesuai dilihat dari elektroforegram.
- Modifikasi elektrode memberikan profil voltammogram siklik yang sama setelah
pengujian menggunakan Fe2+
.
- Reaksi hibridisasi pada permukaan elektrode diamati dari sinyal guanin pada potensial
+0,21 V. Nilai sensitivitas yang diperoleh sebesar 0,52, dan batas deteksi 3,47 µg mL-1
.
7.2 Saran
- Data validasi belum lengkap untuk menguji selektivitas dari urutan DNA probe yang didisain.
37
DAFTAR PUSTAKA
Brabec, V and G. Dryhurst. 1978. Electrochemical oxidation of polyadenylic acid at graphite
electrodes. J. Electroanal. Chem. 91: 219–229.
Cai, X., G. Rivas, H. Shiraischi. 1997. Electrochemical analysis of formation of polynucleotide
complexes in solution and at electrode surfaces. Anal. Chim. Acta. 344: 64-76.
Cambau, E, C. Wichlacz, C. Truffot-Pernot, and V. Jarlier, ―Evaluation of the new MB Redox
system for detection of growth of mycobacteria,‖ Journal of Clinical Microbiology, vol.
37, no. 6, pp. 2013–2015, 1999.
Chaudhry, R., B V Laxmi, N. Nisar, K. Ray, D. Kumar. (1997). Standardisation of polymerase
chain reaction for the detection of Salmonella typhi in typhoid fever. J. Clin Pathol .
50:437-439.
Choi, Y.J, Y. Hu, and A. Mahmood, ―Clinical significance of a polymerase chain reaction assay
for the detection of Mycobacterium tuberculosis,‖ American Journal of Clinical
Pathology, vol. 105, no. 2, pp. 200–204, 1996.
Delacourt, C, J. Gobin, J. L. Gaillard, J. De Blic, M. Veron, and P. Scheinmann, ―Value of
ELISA using antigen 60 for the diagnosis of tuberculosis in children,‖ Chest, vol. 104, no.
2, pp. 393–398, 1993.
Drummond, T. G., M. G. Hill, J. K. Barton. 2003. Electrochemical DNA sensors. Review Nature
Biotechnology. Nature Publisihing Group. 21, 1192 -1199.
Durmaz, R, A. Aydin, B. Durmaz, N. E. Aydin, B. S. Akbas¸ak, and S. G¨unal, ―Sensitivity of
two-stage PCR amplification for detection ofMycobacterium tuberculosis in paraffin-
embedded tissues,‖ Journal of Microbiological Methods, vol. 29, no. 2, pp. 69–75, 1997.
Gamboa, F, J. M. Manterola, J. Lonca et al., ―Detection and identification of mycobacteria by
amplification of RNA and DNA in pretreated blood and bone marrow aspirates by a simple
lysis method,‖ Journal of Clinical Microbiology, vol. 35, no. 8, pp. 2124–2128, 1997.
Griffiths, D, and G. Hall, ―Biosensors—what real progress is being made?‖ Trends in
Biotechnology, vol. 11, no. 4, pp. 122– 130, 1993.
Hartati, Y.W., (2009). Biosensor Voltammetri untuk deteksi urutan spesifik dan mutasi basa
tunggal pada fragmen DNA. Disertasi: Unpad
Hashimoto, K., K. Ito, Y. Ishimori. 1994. Novel DNA sensor for electrochemical gene detection.
Anal. Chim. Acta 286: 219-224.
Kai, E., S. Sawata, K. Ikebukuro, T. Lida, T. Honda, I. Karube, (1999). Detection of PCR
Products in Solution Using Surface Plasmon Resonance. Anal. Chem. 71, 796-802
Kara, P., K. Kerman, D. Ozkan, B. Meric, A. Erdem, P.E. Nielsen, M. Ozsoz. 2002. Label-free
and label-based electrochemical detection of hybridization by using methylene blue and
peptide nucleic acid probes at chitosan modified carbon paste electrodes. Electroanalysis
14: 1685-1690.
Krambovitis,E, M. B.Mcillmurray, P. E. Lock,W. Hendrickse, and H. Holzel, ―Rapid diagnosis
of tuberculous meningitis by latex particle agglutination,‖ Lancet II, p. 538, 1984.
Liu, Z, H, X. D. Shi, and X. Y. Wu, ―The method of Mycobacterium tuberculosis rapid
cultivation fluorescence detection,‖ Chinese Journal of Clinical Laboratory Science, vol.
19, p. 347, 2001.
Loewy, Z.G., R. Pottathilin, P. Singh, B.P. Sharma, P. Tyle. 1993. Antibody, Biosensor and
Nucleic Acid Technologies. Van Nostrand Reinhold, New York.
38
Lucarelli, F.,Giovanna Marrazza, Anthony P. F. Turner, and M. Mascini. (2004).Carbon and
gold electrodes as electrochemical transducers for DNA hybridization sensors. Biosensors
and Bioelektronics. 19: 515-530.
Meric, B., K. Kerman, D. Ozkan, P. Kara, S. Erensoy, U.S Akarca, M. Mascini, M. Ozsoz. 2002.
Electrochemical DNA biosensor for the detection of TT and hepatitis B virus from PCR
amplified real samples by using methylene blue. Talanta 56: 837- 846.
Middlebrook, W. D. Tigertt, and Z. Reggiardo, ―Automatable radiometric detection of grwoth of
Mycobacterium tuberculosis in selective media,‖ American Review of Respiratory Disease,
vol. 115, no. 6, pp. 1066–1069, 1977.
Nassau, E, E. R. Parsons, and G. D. Johnson, ―The detection of antibodies to Mycobacterium
tuberculosis by microplate enzyme linked immunosorbent assay (ELISA),‖ Tubercle, vol.
57, no. 1, pp. 67–70, 1976.
Nath, G., P. Maurya, A.K. Gulati, T. B. Singh,R. Srivastava, K. Kumar, S. K.Tripathi, (2010),
Comparison of V1 serology and nested PCR in diagnosis of chronic typhoid carriers in two
different study populations in typhoid endemic area of India. Southeast Asian J. Trop Med
Public health.41: 3
Newton, C.R and A. Graham. 1994. PCR Inroduction to Biotechniques. Oxford: BIOS Scientific
Publishers.
Owen, V M, ―Market requirements for advanced biosensors in healthcare,‖ Biosensors and
Bioelectronics, vol. 9, no. 6, pp. 29–35, 1994.
Palecek, E. 1983. Dalam: Milazzo, G (ed) Topics in bioelectrochemistry and bioenergetics.
London: Wiley.
Prakash, P., O. P. Mishra, A. K Singh, A.K. Gulati, G. Nath. (2005). Evaluation of Nested PCR
in Diagnosis of Typhoid Fever. J. Clin Microbiol. 43:1
Qin, D L, X. X. He, K. M. Wang, and W. H. Tan, ―Using fluorescent nanoparticles and SYBR
Green I based twocolor flow cytometry to determine Mycobacterium tuberculosis avoiding
false positives,‖ Biosensors and Bioelectronics, vol. 24, no. 4, pp. 626–631, 2008.
Rivas, G., M.L. Pedano, N. Ferreyra. 2005. Electrochemical biosensor for sequence-specific
DNA detection. Anal. Letters 38: 2653–2703.
Silva, M.M.S., I. T. Cavalanti, M. F. Barroso, M. G. F. Sales & R. F. Dutra. 2010. Gold
electrode modified by self assembled monolayers of thiol to determine DNA sequences
hybridization. Journal Chem Science. 122: 911-917
Song, Y. 2008. Experimental and theoretical study of DNA oxidation. Nature Precedings :
hdl:10101/npre.2008.1797.1
Tamminen, M, T. Joutsjoki, M. Sj¨oblom et al., ―Screening of lactic acid bacteria fromfermented
vegetables by carbohydrate profiling and PCR-ELISA,‖ Letters in AppliedMicrobiology,
vol. 39, no. 5, pp. 439–444, 2004.
Thevenot, D. R., K. Toth, R.A. Durst, G.S. Wilson. 1999. Electrochemical biosensors:
Recommended definitions and classification. Pure Appl. Chem. 71: 2333-2348.
Thomson, LM, H. Traore, H. Yesilkaya et al., ―An extremely rapid and simple DNA-release
method for detection of M.tuberculosis from clinical specimens,‖ Journal of
MicrobiologicalMethods, vol. 63, no. 1, pp. 95–98, 2005.
Torres-Chavolla, E and E. C. Alocilja, ―Aptasensors for detection of microbial and viral
pathogens,‖ Biosensors andBioelectronics, vol. 24, no. 11, pp. 3175–3182, 2009.
Turner,A P F, M. F. Cardosi,G. Ramsay, B.H. Schneider, and A. Swain, ―Biosensors for use in
the food industry: a new rapid bioactivity monitor,‖ in Biotechnology in the Food Industry,
pp. 97–116, Online Publications, Pinner, UK, 1986.
39
Wang, J., X. Cai, G. Rivas, H. Shiraishi, P.A.M. Farias and N. Dontha. (1996). DNA
Electrochemical Biosensor for the Detection of Short DNA Sequences Related to the
Human Immunodeficiency Virus. Anal. Chem. 68 : 2629.
Wang, J., G. Rivas, X. Cai. 1997. Screen-printed electrochemical hybridization biosensor for the
detection of DNA sequences from the Escherichia coli pathogen. Electroanalysis 9: 395-
398.
Wang, J., J.R. Fernandes, L.T. Kubato. 1998. Polishable and Renewable DNA Hybridization
Biosensors. Anal. Chem. 70: 3699-3702.
World Health Organization, Global TB Control Report, World Health Organization, Geneva,
Switzerland, 2003.
Zhou, L., X. He, D. He, K. Wang & D. Qin. 2011. Biosensing technologies for Mycobacterium
tuberculosis detection: status and new development. Clinical and Development
Immunology.10: 1-8.
40
LAMPIRAN 1. EVALUASI CAPAIAN LUARAN KEGIATAN
Ketua : Yeni Wahyuni Hartati
Perguruan Tinggi : Universitas Padjadjaran
Judul : Teknologi Biosensing DNA Untuk Deteksi Patogenik M. tuberculosis
Secara Elektrokimia Menggunakan Modified Electrode
Waktu Kegiatan : tahun ke 1 dari rencana 2 tahun
Luaran yang direncanakan dan capaian tertulis dalam proposal awal:
No Luaran yang Direncanakan Capaian
1 Artikel jurnal nasional
terakreditasi/Jurnal Internasional
In progress
2 Seminar internasional diterima
3 ……… ………
dst.
CAPAIAN (Lampirkan bukti-bukti luaran dari kegiatan dengan judul yang tertulis di atas,
bukan dari kegiatan penelitian/pengabdian dengan judul lain sebelumnya)
1. PUBLIKASI ILMIAH
Keterangan
Artikel Jurnal Ke-1*
Nama jurnal yang dituju Journal of Electrochemical Science
Klasifikasi jurnal Jurnal Nasional Terkareditasi/Jurnal Internasional
Impact factor jurnal 1.2
Judul artikel An Electrochemical DNA Biosensor for the Detection of
Mycobacterium tuberculosis using Gold Electrode Modified
by Self-Assembled Monolayer of Thiol
- Draf artikel V
- Sudah dikirim ke jurnal
- Sedang ditelaah
- Sedang direvisi
- Revisi sudah dikirim ulang
- Sudah diterima
- Sudah terbit
41
* Jika masih ada artikel ke-2 dan seterusnya, uraikan pada lembar tambahan.
2. BUKU AJAR
Buku ke-1
Judul: -
Penulis:
Penerbit:
Jika masih ada buku ke-2 dan seterusnya, uraikan pada lembar tambahan.
3. PEMBICARA PADA PERTEMUAN ILMIAH (SEMINAR/SIMPOSIUM)
Nasional Internasional
Judul Makalah Label Free Electrochemical DNA
Biosensor for the Detection of
Mycobacterium tuberculosis using
Gold Electrode Modified by Self-
Assembled Monolayer of Thiol Nama Pertemuan Ilmiah Third International Seminar on
Chemistry of Universitas
Padjadjaran
Tempat Pelaksanaan Unpad, Bandung
Waktu Pelaksanaan 20-21 November 2014
- Draf makalah
- Sudah dikirim V
- Sedang direview V
- Sudah dilaksanakan
Jika masih ada pertemuan ilmiah ke 2 dan seterusnyauraikan pada lembar tambahan.
4. SEBAGAI PEMBICARA KUNCI (KEYNOTE SPEAKER)
Nasional Internasional
- Bukti undangan dari Panitia
- Judul makalah
- Penulis
- Penyelenggara
- Waktu Pelaksanaan
- Tempat Pelaksanaan
- Draf makalah
- Sudah dikirim
- Sedang direview
42
- Sudah dilaksanakan
Jika masih ada undangan ke-2 dan seterusnya, uraikan pada lembar tambahan
5. UNDANGAN SEBAGAI VISITING SCIENTIST PADA PERGURUAN TINGGI
LAIN
Nasional Internasional
- Bukti undangan
- Perguruan tinggi
pengundang
- Lama kegiatan
- Kegiatan penting yang
dilakukan
Jika masih ada undangan ke-2 dan seterusnya, uraikan pada lembar tambahan.
6. CAPAIAN LUARAN LAINNYA
HKI -
TEKNOLOGI TEPAT GUNA
-
REKAYASA SOSIAL
-
JEJARING KERJA SAMA
-
PENGHARGAAN -
LAINNYA (Tuliskan)
Jika luaran yang direncanakan tidak tercapai, uraikan alasannya:
Bandung, Oktober 2014
Ketua Peneliti,
Dr. Yeni Wahyuni Hartati, M.Si
43
LAMPIRAN 2. FOTO-FOTO PENELITIAN
44
45
LAMPIRAN 3. BIODATA PERSONALIA PENELITIANBIODATA KETUA DAN ANGGOTA PENELITI
KETUA PENELITI:
A. A. Identitas Diri
1 Nama Lengkap (dengan
gelar) Dr. Yeni Wahyuni Hartati, M.Si P
2 Jabatan Fungsional Lektor Kepala
3 Jabatan Struktural -
4 NIP/NIK/No. Identitas
lainnya 19710924 199802 2 001
5 NIDN 0024097101
6 Tempat dan Tanggal Lahir Garut, 24 September 1971
7 Alamat Rumah Jl. Merkuri Utara No. 8 Margahayu Raya Bandung
8 Nomor Telepon/Faks 022-7561080
9 Nomor HP 08122132349
10 Alamat Kantor Jurs Kimia Jl. Raya Bandung Sumedang KM 21
Jatinangor
11 Nomor Telepon/Faks 022-7794391
12 Alamat e-mail yw_hartati @unpad.ac.id
13 Lulusan yang telah
dihasilkan S1=10, S2=1, S3= -
14 Mata Kuliah yang diampu
1. Kimia Dasar
2. Analisis Kimia
3. Teknik Pengukuran Kimia
4. Kapita Selekta Kimia Analitik
4. Analisis Instrumental dan Biosensor
B. Riwayat Pendidikan
2.1 Program: S-1 S-2 S-3
2.2 Nama PT Universitas Padjadjaran
Institut Teknologi
Bandung
Universitas
Padjadjaran
2.3 Bidang Ilmu Kimia/MIPA Biokimia/MIPA Kimia
46
C. Pengalaman Penelitian 5 Tahun Terakhir
2.4 Tahun Masuk 1990 1996 2005
2.5. Tahun Lulus 1996 1999 2009
2.6 Judul Skripsi/
Tesis/Disertasi
Penentuan Rotenon
dalam Biji Tephrosia
vogelii secara
Kromatografi Lapis
Tipis -Densitometri
Studi Struktur Fungsi
Gen Sup-45
Saccharomyces
cerevisiae Sensitif
Paromomisin
Biosensor
Voltammetri Untuk
Penentuan Urutan
Spesifik dan Mutasi
Basa Tunggal pada
fragmen DNA
2.7. Nama
Pembimbing/
Promotor
Prof. Dr. Ir. Roekmiati
Tjokronegoro
Prof. Dr. Akhmaloka,
Dr. Muliawati
Sindumartha
Prof. Dr. Muljadji
Agma, Prof. Dr. Siti
Rochani, Prof. Dr.
Husein H. Bahti
No Tahun Judul Penelitian
Pendanaan
Sumber Jumlah (Juta
Rp)
1 2014 Teknologi Biosensing DNA
Untuk Deteksi Patogenik M.
tuberculosis secara Elektrokimia
Menggunakan Modified
Electrode(Tahun I)
PUPT 80,5
2 2012-2013 Pengembangan Biosensor DNA
Tanpa Indikator Eksternal untuk
Deteksi Bakteri Patogen dalam
Sampel Darah
Hibah Bersaing
(Peneliti Utama)
37,5+59,5
3 2009-2010 Pengembangan Biosensor DNA
Tanpa Indikator Eksternal untuk
Deteksi Mutasi Titik (Point
Mutation) DNA Mitokondria
pada Pasien Diabetes Mellitus
Tipe 2
Hibah Bersaing
(Peneliti Utama)
50 45
47
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat
No Tahun Judul Penelitian
Pendanaan
Sumber Jumlah (Juta)
1 2008 Sosialisasi Pembuatan
Sabun Mandi Cair Dengan
Lendir Lidah Buaya (Aloe
vera Linn)
BLU Unpad 3
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal
No Tahun Judul Artikel Ilmiah Volume/Nomor Nama Jurnal
1 2014 Determination of uric acid
level by polyaniline and
poly (allylamine): Based
biosensor
2014 Jan-Mar;
5(1): 13–16
J. Adv. Pharm
Technol. Res.
2 2013 Sensitive Detection of
Mitochondrial DNA
A3243G tRNALeu
Mutation via an
Electrochemical
Biosensor Using
Meldola’s Blue as a
Hybridization Indicator
Vol 3(3A): 20-
27
Advance in
Analytical
chemistry
3 2012 Pengembangan Elektrode
Grafit Pensil untuk
Penentuan Kromium(VI)
secara Voltammetri
Stripping Adsorptif
Volume 3 Jurnal Sains
dan Teknologi
Kimia
4 2009 Deteksi Urutan Pendek
DNA Salmonella Typhi
Berdasarkan Sinyal
Guanin Target Secara
Voltammetri
Vol 11 No 3 Bionatura
48
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan/Seminar
Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir
No Nama Pertemuan
Ilmiah / Seminar
Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Tempat
1 Seminar nasional Unpak-
Unpad
Studi biosensor DNA dalam deteksi
Urutan flagellin Salmonella typhi dari
amplikon PCR sampel darah
28 Juni 2013,
Universitas Pakuan,
Bogor 2 International Conference Study Of Nested PCR-Voltammetric DNA
Biosensor Related To Flagellin Gene
Fragment Of Pathogenic Salmonella Typhi
2012, Malang
3 The third International
Conference on
Mathematics and
Natural Sciences 2010,
ITB
Single base mismatch detection on the
mtDNA A3243G mutation using
electrochemical DNA biosensor based
based on target guanine signal
2010, ITB
4 Seminar Nasional XIII
Jaringan Kerjasama
Kimia Indonesia,
Yogyakarta, 15 Juli 2010
Penentuan Kandungan Basa Guanin dan
Adenin dalam Urutan DNA secara
Voltammetri Menggunakan Elektrode
Grafit Pensil
2010, Yogyakarta
G. Pengalaman Penulisan Buku
No Tahun Judul Buku Jumlah
Halaman
Penerbit
1 2010 Biosensor Elektrokimia Untuk Deteksi
Urutan Spesifik DNA
ISBN 978-979-3985-84-8
158 Unpad Press
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 – 10 Tahun Terakhir
No. Judul/Tema HKI Tahun Jenis Nomor P/ID
1 Disertasi: Biosensor Voltammetri Untuk Penentuan
Urutan Spesifik dan Mutasi Basa Tunggal pada
fragmen DNA
2012 Hak
Cipta
063/STBKHC
/HKI/X/2012
2 Buku: Biosensor Elektrokimia untuk Deteksi Urutan
Spesifik DNA
2013 Hak
Cipta
062853
49
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat
dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak-
sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.
Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan
dalam pengajuan hibah Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi.
Bandung, Oktober 2014
Dr. Yeni Wahyuni Hartati, M.Si
50
Anggota Peneliti 1:
A. Identitas Diri
1. Nama Lengkap (dengan gelar) Dr. Shabarni Gaffar, M.Si (Perempuan)
2. Jabatan Fungsional Lektor
3. Jabatan Struktural -
4. NIP/NIK/ Identitaslain 19710425 200501 2 001
5. NIDN 00225047105
6. Tempat dan tanggal lahir Batang Buo, 25 April 1971
7. Alamat Rumah Komp. Anggrek Residence B12A, Jl Rumah
Sakit, Ujung Berung, Bandung.
8. Nomor Telepon/ Faks/ Hp 081573019025
9. Alamat Kantor Jl. Raya Bandung-Sumedang Km 21
Jatinangor, 45363
10. Nomor Telepon/ Faks 022-7794391/ 022-7794391
11. Alamat e-mail [email protected]
12. Lulusan yang telah dihasilkan S1 = 17 orang
S2 = 0
S3 = 0
13. Mata kuliah yang diampu 1. Biokimia I
2. Biokimia II
3. Bioteknologi
4. Teknik Penelitian Biokimia
5. Bioinformatika
B. Riwayat Pendidikan
S-1 S-2 S-3
Nama Perguruan
Tinggi
Unand ITB Unpad
Bidang Ilmu Kimia Biokimia Biokimia
Tahun Masuk-Lulus 1990-1995 1996-1998 2006-2011
JudulSkripsi/Thesis/
Disertasi
Analisis parameter
pembentuk kerak
serta kualitas air
untuk injeksi uap di
stasiun pengumpul
pusat I, III dan V,
PT. Caltex Pacific
Indonesia,Duri.
Varian normal
fragmen 0,4 kB
daerah D-loop
DNA mitokondria
manusia
Indonesia
Pengaruh
kombinasi
manipulasi genetik
terhadap tingkat
sekresi -amilase
S. fibuligera R64
dalam Pichia
pastoris
Nama Pembimbing/
Promotor
Dr. Admin Alief Dr. Achmad
Saifuddin Noer
Prof. O. Suprijana
Prof. Soetijoso
Soemitro
Dr. Dessy Natalia
51
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir
No Tahun Judul Penelitian Pendanaan
Sumber Jumlah
(Juta Rp)
1. 2009 Koekspresi Protein Disulfida Isomerase
(PDI1) untuk meningkatkan sekresi α-
amilase dalam Pichia pastoris
PHB Dikti
Tahun 1
(ketua)
22,5,-
2. 2010 Koekspresi Protein Disulfida Isomerase
(PDI1) untuk meningkatkan sekresi α-
amilase dalam Pichia pastoris
PHB Dikti
Tahun 2
(ketua)
35,-
3. 2011 Koekspresi Protein Disulfida Isomerase
(PDI1) untuk meningkatkan sekresi α-
amilase dalam Pichia pastoris
PHB Dikti
Tahun 3
(ketua)
35,5,-
4. 2012 Identifikasi populasi bakteri dalam spons
pencuci piring dengan metoda PCR-
RFLP
BOPTN
(ketua)
30,0,-
5. 2012 Pengembangan biosensor DNA secara
elektrokimia tanpa indicator eksternal
untuk deteksi bakteri patogen dalam
sampel darah
PHB Dikti
(Anggota)
45,0,-
6. 2012 Pengembangan vaksin influenza
universal berbasis epitop
Insentif
Riset SINas
(Anggota)
300,0,-
7. 2013 Pengaruh Ko-ekspresi Sec4p Pichia
pastoris Terhadap Tingkat Sekresi -
Amilase Saccharomycopsis fibuligera
oleh Pichia pastoris rekombinan
PUPT
(Ketua)
53,6,-
8. 2013 Pengembangan produksi thrombin
rekombinan sebagai komponen lem fibrin
pengganti jahitan pada bedah mata
Unggulan
Stranas
(Anggota)
800,0,-
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir
No. Tahun Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Pendanaan
Sumber Jml (Juta Rp)
1 2008 Pembinaan kreativitas melalui peningkatan
budaya minat baca dalam sarana dan prasarana
taman bacaan kampung Rancakemit,
kecamatan Solokan Jeruk, Kabupaten Bandung
LPPM
Unpad
5,-
52
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir
No. Judul Artikel Ilmiah Volume/
Nomor/Tahun Nama Jurnal
1 Phylogenetics analysis of marine and
coastal species using 18S rRNA sequence
Volume 11,
no.2, 2009
Bionatura
2 Deteksi urutan pendek DNA Salmonella
Typhi berdasarkan sinyal guanin target
secara voltammetri
Volume 11,
no.3, 2009
Bionatura
3 Pengaruh konsentrasi penginduksi metanol
serta sumber karbon sorbitol dan manitol
terhadap produksi -amilase
Saccharomycopsis fibuligera R64 dalam
Pichia pastoris.
13, 2, 58-64,
2011
Jurnal Kimia
Terapan
Indonesia
4. Chemical Modification of
Saccharomycopsis fibuligera R64α-
Amylase to Improve its Stability Against
Thermal, Chelator, and Proteolytic
Inactivation
170:44–57,
2013
DOI
10.1007/s12010-
013-0164-8
Applied
Biochemistry
and
Biotechnology
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar
Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir
Nama Pertemuan
Ilmiah / Seminar Judul Artikel Ilmiah
Waktu dan
Tempat
1 International Seminar
on Chemistry
Enhancement of
Saccharomycopsis fibuligera -
Amylase Secretion in Pichia
pastoris by Co-expression of
Protein Disulfida Isomerase
November 2011,
Kimia Unpad,
Bandung
2 International Seminar
on Chemistry Signal Peptide Modification of -
amylase Gene (ALPI) and
construction of pPICZA-MSALPI
plasmid for improving secretory
production of a-amilase in Pichia
pastoris
November 2008,
Kimia Unpad,
Bandung
3 Seminar hasil
penelitian unggulan
Unpad kelompok Ilmu
Alam
Ekspresi dan sekresi -amilase
Saccharomycopsis fibuligera R64
dalam Pichia pastoris rekombinan
menggunakan dua jenis peptida
sinyal
22 Oktober
2010, Unpad,
Bandung
53
G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir
No Judul Buku Tahun Jumlah
Halaman Penerbit
1 Produksi protein rekombinan dalam
sistem ekspresi P. pastoris (ISBN
978-602-8743-23-5)
2010 176 Unpad Press
2 Bioteknologi molekul, konsep dan
aplikasi. ISBN: 978-602-8323-46-8.
2010 93 Widya
Padjadjaran
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 -– 10 Tahun Terakhir
No. Judul/Tema HKI Tahun Jenis Nomor
P/ID 1
2
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan
dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata
dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.
Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu
persyaratan dalam pengajuan Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi.
Bandung, 26 Oktober 2014
Pengusul,
SHABARNI GAFFAR
54
Anggota Peneliti 2:
A. Identitas Diri
1 Nama Lengkap (dengan gelar) Santhy Wyantuti, M.Si P
2 Jabatan Fungsional Lektor
3 Jabatan Struktural -
4 NIP/NIK/No. Identitas lainnya 19731026 199903 2 001
5 NIDN 0026107301
6 Tempat dan Tanggal Lahir Jakarta, 26 Oktober 1973
7 Alamat Rumah Griya Cinunuk Indah B1/4 Bandung
8 Nomor Telepon/Faks 022-7561080
9 Nomor HP 08122344274
10 Alamat Kantor Jurusan Kimia Jl. Raya Bandung Sumedang KM 21 Jatinangor
11 Nomor Telepon/Faks 022-7794391
12 Alamat e-mail [email protected]
13 Lulusan yang telah dihasilkan S1= 3 orang, S2=-, S3= -
14 Mata Kuliah yang diampu -
B. Riwayat Pendidikan
2.1 Program: S-1 S-2 S-3
2.2 Nama PT Universitas Padjadjaran Universitas Padjadjaran
Universitas Padjadjaran
2.3 Bidang Ilmu Kimia/MIPA Kimia Analitik/MIPA Kimia
2.4 Tahun Masuk 1992 2002 2010
2.5. Tahun Lulus 1997 2006 -
2.6 Judul Skripsi/ Tesis/Disertasi
Hidrolisis Trigliserida yang Mengandung Asam Lemak Omega 3
Pengembangan metode anodik striping voltammetri
-
55
EPA dan DHA dari Minyak Ikan Lemuru dengan Bantuan Enzim Lipase Aspergillus niger
untuk penentuan ziram dengan HMDE
2.7. Nama Pembimbing/ Promotor
Prof. Dr. O. Suprijana, M. Sc.
Prof. Dr. Ir. Roekmiati Tjokronegoro, Prof. Dr. Siti Rochani.
Prof. Dr. Ir. Roekmiati Tjokronegoro, Dr. Yeni Wahyuni Hartati, M.Si., Dr. Eng. Camellia Panatarani, M. Si.
C. Pengalaman Penelitian 5 Tahun Terakhir
No Tahun Judul Penelitian
Pendanaan
Sumber Jumlah (Juta
Rp)
1 2008 Karakterisasi zeolit alam asal Cikalong Tasikmalaya
Litmud (Peneliti Utama)
6,125
2 2008 Konversi Ba2Bi4Ti5O18 menjadi bentuk asamnya dan aplikasinya sebagai katalis
DIPA (Peneliti Utama)
6,125
3 2012 Pengembangan biosensor DNA secara elektrokimia tanpa indikator eksternal untuk deteksi patogen dalam sampel darah
Hibah Bersaing (Anggota)
37,5
4 2012 Pembuatan elektrode nanopartikel emas berbasis grafit untuk biosensor DNA
Hikom (Peneliti Utama)
22,5
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat
No Tahun Judul Penelitian
Pendanaan
Sumber Jumlah (Juta)
1 2008 Pembinaan kreativitas melalui peningkatan budaya minat baca dalam sarana dan prasarana taman bacaan
BLU Unpad 3
56
kampung Rancakemit kecamatan Solokan Jeruk kabupaten Bandung
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal
No Tahun Judul Artikel Ilmiah Volume/Nomor Nama Jurnal
1 2009 Deteksi Urutan Pendek DNA Salmonella Typhi Berdasarkan Sinyal Guanin Target Secara Voltammetri
Vol 11 No 3 Bionatura
2 2012 Pengembangan Elektrode Grafit Pensil untuk Penentuan Kromium(VI) secara Voltammetri Stripping Adsorptif
Volume 3 Jurnal Sains dan Teknologi Kimia
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar Ilmiah
Dalam 5 Tahun Terakhir
No Nama Pertemuan Ilmiah / Seminar
Judul Artikel Ilmiah Waktu dan
Tempat
1 International Seminar on Chemistry, 2008 UNPAD
The development of differential pulse anodic stripping voltammetry method to determine of ziram (fungicide dithiocarbamate) with hanging mercury drop electrode
2008, Unpad
2 The third International Conference on Mathematics and Natural Sciences 2010
Single Base Mismatch Detection on the mtDNA A3243G Mutation using Electrochemical DNA Biosensor Based on Target Guanine Signal.
2010, ITB
3 Seminar Nasional
Kimia Analitik dan
Instrumentasi
Biosensor Voltammetri untuk Deteksi Urutan Spesifik DNA dari Amplikon PCR
2012, Jakarta
4 International Conference of the Indonesian Chemical Society
A Study of Gold Nanoparticles Modified Pencil Graphite Electrode for the Determination of Cr(III)
2012, Malang
5 Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia 2012
Pengembangan Elektrode Grafit Pensil untuk Penentuan Kromium(III) secara Voltammetri stripping Anodik
2012, Unsoed
57
G. Pengalaman Penulisan Buku
No Tahun Judul Buku Jumlah Halaman
Penerbit
- - - - -
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 – 10 Tahun Terakhir
No. Judul/Tema HKI Tahun Jenis Nomor P/ID
- - - - -
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat
dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidak-
sesuaian dengan kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.
Bandung, 30 April 2013
Santhy Wyantuti, M.Si
58
LAMPIRAN 4. Seminar/Publikasi
59
The International Seminar on Chemistry (ISC) of Universitas Padjadjaran, 2014
Label Free Electrochemical DNA Biosensor
for the Detection of Mycobacterium tuberculosis using Gold
Electrode Modified by Self-Assembled Monolayer of Thiol
Ratna Nurmalasari, Yohan, Shabarni Gaffar, Yeni W. Hartati*
Department of Chemistry, Faculty of Mathematics and Natural Science, Padjadjaran University, 45363 Jatinangor, Sumedang, West Java,
Indonesia
Email: [email protected]
Abstract
Tuberculosis (TB), an infectious disease affects millions of humans worldwide and is caused by the Mycobacterium
tuberculosis complex. A label free electrochemical DNA biosensor for the detection of M. tuberculosis using gold
electrode modified by self-assembled monolayer of thiol is presented in this paper. Single-stranded DNA probe was
immobilized on the surface of self assembled monolayer gold electrode with the help of cysteamine and glutaraldehyde,
which was further used to hybridize with the target sequence and non-complementary target sequence. The
hybridization reaction on the gold electrode surface was detected by monitoring a guanine oxidation signal at potential
0,2 V.
Keywords: DNA Biosensor; gold electrode; guanine oxidation; Mycobacterium tuberculosis; Self-assembled monolayer.