Proses Transkrip Pasca-Transkripsi

Pemotongan dan penyambungan RNA ( splicing )

Pada eukaryot banyak terdapat gen yang organisasinya tersusun atas akson dan intron,

meskipun tidak semua gen eukaryot mempunyai intron. Pada awalnya, gen yang terdiri atas

ekson dan intron yang ditranskipsi menghasilkan pre-mRNA (transkripsi primer, primary

transcpt ) karena masih mengandung sekuensi intro. Pada tahapan selanjutnya intron akan

dipotong dari pre-mRNA dan ekson-ekson yang ada selanjutnya disambung menjadi mRNA

yang matang ( mature mRNA ). Proses pemotongan intron dan penyambungan kembali

ekson-ekson disebut sebagai proses penyambungan RNA ( RNA splicing ). Transkripsi

mRNA yang sudah matang inilah yang selanjutnya akan ditranslasi.

Proses splicing RNA adalah proses yang sangat akurat. Akurasi proses pemotong dan

penyambungan ditentukan oleh suatu urutan nukleotida yang dikenal sebagai splicing signals.

Sejauh ini nukleotida lestari yang ditemukan pada beberapa intron yang berbeda yang

diketahui adalah dua nukleotida pada ujung intron, yaitu :

Ekson-GU..............AG-ekson

Selain urutan tersebut juga ada urutan kosensus pada bagian pertemuan antara ekson dan

intron. Pada gen-gen yang ada dalam nukleus, urutan konsesusnya adalah sebagai berikut :

A64 G73 G100 U68 A68 A68 G84 U63...............Gpy74-87 n C65 A100 G100 n

Angka-angka menunjukkan persentase frekuensi nukleotida pada tiap posisi, jika angkanya

100 berarti basa tersebut selalu berada pada posisi tersebut. N dan py menyatakan nukleotida

apa pun atau basa pirimidin yang mungkin ada pada posisi tersebut. Urutan nukleutida pada

bagian pertemuan ekson-intron tersebut berbeda untuk gen tRNA dan gen struktural pada

mitokondria dan kloroplas karena adanya perbedaan dalam hal mekanisme pemotongan-

penyambungan RNA-nya. Pada gen-gen yang ada dalam nukleus hanya ada dalam urutan

nukleotida lestari. (conserved ) yang pendek yaitu tactaac, yang terletak sekitar 30 pasangan

basa di sebelah hulu dari sisi 3 penyambungan. Residu adenine pada posisi keenam kotak

tactaac adalah residu yang lestari dan mempunyai peranan sangat penting dalam proses

pemotongan-penyambungan intron-ekson. Secara umum dapat disebut bahwa sekuens intron

pada gen-gen dalam nukleus bersifat acak, kecuali sekuens dinukleutida gt dan ac serta kotak

tactaac. Intron pada gen-gen dalam inti sel. Sekuens konsensus pada daerah perbatasan antara

ekson-intron pada prekursor mRNA khamir telah diketahui dengan urutan sebagai berikut :

5 GUAUGU intron - UACUAAC pyAG 3

Dari beberapa penelitian diketahui bahwa sinyal untuk pemotongan intron dan

penyambungan ekson ( splicing signals ) pada prekursor mRNA gen-gen pada nukleus sangat

seragam, yaitu kedua basa intron pertama hampir selalu mengandung gu dan dua basa

terakhir hampir selalu mengandung ag. Selain itu, keseluruhan sekuens konsensus sangat

penting untuk pemotongan intron dan penyambungan ekson secara tepat. Mutasi pada

sekuens konsensus dapat mengakibatkan splicing yang abdnormal. Sifat lestari ujung 5 dan

3 pada posisi pemotongan-penyambungan serta kotak tactaac menunjukan bahwa hal ini

mempunyai fungsi sangat pen ting dalam ekspresi genetik. Mutasi pada bagian tersebut dapat

menyebabkan perubahan fenotip pada banyak jasad eukaryot. Sebagai contoh, mutasi pada

daerah ini seringkali bertanggung jawab dalam pemunculan penyakit menurun pada manusia,

misalnya kelainan hemoglobin.

Penelitian menunjukan bahwa proses pemotongan intron dan transkrip RNA terdiri atas tiga

tipe yang bebeda yaitu :

1. Intron pada prekursor tRNA dipotong dengan menggunakan endonuklease secara

tepat diikuti oleh reaksi ligasi ( penyambungan ) menggunakan enzim ligase.

2. Intron pada beberapa prekursor rRNA dihilangkan dengan mekanisme auto katalitik

melalui reaksi unik yang melibatkan molekul RNA itu sendiri dan tidak melibatkan

aktivitas enzim.

3. Intron pada pre-mRNA dipotong dengan mekanisme reaksi dua-langkah yang

dilakukan oleh partikel ribonukleoprotein yang disebut spliceosome.

Mekanisme splicing prekursor mRNA inti sel

Proses splicing menghasilkan suatu struktur cabang yang disebut dengan lariat karena

bentuknya seperti tali laso. Pada tahap pertama, gugus 2-oh nukleotida adenine yang ada

dalam intron menyerang ikatan fosfodiester yang menghubungkan ekson 1 dengan intron. Hal

ini menyebabkan terputusnya ikatan ekson 1 dengan intron sehingga dihasilkan ekson 1 yang

bebas dan struktur lariat yang merupakan gabungan antara intron dengan ekson 2. Struktur

lariat tersebut mempunyai ujung 5 gu yang berikatan dengan titik percabangan melalui

ikatan fosfodiester antara intron dengan ekson 2, menghasilkan struktur intron berbentuk

lariat dan ekson 1/ ekson 2 yang bersambungan. Penyambungan antara ekson 1 dan ekson 2

diperantai oleh gugus fosfat pada ujung 5 ekson 2.

Penelitian pada khamir menunjukan bahwa spilicing berlangsung didalam suatu partikel

berurutan 40s yang disebut sebagai spliceosome. Partikel tersebut mempunyai peranan sangat

penting dalam splicing karena pre-mRNA yang mengalami mutasi A menjadi C.

Pada titik percabangan tidak dapat mengalami splicing. Hal itu disebabkan RNA semacam ini

tidak mampu membuat struktur spliceosome. Selain partikel spliceosome, faktor lain juga

berperan penting dalam splicing adalh molekul RNA berukuran kecil yang disebut small

nuclear RNA ( snRNA ) yang berasosiasi dengan suatu protein membentuk kompleks small

ribonuclear proteins ( snrnp, dibaca snurp ). Kompleks tersebut dapat dipasangkan

dipisahkan dengan elektroforesis gel menghasilkan partikel-partikel individual yangb disebut

u1, u2, u4, u5 dan u6.

Mekanisme splicing secara autokatalik

Mekanisme ini terjadi pada prekursor rRNA tanpa melibatkan enzim. Lebih jauh telah

diketahui pula bahwa mekanisme semacam ini juga terjadi pada pemotongan intron prekursor

rRNA, tRNA, mRNA yang ada pada mitokondria dan kloroplas banyak spesies, misalnya

pemotongan intron gen 26s rRNA dan tetrahymena. Mekanisme splicing autokatalitik tidak

memerlukan energi maupun enzim tetapi melibatkan reaksi transfer ikatan fosfoester tanpa

ada ikatan yang hilang. Proses pemotongan intron secara autokatalitik dapat dibedakan

menjadi dua yaitu pada gen-gen yang mengandung intron grup i dam intron grup ii.

Pada intro grup i ( misalnya 26s rrn pada tetrahymena ), proses splicing melibatkan

penambahan nukleotida guanine pada ujung 5 intron. Guanine tersebut adalah nukleotida

yang berasal dari luar, bukan bagian integral intron seperti yang diamati pada splicing

menggunakan spliceosome. Pada tahap pertama, nukleotida guanine menyerang nukleotida

adenine pada ujung 5 intron dan melepaskan ekson 1. Pada tahap kedua, ekson 1 menyerang

ekson 2 sekaligus melakukan penyambungan ekson 1 dan ekson 2 serta melepaskan intron

berbentuk linier. Selanjutnya, dengan proses yang berbeda, intron linier dipotong

nukleotidanya sebanyak 19 nukleotida dari ujung 5.

Mekanisme splicing precursor tRNA

Mekanisme splicing precursor tRNA pada sacchromyces cerevisiaemalaui du tahapan. Dalam

tahapan pertama, enzim yang disebut splicing edonuklease (tRNA endonucleasse) yang

terikat pada memberan nucleus melakukan dua pemotongan secra tepat pada kedua ujung

intrn. Selanjutnya pada tahap ke dua suatu enzim yang disebut splicing ligase (RNA ligase)

menyambung kedua bagian tRNA sehigga dihasilkan molekul tRNA yng sedah matang.

Beberapa mekanisme splicing yang dijelaskan adalah mekanisme cis splicing yaitu proses

splicing yng melibatkan dua ekson atau lebih yang ada pada gen yang sma. Penelitian pada

triphanosoma, protozoa yang memiliki alatgerak flagella, menunjukkan ada mekanisme

splicing alteRNAtive yang disebut trans-splicing . Pada trans-splicing ekson-ekson yang

digabungkan erasal dari gen yang sama, bahkan dapat berasal dari kromosom yang berbeda.

Penelitian yang lebih lanjut pada jasad ini menunjukkan bahwa semua mRNA mempunyai 35

nukliotida awal (leader), disebut sebagai splicid leader(sl), tetapi gen-gen yang mengkode

mRNA tersebut tidak mempunyai urutan komplementer ke 35 nukleotida awal. Gen yang

mengkode sl tersebut diketahui berulang sekitar 200 kali pada genon tripanosoma. Gen

tersebut hanya mengkode sl ditambah 100 nukleotida yang tersambung pada sl melalui

skekuen splising. Consensus pada ujung 5. Dengan demikian gen mini tersebut tersusun

ekson sl yang pendek dan ujung 5 suatu intron.

Poliadenilasi mRNA

Transkrip mRNA pada eukariot juga mengalami pemprosesan dalam bentuk penambahan

polia (ranntai amp). Pada ujung 3 sepanjang kurang lebih 200-250 nukletida. Penambahan

polia semacam ini tidak terjadi pada rRNA maupun tRNA. Rantai polia tersebut ditambahkan

pasca transkripsi karena tidak ada bagia gen yang mengkode rangkaian a atau t semacam ini.

Penambahan tersebut dilakukan dengan menggunakan aktivitas enzim poli(a) polimease yang

ada di dalam nucleus. Sebagai besar mRNA mengandung polia kecuali mRNA histon.

Penambahan polia pada ujung 3 meningkatkan stabilitas mRNA sehingga mRNA memiliki

umur yang leih panjang dibandingkan mRNA yang tidak memiliki polia. Selain itu juga ada

bukti yang mununjukkan bahwa keberadaan poli a meningkatkan efisies=nsi translasi mRNA

semacam itu. Diketahui ada suatu protein, yaitupoli(a) bindng protein i., yang menenpel pada

polia sehingga meningkatkan eisiensi translasi. Bukti lain juga menegaskan bahwa mRNA

yang mempunyai polia, mempunyai kemungkinan yang lebih tinggi untuk mengikat ribosom

sehingga dapat meningkatkan efisiensi translasi dibndingkan mRNA yang tidak mengalami

poliadenilasi. Poliadenilasi dlakukan pada prekusor mRNA bahkan sebulum terjadi termnasi

transkripsi. Hal tersebut dlakukan dengan cra memoton prekusor mRNA pada bagian yang

nantinya akan menjadi bagian mRNA yang matang, kemudian dilanjutkan dengan

penambhan polia paa ujung 3 yang terbuka. Bagian mRNA yang isentesis setelah

poliadenilasi selanjutnya akan didegradasi.

Tempat dilakukannya poliadenilasi dicirikan oleh suatu sinyal poliadenilasi pada gen

mamalia. Sinyal tersebut terdri aas rankaian nukleotida aataaa yang diikuti oleh sekitas 20

tida yang kaya kakn residu gt serta diikuti oleh motif yang kaya akan t. Transkrip mRNA

pada tanaman dan khamir juga mengalami poliadenilasi tetapi sinya poliadenilasinya berbeda

dari yang ada pada mamalia karena ada variase pada sekuens aataaa. Pada khamir jarang

sekali ada moif aataaa yang ditemukan.

Penambahan tudung (cap) pada mRNA

Pada mRNA eukariot mengalami meilasi (penambahan gugus metal) yang sebagian besar

terakumulasi pada ujung 5 mRNA. Struktur ini kemudian dikenal sebagai tudung mRNA

(mRNA cap). Pada perkembangan selanjutnya, tudung mRNA tersebut merupakan molekul 7

metilguanosin (m7g). Tudug mRNA tersebut disintesis dalam beberapa tahap. Pertama,

enzim RNA triposphatase memotong gugus fosfat pada ujung pre-mRNA, kemudian nzim

guanilil transferase menambahkan gnp. Selanjutnya, enzim metal transferase melakukan

metilasi tudung guanosin pada n7 dan gugus 2-o metal pada nukleotida pada ujung tudung

tersebut. Proses penambahan tudung tersebut berlagsung pada tahapan awal transkripsi

sebulum transkrip mencapai panjang 30 nukleotida.

Tudung mRNA memiliki empat macam fungsi yaitu :

1. melindungi mRNA dari degradasi,

2. meningkatkan efisiensi translasi mRNA,

3. meningkatkn pengangkutan mRNA dari nucleus ke sitoplasme,

4. meningkatkan efisiensi proses splicing mRNA.

Tudung m7g berikatan dengan mRNA melalui ikatan trifosfat dan hal ini diperkirakan untuk

melindungi mRNA dari serangan RNAse yang tidak dapat memotong ikatan triphosphat.

Tudung tersebut juga meningkatkan efisiensi translasi karena ribosom dapat mengakses

mRNA melalui suatu protein yang menempel pada tudung. Dengan demikian, jika tida ada

tudung, maka proein yang melekat pada tudung tidak dapat menempel. Hal itu akhirnya

mengurangi kemungkinan ribosom untuk menempel dan melakukan translasi.

Pemrosesan rRNA dan tRNA

Molekul rRNA yang dihasilkan pada prokariot maupun eukariot pada awlnya berupa

prekosor yang erukuran leih anjang dari molekul yang matang. Sebagai contoh, pada

mamalia, dihasilkan prekuso rRNA yang berukuran 45s yang sesungguhnya terdiri atas

ukurang yang lebih kecil yaitu 28 s, 18s, dan 5,8s. Nukleotida diantara unit-unit kecil tersebut

harus dipotong (diproses) untuk menghasilkan unit-unit fungsional yang lebih kecil. Perlu

diperhaikan bahwa pemrosesan prekusor rRNA yang dimaksud disini buknlah splicing,

karena splicing adalah proses pemotongan intron yang ada di dalam struktur inteRNAl

transkrip dan diikuti oleh penyambungan ekson. Pada pemrosesan prekusor rRNA semacam

ini idak ada penyambungan kembali molekulmolekul rRNA yang sudah dipotong karena

masing-masing unit yang dihailkan adalah unit independen.

Selain rRNA, molekul tRNA juga disintesis juga disintesis dalam dibentuk prekusor. Pada

prokariot, prekusor tersebut dapat terdiri atas satu tRNA atau lebih, atau kadang bercampur

dengan rRNA. Untuk memotong prekusor yang terdiri atas lebih dari satu tRNA atau

campuran tRNA danrRNA pada prokariot diperlukan aktifitas enzim RNAse iii. Setelah

dipotong , tRNA masih mengandung beberapa nukleotida pada ujung 5 maupun 3.

Demikian pla pada eukariot, ujung5 dan 3 pada prekusor tRNA mengandung beberapa

nukleotida. Nukleotida tambahan yang ada pada ujung 5 pada prekusor tRNA prokariot

maupun eukariot akan dipotong oleh enzim RNAse p, sedangkan ujung 3nya akan diproses

dengan enzim RNAse d., RNAse bn, RNAse t, RNAse ph, RNAse ii, dan polinukleotida

osforilase (PNPase).

Penyuntingan RNA

Selain fenomena trans-splicing, pada tripanosoma juga terdapat mekanisme pasca transkripsi

lain yang aneh yang disebut sebagai penyuntingan RNA (RNA editing). Pada perkembangan

selanjutnya diketahi bahwa sekuen mRNA sitokrom oksidase ii (coii) pada tripanosoma

ternyata tidak sesuai dengan sekuens gen yang mengkodenya. Sekuens mRNA coii diketahui

mengandung 4 nukleotida yang tidak terdapat pada gen coii yang ada di dalam kinetoplast

(semacam mitokondria yang mengandung dua dna lingkar yang terikat bersama menjadi

struktur catanane). Ketiadaan keempat nukleotida tersebut pada gen coii nampaknya dapat

menyebabkan terjadinya mutasi pergeseran pola baca (framehift) yang dapat menyebabkan

gen menjadi tidak ktif. Meskipun demikian, mRNA yang dihasilkan ternyata mengandung

empat nukleotida tersebut sehingga tidak terjadi pergeseran pola baca. Rob banne

berkesimpulan bahwa mRNA tripanosoma tersebut dikopi dari suatu gen yang tidak lengkap,

disebut sebgai cryptogene, kemudian disun ting lagi dengan menambahkan empat nukleotida

yang kesemuanya adalah urdine.

Penelitian-penelitian berikutnya membuktian bahwa penyuntingan mRNA memang

fenomena umum pada tripanosoma. Bahkan, beberapa mRNA isunting secara sangat

ekstensif, misalnya sukuens mRNA coii trypanosoma brucei sepanjang 731 nukleotiga

mengandung 407 uridine (u) yang ditambahkan melalui proses penyuntingan. Selain

penambahan, penyuntingan pada mRNA coii juga menghilangkan 19 uridine yang dikod.

Fenomena penyuntingan tersebut diketahui selalu terjadi pada ujung 3 dn tidak ada pada

ujung 5 dengan orientasi 3 ke 5. Penyuntingan tersebut diketahui dilakukan oleh suatu

molekul RNA yang disebut sebagai guide RNA (gRNA). Molekul gRNA tersebut

berhibidisasi dengan baigian mRNA yang tidak di edit dn menyediakan nukleotida a dan g

sebagai cetakan untuk penggabungan nukleotida u yang tidak ada pada mRNA. Kadang-

kadang gRNA tidak mempunyai a atau g yang dapat berpasangan dengan u pada mRNA

sehingga nukleotida tersebut dihilangkan menggunakan enzim eksoniklease.