isolasidna dan rna

10/7/2014 TekLabGen/Rarastp/BioUGM 1

ISOLASI DNA DAN RNA

Prinsip yang mendasari tehnik isolasi DNA dan RNA

- DNA dan RNA merupakan materi penyimpan informasi tentang identitas organisme. Materi tersebut diperoleh dari induknya dan dapat diturunkan ke anaknya

- Setiap sel yang mampu melakukan pembelahan memiliki materi genetik. Untuk mendapatkan (mengisolasi) materi genetik tersebut harus dilakukan pemecahan sel.

- Untuk mempelajari karakter molekuler suatu gen, sering memerlukan pendekatan dengan menggunakan organisme model

- Organisme model yang sederhana adalah bakteri yakni E. coli dan yeast (S. cerevisiae).

- Untuk mempelajari tentang materi genetik manusia sering dipakai model dengan menggunakan sel yang berasal dari mencit, tikus atau Kultur sel manusia

- Sel prokariotik, bakteri, dan tumbuhan memiliki dinding sel, sedangkan sel hewan hanya memiliki membran sel.


Prinsip dari isolasi DNA atau RNA yakni membebaskan DNA dari bahan penyusun sel lainnya (lipid, protein, karbohidrat dan biomolekul lainnya). Untuk membebaskan materi genetik, sel harus dipecah (membran lipid dibuat lisis dan enzim perusak asam nukleat (nuklease) harus di nonaktifkan.


Sel yang menyusun tubuh umumnya memilki inti sel yang berisi materi genetik DNA dan RNA. Sel tubuh dapat berada dalam kondisi interfase (sintesis DNA) atau mitosis (pembelahan sel). Pada saat isolasi DNA genom sel bisa berada dalam berbagai fase siklus sel,


DNA genom banyak mengandung protein yang berinteraksi dengan DNA, antara lain protein histon, enzim DNA maupun RNA polimerase, protein regulator dll.


Tahapan teknik isolasi asam nukleat (DNA dan RNA). Larutan fenol diperlukan untuk mengendapkan protein yang tercampur dengan asam nukleat.


DNA yang terlarut dalam bufer dapat dipresipitasikan dengan garam sodium asetat dan ethanol dingin. Apabila jumlah DNA cukup banyak maka dapat diambil dengan batang gelas. Apabila DNA tidak dapat diambil dengan batang gelas maka dapat diendapkan dengan sentrifugasi.


Prinsip teknik isolasi DNA bakteri (E. coli).


Dalam menggunakan bakteri sebagai organisme uji, maka diperlukan pembuatan media untuk memperbanyak sel bakteri (materi genetiknya). Berikut adalah contoh media cair yang sering dipakai untuk menumbuhkan bakteri.


Salah satu cara penentuan konsentrasi (jumlah sel) untuk mendapatkan kondisi ideal dalam isolasi DNA.


Pemanenan sel bakteri dengan teknik sentrifugasi.


Prinsip isolasi DNA plasmid pada E. coli.


Jumlah kopi plasmid bisa ditingkatkan dengan menambahkan chloramfinicol pada

media tumbuh,


Salah satu cara memecah dinding sel bakteri dengan cara melisikan sel. Setelah sel lisis maka DNA dapat dipisahkan dari ekstrak sel.


Bentuk alami dari DNA plasmid, dapat berupa super koil (terpilin) atau sirkuler.


Hasil interpetasi gambaran elektroforesis dari migrasi DNA plasmid yang memiliki ukuran sama namun struktur yang bervariasi antara keadaan relaksasi dan superkoil.


Analisis fragmen DNA yang dipotong oleh enzim endonuklease restriksi.


Isolasi DNA virus diawali dengan tahapan pemanenan partikel virus setelah Virus diinfeksikan pada bakteri (bakteriophage)


Teknik pengendapan partikel virus.


Tahapam isolasi DNA bakteriofag.


Teknik purifikasi DNA atau RNA dengan menggunakan reagen ss-phenol, chloroform untuk mengikat dan mempresipitasikan protein (pada lapisan tengah), sedangkan DNA atau RNA ada dilapisan atas. Untuk membersihkan DNA dari protein dapat juga digunakan proteinase (mendegradasi protein). Apabila DNA akan dibebaskan dari RNA maka perlu perlakuan dengan RNAse (enzim yang mendegradasi RNA), sedangkan apabila RNA yang diperlukan, maka bisa dibebaskan dari DNA dengan menggunakan DNAse.


Setelah mengalami purifikasi DNA atau RNA diendapkan dengan garam (NaCl atau Na asetat) dan ethanol dingin.


Pengambilan supernatan yang tidak diperlukan dengan teknik hisap vakum. Cara ini memudahkan mendapatkan pelet yang terendapakan setelah sentrifugasi.


Presipitan DNA atau RNA murni dapat dilarutkan dengan bufer (TE). Dengan volume tertentu tergantung banyak sedikitnya DNA. Konsentrasi DNA dapat ditentukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang () 260 nm. OD 1 setara dengan 50 ug/ml DNA atau 40 ug/ml RNA. Kemurnian DNA dapat dilihat dengan perbandingan nilai absorbansi pada 260/280 nm dengan nilai indeks mendekati 2. Kemurnian DNA juga dapat dilihat dengan teknik elektroforesis.


Teknik menghomogenkan (melarutkan) pelet (DNA) kedalam pelarutnya dengan menggunakan vorteks.


Pemotongan DNA kromosom dengan enzim endonuklease restriksi pada berbagai tempat.


DNA hasil amplifikasi dipotong pada ikatan fosfodiester yang memiliki urutan nukleotida tertentu (misal GAGGTC). Reaksi dikatalisis oleh enzim endonuklease restriksi tertentu yang memotong pada kedua ujung dan bagian tengah potongan DNA. Hasilnya berupa dua pita (fragmen) DNA dengan panjang pasang basa yang berbeda.


Prinsip amplifikasi potongan DNA dengan teknik PCR (polymerase chain reaction)


- DNA dan RNA merupakan biomolekul yang memiliki muatan negatif yang dihasilkan oleh ikatan fosfodiester. -Tehnik elektroforesis merupakan metode standar yang digunakan untuk analisis, identifikasi dan pemurnian fragmen (potongan) DNA. -Tehnik ini juga dapat dipakai untuk analisis RNA dan oligonukleotida - Gel elektroforesis yang dapat dipakai untuk analisis DNA atau RNA terdiri dari agarose atau poliakrilamid. - Gel agarose terbuat dari polisakarida yang diekstrak dari Algae, sehingga tidak berbahaya jika mengenai tubuh. - Agarosa untuk keperluan analisis DNA atau RNA memiliki tingkat kemurnian yang tinggi

Analisis hasil isolasi DNA atau RNA dengan elektroforesis gel agarosa


Pembuatan gel agarose cukup sederhana hanya dengan melarutkan serbuk agar dengan bufer (TBE = tris-borat EDTA) dan memanaskannya hingga terlarut kemudian dimasukkan kedalam cetakan.


Konsentrasi agarosa untuk analisis DNA atau RNA adalah 0,5 hingga 2%. Makin tinggi konsentrasi agarosa maka makin kecil pori-pori gel yang terbentuk, sehingga panjang DNA yang dapat dipisahkan makin rendah. Gel agarosa memiliki kisaran pemisahan DNA cukup luas yakni antara 200 50.000 bp, Namun resolusi yang dihasilkan cukup rendah.


Resolusi gel agarosa (kemampuan pemisahan fragmen DNA) lebih tinggi apabila konsentarsinya meningkat (2%).


Pemisahan potongan DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis gel agarosa. Dasar dari teknik ini adalah dalam medan listrik DNA yang bermuatan negatif (karena adanya gugus fosfat) akan bergerak menuju elektroda positif dan kecepatannya sesuai dengan panjang pendeknya potongan DNA.


Sidik jari DNA untuk golongan darah ABO dengan mengamplifikasi allel A dan B.


Hasil potongan DNA dengan enzin endonuklease restriksi tertentu pada suatu gen marker dapat digunakan sebagai sidik jari DNA untuk menunjukkan hubungan kekerabatan.


PROSEDUR ISOLASI RNA DARI SAMPEL CAIR

(Micro to Midi RNA isolation Kit / invitrogen )

1. Kedalam 200 sample tambahkan 200 RNA lysis solution yang

mengandung 1%(v/v) 2-mercaptoethanol (freshly prepared), kemudian

tambahkan 200 100% ETOH, campur dengan baik.

2. Masukkan ke RNA spin cartridge. Centrifuge 12000g 15dtk 25C. buang

cairan di bawah.

3. tambahkan 700 Wash bufferI ke cartridge, centrifuge 120000g 15dtk 25C.

Buang cairan dibawah.

4. Tempatkan spin cartridge ke RNA wash tube bersih. Tambahkan 500

Wash buffer II yang sudah mengandung ETOH ke cartridge. Centrifuge

12000g 15dtk 25C. Buang cairan di bawah.

5. Tambahkan 500 Wash buffer II yang sudah mengandung ETOH ke

cartridge. Centrifuge 12000g 15dtk 25C. Buang cairan di bawah.

Centrifuge 1 menit untuk mengeringkan membran.

6. Pindahkan cartridge dari wash tube ke RNA recovery tube

7. Tambahkan 50 RNAse free water ke cartridge membrane, biarkan 1 menit,

kemudian centrifuge 12000g 2 mnt 25C.

8. Ulangi langkah 7 sekali lagi. Amankan cairan elusi (dalam collection tube).

9. Simpan -70C.


Teknik Isolasi RNA


Teknik isolasi mRNA


Teknik isolasi mRNA dengan kolom kromtografi yang mengandung oligo (dT).


mRNA dapat dibebaskan dari kolom dengan cara elusi.


mRNA dapat diubah menjadi cDNA dengan menggunakan primer oligo (dT), enzim reverse transkriptase dan dNTP.


Perkembangan teknologi memungkinakan isolasi DNA maupun RNA berlangsung

Lebih cepat (+ 1 jam) dengan menggunakan kit.

Tissue Lysis. Detergents lyse membranes.

Proteinase K breaks down proteins.

Sample loading onto column. Nucleic acids bind

to membrane and other components flow through.

Column washing. Removes any contaminants.

Elution of DNA. DNA is released from column

and ready for use in downstream applications.

Kit DNA Extraction


REFERENSI

Brooker RJ(1999) Genetics: Analysis and Principles. Addison-Wesley Davis LG, Kuehl WM, Battey, JF (1994) Basic Methods in Molecular Biology. Second Edition. Prentice-Hall International Inc. Brown TA(1993) Gene Cloning an introduction. Third edition. Chapman & Hall. Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Materi dan Gambar

isolasidna dan rna

Documents