By. Jaya Mahar MaliganLaboratorium Nutrisi Pangan dan Hasil Pertanian

PS- Ilmu dan Teknologi PanganJurusan Teknologi Hasil Pertanian

FTP - UB

PEMANFAATAN & PENGELOLAAN HEWAN COBA

DALAM EVALUASI GIZI PANGAN (IN VIVO TEST)

INTRODUCTION

Food

Metabolism

Nutrition

Functional Benefit

Human Body

In Vitro Test

In Vivo Test

In vivo (Latin for "within the living") is experimentation using a whole, living organism as opposed to a partial or dead organism, or an in vitro controlled environment. Animal testing and clinical trials are two forms of in vivo research.

In vivo testing is often employed over in vitro because it is better suited for observing the overall effects of an experiment on a living subject.

In Vivo Test

(Wikipedia, 2010)

PEMELIHARAAN DAN PENGEMBANGBIAKAN HEWAN COBA

6 Prinsip :

1. Lingkungan

-> stabil dan sesuai untuk keperluan fisiologis (suhu, kelembapan dan kecepatan aliran udara)

2. Status Kesehatan

-> kesehatan kandang, gedung dan lingkungan

PEMELIHARAAN DAN PENGEMBANGBIAKAN HEWAN COBA

6 Prinsip :

3. Pegawai (perawat hewan)

-> senang dan empati, kompeten dan profesional

4. Kualitas dan Kuantitas Pakan (feed)

-> cukup dalam segi nutrisi, wadah bersih dan bebas kontaminan

PEMELIHARAAN DAN PENGEMBANGBIAKAN HEWAN COBA

6 Prinsip :

5. Sistem Pengelolaan dan Pembiakan

-> fungsi pengawasan, dokumentasi

6. Kualitas Hewan

-> sehat, SPF (specific pathogen free) dan germ-free

ANIMAL TESTING

Pemanfaatan Hewan Coba di Laboratorium

Diternakkan khusus untuk keperluan invivo test

Sebagai model untuk melihat pengaruh metabolisme nutrisi secara langsung pada jaringan biologis hewan coba

Sehat, SPF (Specific Pathogen Free) , germ-free

Kondisi metabolisme hewan coba yang serupa dengan manusia

Tingkat reproduksi tinggi

Kesesuaian dengan tujuan penelitian

ANIMAL TESTING

ANIMAL TESTING

Rodensia dan Kelinci

Tikus (Rattus norvegicus), Mencit (Mus musculus), Guinea pig, Kelinci : penelitian penyakit parasit, infeksi dan degeneratif, nutrisi, reproduksi, toksisitas

Carnivora

Kucing dan Anjing : penelitian fisiologi, sistem syaraf dan praktek bedah, cancer dan tumor, toksisitas, metabolisme dan evaluasi obat

ANIMAL TESTING

Primata

Kera : penelitian infeksi, metabolisme dan toksisitas obat

Ungulata

Sapi, kambing, kuda : penelitian infeksi, produksi antiserum dan antitoksin

Unggas

Telur : penelitian virology

ANIMAL WELFARE

3R (Russel and Burch) Replacement : Setiap metode yg menggunakan materi yang tidak dapat

merasa (non-sentient material) sebagai pengganti metode yg menggunakan vertebrata hidup yg mempunyai kesadaran. Seperti contohnya dengan menggunakan teknologi canggih dengan komputer modeling, daripada menggunakan hewan asli yang hidup

Reduction : Mengurangi jumlah hewan digunakan untuk memperoleh sejumlah informasi dan ketetapan tertentu. Dari satu ekor hewan saja dapat digunakan untuk beberapa kali ataupun penelitian yang berbeda. Jangan sampai membuang-buang atau memboroskan organ yang tidak digunakan. Gunakan seefisiensi mungkin dari satu ekor hewan percobaan.

Refinement : Pengurangan indikasi atau keparahan (severity) prosedur yang tidak berperikemanusiaan (inhumane) yang diterapkan pada hewan harus digunakan. Sedapat mungkin kita mengurangi rasa sakit yang dirasakan oleh hewan yang diujicobakan. Gunakan prosedur yang baik untuk “memakai” mereka.

ANIMAL WELFARE

Five (5) Freedom : World Society for Protection of Animals (WSPA)

Freedom from hunger and thirst (bebas dari rasa lapar dan haus).

Freedom from discomfort (bebas dari rasa panas dan tidak nyaman).

Freedom from pain, injury, and disease (bebas dari luka, penyakit dan sakit).

Freedom from fear and distress (bebas dari rasa takut dan penderitaan).

Freedom to express normal behavior (bebas mengekspresikan perilaku normal dan alami)

MENCIT - Konsumsi pakan per hari- Konsumsi air minum per hari- Diet protein- Ekskresi urine per hari- lama hidup- Bobot badan dewasa- Jantan- Betina- Bobot lahir- Dewasa kelamin (jantan=betina)- Siklus estrus (menstruasi)- Umur sapih- Mulai makan pakan kering- Rasio kawin- Jumlah kromosom- Suhu rektal- Laju respirasi- Denyut jantung- Pengambilan darah maksimum- Jumlah sel darah merah (Erytrocyt)- Kadar haemoglobin(Hb)- Pack Cell Volume (PCV)- Jumlah sel darah putih (Leucocyte)

5 g (umur 8 minggu)6,7 ml (umur 8 minggu)

20-25%0,5-1 ml

1,5 tahun

25-40 g20-40 g1-1,5 g

28-49 hari4-5 hari (polyestrus)

21 hari10 hari

1 jantan – 3 betina40

37,5oC163 x/mn

310 – 840 x/mn7,7 ml/Kg

8,7 – 10,5 X 106 / μl13,4 g/dl

44%8,4 X 103 /μl

Data Biologis

TIKUS PUTIH

- Konsumsi pakan per hari- Konsumsi air minum per hari- Diet protein- Ekskresi urine per hari- lama hidup- Bobot badan dewasa- Jantan- Betina- Bobot lahir- Dewasa kelamin (jantan=betina)- Siklus estrus (menstruasi)- Umur sapih- Mulai makan pakan kering- Rasio kawin- Jumlah kromosom- Suhu rektal- Laju respirasi- Denyut jantung- Pengambilan darah maksimum- Jumlah sel darah merah (Erytrocyt)- Kadar haemoglobin(Hb)- Pack Cell Volume (PCV)- Jumlah sel darah putih (Leucocyte)

5 g/100 g bb8-11 ml/100 g bb

12%5,5 ml/100 g bb

2,5- 3 tahun

300-400 g250-300 g

5-6 g50+10 hari

5 hari (polyestrus)21 hari, 40-50 g

12 hari1 jantan – 3 atau 4 betina

4237,5oC

85 x/mn300 – 500 x/mn

5,5 ml/Kg7,2-9,6 X 106 / μl

15,6 g/dl46%

14 X 103 /μl

Data Biologis

TEKNIK EKSPERIMEN

Pemeliharaan dan handling

Identifikasi

Pengambilan spesimen / sampling

Anastesi dan eutanasia

PEMELIHARAAN

Individual Cage atau Metabolic Cage

Kandang mudah dibersihkan

Alas tidur dibersihkan secara periodik

HANDLING - MENCIT

IDENTIFIKASI - MENCIT

Penandaan Hewan Coba -> pembeda perlakuan

Temporer dan Permanen

Spot Tail / Numbered Tail, Ear Tag, Ear Piece, Tail Tatto, Electronic Transponder

PEMBERIAN MATERI

Injeksi

intraperitoneal, subkutan, intravena, intramuskular

Sonde intragastrik (per oral)

Dosis tertentu

mis : sonde mencit 20 gr (maks 1ml)

sonde tikus 200 gr (maks 5 ml)

SAMPLING

Pengambilan darah -> ≠ shock hipovolemic

10% total volume darah, interval 2-4 minggu

1% interval 24 jam

Vena lateral ekor, sinus orbitalis mata, vena saphena (kaki), jantung (intrakardial)

EUTHANASIA

Eutanasia (Bahasa Yunani: ευθανασία -ευ, eu yang artinya "baik", dan θάνατος, thanatos yang berarti kematian)

praktek pencabutan kehidupan manusia atau hewan melalui cara yang dianggap tidak menimbulkan rasa sakit atau menimbulkan rasa sakit yang minimal

Inhalasi CO2, Injeksi barbiturat over dosis (200mg/kg BB), dekapitasi, dan dislokasi.

ANESTHESIA

from Greek αν-, an-, "without"; and αἴσθησις, aisthēsis, "sensation"), traditionally meant the condition of having sensation (including the feeling of pain) blocked or temporarily taken away.

Tujuan anastesi : mengurangi rasa sakit dan rasa tidak enak pada segala kondisi (ex : selama pemeriksaan dan pembedahan)

Tikus dan mencit : Metode fisik, parenteral dan inhalasi

ANESTHESIA

Metode fisik : hipothermia

Metode parenteral : pentobarbital (30-70 mg/kg BB), Ketamine (50-400 mg/ kg BB), etc

Metode Inhalasi : CO2 (1 mnt), Chloroform, Ether, halothane, etc

HANDLING - TIKUS

IDENTIFIKASI- TIKUS

Identifikasi Hewan Coba -> pembeda perlakuan

Temporer dan Permanen

Spot Tail / Numbered Tail, Ear Tag, Ear Piece, Tail Tatto, Electronic Transponder

SAMPLING

Pengambilan darah -> shock hipovolemic

10% total volume darah, interval 2-4 minggu

1% interval 24 jam

Vena lateral ekor, ventral arteri ekor, sinus orbitalis mata, vena saphena (kaki), arterior vena cava, jantung

EUTHANASIA

Eutanasia (Bahasa Yunani: ευθανασία -ευ, eu yang artinya "baik", dan θάνατος, thanatos yang berarti kematian)

praktek pencabutan kehidupan manusia atau hewan melalui cara yang dianggap tidak menimbulkan rasa sakit atau menimbulkan rasa sakit yang minimal

Inhalasi CO2, Injeksi barbiturat over dosis (200mg/kg BB) atau ketamin (60-70mg/kg BB), dekapitasi, dan dislokasi.

PERHITUNGAN DOSIS

Dosage Converse (Laurence & Bacharah, 1964)

Konversi dosis dari manusia (70 kg) ke :

a. mencit (20 g) = 0.0026

b. tikus (200 g) = 0.0018

Konversi sederhana

BB manusia – mencit atau tikus

APLIKASI INVIVO TEST - NUTRISI

Bioavailability Test (Nutrition)

Meal Tolerance test (glycemic index)

Blood : Diabetic, Artheroschlerosis test

Tissue : Carcinoma test, Antioxidant test

Caecum : Probiotic , SCFA test

Brain : Omega 3 and phospolipid incorporation

etc.. etc..

APLIKASI INVIVO TEST - NUTRISI

EFEK HIPOKOLESTEROLEMIK TEPUNG UMBI GADUNG PADA

TIKUS WISTAR YANG DIBERI DIET HIPERKOLESTEROL

BY. JAYA MAHAR MALIGAN, TETI ESTIASIH, WENNY B. SUNARHARUM DAN THOMAS

RIANTO

LATAR BELAKANG

Gadung (Dioscorea hispida Dennst)

Potensi yang masih belum tergali dengan optimal

Senyawa Bioaktif

Meningkatkan Derajat Kesehatan

Menurunkan Resiko Penyakit Jantung Koroner (PJK)

Mencegah Dislipidemia dengan Memperbaiki Profil Lipid (HDLc, LDLc, TG dan TK)

TUJUAN PENELITIAN Mengetahui efek

hipokolesterolemik tepung umbi gadung (Dioscorea hispida Densst) terhadap tikus Rattus novergicus strain wistar jantan yang diberi diet tinggi lemak (aterogenik) melalui pengujian profil lipid (LDL-c, HDL-c, Kolesterol Total dan Trigliserida).

DIET HIPERKOLESTEROL (AIN-93M)

Komponen Komposisi (g/kg diet)Standar (AIN-93M) Hiperkolesterol

Tepung jagung 620,692 440,66Kasein 140 140Sukrosa 100 100Minyak kedelai 40 40Serat 50 50Campuran mineral 35 35Campuran vitamin 10 10Lemak sapi 0 180L-sistin 1,8 1,8Kolin bitartrat 2,5 2,5TBHQ 0,008 0,04Kolesterol 0 0,196Total (g) 1000 1000

METODOLOGI PENELITIAN

Desain Penelitian : Control Group Post Test Design Tahapan Pelaksanaan Penelitian

1. Persiapan dan Pemilihan Hewan Coba

2. Formulasi Diet Aterogenik

3. Pembuatan Tepung Umbi Gadung (Syafii,dkk.2005)

4. Pemberian Asupan Tepung Gadung pd Hewan Coba

5. Pengumpulan dan Analisis Data

Tikus Wistar Jantan

Adaptasi 7 hari dg diet normal (AIN-93M)

Diet AIN-93M Diet hiperkolesterol Diet hiperkolesterol + tepung gadung

(Pemeliharaan tikus selama 28 hari)

- Penimbangan berat pakan yang dikonsumsi tiap hari- Penimbangan BB tikus tiap 7 hari

- Pengujian Profil Lipid (HDLc,LDLc,TK dan TG) pd hari ke-28

Hasil

HASIL PENELITIAN

HASIL PENELITIAN

HASIL PENELITIAN

APLIKASI INVIVO TEST - NUTRISI

SIFAT BIOAKTIF FOSFOLIPID TERSTRUKTUR DARI LESITIN

KEDELAI KOMERSIAL MENGANDUNG ASAM LEMAK OMEGA-3 HASIL

SAMPING PENGALENGAN IKAN TUNA

BY. JAYA MAHAR MALIGAN, TETI ESTIASIH DAN JONI KUSNADI

LATAR BELAKANG

Minyak Hasil Samping Pengalengan Ikan Tuna

Asam Lemak Omega-3

Kestabilan rendah

Fosfolipid

Lesitin Kedelai Komersial

Fosfolipid Terstruktur

Karakterisasi Sifat Bioaktif :

Uji Invivo

Rx. Asidolisis Enzimatis

Kristalisasi pelarut suhu rendah

Mengkaji kondisi proses sintesis fosfolipid terstruktur mengandung asam lemak omega-3 dari lesitin kedelai komersial dan minyak kaya asam lemak omega-3 dari hasil samping pengalengan tuna.

TUJUAN PENELITIAN

Mengkarakterisasi sifat bioaktif fosfolipid terstruktur dalam menurunkan resiko aterosklerosis menggunakan uji invivo pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain Sprague dawley jantan.

Menguji tingkat inkorporasi DHA fosfolipid terstruktur pada jaringan otak tikus putih (Rattus norvegicus) strain sprague dawley jantan.

TUJUAN PENELITIAN

Diduga pemberian fosfolipid terstruktur, lesitin kedelai komersial dan minyak kaya asam lemak omega-3 pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley jantan yang diberi diet aterogenik akan memberikan pengaruh yang berbeda dalam menurunkan resiko aterosklerosis dan perlemakan hati (steatosis).

HIPOTESIS PENELITIAN

• Diduga konsentrasi enzim dan lama reaksi asidolisis akan berpengaruh terhadap tingkat inkorporasi EPA-DHA pada fosfolipid terstruktur.

Diduga pemberian fosfolipid terstruktur, lesitin kedelai komersial dan minyak kaya asam lemak omega-3 pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley jantan akan memberikan pengaruh yang berbeda terhadap tingkat inkorporasi DHA pada jaringan otak.

HIPOTESIS PENELITIAN

1. Sintesis asidolisis enzimatis dan karakterisasi kimia fosfolipid terstruktur mengandung asam lemak omega-3 dari fosfolipid kedelai dan minyak kaya asam lemak omega-3.

2. Pengujian sifat bioaktif fosfolipid terstruktur melalui uji invivo pada tikus putih (Rattus norvegicus) strain Sprague Dawley jantan

TAHAPAN PENELITIAN

Rancangan Acak Kelompok

Faktor 1. Lama Reaksi : 18, 24,36 jam

Faktor 2. Konsentrasi Enzim : 20,30,40%

Analisis Data : Anova dan Uji Lanjut Post Hoc Tuckey and Duncan (α = 0.05)

DESAIN PENELITIAN

Tahap 1 - Sintesis Asidolisis Enzimatis

P0 : diet standart AIN-93M

P1 : diet aterogenik

P2 : diet aterogenik + lesitin kedelai komersial

P3 : diet aterogenik + minyak kaya asam lemak omega-3

P4 : diet aterogenik + fosfolipid terstruktur

@ 4 ekor tikus (design experiment : nested , uji lanjut : Tukey)

DESAIN PENELITIAN

Tahap 2 – Pengujian Sifat Bioaktif Fosfolipid Terstruktur

Fosfolipid Terstruktur3

Fosfolipid Terstruktur Perlakuan Terbaik 3d

PerlakuanRerata

Kadar EPA-DHA (mg/g) Persentase Relatif (%)

18 jam : 20% (L1K1) 64,69 50,5718 jam : 30% (L1K2) 127,47 51,0418 jam : 40% (L1K3) 119,95 46,0524 jam : 20% (L2K1) 56,70 49,7924 jam : 30% (L2K2) 62,11 51,5824 jam : 40% (L2K3) 134,69 46,0436 jam : 20% (L3K1) 95,62 46,3936 jam : 30% (L3K2) 49,71 49,8236 jam : 40% (L3K3) 115,67 49,92

Pengujian Sifat Bioaktif Fosfolipid Terstruktur4

Profil Lipid4a

Tingkat Inkorporasi DHA di Otak

Histopatologi Aorta dan Ketebalan Lapisan Intima-media Aorta

Histopatologi Perlemakan Hati dan Tingkat Kerusakan Sel Hati

4b

4d

4c

Profil Lipid4a

P0 P1 P2 P3 P4Rerata TK Minggu 0 (mg/dl) 104,42 215,64 231,92 226,99 212,56

Rerata TK Minggu 10 (mg/dl) 109,42 253,64 233,57 192,26 134,21Rerata Rerubahan TK (mg/dl) 4,85c 38,00c 1,64bc -34,72b -78,36a

Total Kolesterol

Profil Lipid4a

Total TrigliseridaP0 P1 P2 P3 P4

Rerata TG Minggu 0 (mg/dl) 64,36 114,65 109,57 117,97 104,9Rerata TG Minggu 10 (mg/dl) 68,55 162,28 111,90 94,44 84,92Rerata Rerubahan TG (mg/dl) 4,20b 50,63c 2,33b -23,52a -94,57a

Profil Lipid4a

P0 P1 P2 P3 P4Rerata HDL Minggu 0 (mg/dl) 57,12 52,56 56,67 55,26 55,96

Rerata HDL Minggu 10 (mg/dl) 56,31 43,82 54,46 57,64 68,60Rerata Rerubahan HDL (mg/dl) -0,87b -8,74c -2,21b 2,39a 12,64a

Kadar HDL

Profil Lipid4a

P0 P1 P2 P3 P4Rerata LDL Minggu 0 (mg/dl) 34,44 140,15 153,34 148,14 135,70

Rerata LDL Minggu 10 (mg/dl) 39,26 176,77 156,73 115,73 48,62Rerata Rerubahan LDL (mg/dl) 4,82d 36,32cd 3,39c -32,41b -87,08a

Kadar LDL

Histopatologi Aorta dan Ketebalan Lapisan Intima-media

Aorta4b

P0

L

OP

100µm

P2

E

L

100µm

P4 L

100µm

P3

L

P1

FC

100µm

100µm

Histopatologi Aorta dan Ketebalan Lapisan Intima-Media Aorta

4b

P0 P1 P2 P3 P4

Rerata IMT (µm) 103,81a 214,02c 206,52c 140,21b 131,82b

Histopatologi Perlemakan Hati dan Tingkat Kerusakan

Sel hati4c

P1

M

D

20 µm

P3

D

20 µm

P2

M

20 µm

P4N

20 µm

P0

N

20 µm

Histopatologi Perlemakan Hati dan Tingkat Kerusakan Sel hati4c

P0 P1 P2 P3 P4Rerata Tingkat Kerusakan

Sel Hati (%) 3,61a 48,98d 39,44c 15,36b 5,06a

Tingkat Inkorporasi DHA di Otak4d

P0 P1 P2 P3 P4Rerata Kadar DHA (mg/g) 1,82a 1,74a 2,37a 65,88ab 224,96c

Rerata Persentase Relatif (%) 0,62a 0,44a 0,54a 12,45b 17,18c

THANK YOU FOR YOUR ATTENTION

April, 2013