noviayuliarni 10060309035 skr 2013 analisis kualitatif dan

PERINGATAN !!! Bismillaahirrahmaanirraahiim

Assalamu’alaikum warahmatullaahi wabarakaatuh

1. Skripsi digital ini hanya digunakan sebagai bahan referensi

2. Cantumkanlah sumber referensi secara lengkap bila Anda mengutip dari Dokumen ini

3. Plagiarisme dalam bentuk apapun merupakan pelanggaran keras terhadap etika moral penyusunan karya ilmiah

4. Patuhilah etika penulisan karya ilmiah

Selamat membaca !!!

Wassalamu’alaikum warahmatullaahi wabarakaatuh

UPT PERPUSTAKAAN UNISBA

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF ANTIOKSIDAN

SINTETIK TERSIER BUTIL HIDROKUINON (TBHQ) DALAM SAMPEL

MARGARIN CURAH YANG BEREDAR DI PASAR BALUBUR

BANDUNG DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI

CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

SKRIPSI

Oleh :

NOVIA YULIARNI

NPM : 10060309035

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG

1434 H / 2013 M

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF ANTIOKSIDAN

SINTETIK TERSIER BUTIL HIDROKUINON (TBHQ) DALAM SAMPEL

MARGARIN CURAH YANG BEREDAR DI PASAR BALUBUR

BANDUNG DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI

CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu persyaratan untuk

menyelesaikan pendidikan dan memperoleh gelar Sarjana Farmasi

pada Program Studi Farmasi FMIPA Unisba

Oleh :

NOVIA YULIARNI

NPM : 10060309035

Juli 1432 H / 2013 M

BANDUNG

JUDUL : ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF

ANTIOKSIDAN SINTETIK TERSIER BUTIL

HIDROKUINON (TBHQ) DALAM SAMPEL

MARGARIN CURAH YANG BEREDAR DI PASAR

BALUBUR BANDUNG DENGAN MENGGUNAKAN

METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

(KCKT)

NAMA : NOVIA YULIARNI

NPM : 10060309035

Setelah membaca Skripsi ini dengan seksama, menurut pertimbangan kami

telah memenuhi persyaratan ilmiah sebagai Skripsi

Menyetujui

Pembimbing Utama Pembimbing Serta

Bertha Rusdi, M.Si., Apt.

NIK. D. 05.0.418

Dr. Rusnadi

NIP. 198202082008121002

Mengetahui

Dekan FMIPA Unisba Ketua Program Studi Farmasi

M. Yusuf Fajar, Drs., M.Si. H. Embit Kartadarma, DR., Mapp.Sc., Apt

NIP. 195610261986031002 NIK. D.06.0.437

“Dan sekali-kali bukanlah harta dan bukan (pula) anak-anak kamu yang

mendekatkan kamu kepada Kami sedikitpun; tetapi orang-orang yang

beriman dan mengerjakan amal-amal saleh, mereka itulah yang memperoleh

balasan yang berlipat ganda disebabkan apa yang telah mereka kerjakan; dan

mereka aman sentosa di tempat-tempat yang tinggi (dalam syurga)”.

(Qs. Saba : 37)

Kutipan atau saduran baik sebagian

ataupun seluruh naskah, harus

menyebutkan nama pengarang dan

sumber aslinya, yaitu Program Studi

Farmasi, Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Islam Bandung.

RIWAYAT PENULIS

BIODATA

Nama : NOVIA YULIARNI

Tempat/ Tgl.lahir : BANDUNG, 19/11/1991

Jenis Kelamin : PEREMPUAN

Agama : ISLAM

Pekerjaan : MAHASISWA

Alamat : JL. KAMPUS 1 NO. 8B

RT/RW : 001/008

Desa/Kel. : BABAKANSARI

Kecamatan : KIARACONDONG

Telepon : 08562111282

Nama Ibu Kandung : HJ. JAHIYAR

Nama Ayah Kandung : H. MOCH. NAJIB

Alamat Orangtua : JL. KAMPUS 1 NO. 8B

RT/RW : 001/008

Desa/Kel. : BABAKANSARI

Kecamatan : KIARACONDONG

Telepon : 08122003577

Pendidikan:

1. TK Al-Fajar, Bandung (1996-1997)

2. SDN SOKA 1, Bandung (1997-2003)

3. SMPN 27, Bandung (2003-2006)

4. SMAN 10, Bandung (2006-2009)

5. Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan

Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Islam Bandung (2009-2013)

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTINTATIF ANTIOKSIDAN

SINTETI TERSIER BUTIL HIDROKUINON (TBHQ) YANG BEREDAR

DI PASAR BALUBUR BANDUNG DENGAN METODE

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

ABSTRAK

NOVIA YULIARNI

Email : [email protected]

Telah dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif kadar antioksidan sintetik

tersier butil hidrokuinon (TBHQ) dalam sampel margarin curah yang beredar di

pasar Balubur Bandung. Analisis kualitatif TBHQ dalam margarin menggunakan

pereaksi dimetilamin, larutan sample yang mengandung TBHQ akan berubah

warna dari merah menjadi merah terang. Metode ekstraksi TBHQ dari margarin

yang digunakan ialah ekstraksi cair-cair yang menggunakan n-heksan dan

asetonitril. Analisis menggunakan metode kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT) dengan detektor sinar UV, pada kondisi pengukuran dengan kolom C18

dan fase gerak metanol: asetoniril: asam asetat 1% (70:10:20). Dari hasil

penelitian ini ketahui hanya satu sampel dari lima sampel pada yang terdeteksi

mengandung TBHQ. Konsentrasi sampel positif mengandung TBHQ tidak

terkuantifikasi karena kadarnya dibawah nilai LOQ.

Kata kunci: Margarin, tersier butil hidrokuinon (TBHQ), kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT), detektor UV

mailto:[email protected]

Analysis Qualitative and Quantitative Antioxidant Synthetic Tertiary Butyl

Hidroqyunine (TBHQ) Which Was Marketed in Pasar Balubur Bandung Using

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Methode

ABSTRACT

NOVIA YULIARNI

Email : [email protected]

Quantitative and qualitative analysis of tertiary butyl hydroquinone (TBHQ) in

margarine which was marketed in Pasar Balubur Bandung has been done.

Analysis qualitative of TBHQ in margarine was using dimethilamine , sample

solution which contained TBHQ were turned red to red light. TBHQ was

extracted from margarine by liquid-liquid extraction method using n-hexane and

acetonitrile. Analysis quantitative of TBHQ was conducted by HPLC method

using C18 column and combination of methanol: acetonitrile: Acetic acid

(70:10:20) as mobile phase. Only one of five sample was detected contain TBHQ.

Concentrantion of those positive sample was not quantified because it was below

the LOQ.

Keywords : Margarine, tertiary butyl hydroquinone (TBHQ), High

Performance Liquid Chromatography (HPLC), UV detector

mailto:[email protected]

i

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Warrahmatullahi Wabarrakatuh

Alhamdulillahirobbil’alamin, segala puji bagi Allah SWT, karena hanya

berkat Rahmat, Hidayah dan Karunia-Nyalah skripsi yang berjudul “Analisis

Kualitatif dan Kuantitatif Antioksidan Sintetik Tersier butil Hidrokuinon (TBHQ)

dalam Sampel Margarin Curah yang Beredar di Pasar Balubur Bandung dengan

Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi” dapat diselesaikan tepat

pada waktunya. Skripsi ini diajukan untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah

satu syarat dalam rangka menyelesaikan program pendidikan sarjana farmasi pada

Program Studi Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Islam Bandung.

Dalam penulisan tugas akhir ini tidak terlepas dari bantuan, dukungan, dan

masukkan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dalam kesempatan ini penulis

ingin mengucapkan terima kasih kepada :

1) Bapak M. Yusuf Fajar, Drs., M.Si., selaku Dekan FMIPA Unisba

2) Bapak H. Embit Kartadarma, DR., MappSc., Apt selaku Ketua Program Studi

Farmasi Universitas Islam Bandung

3) Ibu Bertha Rusdi.,M.Si.,Apt dan Bapak Dr. Rusnadi selaku pembimbing yang

senantiasa memberikan masukan, arahan dan dukungan dalam menyelesaikan

skripsi ini.

4) Ibu Diar Herawati M.Si.,Apt selaku dosen wali yang selalu mencurahkan

perhatian, nasihat, serta dukungan moril selama penulis menempuh

pendidikan di Farmasi Unisba, juga kepada seluruf staf pengajar yang telah

memberikan banyak ilmu dan wawasan baru bagi penulis selama menjalani

pendidikan di FMIPA Unisba.

5) Ayahanda, H. Moch Najib dan Ibunda Hj. Jahiyar yang tercinta, atas segala

kasih sayang yang dilimpahkan, seluruh perhatian, nasihat, doa yang tak

pernah putus, serta dukungan moril dan materil yang tanpa henti mengiringi

hidup Penulis.

ii

6) Kakak (H. Jhoniardi, Yuni Fitriyani) dan adikku (Sari Mulyani, Rahmat

Jainanda Putra) tersayang yang tak pernah lelah memberikan semangat dan

dukungan

7) Sahabat-sahabatku (Nita, Indi, Atin, Ica, Putri, Bebel, Linda, Elika, Lita, Cici),

seluruh sahabat seperjuangan Farmasi A (Diah, Sheyrra, Uzi, Tuti, Indri,

Anitha, Dedi, Neysa, Iga, Tika, Nuy, Lisnawati, Tammy, Adit, ival dll) yang

senantiasa memberikan bantuan, masukan dan dukungan kepada penulis.

8) Seluruh rekan-rekan farmasi Unisba dan semua pihak yang tidak dapat

disebutkan satu persatu. Terima kasih atas semua dukungan dna bantuannya.

Penulis menyadari bahwa tugas akhir ini masih jauh dari sempurna.

Oleh karena itu, Penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang bersifat

membangun agar tugas akhir ini dapat lebih baik lagi. Semoga skripsi ini

dapat bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.

Bandung, 9 Ramadhan 144 H

18 Juli 2013M

Penulis

iii

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK

ABSTRACT

KATA PENGANTAR .................................................................................... i

DAFTAR ISI ............................................................................................. iii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. v

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... vi

DAFTAR TABEL .......................................................................................... vii

PENDAHULUAN ........................................................................................... 1

BAB

I TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................... 4

1.1. Margarin ......................................................................................... 4

1.2. Bahan Tambahan Makanan ......................................................... 5

1.3. Oksidasi .......................................................................................... 6

1.4. Antioksidan .................................................................................... 8

1.4.1. Mekanisme Antioksidan ............................................................... 9

1.4.2. Tersier Butil Hidroquinon ............................................................ 9

1.5. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .............................................. 10

1.5.1. Prinsip Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .......................... 12

1.6. Analisis TBHQ ............................................................................... 13

1.7. Validasi Metode ............................................................................. 14

1.7.1. Akurasi .......................................................................................... 14

1.7.2. Presisi ............................................................................................ 14

1.7.3. Linearitas ...................................................................................... 16

II METODOLOGI PENELITIAN .......................................................... 18

III BAHAN DAN ALAT ............................................................................ 21

3.1. Bahan ............................................................................................. 21

3.2. Alat ............................................................................................. 21

IV PROSEDUR KERJA ............................................................................ 22

4.1. Pengambilan Sampel ..................................................................... 22

4.2. Ekstraksi Margarin ....................................................................... 22

4.3. Analisis Kualitatif dan Kuantitaif TBHQ dengan metode KCKT 22

4.3.1. Penyiapan Larutan Baku ............................................................... 23

4.3.2. Pembuatan Fase Gerak ................................................................. 23

4.3.3. Penetapan Kadar TBHQ dalam Sampel Margarin ........................ 23

4.4. Uji Kesesuaian Sistem ................................................................... 23

4.5. Verifikasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi............... 24

iv

4.5.1. Linearitas ...................................................................................... 24

4.5.2. Presisi ............................................................................................ 24

4.5.3. Akurasi .......................................................................................... 24

V HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 25

VI KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 34

6.1. Kesimpulan .................................................................................... 34

6.2. Saran ............................................................................................. 34

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 35

LAMPIRAN ............................................................................................. 36

v

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1 Certificate Of Analysis TERT-BUTHYLHYDROQUINONE .................. 36

2 Perhitungan linearitas ............................................................................. 37

3 Perhitungan akurasi ................................................................................ 38

4 Perhitungan presisi.................................................................................. 39

5 Perhitungan sampel ................................................................................. 40

6 Dokumentasi puncak kromatogram linearitas ........................................ 41

7 Dokumentasi puncak kromatogram akurasi ........................................... 43

8 Dokumentasi puncak kromatogram sampel............................................ 52

vi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

I.1. Struktur TBHQ ....................................................................................... 10

I.2. Diagram skematik alat KCKT ................................................................ 11

II.2. Bagan alir penelitian ............................................................................... 20

V.1. Kurva kalibrasi dan linearitas ................................................................. 28

vii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

V.1 Kurva kalibrasi dan lienaritas............................................................... 28

V.2.1 Nilai akurasi baku pembanding ditambahkan setelah preparasi sampel 29

V.2.2 Nilai akurasi penambahan sebelum ekstraksi ...................................... 30

V.3 Nilai presisi .......................................................................................... 31

V.4 Penetapan kadar TBHQ dalam sampel ................................................ 33

L.2 Derajat kelinearan ................................................................................ 37

L.3 Hasil pengukuran akurasi ..................................................................... 38

L.4 Data presisi ........................................................................................... 39

L.5 Data pengukuran sampel ...................................................................... 40

1

PENDAHULUAN

Margarin pertama ditemukan pada tahun 1870 oleh Mouries Mega di

Perancis. Margarin pada awalnya ditujukan sebagai pengganti mentega.

Penampilan, bau, konsistensi, rasa, dan nilai gizi dibuat hampir sama dengan

mentega. Margarin merupakan salah satu produk emulsi air dalam minyak (w/o),

yaitu fase air berada dalam fase minyak (Ketaren,1986). Lemak yang digunakan

untuk pembuatan margarin dapat berasal dari lemak hewani atau lemak nabati.

Margarin yang terbuat dari minyak tumbuh-tumbuhan mengandung asam lemak

tidak jenuh yang lebih banyak dibandingkan asam lemak jenuhnya, 13-15%

asam lemak jenuh dan 85-87% asam lemak tidak jenuh (Ketaren, 1986).

Dalam makanan yang mengandung lemak tak jenuh, oksigen dapat

mengoksidasi makanan sehingga menimbulkan perubahan bau dan rasa tengik

(Arisman, 2009:59). Oksidasi lemak juga dapat menurunkan kualitas dan

keamanan makanan setelah pemasakan dan pemrosesan akibat terbentuknya

produk reaksi sekunder dalam makanan tersebut (Franked,1980). Untuk mengatasi

pengoksidasian tersebut maka digunakan zat berupa antioksidan. Fungsinya

mencegah, memperlambat, atau meminimalkan proses pengoksidasian makanan

dengan cara kerja mengikat oksigen atau mencegah reaksi oksigen dengan

komponen makanan (Arisman,2009).

Dalam industri pangan salah satu antioksidan yang digunakan adalah

Tersier Butil Hidrokuinon (TBHQ) karena sifatnya yang efektif untuk mencegah

ketengikan makanan yang mengandung minyak dan lemak. Adapun batas yang

2

diijinkan oleh BPOM untuk penggunaan TBHQ adalah 200 mg/kg, dan nilai

Acceptable Daily Intake (ADI) dari TBHQ adalah 0-0,7 mg/kg berat badan

(WHO,1999).

Menurut Smith (2003:101) penggunaan TBHQ pada beberapa Negara

seperti Jepang, Eropa, Denmark, dan Kanada penggunaan TBHQ sudah dilarang.

Pada beberapa penelitian dalam konsentrasi yang tinggi TBHQ dapat

menyebabkan kanker. Penyebabnya adalah metabolit dari oksidasi TBHQ yaitu 2-

tertbutyl-1,4-benzoquinone(tBBq) dan ROS (Gharavi, Haggarty, dan EL-

kadi,2007:1). Chaerinisa pada tahun 2012 telah melakukan penelitian analisis

kuantitatif TBHQ dalam minyak goreng dan antioksidan TBHQ masih umum

digunakan oleh produsen minyak goreng, namun berdasarkan hasil analisis,

jumlah antioksidan yang ditambahkan masih berada pada batas wajar penggunaan,

berkisar antara 55,8-138,5 ppm.

Metode KCKT merupakan salah satu metode analisis TBHQ yang paling

banyak dilakukan. Metode ini berguna dalam penentuan kemurnian dan

perhitungan kandungan TBHQ dalam sampel secara kuantitatif. Metode ini dapat

memberikan hasil data yang akurat dalam penentuan kadar dan memiliki

kepekaan yang tinggi (Munson,1991:14).

Berdasarkan paparan diatas, dapat disimpulkan bahwa yang menjadi

rumusan masalah dalam penelitian ini adalah mengetahui ada atau tidaknya

TBHQ dalam margarin curah, jika terdapat TBHQ berapa kadarnya dan apakah

berada dalam batas aman atau tidak.

3

Manfaat penelitian ini diharapkan dapat menambah pengetahuan mengenai

penggunaan bahan tambahan makanan antioksidan sintetik TBHQ yang tepat

sesuai dengan ketentuan yang telah ditetapkan.

4

BAB 1

TINJAUAN PUSTAKA

1.1. Margarin

Margarin merupakan emulsi dengan tipe emulsi air dalam minyak (water

in oil emulsion – W/O), berbentuk semi padat, dan bersifat plastis, terbuat dari

lemak nabati dan mempunyai lemak nabati minimal 80% dan maksimum 90%.

Namun di Amerika, margarin dapat dibuat dari lemak makan dan/atau minyak

makan atau campuran minyak dan lemak dimana asal minyak dan lemak tersebut

adalah nabati, karkas hewan dan hewan laut (minyak ikan). Di Kanada margarin

dapat dibuat dari minyak dan lemak apa saja asalkan bukan dari lemak susu

(Ketaren,1986).

Margarin pertama kali ditemukan di Perancis oleh seorang ahli Kimia

bernama Hippolyte Mege-Mouries pada tahun 1869. Penemuan margarin

sebetulnya dipicu oleh keadaan di Perancis pada saat itu dimana harga mentega

sangat mahal sehingga banyak masyarakat yang tidak mampu membelinya

(Ketaren,1986).

Margarin dibuat melalui proses hidrogenasi. Proses pembuatan margarin

diawali dengan proses pengepresan yaitu memisahkan antara minyak dengan

bungkilnya. Kedua, proses netralisasi yaitu dengan penambahan NaOH 11,06%.

Ketiga, proses bleaching menggunakan karbon aktif sebagai adsorber sebanyak

1,5% dari jumlah minyak. Keempat, proses hidrogenasi untuk menjenuhkan

ikatan tidak jenuh pada minyak dengan menambahkan gas H2 dan menggunakan

5

katalis Ni. Proses selanjutnya yaitu proses deodorisasi pada tekanan vakum.

Kemudian proses emulsifikasi dengan penambahan EFM dan EFC. Proses

terakhir yaitu memasukkan minyak ke dalam tangki votator untuk menurunkan

suhu dan membentuk margarin yang bersifat plastis pada suhu kamar dan

dilakukan proses pengepakan.

1.2 . Bahan Tambahan Makanan

Pengertian bahan tambahan pangan secara umum adalah bahan yang

biasanya tidak digunakan sebagai makanan dan biasanya bukan merupakan

komponen khas makanan, mempunyai atau tidak mempunyai nilai gizi, yang

dengan sengaja ditambahkan kedalam makanan untuk maksud teknologi pada

pembuatan, pengolahan penyiapan, perlakuan, pengepakan, pengemasan, dan

penyimpanan (Cahyadi, 2006).

Pemakaian Bahan Tambahan Pangan di Indonesia diatur oleh Departemen

Kesehatan. Sementara, pengawasannya dilakukan oleh Direktorat Jenderal

Pengawasa Obat dan Makanan (Dirjen POM). Beberapa Bahan Tambahan yang

diizinkan digunakan dalam makanan menurut Permenkes RI No.

722/Menkes/Per/IX/1988 diantaranya sebagai berikut: Antioksidan, Antikempal,

Pengatur Keasaman, Pemanis Buatan, Pemutih dan Pematang Telur, Pengemulsi,

Pemantap, dan Pengental, Pengawet (Preservative), Pengeras (Firming Agent),

Pewarna (Colour), Penyedap Rasa dan Aroma, Penguat Rasa (Flavour, Flavour

Enhancer), Sekuestran (Sequestrant).

6

Menurut peraturan No.722/MENKES/PER/IX/88 tentang Bahan

Tambahan Makanan disebutkan bahwa antioksidan adalah bahan tambahan

makanan yang dapat mencegah atau memperlambat oksidasi. Selain itu,

disebutkan pula larangan menggunakan bahan tambahan makanan dalam jumlah

berlebih dari batas penggunaan maksimumnya untuk setiap jenis makanan.

1.3. Oksidasi

Oksidasi adalah masalah yang paling sering ditemukan dalam produksi,

penyimpanan, dan penggunaan makanan yang mengandung lemak dan minyak.

Oksidasi minyak dan lemak tak jenuh diawali terjadinya pembentukan radikal

bebas karena adanya panas, cahaya, ion logam atau oksigen. Reaksi terjadi pada

gugus metal yang berada dekat pada ikatan rangkap antar karbon (Smith, 1991).

Mekanisme oksidasi umumnya terdiri dari tiga tahap utama, yaitu inisiasi,

propagasi, dan terminasi. Pada tahap inisiasi terjadi pembentukan radikal bebas

lemak (R•), yaitu suatu senyawa yang bersifat tidak stabil dan sangat reaktif

akibat hilangnya satu atom hidrogen (reaksi 1). Tahap ini berlansung lambat dan

terjadi karena adanya cahaya atau logam. Pada tahap propagasi, radikal lemak

akan bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksida (ROO•). Radikal

peroksida selanjutnya akan menyerang molekul lemak lain (RH) menghasilkan

hidroperoksida (ROOH) dan radikal baru (reaksi 2 dan 3). Tahap ini merupakan

reaksi rantai yang berlansung sangat cepat (Smith, 1991).

Hidroperoksida yang terbentuk bersifat tidak stabil dan akan terdegradasi

menjadi senyawa seperti aldehida, keton, dan asam yang menyebabkan bau dan

7

rasa tengik. Reaksi oksidasi akan berakhir pada tahap terminasi, yaitu melalui

reaksi antara radikal bebas (reaksi4,5,6) (Smith,1991).

Faktor-faktor yang dapat memicu terjadinya oksidasi antara lain (Smith,1991) :

1) Panas. Setiap kenaikan suhu 100C akan meningkatkan kecepatan reaksi

oksidasi menjadi dua kalinya

2) Cahaya. Sinar UV merupakan katalis yang kuat untuk terjadinya oksidasi.

3) Logam-logam dalam bentuk ion atau terlarut merupakan katalis untuk

terjadinya oksidasi.

4) Suasana Basa. Kebasaan dan ion logam alkali memicu terbentuknya radikal

bebas.

5) Derajat ketidakjenuhan. Jumlah dan posisi ikatan rangkap dalam molekul

lemak mempengaruhi kerentanan terhadap oksidasi.

6) Pigmen. Residu pigmen seperti klorofil dalam minyak nabati dapat memicu

terjadinya oksidasi.

7) Oksigen. Oksigen diperlukan dalam oksidasi.

Terjadinya oksidasi dapat dikenali dari tanda-tanda; seperti ketengikan,

perubahan warna (warna bisa berubah menjadi gelap ataupun pudar

tergantung substrat yang teroksidasi, misalnya minyak dan lemak cenderung

menjadi lebih gelap sedangkan pigmen, terutama karotenoid, cenderung

memudar), dan hilangnya aroma (missal pada minyak atsiri yang teroksidasi

akan menghilangkan aromanya yang khas).

8

1.4. Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang dapat memperlambat oksidasi di

dalam bahan. Penggunaan pada bahan, antara lain lemak hewani, minyak nabati,

produk pangan dengan kadar lemak tinggi, produk pangan berkadar lemak

rendah, produk daging, produk ikan, dan produk lain-lain (Cahyadi,2006:120).

Meskipun kerusakan mikrobiologis merupakan faktor utama yang perlu

diperhatikan dalam pengawetan bagian karbohidrat dan protein suatu produk

pangan, namun oksidasi adalah faktor utama yang mempengaruhi kualitas lemak,

minyak, dan bagian lemak dari pangan. Lemak dan minyak mudah mengalami

oksidasi yang mengakibatkan kerusakan karena timbulnya bau dan cita rasa yang

menyimpang (Cahyadi,2006:121).

Antioksidan efektif dalam mengurangi ketengikan oksidatif dan

polimerisasi tetap tidak mempengaruhi hidrolisis atau sebaliknya. Antioksidan

terdiri dari dua macam, yaitu antikoksidan alam dan sintetik. Antioksidan alam

antara lain turunan fenol, kumarin, hidroksi sinamat, tokoferol, difenol, nonfenol,

katekin, dan asam askorbat. Antioksidan sintetik antara lain butil hidroksianisol

(BHA), butil hidroksitoluen (BHT), tersier butil hidrokuinon (TBHQ), propel

galat dan etoksiquin (Cahyadi,2006:121)

Berdasarkan Menurut Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia

Nomor 722/Menkes/Per/IX/88, antioksidan yang diizinkan penggunaannya

adalah asam askorbat, asam ertorbat, askorbil palmitat, askorbil stearat, butil

hidroksianisol (BHA), butil hidroksitoluen (BHT), tersier butil hidrokuinon

9

(TBHQ), dilauril tiodipropionat, propel gallat, timah (II) klorida, alpha tokoferol,

dan tokoferol campuran pekat.

1.4.1. Mekanisme antioksidan

Antioksidan yang baik akan bereaksi dengan radikal lemak dan peroksida

segera setelah senyawa tersebut terbebntuk. Salah satu mekanisme kerja

antioksidan adalah dengan menyediakan hydrogen untuk bereaksi dengen radikaln

bebas dan memutuskan reaksi berantai oksidasi sebelum terbentuk produk akhir

yang menyebabkan ketengikan, contohnya antioksidan golongan fenolat (AH2dan

AH). Radikal bebas fenolat yang terbentuk stabil (berenergi rendah) karena

adanya hibridasi resonnansi (Smith,1991).

1.4.2. Tersier Butil Hidrokuinon (TBHQ)

TBHQ merupakan bahan tambahan makanan berupa antioksidan sinteteik

yang digunakkan untuk menstabilkan berbagai minyak, lemak dan makanan

terhadap kerusakan oksidatif dengancara memperlambat proses terjadinya

ketengikan pada produk dan membuat produk tersebut menjadi tahan lama dalam

penyimpanan yang cukup lama. TBHQ memiliki efek yang efektif untuk

menstabilkan dalam lemak tak jenuh dan lemak hewani yang dapat dimakan.

TBHQ juga secara luas digunakan dlaam minyak esensial, kacang-kacangan,

lemak hewan, lemak susu, makanan yang digoreng, dan makanan-makanan

kemasan.

Sinonim TBHQ antara lain 2-(1,1-dimetiletil)-1,4-benzendiol; E319; 2-

tert-butil-1,4-dihidroksibenzen. TBHQ terbentuk serbuk Kristal berwarna putih

atau coklat muda dengan bobot molekul 166,22 dengan titik didih 2950C pada

10

tekanan 1 atmosfir dan titik lebur 126,5-128,50C. TBHQ praktis tidak larut dalam

air, larut dalam minyak, etanol, etil asetat, dan propilenglikol (Smith,2003:100).

Gambar 1.1. Struktur TBHQ (Decker et al, 2010:279)

TBHQ dalam makanan berfungsi sebagai antioksidan yaitu untuk

mencegah terjadinya ketengikan oksidatif dengan mengakhiri pembentukan

radikal bebas. Namun, mengenai keamanan pangan, TBHQ menunjukkan adanya

mutagenisitas pada pengujian in vivo, sehingga di beberapa Negara menganggap

bahwa TBHQ tidak memenuhi standar pengujian toksisitas. Beberapa Negara

yang melarang TBHQ digunakan sebagai bahan tambahan makanan antara lain :

Jepang, Kanada (Smith,2003:101)

Penggunaan TBHQ yang diizinkan adalah pada konsentrasi 0,02% berat

kandungan lemak atau minyak dari makanan (Smith,2003:101). Nilai ADI TBHQ

adalah 0,7 mg/kg berat badan (WHO,1999).

1.5. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh

suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase

atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah

tertentu dan didalamnya zat-zat ini menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan

11

adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul

atau kerapatan muatan ion. Dengan demikian masing-masing zat dapat

diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (FI edisi IV,1995:1002)

Gambar 1.2. Diagram Skematik alat KCKT

Kromatografi merupakan tehnik dimana solut atau zat terlarut terpisah

oleh perbedaan kecepatan elusi, saat solut melewati suatu kolom kromatografi.

Pemisahan solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.

Instrumen KCKT pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu (1)

wadah fase gerak, (2) sistem penghantaran fase gerak, (3) alat untuk memasukkan

sampel, (4) kolom, (5) detektor, (6) wadah penampung buangan fase gerak, (7)

tabung penghubung, (8) suatu komputer atau integrator atau perekam (Gandjar

dan Rohman,2007: 379).

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam, dan sifat komponen sampel. Fase gerak yang paling sering digunakan

12

untuk pemisahan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol

atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase

gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut hidrokarbon dengan

pelarut yang terklorasi atau menggunakan pelarut jenis alkohol (Gandjar dan

Rohman,2007 hal: 381). Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom

konvensional dan kolom mikrobor. Fase diam pada KCKT berupa silika yang

dimodifikasi secara kimiawi (dengan reagen-reagen seperti klorisan), silika yang

tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena. Permukaan

silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanon (Si-OH)

(Gandjar dan Rohman,2007: 385). Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan

fese diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa

dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi (Gandjar dan

Rohman,2007: 386).

Detektor pada KCKT terbagi 2 yaitu detektor universal (detektor indeks

bias dan detektor spektrofotometri massa) dan golongan detektor spesifik

(detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia) (Gandjar dan

Rohman,2007: 388). Detektor spektrofotometri UV-Vis didasarkan pada adanya

penyerapan radiasi ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang

gelombang 190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai struktur atau gugus

kromoforik (Gandjar dan Rohman,2007: 390).

1.5.1 Prinsip Kerja Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Prinsip kerja dari KCKT adalah memisahkan setiap komponen dalam

sampel untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa

13

konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Luas puncak

kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa

yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal dan transfer massa tidak setimbang.

Sedangkan parameter-parameter yang menentukan proses berlansungnya proses-

proses tersebut adalah proses pemisahan dan proses identifikasi (Effendy,2004).

Alur dari kerja KCKT adalah fase gerak disimpan pada reservoir (tabung

gelas), kemudian akan disedot oleh pompa dan masuk kedalam pipa yang akan

melewati tempat penyuntikan sampel tersebut yang jumlahnya biasanya 20 µl atau

yang paling besar 100 µl. Sampel dimasukkan ke dalam aliran fase gerak sehingga

akan ikut masuk ke dalam aliran yang selanjutnya menuju ke kolom, disinilah

tempat sampel akan dipisah-pisahkan dan hasilnya berupa puncak-puncak

(Effendy,2004).

Faktor-faktor yang harus diperhatikan antara lain, jenis kolom, komposisi

eluen, volume injeksi dan jenis detektor umumnya adalah spektrofotometer UV-

cahaya tampak (Effendy,2004).

1.6. Analisis TBHQ

Beberapa metoda analisis antioksidan sintetik TBHQ dapat dilakukan uji

kualitatif maupun kuantitatif. Untuk kualitatif diantaranya kromatografi kertas,

kromatografi lapis tipis,reaksi warna dengan dimetilamin akan menghasilkan

warna merah. Kromatografi cair kinerja tinggi dan kromatografi gas dapat

digunakan untuk uji kuantitatif senyawa TBHQ. Spektrofotometri dapat

digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan.

14

1.7 Validasi Metode

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan

untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel dan tahan

pada kisaran analit yang akan dianalisis. Suatu metode analisis harus divalidasi

untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya cukup mampu

untuk mengatasi problem analisis (Gandjar dan Rohman, 2007:463-464).

Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan

bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya

(Harmita,2004: 117).

1.7.1. Akurasi

Akurasi Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan

hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyataka sebagai

persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil

analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik di dalam keseluruhan

tahapan analisis (Harmita, 2004: 117).

Penentuan ketepatan dan kadar teoritis dari jumlah tertentu senyawa

standar yang sengaja ditambahkan ke dalam contoh. Harga perbandingan ini

disebut persen perolehan kembali (recovery). Nilai keberterimaan adalah RSD <

1% nilai recovery antara 80-120% (Gandjar dan Rohman, 2007:465).

1.7.2. Presisi

Presisi atau keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual

15

dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel yang diambil

dari campuran yang homogen (Harmita, 2004:121).

Presisi merupakan ukuran kedekatan antar serangkaian hasil analisis yang

diperoleh dari beberapa pengukuran dalam sampel homogen yang sama.

Dokumentasi presisi seharusnya mencakup simpangan baku relatif (RSD) atau

koefisien variansi (CV) dan kisaran kepercayaan sebagaimana dipersyaratkan oleh

ICH (international conference harmanizatio) (Harmita, 2004:121).

1) RSD =

= rat-rata

SD = standar deviasi serangkaian data

2) Sementara itu, nilai SD dihitung dengan :

SD =

X = nilai dari masing-masing pengukuran

= rata-rata (mean) dari pengukuran

N = banyaknya data

N-1 = derajat kebebasan

Data untuk menguji presisi seringkali dikumpulkan sebagai bagian kajian

lain yang berkaitan dengan presisi seperti linearitas atau akurasi. Biasanya 6-15

kali penyuntikan dilakukan pada sampel tunggal untuk tiap konsentrasi. Pada

pengujian KCKT, nilai RSD antar 1-2% biasanya dipersyaratkan untuk senyawa

aktif dalam jumlah banyak, sedangkan untuk senyawa-senyawa aktif dengan

kadar dalam jumlah sedikit RSD berkisar antar 5-15% (Rohman,2007:17-18).

16

Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif

(koefisien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan

(repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah

keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada

kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek (Harmita, 2004: 122).

1.7.3. Linearitas

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon

yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematematik yang

baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode

adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan

dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat

diterima (Harmita,2004:128).

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-

hasil uji yang secara lansung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran

yang diberikan. Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva

kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x).

Linearitas dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi

yang berbeda-beda (Gandjar dan Rohman.2007:469). Sebagai parameter adanya

hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a +

bX (Harmita,2004:128)

18

BAB II

METODELOGI PENELITIAN

Penentuan kadar antioksidan sintetik TBHQ dalam sampel margarin

menggunakan KCKT dilakukan dalam beberapa tahap. Tahap awal dari penelitian

ini adalah pengumpulan sampel, sampel diambil dari pasar Balubur Bandung,

pengambilan sampel dilakukan dalam dua waktu yang berbeda.

Margarin yang akan diteliti kandungan TBHQ dicairkan terlebih dahulu

diatas penangas air. Setelah mencair sampel kemudian diekstraksi dengan corong

pisah menggunakan heksana kemudian bagian heksana diambil dan diekstraksi

kembali dengan asetonitril. Fase asetonitril diambil dimasukkan ke dalam labu

ukur 50 ml dan ditambahkan asetonitril hingga tanda batas.

Analisis kadar TBHQ dilakukan dengan menggunakan metode KCKT

dengan detektor UV. Kadar sampel dihitung dengan menggunakan kurva baku

standar TBHQ. Kondisi percobaan adalah sebagai berikut fase gerak berupa fase

gerak metanol: asetonitril: asam asetat 1% (70:10:20), fase diam (kolom) n-

oktadesil silan C-18 (10µm), laju alir 1 mL/menit, pembacaan gelombang pada

detektor UV 280 nm dan pada suhu kamar (250C).

Sebelum metoda analisis tersebut digunakan untuk menganalisa sampel,

terlebih dahulu dilakukan verifikasi metode analisis untuk menjamin metode

analisis yang digunakan memenuhi untuk dipergunakan. Metode tersebut

diverifikasi dan diukur berdasarkan parameter-parameter utama yaitu uji

perolehan kembali (recovery) metode ekstraksi, linearitas, akurasi dan presisi.

19

Pengerjaan ekstraksi dan analisis TBHQ dengan metode KCKT dilakukan

di Laboratorium Penelitian Farmaasi FMIPA Unisba Bandung.

20

Gambar II.1. Bagan alir penelitian

Sampel margarin

ALAT KCKT PREPARASI

SAMPEL

PEMBUATAN

LARUTAN BAKU

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF TBHQ DALAM MARGARIN

VALIDASI METODE

ANALISIS

OPTIMASI ALAT

PENETAPAN KADAR

TBHQ

21

BAB III

ALAT DAN BAHAN

3.1 Bahan

Akuabidestilata (IPHA Laboratories), asetonitril (Merck, proKCKT),

metanol (Merck, pro KCKT), asam asetat glacial (Merck), baku pembanding

tersier butil hidrokuinon (Fluka), n-heksana (Merck, proKCKT), sampel

margarin.

3.2 Alat

Peralatan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Agilent 1220 Infinity LC

kolom C-18 Zorbax (10µm) dengan detektor UV, mikropipet 100-1000 µL

(Socorex, Acura-825), nilon membran filter 0,45µm, dan alat gelas lain yang

umum digunakan di laboratorium analisis.

22

BAB IV

PROSEDUR KERJA

4.1. Pengambilan Sampel

Sampel diambil dari pasar Balubur Bandung yang diambil dalam dua

waktu yang berbeda.

4.2. Ekstraksi Margarin

Sejumlah sampel dicairkan dalam gelas kimia 50 mL diatas penangas air

dan diaduk hingga homogen. Sampel yang telah dicairkan ditimbang sebanyak 1

gram dan dimasukan kedalam corong pisah. Tambahkan 5 mL heksan kedalam

corong pisah, kocok corong pisah agar sampel bercampur dengan heksan.

kemudian ditambahkan dengan 12 mL asetonitril yang telah dijenuhkan dalam

labu ukur 50 mL, lapisan asetonitril diambil (ekstraksi dengan asetonitril diulangi

sebanyak tiga kali pengulangan). Tambahkan asetonitril sampai tanda batas 50 ml.

4.3. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif TBHQ dengan Metode KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang digunakan adalah KCKT Agilent

1220 dengan kondisi analisis kromatografi sebagai berikut:

Kolom : Zorbax ® Eclipse XDB-C18, 4.6 mm 150 mm, 3.5 µm

Fase gerak : metanol: asetonitril: asam asetat 1% (70:10:20)

Laju alir : 1 mL/min

Detektor UV : panjang gelombang 280 nm

23

Volume injeksi : 10 µL

4.3.1. Penyiapan Larutan Baku

Standar TBHQ sebanyak 50 mg dilarutkan dalam labu ukur 50 mL

dengan metanol hingga tanda batas 50 mL sehingga didapatkan larutan baku

TBHQ 1000 ppm. Larutan stok ini kemudian dapat diencerkan untuk memperoleh

larutan dengan konsentrasi yang diinginkan.

4.3.2. Pembuatan Fase Gerak

Diambil sejumlah metanol, asetonitril dan asam asetat 1% dengan

perbandingan 70: 10:20, kemudian dicampurkan hingga homogen.

4.3.3. Penetapan Kadar TBHQ dalam Sampel Margarin

Hasil ekstraksi dari margarin disaring dalam membran selulosa. Filtrat

disuntikkan kedalam KCKT Agilent 1220 dengan kondisi seperti yang telah

disebutkan diatas.

4.4. Uji Kesesuaian Sistem

Konsentrasi larutan baku yang telah dibuat sebelumnya disuntikkan

sebanyak 7 kali kedalam KCKT sebanyak 10 µL. Dari hasil pengukuran dihitung

taily factor dan simpangan baku.

4.5. Verifikasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

4.5.1. Linearitas

Dari larutan TBHQ standar 1000 ppm diencerkan menjadi 200 ppm yaitu

dengan mengambil 10 mL larutan standar, kemudian dilarutkan dalam labu ukur

24

50 mL dengan metanol. Dari larutan stok 200 ppm dibuat deret penggunaan

larutan standar dengan memipet masing-masing 1; 2; 3; 4; 5 dan 6 ml, kemudian

dilarutkan dalam labu ukur 10 mL dengan fasa gerak (metanol:asetonitril:asam

asetat1%, 70:10:20) sehingga diperoleh deret larutan standar TBHQ dengan

konsentrasi 20 ; 40; 60; 80; 100 dan 120 ppm, selanjutnya diinjeksikan ke dalam

kolom KCKT. Dari hasil pengukuran dihitung koefisien korelasi, standar deviasi

dan koefisien variansi.

4.5.2. Presisi

Sampel margarin yang akan diekstraksi ditambahkan standar TBHQ

konsentrasi 40 ppm. Kemudian diekstraksi menggunakan prosedur yang sama

dengan ekstraksi sampel. Ekstraksi dan pengukuran diulang sebanyak 6 kali.

Selanjutnya dilakukan prosedur penetapan kadar seperti yang telah disebutkan

diatas. Dari hasil pengukuran dihitung standar deviasi.

4.5.3. Akurasi

Prosedur untuk menentukan akurasi adalah sama seperti prosedur

penentuan presisi. Dari hasil pengukuran dihitung % perolehan kembali

(recovery).

25

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Preparasi Sampel

Prosedur preparasi sampel yang digunakan adalah ekstraksi cair-cair

dimana menurut Harbone (1987:21) ekstraksi cair-cair merupakan pemisahan

komponen kimia diantara 2 fase pelarut yang tidak saling bercampur sehingga

komponen larut pada fase pertama dan sebagian larut pada fase kedua. Kedua fase

yang mengandung zat terdispersi dikocok, lalu didiamkan sampai terjadi

pemisahan sempurna dan terbentuk dua lapisan cair. Dalam proses ekstraksi pada

penelitian ini digunakan dua pelarut yang tidak saling bercampur yaitu n-heksana

(bj 0,659 g/ml) dan asetonitril (bj 0,786g/ml).

Margarin dicairkan terlebih dahulu kemudian ditimbang sebanyak lalu

dimasukkan kedalam corong pisah dan ditambahkan n-heksana kemudian

dikocok. Penambahan n-heksana bertujuan untuk menarik lemak dan minyak serta

matriks non polar yang terkandung dalam margarin. Setelah homogen margarin

dengan n-heksana lalu ditambahkan dengan asetonitril dan kemudian dikocok

kembali lalu didiamkan sehinggga terpisah menjadi dua fasa. Penambahan

asetonitril yang semipolar bertujuan untuk menarik TBHQ. Bj asetonitril lebih

besar dari bj n-heksana sehingga fase asetonitril berada di bagian bawah dan fase

n-heksan berada dibagian atas. Diambil fase asetonitril. Kemudian ditambahkan

kembali asetonitril kedalam corong pisah dengan prosedur yang sama sebelumnya

yaitu dikocok kembali dan didiamkan hingga terjadi pemisahan dan diambil fase

26

asetonitril, prosedur ini dilakukan sebanyak 3 kali agar TBHQ terekstraksi dengan

sempurna. Ekstrak yang didapat kemudian disaring secukupnya dengan nilon

membran filter 0,45µm untuk menghilangkan partikel yang dapat mengganggu

pengukuran, kemudian filtrat disuntikkan kedalam KCKT.

5.2. Kondisi pengujian dengan KCKT

Instrumen yang digunakan dalam penetapan kadar adalah KCKT dengan

sistem yang digunakan adalah sistem kromatografi terbalik yaitu polaritas fase

gerak lebih polar dibandingkan dengan fase diam yaitu kolom C-18 (n-oktadesil

silan) dimana analit yang lebih non polar akan tertahan lebih lama pada fasa diam,

TBHQ bersifat semi polar sehingga akan keluar dari kolom lebih lama daripada

analit lain yang lebih polar. Kolom C-18 lebih umum digunakan karena mampu

memisahkan senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi.

Detektor yang digunakan adalah detektor UV dengan panjang gelombang

280 nm karena TBHQ memiliki cincin aromatik dan gugus ausokrom golongan

anion yaitu –OH. Fase gerak yang digunakan adalah metanol : asetonitril : asam

asetat 1% (70:10:20) dengan laju alir 1ml/menit, waktu pemisahan 6 menit dan

waktu retensi 3,1 menit.

Elusi yang dilakukan adalah dengan cara isokratik yaitu komposisi fase

gerak tetap selama elusi. Metanol dan asetonitril digunakan sebagai fase gerak

karena dapat mengelusi TBHQ dan merupakan pelarut cenderung polar yang

umum digunakan dalam kromatografi fasa balik. Menurut Munson (1991:46),

metanol dan asetonitril mempunyai kepolaran yang serupa, namun asetonitril

27

merupakan pelarut aprotis yang menjadi penting karena peran ikatan hidrogen

bermakna dalam pemisahan. Asam asetat yang digunakan bertujuan untuk

memberikan suasana asam pada sistem sehingga dapat menahan ionisasi analit

dimana jika analit terionisasi maka akan menjadi lebih polar sehingga analit yang

bersifat polar akan terpisahkan terbawa oleh fasa gerak. Menurut Munson

(1991:53) asam asetat glacial ini digunakan sebagai pemodifikasi kolom silika

untuk mengurangi ekor puncak senyawa asam.

Sebelum melakukan analisis TBHQ pada sampel maka terlebih dahulu

melakukan kinerja analitik dimana kinerja analitik ini merupakan suatu proses

evaluasi untuk menjamin kesesuaian persyaratan metode analisis yang digunakan.

Kinerja analitik yang dilakukan pada penelitian ini antara lain linearitas, akurasi

dan presisi

5.3 Linearitas

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon

yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik,

proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Sebagai parameter adanya

hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a +

bX (Harmita,2004:128).

Tabel V.1 Data Kurva Kalibrasi dan Linearitas

No Konsentrasi (ppm) Luas Area

1 20 5430536

2 40 8018996

3 60 11029884

4 80 14259634

5 120 20434234

28

Gambar V.1 Kurva Kalibrasi dan Linearitas

Nilai koefisien korelasi (R) merupakan indikator kualitas dari parameter

linearitas yang menggambarkan proporsionalitas respon analitik (luas area)

terhadap konsentrasi yang diukur. Data hasil kurva kalibrasi dan linearitas dapat

dilihat pada tabel V.1. Dari hasil pengukuran diperoleh kurva kalibrasi

dengan koefisien korelasi R= 0,9994. Nilai koefisien

yang diperoleh menunjukkan hasil yang baik karena mendekati nilai 1, hal ini

menginformasikan bahwa terdapat hubungan yang proporsional antara respon

analitik dengan konsentrasi yang diukur yang berarti metode KCKT yang

digunakan untuk penetapan kadar adalah sesuai. Dari persamaan regresi linear

yang dihasilkan, maka dapat dihitung simpangan baku residual, standar deviasi,

dan koefisien variansinya untuk melihat derajat linearitas. Dari persamaan linear

juga diperoleh nilai LOD (4,482 ppm) dan LOQ (14,939 ppm) perhitungan dapat

dilihat di Lampiran 2.

y = 151512,2x + 2137876 R = 0,9994

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

0 20 40 60 80 100 120 140

luas

are

a

konsentrasi (ppm)

29

5.4 Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan hasil pengukuran dengan nilai yang

sebenarnya. Akurasi dapat dinyatakan dengan nilai perolehan kembali, yang

didapatkan dengan cara membandingkan hasil pengukuran dengan hasil yang

sebenarnya yang sudah diketahui. Nilai perolehan kembali yang baik adalah

antara 95-105 % dengan matrik sampel > 0,1 % (Harmita,2004:119).

Dalam penelitian ini dilakukan dua metode akurasi, akurasi dengan

penambahan baku yang ditambahkan sebelum dilakukannya ekstraksi dan

penambahan baku yang ditambahkan pada hasil ekstraksi.

Tabel V.2. Nilai akurasi dimana baku pembanding ditambahkan setelah preparasi sampel

Ekstraksi sampel Konsentrasi

sebenarnya (ppm)

Luas area Konsentrasi yang

terukur (ppm)

% Nilai

perolehan

kembali

1 40 8721048,5 43,45 108,63

2 40 8045587,5 38,99 97,48

3 40 7418187 34,85 87,125

4 40 6428126 28,32 70,8

5 40 7711533,5 36,79 91,98

6 40 7112408 32,83 82, 075

Metode akurasi yang digunakan adalah baku tinambah dimana sampel

ditambahkan dengan larutan standar yang telah ditentukan konsentrasinya.

Konsentrasi yang digunakan dalam akurasi ini adalah satu konsentrasi yaitu 40

ppm dan dilakukan 6 kali ekstraksi sampel. Dari tabel hasil akurasi diatas

diperoleh nilai perolehan kembali berada pada rentang 82,075-108,63 % dengan

konsentrasi analit pada matrik sampel adalah 0,2 %. Nilai perolehan kembali hasil

pengujian menunjukkan kecendrungan terjadinya kesalahan acak, dimana nilai

perolehan kembali yang dihasilkan dari setiap ektraksi berbeda meskipun dengan

konsentrasi baku dan prosedur ekstraksi yang sama. Penyimpangan pengukuran

30

juga bisa disebabkan oleh pengukuran yang tidak dilakukan dalam satu waktu

dengan preparasi sampel sehingga kemungkinan terjadi perubahan kimiawi dari

analit yang telah dipreparasi dan komposisi fasa gerak yang tidak sesuai dengan

metode acuan yaitu kesalahan pengukuran volume pada pencampuran metanol

dan asetonitril.

Tabel V.2.2. Nilai akurasi penambahan sebelum ektraksi

Konsentrasi (ppm) Rata-rata Luas

area

% nilai perolehan

kembali

Rentang

40 1598162,3 8,905

5,02-8,905 % 80 2065425,7 0,598

120 305116 5,02

Dalam ekstraksi penambahan baku yang diberikan sebelum ekstraksi

diperoleh rentang %recovery 5,02-8,905 %. Kecilnya nilai perolehan kembali ini

dapat dikarenakan proses ekstraksi yang tidak sempurna yaitu sebagian TBHQ

masih

terlarut dalam n-heksana. Dilihat dari kromatogram hasil akurasi diatas

yaitu pada Lampiran 7, ada senyawa lain yang ikut terbawa pada pengukuran.

Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa kemungkinan metode preparasi yaitu

ekstraksi cair-cair belum optimal sehingga perlu dilakukan optimasi metode

preparasi.

5.5 Presisi

Presisi atau keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat

kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual

31

dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel yang diambil

dari campuran yang homogen (Harmita, 2004:121).

Tabel V.3 Nilai presisi

Pengukuran Luas Area

1 8721048,5

2 8045587,5

3 7418187

4 6428126

5 7711533,5

6 7112408

Rata-rata 7572815,08

SD 5,20

RSD (%) 14,5 %

Uji presisi ini dilakukan untuk melihat kedekatan antara hasil uji yang

dilakukan secara berulang pada sampel. Pengujian dilakukan dengan metode

pengulangan terhadap konsentrasi yang sudah diketahui, sehingga diperoleh

ketepatan sistem dalam memberikan respon terhadap analit yang dideteksi.

Konsentrasi yang digunakan dalam presisi atau keseksamaan ini adalah 40 ppm

yang dilakukan dalam 6 kali pengukuran. Tujuan penentuan keseksamaan ini

adalah untuk melihat kinerja alat dan metode analisis yang digunakan. Presisi

metode dinyatakan dengan simpangan baku relatif atau koefisien variansi. Kriteria

penerimaan presisi ini jika RSD 2,0% dan dari data presisi diatas diperoleh

RSD 14,5% yang menunjukkan bahwa metode yang digunakan tidak memenuhi

persyaratan. Kesalahan hasil pengukuran presisi ini dapat disebabkan karena

kesalahan acak atau random error. Menurut Miller pada tahun 2000 menyebutkan

bahwa golongan kesalahan ini merupakan bentuk kesalahan yang menyebabkan

32

hasil dari suatu perulangan menjadi relatif berbeda satu sama lain, dimana hasil

secara individual berada di sekitar harga rata-rata. Kesalahan ini memberi efek

pada tingkat akurasi dan kemampuan dapat terulang (reprodusibilitas) dan

kesalahan ini bersifat wajar dan tidak dapat dihindari.

5.6 Analisis TBHQ pada sampel margarin

Sampel margarin yang digunakan untuk analisis TBHQ dalam penelitian

ini adalah 5 sampel margarin curah yang dijual di pasar Balubur Bandung dan

sampel ini diambil dalam 2 waktu yang berbeda yaitu dengan selang waktu 2

minggu.

Tabel V.4 Penetapan kadar TBHQ dalam sampel

Nama Sampel Luas Area Keterangan

Sampel 1.1 3485836 Tidak terkuantifikasi

Sampel 2.1 969376 Tidak terdeteksi









Setelah dilakukan perhitungan nilai sampel 1.1 berada dibawah LOQ dan

diatas LOD sehingga disimpulkan sampel 1.1 hanya terdeteksi dan tidak

terkuantifikasi. Sampel 2.1 sampai 5.2 memberikan nilai dibawah LOQ dan LOD

sehingga disimpulkan sampel 2.1 sampai 5.2 tidak terdeteksi mengandung TBHQ.

33

Namun dilihat dari waktu retensi dan munculnya puncak sampel 2.1; 3.1; 5.1; 1,2;

3,2; 4,2 memberikan waktu retensi berkisar 3,097-3,100 menit yang sesuai dengan

waktu retensi baku TBHQ 3,100 menit. Kecilnya luas area yang dihasilkan bisa

disebabkan karena jumlah sampel yang digunakan kurang sehingga luas area yang

dihasilkan pada saat pembacaan alat kecil. Dari hasil penetapan kadar TBHQ

dalam sampel dapat disimpulkan tidak ada sampel yang terkuantifikasi dan hanya

satu sampel yang terdeteksi.

34

BAB VI

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Dari hasil pengujian analisis lima jenis sampel margarin curah yang

diambil dalam dua waktu yang berbeda dari pasar Balubur Bandung, hanya satu

sampel yang terdeteksi tetapi tidak terkuantifikasi yaitu sampel 1 yang diambil

pada pengambilan pertama dan sampel lainnya tidak terdeteksi. Hasil pengujian

kinerja analitik menghasilkan nilai akurasi 82,075-108,63 % dan presisi 14,5%.

Maka tidak dapat disimpulkan bahwa antioksidan sintetik TBHQ dalam sampel

berada pada batas aman.

6.2 Saran

Dari hasil penelitian ini diketahui bahwa nilai akurasi atau perolehan

kembali kurang dari 95% dan nilai presisi > 2% sehingga perlu dilakukan

pengembangan metode preparasi sampel untuk mendapatkan hasil analisis yang

lebih baik. Proses preparasi yang dilakukan hanya sebatas mendeteksi keberedaan

TBHQ, disarankan agar mengembangkan prosedur ektraksi yang sudah ada dan

disarankan agar dilakukan penelitian terhadap sampel lain yang kemungkinan

terkandung antioksidan TBHQ.

35

DAFTAR PUSTAKA

Arisman (2009). Keracunan Makanan: Buku Ajar Ilmu Gizi, penerbit EGC,

Jakarta

Badan Standar Nasional (1995). Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia

Nomor: 722/Menkes/Per/IX/88 Tentang Bahan Tambahan Makanan,

Menteri Kesehatan Republik Indonesia: Jakarta.

Brisco, G. (2001). Revisied: Codex Standard For Buillons And Consommes,

Codex Stan 117-1981, International Food Standards: Australia

Cahyadi, W. (2006). Analisis dan Aspek kesehatan: Bahan Tambahan Pangan,

Bumi Aksara, Jakarta

Chaerianisa, Marina. (2012). Penetapan Kadar Antioksidan Sintetik Tersier Butil

hidrokuinon (TBHQ) dalam Sampel Minyak Goreng Menggunakan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dengan Detektor Sinar UV. Universitas

Islam Bandung. [SKRIPSI]

Decker, et. al,. (2010). Oxidation In Foods and Beverages and Antioxidant

Applications Volume 1: Understanding Mechanisms Of Antioxidant

Activity. Woodhead publishing Seriesin Food Science, Technology and

Nutrion : Number 199. UK.

Effendy. (2004). Makalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang

Farmasi. Universitas Sumatera Utara: Sumatera utara

Ersan. (2009). Makalah Kimia Umum, Margarin. Fakultas Matematikan dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Indonesia : Bandung

Departemen Kesehatan Republik Indonesia (1995). Farmakope Indonesia: edisi

IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia: Jakarta.

Gandjar,G.I dan Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar.

Yogyakarta.

Gharavi,N., Haggarty, S., El-Kadi, A.O., Chemoprotective and Carcinogenic

Effect of tert-Butylhydroquinone and Its Metabolite, Current Drug Metab.

2007, 8:1-7. Canada.

Harbone, J.B. (1987). Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, Terbitan kedua, Penerbit ITB, Bandung.

Harminta (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara

Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol 1, No.3. Departemen

Farmasi F-MIPA UI. Jakarta.

Ketaren (1986). Margarin. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Miller, J.N and Miller, J.C., (2000), Statistics and Chemometrics for Analytical

Chemistry, 4th ed, Prentice Hall, Harlow.

Munson, James W. (1991). Analisis Farmasi: Metode Modern, Ilmu Farmasi dan

obat volume 11. Parwa B : Airlangga University Press, Surabaya.

Smith, J. (1991). Food Additive User’s Handbook, Blackie and son Ltd., London.

Watson, G. David (2009). Analisis Farmasi: Buku Ajar untuk Mahasiswa

Farmasi dan Praktisi Kimia Farmasi, edisi 2. Penerbit Buku Kedokteran

EGC: Jakarta.

36

Winarno, F.G. (2004). Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia Pustaka Utama,

Jakarta.

World Health Organization (1999). WHO Food Additives Series.

LAMPIRAN

37

Lampiran 1

Certificate Of Analysis TERT-BUTYLHYDROQUINONE

Lampiran 2

38

Lampiran 2

PERHITUNGAN LINEARITAS

Tabel 1. Tabel derajat ke linearan

konsentrasi AUC Ŷ y-ŷ (y-ŷ)2

20 5430536 5168120 262416 6,886 1010

40 8018996 8198364 -179368 3,217 1010

60 11029884 11228608 -198724 3,949 1010

80 14259634 14258852 782 611524

120 20434234 20319340 114894 1,320 1010

Rata-rata 11834656,8 Rata-rata 3,074 1010

Keterangan: ŷ = bx + a = 64

Simpangan baku residual (Sy/x)

Sy/x =

Standar deviasi (Sx0)

Sx0 = =

Koevisien variansi (Vxo)

Vx0 =

LOD = ppm

LOQ = ppm

39

Lampiran 3

PERHITUNGAN AKURASI

Tabel 1. Hasil pengukuran akurasi

Ekstraksi sampel AUC Rata-rata AUC x % recovery

1 10481990

8721048,5 43,45 108,63 6960107

2 7942571

8045587,5 38,99 97,48 8148604

3 7506846

7418187 34,85 87,125 7329528

4 6471057

6428126 28,32 70,8 6385195

5 7764476

7711533,5 36,79 91,98 7658591

6 7084265

7112408 32,83 82,075 7140551

x = %rec =

dimana:

Sh = kadar analit baku (standar) yang ditambahkan kedalam sampel

y = rata-rata AUC

S = kadar analit teoritir (yang sebenarnya ditambahkan) (ppm)

40

Lampiran 4

PERHITUNGAN PRESISI

Tabel 1. Data perhitungan presisi

Ekstraksi sampel AUC Rata-rata AUC X x- (x- )2

1 10481990

8721048,5 43,45 7,58 57,46 6960107

2 7942571

8045587,5 38,99 3,12 9,73 8148604

3 7506846

7418187 34,85 -1,02 1,04 7329528

4 6471057

6428126 28,32 -7,55 57 6385195

5 7764476

7711533,5 36,79 0,92 0,85 7658591

6 7084265

7112408 32,83 -3,04 9,24 7140551

Rata-rata 35,87 jumlah 135,32

Simpangan baku (SD)

SD =

Simpangan baku relatif (RSD)

RSD = 100% = 14,5 %

41

Lampiran 5

PERHITUNGAN SAMPEL

Tabel 1. Data pengukuran sampel

Nama Sampel Luas Area Keterangan

Sampel 1.1 3485836 Tidak terkuantifikasi










Persamaan regresi linear : y = 2137876 + 151512,2x

Luas area sampel 1.1 : 3485836

Subtitusi luas area kedalam persamaan linear :

y = 2131876 + 151512,2x

3485836 = 2137876 + 151512,2x

x = 8,897 ppm

42

Lampiran 6

DOKUMENTASI PUNCAK KROMATOGRAM LINEARITAS

Gambar 1. Kromatogram linearitas 20 ppm



43

Lampiran 6

(LANJUTAN)



44

Lampiran 7

DOKUMENTASI PUNCAK KROMATOGRAM AKURASI dan PRESISI

Gambar 1. Kromatogram ekstraksi sampel ke-1 injeksi pertama

Gambar 2. Kromatogram ekstraksi sampel ke-1 injeksi kedua

45

Lampiran 7

(LANJUTAN)



46

Lampiran 7

(LANJUTAN)


Gambar 6 Kromatogram ekstraksi sampel ke-3 injeksi kedua

47

Lampiran 7

(LANJUTAN)


Gambar 8.Kromatogram ekstraksi sampel ke-4 injeksi kedua

48

Lampiran 7

(LANJUTAN)

Gambar 9.Kromatogram ekstraksi sampel ke-5 injeksi pertama


49

Lampiran 7

(LANJUTAN)

Gambar 11.Kromatogram ekstraksi sampel ke-6 injeksi pertama


50

Lampiran 7

(LANJUTAN)

Gambar 1. kromatogram akurasi 40ppm (penambahan baku sebelum preparasi sampel) injeksi

pertama


kedua


ketiga

51

Lampiran 7

(LANJUTAN)


pertama

Gambar 5. . kromatogram akurasi 80ppm (penambahan baku sebelum preparasi sampel) injeksi

kedua


ketiga

52

Lampiran 7

(LANJUTAN)


pertama


kedua


ketiga

53

Lampiran 8

DOKUMENTASI KROMATOGRAM SAMPEL

Gambar 1. Kromatogram waktu pengambilan pertama sampel 1

Gambar 2.Kromatogram waktu pengambilan pertama sampel 2


54

Lampiran 8

(LANJUTAN)

Gambar 4.Kromatogram waktu pengambilan pertama sampel 4


55

Lampiran 8

(LANJUTAN)

Gambar 6. Kromatogram waktu pengambilan kedua sampel 1



56

Lampiran 8

(LANJUTAN)



noviayuliarni 10060309035 skr 2013 analisis kualitatif dan

Documents