modifikasi struktur senyawa etil p...

Page | i

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

MODIFIKASI STRUKTUR SENYAWA ETIL

p-METOKSISINAMAT MELALUI PROSES NITRASI

DENGAN METODE COLD MICROWAVE SERTA UJI

AKTIVITAS SEBAGAI ANTIINFLAMASI

SKRIPSI

NOVA SARI AULIA

1111102000098

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

MEI 2015

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

MODIFIKASI STRUKTUR SENYAWA ETIL

p-METOKSISINAMAT MELALUI PROSES NITRASI

DENGAN METODE COLD MICROWAVE SERTA UJI


SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

NOVA SARI AULIA

1111102000098

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

MEI 2015

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Nova Sari Aulia

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul Skripsi : Modifikasi Struktur Etil p-metoksisinamat Melalui Proses

Nitrasi Dengan Metode Cold Microwave Serta Uji Aktivitas

Sebagai Antiinflamasi

Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu metabolit sekunder

yang terdapat pada kencur (Kampferia galanga Linn) dalam jumlah yang relatif

besar dan memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi. Modifikasi struktur EPMS

melalui proses nitrasi dapat mengganti gugus ester menjadi gugus nitro sehingga

aktivitasnya berubah. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui hubungan

struktur aktivitas senyawa nitro turunan EPMS terhadap antiinflamasi. EPMS

dimodifikasi terlebih dahulu menjadi asam p-metoksisinamat (APMS) melalui

proses hidrolisis, dan hasil yang diperoleh kemudian direaksikan dengan

menggunakan asam nitrat 65% dingin dengan bantuan microwave. Hasil nitrasi

APMS akan menghasilkan senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena. Pengujian aktivitas

antiinflamasi dilakukan secara in vitro dengan metode Bovine Serum Albumin

(BSA) dan didapatkan hasil bahwa aktivitas senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena

lebih rendah dibandingkan dengan EPMS. Hasil ini menunjukkan bahwa

keberadaan gugus nitro pada EPMS dapat menurunkan aktivitas antiinflamasi.

Kata kunci : etil p-metoksisinamat, nitrasi, hidrolisis, antiinflamasi, Bovine

Serum Albumin

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

vii

ABSTRACT

Name : Nova Sari Aulia

Programme Study : Bachelor of Pharmacy

Title : Structure Modification of Ethyl p-methoxycinnamate

Compound Through Nitration Process Using Cold

Microwave Method and Determination of Anti-

inflammatory Activity

Ethyl p-methoxycinnamic (EPMC) is one of secondary metabolite which

is found in kencur (Kampferia galanga Linn) in comparatively large quantity

and has anti-inflammatory activity. The EPMC structural modification through

nitration process can replaced the ester group into the nitro, and the activity has

changed. The aims of this study were to determine the structure activity

relationship of EPMC nitro derivative to the anti-inflammatory activity. EPMC

was modified into p-methoxycinnamate acid (PMCA) through hydrolysis

process, and the result was proceed by 65% cold nitric acid using microwave.

The result showed that the nitration of PMCA using 65% cold nitric acid

produced 4-methoxy- β-nitrostyrene. The anti-inflammatory activity performed

in in vitro using Bovine Serum Albumin (BSA) method and showed that 4-

methoxy- β-nitrostyrene has a lower activity than EPMC. This shows that the

nitro group on EPMC can decrease the anti-inflammatory activity.

Keyword : ethyl p-methoxycinnamic, nitration, hydrolysis, anti-inflammatory,

Bovine Serum Albumin.


viii

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas pertolongan,

rahmat, dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “Modifikasi Struktur Etil p-metoksisinamat Melalui Proses Nitrasi

dengan Metode Cold Microwave Serta Uji Aktivitas Sebagai Antiinflamasi”.

Shalawat dan salam senantiasa terlimpah kepada junjungan kita Nabi

Muhammad SAW, teladan bagi umat manusia dalam menjalani kehidupan.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian

akhir guna mendapatkan gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta. Dalam menyelesaikan masa perkuliahan hingga penulisan

skripsi ini penulis tentu menemukan berbagai kesulitan dan halangan yang

menyertai. Oleh karena itu, penulis tidak terlepas dari bantuan, doa, dan

bimbingan dari banyak pihak. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan

ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Bapak Dr. Arief Sumantri, SKM, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Univeristas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta.

2. Ibu Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt sebagai Pembimbing I serta sebagai

pembimbing akademik dan Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt. sebagai

Pembimbing II yang telah memberikan ilmu, nasehat, waktu, tenaga, dan

pikiran selama masa perkuliahan hingga penelitian dan penulisan skripsi.

3. Bapak Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak dan Ibu staf pengajar, serta karyawan yang telah memberikan arahan

selama masa perkuliahan.

5. Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Syahrizal dan Ibunda Yuriati Chrisna

yang selalu ikhlas memberikan dukungan material, moral, nasehat-nasehat,

serta lantunan doa yang tiada pernah putus di setiap sujudnya setiap waktu.

6. Kakek Harun Al-Rasyid dan Nenek Achyana yang selalu memberikan

dukungan, nasehat, arahan, dan doa yang tiada pernah putus di sepanjang


ix

hembusan nafasnya.

7. Adik Ferdi Aulia Syahputra yang selalu memberikan semangat setiap hari.

8. Bagus Yudhi Prabowo yang tak pernah henti untuk menemani saat suka dan

duka serta memberikan arahan, nasehat, bantuan, dan semangat setiap

waktu.

9. Sahabat „mirror‟ satu-satunya, Ichsana Eskha Widya yang selalu

memberikan arahan, bantuan, dan semangat setiap waktu.

10. Sahabat pecinta korea yang selalu memberikan dukungan dan semangatnya

setiap bertemu, Sheila dan Meryza. Terima kasih dan tetap semangat.

11. Teman-teman Farmasi 2011 yang telah mengisi hari-hari selama berada di

kampus UIN serta terima kasih atas kebersamaannya dalam melalui hitam

putih kehidupan sebagai pejuang S.Far.

12. Kak Eris, Mba Rani, Kak Rahmadi, Kak Lisna, Kak Tiwi, dan Kak Liken

yang telah sangat banyak membantu penulis saat melakukan penelitian di

laboratorium.

13. Kakak-kakak dan Teman-teman Kingdom EPMS yang suka dan duka selalu

bersama, Kak Ivo, Kak Fikri, Indah, Reza, Ali, Aziz, Sutar, Indri, Mida,

Bahtiar, dan Adit. Terima kasih atas segala dukungan dan bantuannya.

14. Teman-teman lab PHA, Rhesa, Nicky, dan Haidar. Terima kasih atas

bantuannya.

15. Teman seperjuangan S.Far: Pipit, Ika, Ageng, Lela, serta semua pejuang

beng-beng. Terima kasih atas semangat dan kebersamaan kita selama

perkuliahan berlangsung hingga saat ini.

16. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang

tidak dapat disebutkan namanya satu persatu.

Semoga bantuan yang telah diberikan mendapat balasan dari Allah SWT.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan.

Oleh karena itu, saran dan kritik yang bersifat membangun akan penulis

nantikan. Dan semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pengembangan ilmu

pengetahuan.

Ciputat, 26 Mei 2015

Penulis


x

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS

AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : Nova Sari Aulia

NIM : 1111102000098

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya, dengan judul:

MODIFIKASI STRUKTUR ETIL p-METOKSISINAMAT MELALUI

PROSES NITRASI DENGAN METODE COLD MICROWAVE SERTA UJI


Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak

Cipta.

Demikian pernyataan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : 26 Mei 2015

Yang menyatakan,

Nova Sari Aulia


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL........................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS............................................. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.............................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………..…....... v

ABSTRAK……………………………………………………………….……. vi

ABSTRACT……………………………………………………………..…..… vii

KATA PENGANTAR………………………………………………….…… viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI………...…… x

DAFTAR ISI...................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL............................................................................................ xiii

DAFTAR GAMBAR....................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN………………………................................................. xv

DAFTAR ISTILAH…………………………………………..……………... xvi

BAB 1. PENDAHULUAN.................................................................................. 1

1.1 Latar Belakang Masalah............................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah......................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian.......................................................................... 3

1.4 Manfaat Penelitian........................................................................ 3

1.5 Hipotesis…………………….……………………..…………… 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA........................................................................ 4

2.1 Etil p-metoksisinamat................................................................... 4

2.2 Hidrolisis....................................................................................... 5

2.3 Nitrasi............................................................................................ 7

2.3.1 Asam Nitrat....................................................................... 9

2.4 Ekstraksi...................................................................................... 10

2.4.1 Ekstraksi Cair-Cair......................................................... 10

2.5 Metode Isolasi............................................................................. 11

2.6 Iradiasi Microwave..................................................................... 11

2.6.1 Mekanisme Reaksi Secara Polarisasi Dipolar................. 13

2.6.2 Mekanisme Reaksi Secara Konduksi.............................. 14

2.7 Identifikasi.................................................................................. 14

2.7.1 Kromatografi................................................................... 14

2.7.1.1 Kromatografi Kolom........................................... 15

2.7.1.2 Kromatografi Lapis Tipis.................................... 16

2.7.2 Spektrofotometri............................................................. 18

2.7.2.1 Spektrofotometri Massa...................................... 18

2.7.2.2 Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti......... 18

2.7.2.3 Kromatografi Gas-Spektrofotometri Massa

(KG-MS)............................................................. 18

2.7.2.4 Fourier Transform Infrared (FT-IR)……..…… 19

2.7.2.5 Spektrofotometri UV-Visible............................. 19

2.8 Inflamasi..................................................................................... 20

2.8.1 Definisi............................................................................ 20

2.8.2 Mekanisme dari Inflamasi.............................................. 21

2.8.3 Obat-obat Antiinflamasi................................................. 23

2.8.3.1 Obat Antiinflamasi Steroid................................. 23


xii

2.8.3.2 Obat Antiinflamasi Non-Steroid......................... 23

2.8.4 Mekanisme Obat Antiinflamasi...................................... 24

2.8.5 Natrium Diklofenak........................................................ 25

2.8.6 Bovine Serum Albumin (BSA)....................................... 26

2.8.7 Metode Uji Antiinflamasi In vitro.................................. 26

2.8.7.1 Aktivitas Antidenaturasi dengan BSA.............. 26

2.8.7.2 Metode Stabilisasi Membran HRBC................. 27

BAB 3. METODE PENELITIAN.................................................................... 28

3.1 Tempat......................................................................................... 28

3.2 Waktu……………………………………….…………...…… 28

3.3 Alat dan Bahan............................................................................ 28

3.2.1 Alat.................................................................................. 28

3.2.2 Bahan............................................................................... 28

3.4 Prosedur Peneltian………..…………….……..…………..….... 29

3.4.1 Modifikasi Etil p-metoksisinamat................................... 29

3.4.1.1 Proses Hidrolisis................................................. 29

3.4.1.2 Proses Nitrasi...................................................... 29

3.4.2 Pemurnian dengan Kromatografi Kolom........................ 29

3.4.3 Penentuan Struktur Kimia............................................... 30

3.4.4 Pembuatan Reagen untuk Uji Antiinflamasi................... 31

3.5.5 Uji In vitro Antiinflamasi................................................ 32

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................ 34

4.1 Modifikasi Struktur Etil p-metoksisinamat................................. 34

4.1.1 Reaksi Hidrolisis............................................................. 34

4.1.1.1 Optimasi Hidrolisis............................................. 35

4.1.2 Reaksi Nitrasi.................................................................. 36

4.1.2.1 Optimasi Nitrasi.................................................. 36

4.2 Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi....................................... 37

4.2.1 Senyawa Hasil Hidrolisis................................................ 38

4.2.2 Senyawa Hasil Nitrasi..................................................... 40

4.3 Pengujian Aktivitas Antiinflamasi dan Hubungan Struktur

Aktivitas Senyawa Hasil Modifikasi........................................... 45

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN............................................................ 48

5.1 Kesimpulan................................................................................. 48

5.2 Saran............................................................................................ 48

DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 49

LAMPIRAN...................................................................................................... 53


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1 Daftar daerah spektrum IR 4-metoksi-β-nitrostirena.......................... 40

Tabel 4.2 Data pergeseran kimia (δ) spektrum1H-NMR etil p-metoksisinamat,

asam p-metoksisinamat, dan 4-metoksi-β-nitrostirena………..……. 43

Tabel 4.3 Data pergeseran kimia (δ) spektrum13

C-NMR etil p-metoksisinamat

dan 4-metoksi-β-nitrostirena………………………………..……… 44

Tabel 4.4 Hasil uji aktivitas antiinflamasi etil p-metoksisinamat dan senyawa

hasil modifikasi………….……………….………………………… 46


xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Struktur etil p-metoksi sinamat..................................................... 4

Gambar 2.2 Jalur asam sikimat dalam biosintesa fenilpropanoid untuk

menghasilkan Etil p-metoksisinamat…………………………… 5

Gambar 2.3 Prinsip reaksi hidrolisis………………...……………………… 6

Gambar 2.4 Mekanisme hidrolisis ester dalam suasana basa……….…….…. 6

Gambar 2.5 Mekanisme hidrolisis ester dalam suasana asam……….………. 7

Gambar 2.6 Pembuatan senyawa nitro…………………………………....… 7

Gambar 2.7 Reaksi dari senyawa nitro…………………………………...… 8

Gambar 2.8 Skema reaksi nitrasi………………………………………….... 9

Gambar 2.9 Spektrum radiasi elektromagnetik…….………………………. 12

Gambar 2.10 Interaksi dari microwave dengan benda yang berbeda...…..…... 12

Gambar 2.11 Efek dari medan magnet dalam orientasi dipol ………………13

Gambar 2.12 Mekanisme pergerakan molekul dipolar teradiasi microwave…14

Gambar 2.13 Mekanisme konduksi partikel bermuatan teradiasi microwave.. 14

Gambar 2.14 Skema kromatografi lapis tipis…………………………......….. 17

Gambar 2.15 Bagan susuan alat spektrofotometer Uv-Vis............................... 19

Gambar 2.16 Proses inflamasi dan sintesis mediator inflamasi seperti

prostaglandin, prostasiklin, dan leukotrien…….…………….... 22

Gambar 2.17 Skema mekanisme obat antiinflamasi……………….………… 24

Gambar 2.18 Struktur natrium diklofenak…………………………….…….. 25

Gambar 4.1 Mekanisme reaksi hidrolisis etil p-metoksisinamat……..…….. 34

Gambar 4.2 KLT senyawa hasil hidrolisis dengan eluen heksan

etil asetat 4:1………………………………………………….. 35

Gambar 4.3 Reaksi Nitrasi…………………………………………..……… 36

Gambar 4.4 KLT senyawa hasil nitrasi dengan eluen

heksan-etil asetat 3:2………………………………………… 37

Gambar 4.5 KLT senyawa hasil nitrasi dengan eluen

etil asetat-heksan 3:2…………………………………………. 38

Gambar 4.6 Pola fragmentasi GCMS asam p-metoksisinamat….…………. 39

Gambar 4.7 Fragmentasi MS asam p-metoksisinamat…………...………… 39

Gambar 4.8 Pola fragmentasi GCMS 4-metoksi-β-nitrostirena…….……… 41

Gambar 4.9 Fragmentasi MS 4-metoksi-β-nitrostirena………..………….... 42

Gambar 4.10 (a) Struktur Senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena (b) Struktur

Senyawa Etil p-Metoksisinamat (c) Senyawa Asam

p-Metoksisinamat…………………………...…………………. 42

Gambar 4.11 Grafik presentase inhibisi etil p-metoksisinamat dan senyawa

hasil isolasi…………………………...……………………...… 46


xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Alur Penelitian............................................................................ 53

Lampiran 2. Spektrum IR Senyawa Etil p-Metoksisinamat……………..… 54

Lampiran 3. Spektrum GCMS Senyawa Etil p-Metoksisinamat…………... 56

Lampiran 4. Spektrum 1H-NMR Senyawa Etil p-Metoksisinamat………... 58

Lampiran 5. Spektrum GCMS Senyawa Asam p-Metoksisinamat………... 61

Lampiran 6. Hasil Analisa DSC Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena……… 62

Lampiran 7. Spektrum IR Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena…………….. 63

Lampiran 8. Spektrum GCMS Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena……..… 64

Lampiran 9. Spektrum 1H-NMR Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena…...… 66

Lampiran 10. Spektrum 13

C-NMR Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena…...... 70

Lampiran 11. Perhitungan Reaksi………………………………………….... 71

Lampiran 12. Optimasi reaksi Nitrasi……………………………………….. 72

Lampiran 13. Hasil Perhitungan Uji Antiinflamasi…………………………. 76

Lampiran 14. Gambar Bahan Untuk Reaksi Hidrolisis, Reaksi Nitrasi, dan Uji

Antiinflamasi dengan Metode BSA………………………..… 78

Lampiran 15. Gambaran Proses Hidrolisis dan Identifikasi.………………… 81

Lampiran 16. Gambaran Proses Nitrasi dan Identifikasi……………………… 82

Lampiran 17. Gambar Senyawa Hasil Modifikasi…………………………… 83

Lampiran 18. Gambar Proses Uji Antiinflamasi dengan Metode BSA……… 84

Lampiran 19. Gambar Alat Identifikasi Senyawa……………………………. 85


xvi

DAFTAR ISTILAH

4MBN 4-Metoksi-β-Nitrostirena

AINS Anti Inflamasi Non Steroid

APMS Asam p-metoksisinamat

BSA Bovine Serum Albumine

COX Siklooksigenase

EPMS Etil p-metoksisinamat

FT-IR Fourier Transform Infra Red

g Gram

GC-MS Gas Cromatography-Mass Spectrometry

HRBC Human Red Blood Cell

KLT Kromatografi Lapis Tipis

mg Mili gram

MS Mass Spectrometry

NMR Nuclear Magnetic Resonance

UV-Vis Ultra Violet-Visible


1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Kencur (Kaempferia galanga L.) merupakan salah satu dari lima jenis

tumbuhan (jahe, temulawak, sambiloto, pegagan, dan kencur) yang dikembangkan

sebagai tanaman obat asli Indonesia. Kencur merupakan tanaman obat yang

bernilai ekonomis cukup tinggi sehingga banyak dibudidayakan. Bagian

rimpangnya digunakan sebagai bahan baku industri obat tradisional, bumbu

dapur, bahan makanan, maupun minuman penyegar lainnya (Rostiana et al, 2003;

Hasanah, 2011). Kencur dikenal oleh masyarakat dan telah digunakan secara

empiris dalam mengobati berbagai penyakit seperti radang lambung, radang anak

telinga, influenza, batuk, masuk angin, sakit kepala, memperlancar haid, mata

pegal, keseleo, diare, pengusir lelah serta penghilang darah kotor (Al-Fattah,

2011).

Berdasarkan penelitian Umar et al. (2012) diketahui bahwa subfraksi

kloroform dari kencur secara keseluruhan mengandung etil p-metoksisinamat

(80,05%), β-sitosterol (9,88%), asam propionat (4,71%), pentadekan (2,08%),

asam tridekanoat (1,81%), dan 1,21-docosadien (1,47%). Etil p-metoksisinamat

adalah salah satu metabolit sekunder yang terdapat pada kencur (Kaempferia

galanga Linn) dalam jumlah yang relatif besar. Isolasi dan pemurnian etil p-

metoksisinamat dapat dilakukan dengan mudah, selain itu etil para metoksi

sinamat mempunyai gugus fungsi yang reaktif sehingga sangat mudah

ditransformasikan menjadi gugus fungsi yang lain (Barus, 2009). Etil p-

metoksisinamat diketahui memiliki efektivitas penghambatan enzim

siklooksigenase baik COX-1 dan COX-2 secara tidak selektif. Namun,

penghambatan yang dilakukan oleh EPMS pada COX-2 sebesar 57,82%

sedangkan penghambatan terhadap COX-1 lebih rendah yaitu sebesar 42,9%

(Umar et al, 2012).

Modifikasi struktur dari etil p-metoksisinamat telah banyak dilakukan.

Modifikasi yang telah dilakukan tidak hanya sebatas menggunakan bahan kimia

saja melainkan juga ada yang menggunakan organisme hidup seperti Aspergillus


2

niger. Modifikasi struktur dari etil p-metoksisinamat yang telah dilakukan antara

lain melalui proses amidasi, hidrolisis, transesterifikasi, degradasi sinamat,

reduksi, amidasi dengan dietanolamin, sintesis menjadi turunan thiourea, sintesis

menjadi p-metoksistiril keton, serta demetilasi (Riyanto, 1986; Barus, 2009;

Bangun, 2011; Ekowati, 2012; Hadi, 2014; Mufidah, 2014; Omar et al, 2014).

Namun dari berbagai modifikasi yang dilakukan hanya hasil proses hidrolisis,

transesterifikasi, reduksi, serta degradasi sinamat yang dilakukan uji aktivitas

antiinflamasi (Hadi, 2014; Mufidah, 2014).

Antiinflamasi yang beredar khususnya non steroid antiinflamasi bekerja

dengan cara menghambat pembentukan prostaglandin. Hal tersebut meningkatkan

resiko perdarahan saluran cerna (Meek et al, 2010). Oleh karena itu, saat ini

banyak pengembangan yang dilakukan untuk mengatasi efek samping tersebut.

Substitusi dari gugus NO pada suatu senyawa antiinflamasi diketahui dapat

mempertahankan aliran darah mukosa lambung dan mencegah melekatnya

leukosit pada endotel vaskular sirkulasi splanknikus. Hal tersebut dapat

menghindari efek merugikan yang diakibatkan oleh penghambatan enzim COX-1

dan juga dapat mencegah terjadinya cedera pada mukosa (Halen et al, 2009).

Pada penelitian ini akan dilakukan modifikasi etil p-metoksisinamat yaitu

dengan mengganti gugus ester yang terdapat pada etil p-metoksisinamat dengan

gugus nitro. Berdasarkan hasil uji pendahuluan (lampiran 12), etil p-

metoksisinamat bila direaksikan dengan HNO3 sangat sedikit menghasilkan

senyawa target. Berbeda dengan asam p-metoksisinamat yang menghasilkan

senyawa target lebih banyak. Oleh karena itu, etil p-metoksisinamat dihidrolisis

terlebih dahulu menjadi asam p-metoksisinamat. Setelah itu, dilakukan proses

nitrasi menggunakan asam nitrat (HNO3) dari asam p-metoksisinamat. Proses

reaksi hidrolisis dan nitrasi dilakukan dengan bantuan microwave.

Penggunaan microwave dalam reaksi nitrasi ini bertujuan untuk

mempersingkat waktu yang diperlukan untuk proses reaksi. Namun, selain untuk

mempersingkat waktu, terdapat berbagai keunggulan bila sintesis dilakukan

dengan menggunakan microwave yaitu seperti efisiensi energi, rendemen yang

tinggi, serta mengurangi pemanasan yang berlebihan pada permukaan bahan

seperti yang terjadi pada proses reaksi konvensional. (Bogdal, 2005).


3

Pada penelitian ini dilakukan uji antiinflamasi invitro menggunakan metode

BSA yaitu dengan melihat efek denaturasi pada Bovine Serum Albumin. Pengujian

dengan metode BSA ini dipilih karena mudah, menggunakan sedikit sampel,

waktu analisa yang cepat dan merupakan uji pendahuluan yang dilakukan untuk

skrining awal antiinflamasi (Mufidah, 2014).

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian diatas, maka permasalahan dalam penelitian ini dapat

dirumuskan sebagai berikut:

a. Apakah senyawa etil p-metoksisinamat dapat dimodifikasi melalui

proses nitrasi dengan menggunakan asam nitrat (HNO3)?

b. Bagaimana aktivitas antiinflamasi dari hasil nitrasi etil p-

metoksisinamat bila dibandingkan dengan etil p-metoksisinamat?

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah :

a. Memodifikasi senyawa etil p-metoksisinamat melalui proses nitrasi.

b. Menguji aktivitas antiinflamasi dari senyawa hasil nitrasi etil p-

metoksisinamat.

c. Mengetahui peran ester dalam aktivitasnya sebagai antiinflamasi.

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai hubungan

struktur aktivitas dari etil p-metoksisinamat dan hasil modifikasinya. Diharapkan

senyawa yang dihasilkan dapat memberikan manfaat sehingga dapat digunakan

untuk penelitian lebih lanjut. Misalnya seperti uji in vitro dan in vivo lainnya

seperti uji antimikroba, antioksidan, in vivo antiinflamasi, dan lain-lain.

1.5 Hipotesis

Penggantian gugus ester pada senyawa etil p-metoksisinamat menjadi

gugus nitro akan mempengaruhi aktivitasnya sebagai agen antiinflamasi.


4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Etil p-metoksisinamat

Etil p-metoksisinamat (EPMS) adalah salah satu senyawa hasil isolasi

rimpang kencur. Etil p-metoksisinamat merupakan salah satu metabolit sekunder

yang terdapat pada kencur (Kampferia galanga Linn) dalam jumlah yang relatif

besar. Isolasi dan pemurnian etil p-metoksisinamat dapat dilakukan dengan

mudah, selain itu etil p-metoksisinamat mempunyai gugus fungsi yang reaktif

sehingga sangat mudah ditransformasikan menjadi gugus fungsi yang lain (Barus,

2009).

Gambar 2.1 Struktur etil p-metoksi sinamat (Barus, 2009).

Etil p-Metoksisinamat termasuk kedalam senyawa ester yang mengandung

cincin benzene dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil

yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat

menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil

asetat, metanol, air dan heksan (Barus, 2009).

Etil p-Metoksisinamat dapat diisolasi dari rimpang kencur (Kaempferia

galanga, L) secara perkolasi menggunakan pelarut etanol. Pemurnian etil p-

metoksisinamat dari hasil ekstraksi dapat dilakukan melalui rekristalisasi

mengunakan pelarut etanol (Bangun, 2011).

Asam sinamat memiliki berbagai aktivitas biologis, antara lain antibakteri,

anestetik, antiinflamasi, antispasmodik, antimutagenik, fungisida, herbisida serta

penghambat enzim tirosinase. Salah satu turunan asam sinamat yang terdapat di

alam ialah etil p-metoksisinamat yang terdapat dalam rimpang kencur

(Kaempferia galanga) (Hartanti dan Setiawan, 2009).


5

Gambar 2.2 Jalur asam sikimat dalam biosintesa fenilpropanoid untuk menghasilkan etil p-

metoksisinamat (Bangun, 2011).

2.2 Hidrolisis

Hidrolisis merupakan suatu proses transformasi kimia dimana molekul

organik berupa RX akan bereaksi dengan air menghasilkan sebuah struktur

dengan ikatan kovalen OH (Gambar 2.3). Hidrolisis disebut juga sebagai reaksi

perpindahan nukleofilik di mana nukleofil menyerang atom yang elektrofilik.

Mekanisme Reaksi yang paling sering ditemui subtitusi nukleofilik baik secara

langsung maupun tidak langsung dan eliminasi-adisi nukleofilik (Larson and

Weber, 1994).


6

Gambar 2.3 Prinsip reaksi hidrolisis (Larson and Weber, 1994).

Ester dapat dihidrolisis dengan baik dalam suasana basa melalui reaksi yang

biasa dikenal dengan nama saponifikasi. Selain itu dalam suasana asam, ester juga

dapat dihidrolisis menjadi asam karboksilat dan alkohol kembali.

Mekanisme hidrolisis ester dalam suasana basa disebut saponifikasi

(Gambar 2.4). Hal tersebut terjadi akibat adanya adisi nukleofilik OH- ke karbonil

ester, menjadi intermediet alkoksida tetrahedral (1). Kemudian adanya proses

tersebut menyebabkan keluarnya ion alkoksi menghasilkan asam karboksilat (2).

Ion alkoksida menarik proton dari asam karboksilat menjadi ion karboksilat (3).

Setelah itu terjadi protonasi ion karboksilat oleh asam mineral menghasilkan asam

karboksilat (4) (Riswiyanto, 2009).

Gambar 2.4. Mekanisme hidrolisis ester dalam suasana basa

(Riswiyanto, 2009).

Mekanisme hidrolisis ester dalam suasana asam juga dapat dilakukan

namun tidak hanya menghasilkan asam karboksilat saja melainkan menghasilkan

asam karboksilat dan alkohol (Gambar 2.5). Pada suasana asam, protonasi gugus

karbonil terjadi untuk mengaktifkan (1). Kemudian terjadi serangan nukleofilik

oleh air menjadi intermediet tetrahedral (2). Hal tersebut menyebabkan terjadinya

transfer proton yang kemudian mengubah OR‟ menjadi gugus pergi yang baik (3).

Kemudian terjadi pelepasan alkohol menghasilkan asam karboksilat dan katalis

asam (4) (Riswiyanto, 2009).

(1) (2) (3) (4)


7

Gambar 2.5. Mekanisme hidrolisis ester dalam suasana asam

(Riswiyanto, 2009).

2.3 Nitrasi

Nitrasi merupakan reaksi organik yang mekanisme reaksinya adalah

memasukkan gugus nitro kedalam suatu senyawa baik untuk senyawa alifatik

maupun senyawa aromatik. Nitrasi dapat dilakukan dengan berbagai metode

seperti heterolitik (elektrofilik dan nukleofilik) dan nitrasi radikal. Nitrasi

aromatik biasanya merupakan elektrofilik sedangkan nitrasi alifatik merupakan

radikal bebas. Senyawa nitroaromatik umumnya digunakan sebagai senyawa

intermediet dalam sintesis plastik, insektisida, bahan peledak, dan juga farmasetik.

Berbeda dengan nitroaromatik, nitroalifatik umum digunakan sebagai pelarut dan

hasil sintesis dalam sintesis organik (Olah, 1982). Pembuatan dan reaksi senyawa

nitro dalam sintesis organik banyak dilakukan karena umumnya ketersediaannya

banyak dan mudah ditransformasikan. Pembuatan dan reaksi dari senyawa nitro

dapat dilihat pada gambar dibawah ini (Gambar 2.6 dan Gambar 2.7) (Ono, 2001).

Gambar 2.6. Pembuatan senyawa nitro (Ono, 2001).

(1) (2) (3)

(4)


8

Gambar 2.7. Reaksi dari senyawa nitro (Ono, 2001).

Nitrasi dapat dilakukan dengan metode dingin yang umumnya dikenal

dengan sebutan „Cold Microwave Chemistry’. Pada metode ini reagen yang

digunakan dilakukan pendinginan dibawah 0oC. (dapat mencapai -30

oC).

Campuran dari reagen dan senyawa yang akan di nitrasi diberikan iradiasi

microwave (400-800 W) dengan waktu kira-kira 2 menit dalam sebuah microwave

oven domestik. Kemudian setelah proses iradiasi selesai campuran dikeluarkan

dari microwave oven dan diperbolehkan berada disuhu ruang (Bose et al, 2006).

Reaksi kimia, termasuk nitrasi, dibawah iradiasi microwave dapat dilakukan

berbagai modifikasi terhadap rentang temperatur yang digunakan dalam

percobaan. Reaksi akan menghasilkan produk yang berbeda bila suhu campuran

sebelum di iradiasi berbeda. Campuran yang sebelum reaksi memiliki suhu ruang

dengan campuran yang sebelum di iradiasi memiliki sushu dibawah 0oC akan

menghasilkan produk hasil reaksi yang berbeda (Bose et al, 2006).

Ketika campuran dari asam 4-hidroksisinamat (2) dilarutkan dalam asam

nitrat (10%) kemudian diberikan iradiasi microwave selama beberapa menit, akan

menghasilkan senyawa dinitro (1) dan mononitro (3,4). Rendemen dari senyawa

dinitro dan mononitro bergantung pada temperatur yang digunakan pada saat

preparasi awal sebelum dilakukannya iradiasi microwave (Bose et al, 2006).


9

Gambar 2.8. Skema reaksi nitrasi (Bose et al, 2006).

2.3.1 Asam Nitrat

Sifat fisika dan kimia dari asam nitrat adalah sebagai berikut (Yulianto, 2010):

Sifat fisika dari asam nitrat:

Rumus Kimia : HNO3

Berat Molekul (g/mol) : 63,012

Densitas pada 20oC (g/mL) : 1,502

Bentuk pada 30oC, 1 atm : Cair

Titik Leleh (oC) : -41,59

Titik Didih (oC, 1 atm) : 83,4

Kelarutan (dalam 100 bagian)

- Air dingin : Tak terhingga

- Air panas : Tak terhingga

Viskositas pada 25oC (Cp) : 0,761

Panas Peleburan (Hfus), (Kj/mol) : 10,48

Panas Pembentukan (Hf), 25oC, (Kj/mol) : -174,10

Panas Penguapan pada 25oC, (Kj/mol) : 39,04

Energi Bebas Pembentukan, 25oC, (Kj/mol) : -80,71

Entropi, 25oC, (J/mol.K) : 155,60

Asam nitrat dapat meledak dalam pelarut etanol.

Sifat kimia dari asam nitrat:

Asam nitrat merupakan senyawa yang berperan dalam proses nitrasi

sebagai nitrating agent. Asam nitrat juga merupakan suatu mono basa yang


10

dapat dengan mudah bereaksi kuat dengan alkali, oksida dan senyawa basa

lainnya dalam bentuk garam.

2.4 Ekstraksi

Secara umum teknik ekstraksi menggunakan pelarut organik dapat

dibedakan menjadi tiga, yaitu maserasi, digesti, dan perkolasi. Maserasi

merupakan proses ekstraksi dengan penghancuran sampel menggunakan pelarut,

perendaman beberapa hari dan dilakukan pengadukan, kemudian dilakukan

penyaringan atau pengepresan sehingga diperoleh cairan. Digesti adalah ekstraksi

yang dilakukan dengan bantuan pemanasan sekitar 60°C dan lamanya ekstraksi

dapat berlangsung selama 24 jam. Perkolasi merupakan teknik ekstraksi

komponen terlarut dari suatu sampel menggunakan aliran pelarut dengan

pemanasan atau tanpa pemanasan (Nuraini, 2007).

Ekstraksi dengan pelarut didasarkan pada sifat kepolaran zat dalam pelarut

saat ekstraksi. Senyawa polar hanya akan larut pada pelarut polar, seperti etanol,

metanol, butanol dan air. Senyawa non-polar juga hanya akan larut pada pelarut

non-polar, seperti eter, kloroform dan n-heksana (Gritter, 1991). Jenis dan mutu

pelarut yang digunakan menentukan keberhasilan proses ekstraksi. Pelarut yang

digunakan harus dapat melarutkan zat yang diinginkannya, mempunyai titik didih

yang rendah, murah, tidak toksik dan mudah terbakar (Harborne, 1987).

2.4.1 Ekstraksi Cair-Cair

Ekstraksi cair-cair adalah proses pemisahan suatu komponen dari fasa cair

ke fasa cair lainnya. Operasi ekstraksi cair-cair terdiri dari beberapa tahap, yaitu

(Laddha & Dagaleesan, 1976; Martunus & Helwani, 2007):

1. Kontak antara pelarut (solvent) dengan fasa cair yang mengandung zat

terlarut, kemudian zat terlarut (diluent) akan berpindah dari fasa diluent ke

fasa solvent.

2. Pemisahan fasa yang tidak saling larut yaitu fasa yang banyak mengandung

pelarut asal disebut fasa rafinat.

Aplikasi ekstraksi cair-cair saat ini digunakan untuk penelitian-penelitian

yang ditujukan untuk mengambil senyawa kimia baru atau menemukan pelarut


11

baru yang memberikan hasil ekstraksi yang lebih baik (Martunus & Helwani,

2007). Untuk mencapai proses ekstraksi cair-cair yang baik, pelarut yang

digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut (Martunus & Helwani, 2007):

1. Kemampuan tinggi melarutkan komponen zat terlarut di dalam campuran.

2. Kemampuan tinggi untuk diambil kembali.

3. Perbedaan berat jenis antara ekstrak dan rafinat lebih besar.

4. Pelarut dan larutan yang akan diekstraksi harus tidak mudah bercampur.

5. Tidak mudah bereaksi dengan zat yang akan diekstraksi.

6. Tidak merusak alat secara korosi.

7. Tidak mudah terbakar, tidak beracun, dan harganya relatif murah.

2.5 Metode Isolasi

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan

menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik

tersebut. Keempat teknik kromatografi tersebut adalah Kromatografi Kertas

(KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (KGC) dan

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Pemisahan dan pemurnian kandungan

tumbuhan dilakukan dengan menggunakan salah satu atau gabungan dari

beberapa teknik tersebut dan dapat digunakan pada skala mikro maupun makro

(Harborne, 1987).

2.6 Iradiasi Microwave

Gelombang mikro adalah radiasi elektromagnetik yang terletak diantara

frekuensi radiasi inframerah dan radio, dengan panjang gelombang mulai dari 1

mm hingga 1 m, frekuensinya mulai dari 300 GHz hingga 300 MHz (Bogdal,

2005; Loupy, 2006). Ketika sebuah bahan logam dipaparkan radiasi microwave,

microwave akan secara luas menyebar pada permukaan. Namun, benda tersebut

tidak dipanaskan dengan menggunakan microwave melainkan karena adanya

respon dari medan magnet dari radiasi microwave yaitu elektron bergerak bebas

pada permukaan bahan, dan aliran elektron tersebut dapat menghasilkan panas

(Bogdal, 2005).


12

Gambar 2.9 Spektrum radiasi elektromagnetik (Loupy, 2006).

Gambar 2.10 Interaksi dari microwave dengan benda yang berbeda: (a) konduktor elektrikal; (b)

isolator; (c) tanpa dielektrik (Loupy, 2006).

Reaksi dengan menggunakan microwave dapat dikategorikan sebagai green

chemistry. Tujuan dari green chemistry adalah untuk mengurangi atau

meminimalkan penggunaan dari pelarut yang mudah menguap dalam sintesis

modern dan mengurangi penggunaan energi. Perkembangan dari metode sintesis

baru bebas pelarut dengan menggunakan bantuan microwave saat ini menjadi

topik penting dalam penelitian, karena reaksi bebas pelarut mengurangi

penggunaan pelarut, prosedur sintesis dan pemisahan yang lebih sederhana,

mencegah pemborosan, dan menghindari resiko bahaya atau toksik terkait dengan

penggunaan pelarut (Loupy, 2006).

Semua peralatan standar (oven domestik atau reaktor lebih spesifik yang

didedikasikan untuk sintesis kimia) beroperasi pada frekuensi dari v = 2,45 GHz

(setara dengan λ = 12,2 cm) untuk mengurangi intervensi dari frekuensi radio dan

radar. Reaksi kimia dengan microwave didasarkan pada interaksi dari molekul


13

dengan gelombang oleh efek “microwave dielectric heating”. Fenomena ini

bergantung pada kemampuan suatu bahan untuk mengabsorbsi radiasi microwave

dan mengubahnya menjadi panas. Komponen elektrik dari medan elektromagnetik

telah menunjukkan bahwa perannya sangat penting. Dalam hal tersebut, maka

reaksi yang terjadi melibatkan dua mekanisme yaitu polarisasi dipolar dan

konduksi ionik. Iradiasi dari senyawa polar pada frekuensi microwave

menghasilkan orientasi dari dipol atau ion pada medan elektrik (Loupy, 2006).

Untuk produk cair (contohnya pelarut), hanya molekul polar yang secara

selektif mengabsorbsi gelombang mikro. Sedangkan molekul nonpolar tidak

bereaksi (inert). Pada konteks dari absorpsi gelombang mikro, telah menunjukkan

bahwa titik didih lebih tinggi ditemukan ketika pelarut diberikan iradiasi

microwave daripada dengan pemasan biasa. Efek ini dikenal dengan

“superheating effect” yang telah ditujukan untuk penghambatan dari nukelasi

dalam pemanasan microwave (Loupy, 2006).

Gambar 2.11 Efek dari medan magnet dalam orientasi dipol: (a) tanpa adanya iradiasi, (b)

diberikan medan listrik terus menerus, dan (c) diberikan medan listrik dengan frekuensi tinggi

(Loupy, 2006).

2.6.1 Mekanisme Reaksi Secara Polarisasi Dipolar dalam Iradiasi Microwave

Prinsip dari mekanisme reaksi polarisasi dipolar adalah adanya interaksi

dipol-dipol antara molekul-molekul polar ketika di radiasi dengan microwave.

Molekul yang berinteraksi dipol tersebut sangat sensitif terhadap suatu medan

magnet yang berasal dari luar sehingga dapat mengakibatkan terjadinya rotasi

pada molekul tersebut sehingga menghasilkan sejumlah energi (Lidstrom et al,

2001; Loupy, 2006).


14

Gambar 2.12 Mekanisme pergerakan molekul dipolar teradiasi microwave (Kingston, 1988).

2.6.2 Mekanisme Reaksi Secara Konduksi dalam Iradiasi Microwave

Mekanisme secara konduksi dapat terjadi pada larutan-larutan yang

mengandung ion. Bila suatu larutan mengandung suatu partikel bermuatan atau

ion yang berikatan dengan suatu medan listrik maka ion-ion tersebut akan

bergerak. Pergerakan tersebut akan menyebabkan terjadinya peningkatan

kecepatan dari tumbukan antar molekul sehingga akan merubah energi kinetik

menjadi energi kalor (Kingston, 1988).

Gambar 2.13 Mekanisme konduksi partikel bermuatan teradiasi microwave (Kingston, 1988).

2.7 Identifikasi

2.7.1 Kromatografi

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh

suatu proses migrasi deferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase

atau lebih, salah satu di antaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah

tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan

adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul

atau kerapatan muatan ion. Dengan demikian, masing-masing zat dapat

diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (Departemen Kesehatan,

1995).

Teknik kromatografi umum membutuhkan zat terlarut terdistribusi diantara

dua fase, yaitu satu diantaranya diam (fase diam), yang lainnya bergerak (fase

gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari zat

terlarut lainnya, yang tereluasi lebih awal atau lebih akhir. Umumnya zat terlarut


15

dibawa melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau

gas yang disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai zat penjerap, seperti

halnya penjerap alumina yang diaktifkan, silika gel, dan resin penukar ion, atau

dapat bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam

dan fase gerak. Dalam proses terakhir ini suatu lapisan cairan pada suatu

penyangga yang inert berfungsi sebagai fase diam (Departemen Kesehatan,1995).

Jenis-jenis kromatografi yang bermanfaat dalam analisis kualitatif dan

kuantitatif yang digunakan dalam penetapan kadar dan pengujian Farmakope

Indonesia adalah Kromatografi Kolom, Kromatografi Gas, Kromatografi Kertas,

Kromatografi Lapis Tipis, dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Kromatografi

kertas dan kromatografi lapis tipis umumnya lebih bermanfaat untuk tujuan

identifikasi, karena mudah dan sederhana. Kromatografi kolom memberikan

pilihan fase diam yang lebih luas dan berguna untuk pemisahan masing-masing

senyawa secara kuantitatif dari suatu campuran (Departemen Kesehatan,1995).

2.7.1.1 Kromatografi Kolom

Peralatan yang diperlukan untuk kromatografi kolom sangat sederhana,

terdiri dari tabung kromatografi dan sebuah batang pemampat yang diperlukan

untuk memadatkan wol kaca atau kapas pada dasar tabung jika diperlukan, serta

untuk memadatkan zat penjerap atau campuran zat penjerap dan air secara merata

di dalam tabung. Kadang-kadang digunakan cakram kaca berpori yang melekat

pada dasar tabung untuk menyangga isinya. Tabung berbentuk silinder dan terbuat

dari kaca, kecuali bila dalam monografi, disebutkan terbuat dari bahan lain.

Sebuah tabung mengalir dengan diameter yanglebih kecil untuk mengeluarkan

cairan yang menyatu dengan tabung atau disambung melalui suatu sambungan

anti bocor pada ujung bawah tabung utama (Departemen kesehatan, 1995).

Ukuran kolom bervariasi; kolom yang umum digunakan dalam analisis

farmasi mempunyai diameter dalam antara 150 mm hingga 400 mm, tidak

termasuk tabung pengalir. Tabung pengalir, umumnya berdiameter dalam antara 3

mm hingga 6 mm, dapat dilengkapi dengan sebuah kran untuk mengatur laju

aliran pelarut yang melalui kolom dengan teliti. Batang pemampat merupakan

suatu batang silinder, melekat kuat pada sebuah tangkai yang terbuat dari plastik,


16

kaca, baja tahan karat, atau aluminium, kecuali bila dinyatakan lain dalam

monografi. Tangkai batang pemampat biasanya mempunyai diameter yang lebih

kecil dari kolom dan panjang minimal 5 cm melebihi panjang efektif kolom,

batang mempunyai diameter lebih kurang 1 mm lebih kecil dari diameter dalam

kolom (Departemen kesehatan, 1995).

Zat penjerap atau fase diam (bisa berupa aluminium oksida yang telah

diaktifkan, silika gel, tanah diatome terkalsinasi, atau tanah silika yang

dimurnikan untuk kromatografi) dalam keadaan kering atau dalam campuran

dengan air, dimampatkan ke dalam tabung kromatografi kaca atau kuarsa. Zat uji

yang dilarutkan dalam sejumlah kecil pelarut, dituangkan ke dalam kolom dan

dibiarkan mengalir ke dalam zat penjerap. Zat berkhasiat diadsorpsi dari larutan

secara kuantitatif oleh bahan penjerap berupa pita sempit pada permukaan atas

kolom. Dengan penambahan pelarut lebih lanjut melalui kolom, oleh gaya

gravitasi atau dengan memberikan tekanan, masing-masing zat bergerak turun

dalam kolom dengan kecepatan tertentu, sehingga terjadi pemisahan dan diperoleh

kromatogram (Departemen Kesehatan,1995).

2.7.1.2 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis adalah metode analisis yang sangat lama dan telah

banyak digunakan. Kromatografi lapis tipis (KLT) digunakan jika:

substansi tidak mudah menguap atau memiliki tingkat penguapan yang

rendah;

substansi sangat polar, kepolaran yang sedang, nonpolar atau ionik;

sampel yang harus di analisa dalam jumlah banyak dan dengan waktu

terbatas;

sampel yang bila dianalisa dapat merusak kolom dari Kromatografi Cair

atau Kromatografi Gas;

substansi dalam bahan yang akan dianalisa tidak dapat dideteksi dengan

Kromatografi Cair atau Kromatografi Gas atau hanya dengan kesulitan yang

baik;

setelah kromatografi, semua komponen dari sampel harus dapat dideteksi

(Hahn-Deinstrop, 2006).


17

Totolkan Larutan uji dan Larutan baku, menurut cara yang tertera pada

masing-masing monografi dengan jarak antara lebih kurang 1,5 cm dan lebih

kurang 2 cm dari tepi bawah lempeng, dan biarkan mengering (tepi bawah

lempeng adalah bagian lempeng yang pertama kali dilalui oleh alat membuat

lapisan pada waktu melapiskan zat penjerap). Ketika bekerja dengan lempeng,

gangguan fisik harus terhindarkan dari zat penjerap (Departemen kesehatan,

1995).

Beri tanda pada jarak 10 cm hingga 15 cm di atas titik penotolan.

Tempatkan lempeng pada rak penyangga, hingga tempat penotolan terletak di

sebelah bawah,dan masukkan rak ke dalam bejana kromatografi. Pelarut dalam

bejana harus mencapai tepi bawah lapisan penjerap, tetapi titik penotolan jangan

sampai terendam. Letakkan tutup bejana pada tempatnya, dan biarkan sistem

hingga pelarut merambat 10 cm hingga 15 cm di atas titik penotolan, umumnya

diperlukan waktu lebih kurang 15 menit hingga 1 jam. Keluarkan lempeng dari

bejana, buat tanda batas rambat pelarut, keringkan lempeng di udara,dan amati

bercak mula- mula dengan cahaya ultraviolet gelombang pendek (254 nm) dan

kemudian dengan cahaya ultraviolet gelombang panjang (366 nm). Ukur dan catat

jarak tiap bercak dari titik penotolan serta catat panjang gelombang untuk tiap

bercak yang diamati. Tentukan harga Rf untuk bercak utama. Jika diperlukan,

semprot bercak dengan pereaksi yang ditentukan, amati dan bandingkan

kromatogram zat uji dengan kromatogram baku pembanding (Departemen

kesehatan, 1995).

Gambar 2.14 Skema kromatografi lapis tipis


18

2.7.2 Spektrofotometri

2.7.2.1 Spektrometri Massa

Teknik ini memungkinkan untuk mengukur berat molekul dari senyawa dan

ion molekular yang diidentifikasi, teknik ini memungkinkan untuk mengukur ion

secara akurat untuk memastikan jumlah dari atom hidrogen, karbon, oksigen dan

atom lain yang terdapat dalam suatu molekul. Teknik ini akan memberikan hasil

data berupa rumus molekul (Heinrich, 2004).

2.7.2.2 Resonansi Magnetik Inti (RMI)

Radiasi pada daerah frekuensi radio digunakan untuk mengeksitasi atom-

atom, biasanya proton-proton atau atom-atom karbon-13, sehingga spinnya

berubah dari sejajar menjadi sejajar melawan medan magnet yang digunakan.

Rentang frekuensi yang dibutuhkan untuk eksitasi dan pola-pola pembagian

kompleks yang dihasilkan sangat khas pada struktur kimia molekul tersebut

(Watson, 2009).

2.7.2.3 Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-MS)

Kromatografi gas dan spektrometri massa dapat digunakan untuk

memisahkan komponen dengan memberikan waktu retensi dan puncak elusi yang

dapat dimasukkan ke dalam spektrofotometer massa untuk memperoleh berat

molekul, karakteristik dan informasi fragmentasi (Heinrich, 2004). Teknik ini

juga dapat digunakan untuk komponen yang polar (senyawa yang larut dalam air)

seperti calistegines dan polihidroksil alkaloid jika dibuat turunannya dengan

komponen yang sesuai (trimetilsilil klorida) untuk meningkatkan volatilitasnya

(Heinrich, 2004).

Kromatografi gas saat ini merupakan metode analisis yang penting dalam

kimia organik untuk menentukan senyawa tunggal dalam campuran. Spektrometer

massa sebagai metode deteksi yang memberikan data yang bermakna, yang

diperoleh dari penentuan langsung molekul zat atau fragmen (Heinrich, 2004).


19

2.7.2.4 Fourier Transform Infrared (FT-IR)

FT-IR merupakan metode dari spektroskopi inframerah. Dalam

spektroskopi inframerah, radiasi IR melewati sampel. Beberapa dari radiasi IR

diabsorbsi oleh sampel dan beberapa dari radiasi ditransmisikan. Akibat adanya

radiasi yang diserap dan yang ditrasnmisikan, maka akan menghasilkan spectrum

molekul, membentuk sidik jari molekular dari sampel. Seperti halnya sidik jari,

maka tidak akan ada struktur molekul sampel yang berbeda memiliki spektrum

inframerah yang sama. Ini membuat spektroskopi inframerah berguna untuk

beberapa tipe analisis (Anonim, 2001).

2.7.2.5 Spektrofotometer UV-Visible

Susunan peralatan Spektrofotometer Ultra-violet dan Sinar Tampak

diperlihatkan pada Gambar 2.7 yang meliputi bagian-bagian sebagai berikut:

sumber radiasi/cahaya (A), monokromator (B), sel absorpsi (C), detektor (D) dan

pencatat (E) (Triyati, 1985).

Sumber cahaya dipergunakan untuk pengukuran absorpsi. Sumber cahaya

ini harus memancarkan sinar dengan kekuatan yang cukup untuk penentuan dan

pengukuran, juga harus memancarkan cahaya berkesinambungan yang berarti

harus mengandung semua panjang gelombang dari daerah yang dipakai. Kekuatan

sinar radiasi harus konstan selama waktu yang diperlukan. Sumber Cahaya

Tampak yang paling umum dipakai adalah lampu Wolfram. Sedangkan sumber

radiasi Ultra-violet biasa dipergunakan lampu Hidrogen atau Deuterium yang

terdiri dari tabung kaca dengan jendela dari kwartz yang mengandung Hidrogen

dengan tekanan tinggi. Oleh karena kaca menyerap radiasi Ultra-violet, maka

sistem optik Spektrofotometer Ultra-Violet dan sel harus dibuat dari bahan kwartz

(Triyati, 1985).

Gambar 2.15 Bagan susunan alat spektrofotometer Uv-Vis (Triyati, 1985).


20

Monokromator dipergunakan untuk memisahkan radiasi ke dalam

komponen-komponen panjang gelombang dan dapat memisahkan bagian

spektrum yang diinginkan dari lainnya. Detektor dipergunakan untuk

menghasilkan signal elektrik. Dimana signal elektrik ini sebanding dengan cahaya

yang diserap. Signal elektrik ini kemudian dialirkan ke alat pengukur. Rekorder

dipergunakan untuk mencatat data hasil pengukuran dari detektor, yang

dinyatakan dengan angka (Triyati, 1985).

Seperti terlihat pada bagan alat susunan Spektrofometer Ultra-violet dan

Sinar Tampak, suatu sumber cahaya; dipancarkan melalui monokromator (B).

Monokromator menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya tersebut

menjadi pita-pita panjang gelombang yang diinginkan untuk pengukuran suatu zat

tertentu, yang menunjukkan bahwa setiap gugus kromofor mempunyai panjang

gelombang maksimum yang berbeda. Dari monokromator tadi cahaya/energi

radiasi diteruskan dan diserap oleh suatu larutan yang akan diperiksa di dalam

kuvet. Kemudian jumlah cahaya yang diserap oleh larutan akan menghasilkan

signal elektrik pada detektor, signal elektrik ini sebanding dengan cahaya yang

diserap oleh larutan tersebut. Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat

dapat dilihat sebagai angka (Triyati, 1985).

2.8 Inflamasi

2.8.1 Definisi

Inflamasi merupakan respon terhadap kerusakan jaringan akibat berbagi

rangsangan yang merugikan, baik rangsangan kimia maupun mekanis, infeksi,

serta benda asing seperti bakteri dan virus. Pada proses inflamasi terjadi reaksi

vaskular, sehingga cairan, elemen-elemen darah, sel darah putih, dan mediator

kimia terkumpul pada tempat yang cedera untuk menetralkan dan menghilangkan

agen-agen berbahaya serta untuk memperbaiki jaringan yang rusak. Tanda-tanda

inflamasi meliputi kerusakan mikrovaskuler, peningkatan permeabilitas kapiler,

dan migrasi leukosit ke daerah inflamasi (Hidayati et al, 2008).

Inflamasi adalah reaksi biologis untuk mengganggu homeostasis jaringan.

Pada tingkat dasar, proses penghancuran jaringan yang melibatkan produk darah,

seperti protein plasma, cairan, dan leukosites, sehingga terjadi gangguan jaringan.


21

Migrasi ini difasilitasi oleh perubahan dalam pembuluh darah lokal menjadi

vasodilatasi, meningkatkan permeabilitas pembuluh, serta meningkatkan aliran

darah (Ashley et al, 2012).

Infeksi yang diakibatkan oleh mikroba sering menyebabkan terjadinya

respon inflamasi. Bagaimanapun, luka atau trauma (kehadiran infeksi parasit) dan

paparan partikel/iritan/polutan asing juga dapat menyebabkan inflamasi, respon

yang terjadi dapat kerusakan atau malfungsi jaringan. Fungsi dasar dari inflamasi

adalah untuk menghancurkan dengan cepat pengganggu yang masuk kedalam

tubuh, mengurangi kerusakan jaringan, dan kemudian mengembalikan

homeostatis jaringan. Inflamasi, ketika diatur sewajarnya, adalah proses

menyesuaikan diri. Pernyataan ini didukung oleh peningkatan resiko dari infeksi

serius pada manusia dengan defesiensi genetik dalam komponen dasar dari

inflamasi, seperti neutropenia (kadar rendah yang abnormal dari neutrophil). Pada

studi dengan menggunakan metode knock-out pada tikus menjelaskan bahwa

cacat pada gen yang menyandikan sitokin proinflamasi dan agen inflamasi dapat

meningkatkan kerentaan terhadap infeksi (Ashley et al, 2012).

2.8.2 Mekanisme dari Inflamasi

Inflamasi diatur oleh proses yang melibatkan sistem imun, psikologis, dan

perilaku yang dipengaruhi oleh sitokin. Tahap pertama dari inflamasi termasuk

pengenalan dari infeksi atau kerusakan. Ini secara tipikal diraih dengan cara

deteksi dari susuan molekular yang dihubungkan dengan patogen (PAMPs) yang

secara spesifik bentuk molekul tersebut diekspresikan oleh pathogen yang esensial

untuk bertahan hidup. Susunan molekul dihubungkan dengan kerusakan

(DAMPs), adalah molekul endogen yang merupakan sinyal dari kerusakan atau

nekrosis dan juga dikenali sistem imun bawaan. Sebuah keuntungan dari

mendeteksi sinyal ini adalah mentargetkan tidak dengan hati-hati dari sel inang

dan jaringan diminimalisasi. Tidak seperti sistem imun adaptif, sistem imun

bawaan kurang kemampuannya untuk membedakan perbedaan strain dari patogen

yang membahayakan (dapat membahayakan sel inang) (Ashley et al, 2012).

Inflamasi secara umum dikarakterisasikan dengan tanda umum seperti

kemerahan, bengkak, panas, sakit, dan kadang disertai eksudasi dan kehilangan


22

fungsi. Proses dari inflamasi termasuk peran dari mediator yang merupakan

substansi kimia yang poten yang ditemukan dalam jaringan tubuh, seperti

prostaglandin, leukotriene, prostasiklin, limfokin, kemokin seperti interferon-α

(IFN-α), interleukin (IL)-1, IL-8, histamin, 5-hidroksitriptamin (5-HT), dan

faktor-α nekrosis jaringan. Mediator yang menyebabkan timbulnya respon

inflamasi (Beg et al, 2011).

Gambar 2.16 Proses inflamasi dan sintesis mediator inflamasi seperti prostaglandin, prostasiklin,

dan leukotrien (Beg et al, 2011).

Proses peradangan melibatkan sederet peristiwa yang dapat disebabkan oleh

berbagai stimulus misalnya zat-zat penginfeksi, iskemia, interaksi antigen-

antibodi, serta cidera karena panas atau cedera fisik lain. Pada tingkat

makroskopik, respon peradangan terjadi disertai dengan tanda-tanda klinis yang

umum berupa eritma, edema, sangat peka-nyeri (hiperalgesia), dan nyeri. Respon

peradangan terjadi dalam tiga fase yang berbeda, masing-masing diperantarai oleh

mekanisme yang berbeda yaitu fase akut, fase sub akut lambat, dan fase

proliferatif kronik. Fase akut ditandai dengan vasodilatasi lokal dan peningkatan

permeabilitas kapiler. Fase sub akut lambat ditandai dengan infiltrasi sel leukosit

dan sel fagosit. Sedangkan fase proliferatif kronik ditandai dengan terjadinya

kerusakan jaringan dan fibrosis. Kemampuan untuk meningkatkan respon


23

peradangan sangat penting untuk dapat bertahan hidup dalam menghadapi

patogen lingkungan dan cedera, walaupun pada keadaan penyakit tertentu, respon

peradangan mungkin berlebihan dan berlangsung lama tanpa alasan manfaat yang

jelas (Goodman dan Gilman, 2012).

2.8.3 Obat-obat Antiinflamasi

2.8.3.1 Obat Antiinflamasi Steroid

Glukokortikoid merupakan antiinflamasi golongan steroid. Efek

glukokortikoid pada respon radang terbilang banyak dan terdokumentasi dengan

baik. Obat-obatan ini dapat diberikan secara oral maupun intravena. Prednison

oral merupakan obat pilihan yang masih banyak digunakan. Kebanyakan pasien

mengalami perbaikan yang signifikan dalam waktu 5 hari sejak permulaan terapi.

Pada kasus yang lebih parah, glukokortikoid dapat diberikan secara intravena

(Goodman dan Gilman, 2012).

Steroid sintesis baru sedang dikembangkan dikarenakan obat-obat steroid

yang tersedia buruk absorpsinya dan/atau obat tersebut mengalami metabolisme

lintas pertama yang tinggi seperti sediaan topikal prednisolon, metasulfobenzoat,

tiksokortol pivalat, flutikason propionat, dan beklometason dipropionat (Goodman

dan Gilman, 2012).

2.8.3.2 Obat Antiinflamasi Non-Steroid

Obat-obat antiinflamasi non-steroid (AINS) merupakan suatu grup obat

yang secara kimiawi tidak sama, yang berbeda aktivitas anti-piretik, analgesik,

dan antiinflamasinya. Obat-obat ini terutama bekerja dengan jalan menghambat

enzim siklooksigenase tetapi tidak enzim lipoksigenase. Aspirin adalah prototip

dari grup ini; yang paling umum digunakan dan merupakan obat yang

dibandingkan dengan semua obat antiinflamasi. Namun, sekitar 15% penderita

menunjukkan tidak toleran terhadap aspirin. Karena itu, obat-obat AINS lain

dapat digunakan jika individu tidak toleran terhadap aspirin. Selain itu, pada

penderita tertentu, beberapa obat AINS baru lebih superior daripada aspirin,

karena aktivitas antiinflamasinya lebih besar dan/atau menyebabkan lebih sedikit

terjadinya iritasi pada lambung. Namun, disamping itu terdapat juga kekurangan


24

dari AINS lain tersebut yaitu harganya dapat lebih mahal dari aspirin dan

beberapa telah terbukti lebih toksik (Mycek et al, 2001).

2.8.4 Mekanisme Obat Anti-inflamasi

Efek terapeutik utama dari NSAID adalah kemampuannya untuk

menghambat pembentukan prostaglandin. Enzim pertama dalam jalur sintetis

prostaglandin adalah prostaglandin endoperoksida sintase, atau asam lemak

siklooksigenase. Enzim ini mengubah asam arakidonat menjadi senyawa antara

yang tidak stabil yaitu PGG2 dan PGH2. Diketahui bahwa terdapat dua bentuk dari

enzim siklooksigenase yaitu siklooksigenase-1 (COX-1) dan siklooksigenase-2

(COX-2) (Goodman dan Gilman, 2012).

Enzim COX-1 merupakan suatu isoform konstitutif yang terdapat banyak

pada jaringan normal, sedangkan enzim COX-2 terinduksi saat berkembangnya

suatu peradangan akibat dari sitokin atau mediator radang lain. Namun, COX-2

juga diekspresikan secara konstitutif di daerah tertentu di ginjal dan otak. Penting

diketahui bahwa COX-1 diekspresikan dalam lambung namun tidak dengan COX-

2, sehingga toksisitas terhadap lambung dapat dikurangi dengan memberikan

inhibitor selektif COX-2 (Goodman dan Gilman, 2012).

Gambar 2.17 Skema mekanisme obat antiinflamasi (Kurmis et al, 2012)


25

Produk hasil perubahan arakidonat oleh enzim COX adalah PGG2 dan PGH2

berbeda-beda bergantung pada aktivitas enzimatik metabolism PGG2 dan PGH2

pada suatu jaringan. Asam arakidonat dapat juga diubah melalui jalur 5-

lipoksigenase menjadi leukotrien. Aspirin dan NSAID menghambat pembentukan

enzim siklooksigenase dan prostaglandin namun tidak menghambat jalur

lipoksigenase, dengan demikian tidak menekan pembentukan leukotrien

(Goodman dan Gilman, 2012).

Glukokortikoid menekan ekspresi COX-2 sehingga dapat menekan

pembentukan prostaglandin yang diperantarai oleh COX-2. Efek ini menyebabkan

glukokortikoid memiliki kerja atau efektivitas sebagai antiinflamasi (Goodman

dan Gilman, 2012).

2.8.5 Natrium Diklofenak

Natrium diklofenak adalah penghambat siklooksigenase. Diklofenak

digunakan untuk pengobatan jangka panjang arthritis rematoid, osteoarthritis, dan

spondilitis ankilosa. Diklofenak lebih poten daripada indometasin dan naproksen.

Jalur ekskresi utama dari diklofenak dan metabolitnya adalah melalui ginjal

(Mycek et al, 2001).

Diklofenak mempunyai aktivitas analgesik, antipiretik, dan antiradang.

Diklofenak tampak menurunkan konsentrasi intrasel arakidonat bebas dalam

leukosit, mungkin dengan mengubah pelepasan atau pengambilan asam lemak

tersebut (Goodman dan Gilman, 2012).

Gambar 2.18 Struktur natrium diklofenak (PubChem, n. d.).


26

2.8.6 Bovine Serum Albumin (BSA)

Bovine serum albumin (BSA) merupakan protein globular (~66.000 Da)

yang digunakan dalam aplikasi biokimia diakrenakan stabilitasnya dan kurangnya

gangguan terhadap reaksi biologi. BSA merupakan rantai polipeptida runggal

yang terdiri dari 583 asam amino dan tidak mengandung karbohidrat. Pada pH 5-7

mengandung 17 ikatan intra disulfide dan 1 gugus sulfihidril (Anonim, 2000).

Albumin mudah larut dalam air dan hanya dapat dipresipitasi dengan

konsentrasi tinggi dari garam netral seperti ammonium sulfat. Stabilitas larutan

BSA sangat baik (khususnya ketika larutan disimpan dilemari pendingin). Namun,

albumin dapat menggumpal jika dipanaskan. Ketika dipanaskan 50oC atau lebih,

albumin akan dengan cepat membentuk agregat hidrofobik yang tidak akan

kembali menjadi monomer meskipun didinginkan. Pada temperatur rendah juga

dapat terjadi agregasi tersebut, tapi dalam laju yang relatif lambat (Anonim,

2000).

2.8.7 Metode Uji Antiinflamasi In vitro

2.8.7.1 Aktivitas Antidenaturasi dengan BSA

Denaturasi protein adalah proses dimana protein kehilangan struktur tersier

dan struktur sekunder diakibatkan oleh stress eksternal atau senyawa, seperti asam

atau basa kuat, konsentrat garam inorganik, pelarut organik atau pemanasan.

Banyak protein biologis kehilangan fungsi biologis ketika terdenaturasi.

Contohnya, enzim dapat kehilangan aktivitasnya karena substrat tidak dapat lagi

berikatan dengan sisi aktif (Verma M. et al, 2011).

Studi antidenaturasi protein dilakukan dengan menggunakan Bovine Serum

Albumin (BSA). Pengukuran BSA dilakukan untuk mengeliminasi atau

mengurangi penggunaan spesimen hidup dalam proses pengembangan obat.

Ketika BSA dipanaskan, maka akan terjadi denaturasi dan menunjukkan reaksi

hipersensitif tipe III yang berhubungan dengan antigen. Hal tersebut berhubungan

dengan penyakit seperti arthritis rematoid, serum sickness, glomerulonephritis,

dan sistemik lupus eritematosus. Dengan demikian pengujian aktivitas

antiinflamasi dengan metode BSA diaplikasikan untuk penemuan dan

pengembangan obat baru. Senyawa yang dapat menstabilkan protein dari proses


27

denaturasi merupakan senyawa yang berpotensi sebagai antiinflamasi. Beberapa

NSAID seperti indometasin, ibufenak, natrium diklofenak, asam salisilat, dan

asam flufenamat mencegah denaturasi dari BSA pada pH patologis yaitu 6,2-6,5.

Senyawa seperti fenil propanoid dan eugenol diketahui dapat mencegah

denaturasi dari BSA ditemukan memilki aktivitas antiinflamasi. Berdasarkan data

diatas, mendukung validitas dari penggunaan efek antidenaturasi BSA pada

ekstrak tanaman dalam suasana dipanaskan sebagai parameter terapeutik yang

potensial untuk menemukan senyawa antiinflamasi tanpa harus menggunakan

binatang untuk skrining farmakologi awal. Presentase dari pengendapan

(denaturasi protein) dapat dihitung dengan perbandingan antara absorbansi sampel

dibandingkan dengan absorbansi kontrol (R. Ramalingam et al, 2010).

Metode uji dengan BSA merupakan skrining antiinflamasi tahap awal.

Interaksi BSA dengan zat aktif terjadi akibat adanya ikatan antara zat aktif dengan

tirosin, treonin, dan lisin. Ketika zat aktif menempel dengan tirosin, treonin, dan

lisin yang terdapat pada BSA maka akan tidak mencegah terjadinya denaturasi

BSA (Williams et al, 2008).

2.8.7.2 Metode Stabilisasi Membran HRBC

Aksi utama dari agen antiinflamasi adalah menginhibisi enzim

siklooksigenase yang berperan dalam konversi asam arakidonat menjadi

prostaglandin. Karena membran sel darah merah manusia (HRBC) mirip dengan

komponen membran lisosom, pencegahan dari hipotonisitas diinduksi lisis

membran HRBC yang digunakan sebagai sebuah pengukuran dalam

memperkirakan sifat antiinflamasi pada ekstrak atau pada suatu senyawa. Metode

stabilisasi membran HRBC telah digunakan dalam memperkirakan sifat

antiinflamasi (Saleem et al, 2011).


28

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat

Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia,

Laboratorium Penelitian I, Laboratorium Penelitian II dan Laboratorium

Kimia Obat Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan.

3.2 Waktu

Penelitian ini dimulai pada bulan Februari 2015 sampai Mei 2015.

3.3 Alat dan Bahan

3.3.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah labu nasu flask 250 mL

(Iwaki/Pyrex), beaker glass (Pyrex) 500 mL; 100 mL; 50 mL, Hotplate,

seperangkat alat vacuum rotary evaporator (SB-1000 Eyela), kertas saring

whatman, pH meter, kapas, timbangan analitik, lumpang dan alu, vial, gelas ukur

(Pyrex) 100 mL; 50 mL; 10 mL, spatula, tabung reaksi, rak tabung reaksi,

chamber, magnetic stirrer, stirrer, shaking bath, Gas Chromatography-Mass

Spectrofotometry (GC-MS, Agilent Technologies), Nuclear Magnetic Resonancy

(NMR, 500 MHz, JEOL), Spektrofotometer UV-Vis (HITACHI), Fourier

Transform Infrared (FT-IR, SHIMADZU), Differential Scanning Calorimeter

(DSC, SHIMADZU), plat aluminium TLC silica gel 60 F254 (Merck),

kromatografi kolom.

3.3.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: Etil p-

metoksisinamat hasil isolasi dari kencur, Natrium diklofenak (Sigma-Aldrich),

Asam Nitrat (Merck), Heksan, Metanol p. a., Aquades, Silika gel 60 (Merck), Etil

Asetat, Tris base, Na2SO4 anhidrat (Merck), NaOH (Merck), HCl, Bovine Serum

Albumin (Sigma-Aldrich).


29

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Modifikasi Etil p-Metoksisinamat

3.4.1.1 Proses Hidrolisis Etil p-Metoksisinamat menjadi Asam p-

Metoksisinamat (Mufidah, 2014 dengan modifikasi)

Senyawa etil p-metoksisinamat sebanyak 15,480 gram (75 mmol)

ditambahkan kedalam larutan yang berisi campuran 4,8 gram (75 mmol) NaOH

dan 375 mL (75 mmol) etanol pro analisis dalam gelas kimia yang diikuti dengan

pengadukan. Campuran tersebut kemudian dipanaskan pada suhu 60oC diatas

hotplate dan diaduk dengan bantuan stirer selama 5 jam. Pengecekan reaksi

dilakukan dengan menggunakan KLT. Setelah itu, aquadest 1.000 mL

ditambahkan secara bertahap diikuti dengan pengadukan sampai hasil reaksi larut

sempurna. Kemudian ditambahkan HCl 15% kedalam larutan dan terbentuklah

endapan putih. HCl 15% tersebut dihentikan penambahannya jika tidak ada

endapan putih yang terbentuk lagi atau pH filtrat telah mencapai 4. Residu yang

dihasilkan merupakan senyawa hasil hidrolisis yang kemudian dikeringanginkan.

3.4.1.2 Proses Nitrasi (Bose et al, 2006 dengan modifikasi)

Sebanyak 1 gram asam p-metoksisinamat ditambahkan 4 mL asam nitrat

65% (suhu dibawah -12oC). Berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan (lampiran

12), campuran reaksi tersebut di iradiasi menggunakan microwave pada 300 watt

selama 1 menit. Setelah iradiasi, campuran reaksi ditambahkan aquadest dingin

kemudian di filtrasi, maka akan didapatkan padatan berwarna kekuningan.

Kemudian padatan tersebut dikeringanginkan. Setelah itu, hasil yang telah

terdapat produk dimurnikan dengan kromatografi kolom. Kemudian dilanjutkan

diidentifikasi hasil pemurnian dengan menggunakan GC-MS, FT-IR, NMR.

3.4.2 Pemurnian dengan Kromatografi Kolom

Pemurnian dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi kolom.

Sistem kromatografi yang digunakan adalah kromatografi kolom fase normal,

dimana fase diamnya berupa silika gel 60 yang bersifat polar. Eluent yang

digunakan adalah Heksan 100% hingga Heksan : Etil Asetat (8:2).


30

3.4.3 Penentuan Struktur Kimia

Setelah melakukan pemurnian dari senyawa hasil modifikasi melalui proses

nitrasi, dilakukan elusidasi struktur untuk identifikasi senyawa lebih lanjut.

a. Identifikasi Organoleptis

Senyawa murni etil p-metoksisinamat dan senyawa murni hasil

modifikasi diidentifikasi warna, bentuk, dan juga bau.

b. Pengukuran Titik Leleh

Senyawa murni etil p-metoksisinamat dan senyawa murni hasil

modifikasi diidentifikasi titik lelehnya dengan menggunakan DSC.

c. Identifikasi Senyawa Menggunakan FTIR

Sebanyak 1-2 mg sampel padat ditambahkan 200 mg bubuk KBr

murni dan diaduk hingga rata. Kemudian sampel yang telah dicampur

dengan KBr tersebut diambil dan kemudian ditempatkan dalam tempat

sampel pada alat spektroskopi inframerah untuk dianalisis (Hidayati,

2012).

d. Identifikasi Senyawa Menggunakan GCMS

Kolom yang digunakan adalah HP-5MS (30 m × 0,25 mm ID × 0,25

μm); suhu awal 70oC selama 2 menit, dinaikkan ke suhu 285

oC dengan

kecepatan 20oC/min selama 20 menit. Suhu MSD 285

oC. Kecepatan aliran

1,2 mL/min dengan split 1:100. Pelarut yang digunakan metanol untuk

kromatografi. Solvent delay selama 3 menit. Parameter scanning dilakukan

dari massa paling rendah yakni 35 sampai paling tinggi 550 (Umar et al,

2012).

e. Identifikasi Senyawa Menggunakan 1H-NMR dan 13C- NMR

Sebanyak 10 mg sampel senyawa hasil modifikasi dilarutkan dalam

pelarut kloroform bebas proton yang digunakan khusus untuk NMR.

Setelah itu sampel dimasukkan ke dalam tabung khusus NMR untuk

kemudian dianalisis menggunakan NMR.


31

3.4.4 Pembuatan Reagen untuk Uji Antiinflamasi

a. Pembuatan TBS (Tris Buffer Saline) pH 6,3

Sebanyak 1,21 g Tris base dan 8,7 g Natrium klorida (NaCl)

dilarutkan dalam 1.000 mL aquades. Terbentuklah larutan dapar dengan

pH sekitar 10. Kemudian pH di adjust hingga 6,3 dengan menggunakan

asam asetat glasial (Mohan, 2003).

b. Penyiapan variasi konsentrasi dari Natrium diklofenak sebagai

kontrol positif

Pembuatan larutan induk sebesar 10.000 ppm Natrium diklofenak

dalam pelarut metanol. Kemudian dilakukan pengenceran dari larutan

induk sehingga didapatkan variasi konsentrasi 1.000, 100, dan 10.

Untuk membuat 10.000 ppm dilakukan dengan melarutkan 50 mg

Natrium diklofenak dalam 5 mL metanol. Selanjutnya dilakukan

pengenceran dari larutan induk, yaitu:

1.000 ppm: Sebanyak 500 μL dari larutan induk di tambahkan

4.500 μL metanol.

100 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan induk di tambahkan 4.950

μL metanol.

10 ppm: Sebanyak 5 μL dari larutan induk di tambahkan 4.995 μL

metanol.

c. Penyiapan variasi konsentrasi dari etil p-metoksisinamat dan

senyawa hasil modifikasi

Pembuatan larutan induk sebesar 10.000 ppm etil p-

metoksisinamat dan senyawa hasil modifikasi dengan pelarut metanol.

Kemudian dilakukan pengenceran dari masing-masing larutan induk

sehingga didapatkan variasi konsentrasi 1.000, 100, dan 10 ppm. Untuk

membuat 10.000 ppm dilakukan dengan melarutkan 50 mg sampel

dalam 5 mL metanol. Selanjutnya dilakukan pengenceran dari larutan

induk, yaitu:

1.000 ppm: Sebanyak 500 μL dari larutan induk di tambahkan

4.500 μL metanol.


32

100 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan induk di tambahkan 4.950

μL metanol.

10 ppm: Sebanyak 5 μL dari larutan induk di tambahkan 4.995 μL

metanol.

d. Pembuatan Larutan BSA 0,2% (m/v)

Sebanyak 0,5 g BSA dilarutkan dalam 250 mL Tris Buffer Saline

(TBS) pH 6,3 (Williams et al, 2008).

3.4.5 Uji In vitro Antiinflamasi (Williams et al, 2008)

Tahapan pengujian aktivitas senyawa hasil modifikasi terhadap denaturasi

Bovine Serum Albumin adalah sebagai berikut:

a. Pembuatan Larutan Uji

Sebanyak 5 mL larutan uji terdiri dari 4.950 L BSA dan 50 L

larutan sampel. Larutan uji dibuat berbagai macam konsentrasi, yaitu:

100 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan sampel 10.000 ppm

ditambahkan dengan 4.950 μL larutan BSA.

10 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan sampel 1.000 ppm


1 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan sampel 100 ppm ditambahkan

dengan 4.950 μL larutan BSA.

0,1 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan sampel 10 ppm ditambahkan

dengan 4.950 μL larutan BSA.

b. Pembuatan Larutan Kontrol Negatif

Sebanyak 5 mL larutan kontrol negatif terdiri dari 4.950 L BSA

dan 50 L metanol pro analisis.

c. Pembuatan Larutan Kontrol Positif

Sebanyak 5 mL larutan kontrol positif terdiri dari 4.950 L BSA

dan 50 L larutan Natrium diklofenak. Larutan kontrol positif dibuat

berbagai macam konsentrasi, yaitu:

100 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan kontrol positif 10.000 ppm



33

10 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan kontrol positif 1.000 ppm


1 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan kontrol positif 100 ppm


0,1 ppm: Sebanyak 50 μL dari larutan kontrol positif 10 ppm


Masing-masing larutan diinkubasi selama 30 menit di suhu ruang (27oC).

Sebelum diinkubasi di vortex terlebih dahulu agar larutan yang dibuat homogen.

Setelah itu dipanaskan selama 5 menit pada suhu 72oC. Kemudian dibiarkan di

suhu ruang (27oC) selama 25 menit. Lalu diukur kekeruhannya dengan

spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 660 nm. Presentase inhibisi

dari denaturasi BSA diapat dihitung dengan rumus berikut:

x 100


34

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Modifikasi Struktur Etil p-Metoksisinamat

Senyawa etil p-metoksisinamat sebelum dinitrasi dihidrolisis terlebih dahulu

untuk mendapatkan asam p-metoksisinamat. Hal ini dilakukan karena berdasarkan

uji pendahuluan, ketika etil p-metoksisinamat di nitrasi dengan menggunakan

asam nitrat 65% tidak mendapatkan hasil yang diinginkan. Oleh karena itu

dilakukan reaksi hidrolisis terlebih dahulu kemudian hasilnya dinitrasi dengan

asam nitrat 65% dan menghasilkan produk yang diinginkan.

4.1.1 Reaksi Hidrolisis

Pada reaksi hidrolisis diperlukan katalis basa, dalam reaksi ini digunakan

NaOH dan perlarut yang digunakan adalah etanol pro analisis. Mekanisme dari

reaksi hidrolisis terjadi karena adanya protonasi pada karbonil oksigen. Protonasi

yang terjadi menyebabkan keadaan terpolarisasi pada gugus karbonil melepaskan

elektron dari karbon sehingga bersifat lebih elektrofilik dan akan mengikat OH

yang merupakan nukleofilik (Larson dan Weber, 1994).

Gambar 4.1 Mekanisme reaksi hidrolisis etil p-metoksisinamat

(Mufidah, 2014 telah diolah kembali)

Suhu 60oC


35

4.1.1.1 Optimasi Hidrolisis

Reaksi hidrolisis dilakukan dengan pemanasan 60oC diatas hotplate dan

berlangsung selama 5 jam (Gambar 4.1). Pemanasan diatas hotplate ditujukan

untuk mempersingkat reaksi. Berdasarkan penelitian Mufidah (2014), apabila

reaksi dilakukan pada suhu kamar maka akan membutuhkan waktu 32 jam. Hasil

dari reaksi hidrolisis berupa padatan berwarna putih. Setelah reaksi selesai,

dilakukan pelarutan hasil reaksi dengan aquadest sebanyak 1.000 mL secara

bertahap diikuti dengan pengadukan hingga hasil reaksi tersebut larut sempurna.

Filtrat yang diperoleh kemudian ditambahkan HCl 15% untuk mengikat Na+

sehingga terbentuklah endapan putih yang merupakan senyawa hasil hidrolisis.

Penambahan HCl 15% terus dilakukan hingga tidak lagi terbentuk endapan.

Gambar 4.1. KLT senyawa hasil hidrolisis dengan eluen heksan etil asetat 4:1

(visualisasi UV λ 245 nm)

Keterangan: (1) Reaksi hidrolisis selama 3 jam (2) Reaksi hidrolisis selama 4 jam (3) Reaksi

Hidrolisis selama 5 jam

Berdasarkan KLT (Gambar 4.1), pada jam ke-5 sudah tidak terdapat etil p-

metoksisinamat. Hal tersebut mengindikasikan bahwa etil p-metoksisinamat telah

bereaksi sempurna membentuk asam p-metoksisinamat, sehingga reaksi

dihentikan pada jam ke-5. Pada reaksi hidrolisis gugus ester digantikan dengan

gugus karboksilat sehingga menghasilkan asam p-metoksisinamat. Asam p-

metoksisinamat yang dihasilkan dari 15,480 gram etil p-metoksisinamat sebanyak

12,8616 gram dengan presentase rendemen sebesar 83,085%. Meskipun hanya

Etil p-metoksisinamat

Asam p-metoksisinamat

1 2 3


36

sebagai senyawa antara untuk melakukan reaksi nitrasi, hasil reaksi hidrolisis

dilakukan juga uji aktivitas antiinflamasi.

% Rendemen Hidrolisis =

x 100% = 83,085%

4.1.2 Reaksi Nitrasi

Reaksi nitrasi adalah reaksi dimana suatu senyawa akan disisipkan gugus

nitro. Pada reaksi nitrasi kali ini menggunakan cara dingin yaitu metode „Cold

Microwave’. Proses modifikasi dengan nitrasi hanya menggunakan reagen HNO3

(asam nitrat). Sebelum reaksi menggunakan asam nitrat, asam nitrat didinginkan

dahulu dalam freezer hingga suhu dibawah -12oC. Hal tersebut dilakukan untuk

menjaga kondisi reaksi dan sesudah reaksi ada dalam keadaan dingin, karena suhu

mempengaruhi hasil reaksi yang akan didapatkan (Bose et al, 2006).

Gambar 4.3. Reaksi Nitrasi

4.1.2.1 Optimasi Nitrasi

Reaksi dilakukan dengan iradiasi microwave pada 300 watt selama 1 menit.

Hal tersebut dilakukan berdasarkan hasil optimasi yang dilakukan (Lampiran 12).

Dilakukan optimasi dengan menggunakan waktu dan kekuatan radiasi yang

berbeda, yaitu dilakukan optimasi dengan 300 W selama 30 detik, 300 W selama

1 menit, 300 W selama 2 menit, dan 450 W selama 2 menit. Berdasarkan hasil

optimasi tersebut diketahui bahwa senyawa target memiliki hasil yang cukup baik

pada 300 watt selama 1 menit. Setelah iradiasi dilakukan, campuran reaksi

ditambahkan aquadest dingin yang bertujuan untuk mencuci hasil reaksi dari sisa-

sisa asam nitrat yang digunakan. Kemudian dilakukan filtrasi, maka didapatkan

padatan berwarna jingga. Didalam padatan ini terdapat senyawa target. Kemudian

hasil penyaringan tersebut dikeringkan pada suhu ruang. Setelah kering, hasil

Didinginkan

hingga suhu

dibawah -12oC


37

ditimbang. Lalu hasil dari reaksi nitrasi tersebut dimurnikan dengan menggunakan

kromatografi kolom dengan eluent heksan 100% hingga heksan-etil asetat dengan

perbandingan 8:2. Setelah dilakukan proses pemurnian dengan kromatografi

kolom, senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena dicuci dengan menggunakan heksan.

Setelah itu dilakukan identifikasi lebih lanjut terhadap senyawa hasil tersebut.

Senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena yang dihasilkan dari 1.200,0 mg asam p-

metoksisinamat sebanyak 333,1 mg dengan rendemen sebesar 27,75%.

% Rendemen senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena =

x 100% = 27,75%

Gambar 4.4. KLT senyawa hasil nitrasi dengan eluen heksan-etil asetat 3:2


Keterangan: (1) asam p-metoksisinamat (2) 4-metoksi-β-nitrostirena

4.2 Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi

Senyawa hasil modifikasi pertama kali diidentifikasi dengan

membandingkan nilai Rf. Nilai Rf didapatkan melalui KLT dengan eluen etil

asetat-heksan dengan perbandingan 3:2 (Gambar 4.5). Berdasarkan perhitungan,

didapatkan nilai Rf sebagai berikut:

Etil p-metoksisinamat = 0,95

Asam p-metoksisinamat = 0,7

4-metoksi-β-nitrostirena = 0,90

1 2


4-metoksi-β-nitrostirena


38

Berdasarkan nilai Rf diatas, dapat diketahui tingkat kepolaran dari masing-

masing senyawa. Senyawa etil p-metoksisinamat memiliki nilai Rf yang paling

tinggi. Hal tersebut menunjukkan bahwa etil p-metoksisinamat memiliki nilai

polaritas yang rendah. Reaksi hidrolisis yang dilakukan terhadap etil p-

metoksisinamat menghasilkan asam p-metoksisinamat yang memiliki perbedaan

nilai Rf yang cukup signifikan dibawah etil p-metoksisinamat yaitu 0,7. Hal

tersebut menunjukkan bahwa asam p-metoksisinamat memiliki nilai polaritas

lebih tinggi daripada etil p-metoksisinamat. Namun, berbeda dengan senyawa

hasil nitrasi yang bila dibandingkan dengan etil p-metoksisinamat nilai Rf

senyawa tersebut tidak mengalami perubahan yang signifikan. Senyawa etil p-

metoksisinamat tidak memiliki perbedaan tingkat kepolaran yang signifikan

dengan 4-metoksi-β-nitrostirena. Hal ini menunjukkan bahwa mengganti gugus

ester dengan gugus nitro hanya sedikit meningkatkan polaritas pada senyawa hasil

modifikasi.

Gambar 4.5. KLT senyawa hasil nitrasi dengan eluen etil asetat-heksan 3:2


Keterangan: (1) asam p-metoksisinamat (2) etil p-metoksisinamat (3) 4-metoksi-β-nitrostirena

4.2.1 Senyawa Hasil Hidrolisis

Senyawa hasil hidrolisis etil p-metoksisinamat dihasilkan dengan

mereaksikan etil p-metoksisinamat menggunakan NaOH dan pelarut etanol.

Senyawa ini memiliki karakteristik sebagai berikut:

Warna : Putih

Bau : Tidak berbau

Bentuk : Serbuk

1 2 3



4-metoksi-β-nitrostirena


39

Senyawa hasil hidrolisis dilakukan dengan elusidasi struktur dengan analisa

menggunakan GCMS. Analisa hanya dilakukan dengan GCMS karena senyawa

asam p-metoksisinamat merupakan senyawa antara untuk dilakukannya

modifikasi melalui proses nitrasi (Lampiran 5).

Berdasarkan hasil pola fragmentasi GCMS (Gambar 4.6), dapat

diinterpretasikan bahwa senyawa hasil hidrolisis yang merupakan asam p-

metoksisinamat muncul pada waktu retensi 9,622 yang memiliki berat molekul

178,0 dengan pola fragmentasi massa pada 161; 133; 117; 89; 77 dan 63 (Gambar

4.7).

Gambar 4.6. Pola fragmentasi GCMS asam p-metoksisinamat

Gambar 4.7 Fragmentasi MS asam p-metoksisinamat


40

Berdasarkan berbagai data identifikasi diatas bahwa dapat diketahui bahwa

senyawa hasil modifikasi melalui proses hidrolisis adalah senyawa Asam p-

metoksisinamat.

4.2.2 Senyawa Hasil Nitrasi

Nitrasi asam p-metoksisinamat dilakukan dengan menggunakan HNO3 dan

iradiasi microwave. Senyawa ini memiliki karakteristik sebagai berikut:

Warna : Kuning

Bau : Tidak berbau

Bentuk : Serbuk atau kristal

Titik leleh diukur menggunakan alat DSC (Differential Scanning

Calorimetry). Titik leleh senyawa hasil nitrasi asam p-metoksisinamat adalah

89,08oC (Lampiran 6).

Elusidasi struktur dari senyawa hasil nitrasi dilakukan dengan analisa

menggunakan IR, GCMS, 1H NMR, dan

13C NMR. Analisa pertama dilakukan

menggunakan IR.

Tabel 4.1. Daftar daerah spektrum IR 4-metoksi-β-nitrostirena

Ikatan Daerah Absorbsi (v, cm-1

)

C-H Aril 3105,53

C-H Alifatik 2921,32

C=C Aril 1611,59–1508,40

NO2 1441,85; 1323,22

C-N 1181,45

R-HC=CH-R (Trans) 972,16

Aromatik Posisi Para 824,60

Penafsiran spektrum IR senyawa hasil nitrasi asam p-metoksisinamat dari

berbagai bilangan gelombang dari absorbsi gugus fungsi yang spesifik

ditunjukkan dalam Tabel 4.1 (Lampiran 7). Berdasarkan hasil tersebut, ditemukan

pita serapan pada bilangan gelombang v 3105,53 cm-1

adalah serapan spesifik

vibrasi ulur ikatan antar atom C-H pada gugus aromatik. Pita serapan juga


41

ditemukan pada bilangan gelombang v 2921,32 cm-1

yang merupakan serapan dari

C-H dari gugus alifatik. Serapan dari C=C pada aromatik muncul pada bilangan

gelombang v 1611,59-1508,40 cm-1

. Adanya gugus NO2 diperkuat dengan adanya

pita serapan spesifik dengan dua pola absorbsi kuat yaitu pada bilangan

gelombang v 1441,85 cm-1

dan 1323,22 cm-1

. Kemudian pita serapan dari C-N

muncul pada bilangan gelombang v 1181,45 cm-1

. Pita serapan pada bilangan

gelombang v 972,16 cm-1

merupakan serapan spesifik dari bentuk trans. Lalu

muncul pita serapan dengan bilangan gelombang v 824,60 cm-1

yang

menunjukkan bahwa senyawa memiliki bentuk aromatik dengan substitusi para.

Setelah dilakukan analisa gugus fungsi dengan menggunakan IR,

selanjutnya senyawa hasil nitrasi dilakukan identifikasi lebih lanjut dengan

menggunakan GCMS untuk melihat pola fragmentasi dari senyawa tersebut. Pada

interpretasi menggunakan GCMS, senyawa hasil nitrasi muncul pada waktu

retensi 9,757 menit. Berat molekul senyawa tersebut 179,0 dengan fragmentasi

massa pada 147; 132; 102; 76 (Gambar 4.9). Senyawa tersebut memiliki pola

fragmentasi sebagai berikut:

Gambar 4.8. Pola fragmentasi GCMS 4-metoksi-β-nitrostirena


42

Gambar 4.9 Fragmentasi MS 4-metoksi-β-nitrostirena

Analisa dari senyawa hasil nitrasi tidak hanya menggunakan IR dan GCMS

melainkan dilakukan pula analisa dengan 1H-NMR. Interpretasi analisa dari NMR

berupa nilai dari pergeseran kimia (δ) pada suatu senyawa dalam satuan ppm

(Pavia et al, 2008). Hasil analisis 1H-NMR dari 4-metoksi-β-nitrostirena yang

merupakan senyawa hasil nitrasi yang ditunjukkan pada tabel 4.2 dengan panduan

gambar 4.10.

(a) (b)

(c)

Gambar 4.10. (a) Struktur Senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena (b) Struktur Senyawa Etil p-

Metoksisinamat (c) Senyawa Asam p-Metoksisinamat


43

Tabel 4.2. Data pergeseran kimia (δ) spektrum1H-NMR etil p-metoksisinamat, asam p-

metoksisinamat, dan 4-metoksi-β-nitrostirena (CDCl3, 500 MHz)

Posisi

Pergeseran Kimia (δ, ppm)

4-metoksi-β-

nitrostirena

Etil p-

Metoksisinamat

Asam p-

Metoksisinamat

(Mufidah, 2014)

1 7,50

(d, 1H, J=9,08)

6,90

(d, 1H, J=9,05)

6,95

(d, 1H, J=9,05)

2 6,95

(d, 1H, J=8,43)

7,47

(d, 1H, J=8,45)

7,54

(d, 1H, J=9,1)

4 6,95

(d, 1H, J=8,43)

7,47

(d, 1H, J=8,45)

7,47

(d, 1H, J=9,1)

5 7,50

(d, 1H, J=9,08)

6,90

(d, 1H, J=9,05)

6,95

(d, 1H, J=9,1)

7 7,52

(d, 1H, J=13,62)

7,65

(d, 1H, J=16,25)

7,63

(d, 1H, J=16,2)

8 7,98

(d, 1H, J= 13,62)

6,31

(d, 1H, J=15,6)

6,34

(d,, 1H, J=16,2)

11 - 4,25

(q, 2H, J=7,15) -

12 - 1,33

(t, 3H, J=7,15) -

15 3,86

(s, 3H)

3,82

(s, 3H)

3,82

(s, 3H)

Spektrum 1H-NMR memberikan sinyal pada pergeseran kimia 3,86 ppm

(3H) berbentuk singlet. Sinyal ini lebih downfield karena berikatan dengan

oksigen (-OCH3, metoksi). Pergeseran kimia 7,52 ppm, (1H) berbentuk doublet

memiliki hubungan dengan puncak yang memiliki pergeseran kimia 7,98 ppm

(1H) berbentuk doublet, keduanya memiliki konstanta kopling 13,62 Hz. Bentuk

tersebut merupakan olefin dengan proton yang memiliki konfigurasi trans.

Kemudian pada pergeseran kimia 6,95 ppm – 7,50 ppm (4H) merupakan proton-

proton yang terdapat dari benzen dengan dua substitusi. Pola sinyal ini

menunjukkan bahwa 2 proton yang ekuivalen terkopling secara ortho dengan 2

proton yang ekuivalen dengan yang lainnya. Bentuk tersebut menunjukkan bahwa

sinyal H 1,5 dan H 2,4.


44

Tabel 4.3. Data pergeseran kimia (δ) spektrum13

C-NMR 4-metoksi-β-nitrostirena (CDCl3, 500

MHz)

Posisi

Pergeseran Kimia (δ, ppm)

4-Metoksi-β-Nitrostirena Etil p-Metoksisinamat

(Hasali, 2013)

1,5 131.35, CH 130.19, CH

2,4 115.10, CH 114.77, CH

3 163.12, C 161.28, C

6 122,72, C 127.65, C

7 139.24, CH 144.45, CH

8 135.10, CH 116.28, CH

9 - 167.55, C

11 - 60.77, CH2

12 - 14.60, CH3

15 55.72, OCH3 55.89, OCH3

Spektrum 13

C-NMR menunjukkan bahwa sinyal pertama pada pergeseran

kimia 55,72 ppm merupakan karbon dari metoksi yang berada pada cincin

aromatik. Sinyal karbon pada 163,12 ppm merupakan karbon kuartener (C-3)

yang berikatan dengan atom oksigen dari metoksi. Kemudian terdapat sinyal pada

131,35 ppm (C-1,5) hanya muncul satu sinyal untuk dua karbon karena karbon

tersebut simetris dan ekuivalen antara satu dengan yang lainnya. Hal tersebut juga

terjadi pada C-2,4 dimana hanya muncul satu sinyal yaitu 115,10 ppm. Pada C-8

terdapat sinyal yang lebih downfield daripada sinyal yang dihasilkan etil p-

metoksisinamat yaitu 135,10 ppm. Hal tersebut dikarenakan karbon pada C-8

pada senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena berikatan langsung dengan Nitrogen yang

merupakan unsur penarik elektron. Sinyal pada 167,55 merupakan sinyal dari

karbon C-9 yang muncul pada etil p-metoksisinamat. Namun, pada senyawa 4-

metoksi-β-nitrostirena tidak muncul sinyal tersebut. Hal tersebut mengindikasikan

bahwa senyawa hasil modifikasi tersebut tidak mengandung karbonil.

Berdasarkan berbagai data identifikasi diatas bahwa dapat diketahui bahwa

senyawa hasil modifikasi melalui proses nitrasi adalah senyawa 4-Metoksi-β-

Nitrostirena.


45

4.3 Pengujian Aktivitas Antiinflamasi dan Hubungan Struktur Aktivitas

Senyawa Hasil Modifikasi

Studi antidenaturasi protein dilakukan dengan menggunakan Bovine Serum

Albumin (BSA). Pengukuran BSA dilakukan untuk mengeliminasi atau

mengurangi penggunaan spesimen hidup dalam proses pengembangan obat (R.

Ramalingam et al, 2010). Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antiinflamasi

terhadap etil p-metoksisinamat, senyawa hasil modifikasi yaitu 4-metoksi-β-

nitrostirena dan asam p-metoksisinamat, dan natrium diklofenak sebagai kontrol

positif dengan menggunakan BSA. Pada uji BSA tersebut digunakan konsentrasi

dengan rentang 100 ppm hingga 0,1 ppm.

Berdasarkan William, et al. (2008), senyawa yang memiliki persen inhibisi

denaturasi protein >20% merupakan senyawa yang memiliki aktivitas

antiinflamasi. Natrium diklofenak merupakan kontrol positif yang memiliki

aktivitas menghambat denaturasi protein dengan persen inhibisi sebesar 98,85%

pada konsentrasi 100 ppm.

Senyawa yang diuji aktivitas antiinflamasinya adalah senyawa natrium

diklofenak, senyawa etil p-metoksisinamat, senyawa asam p-metoksisinamat, dan

senyawa 4-metoksi-β-nitrostirena. Dari keempat senyawa tersebut, hanya natrium

diklofenak, etil p-metoksisinamat dan 4-metoksi-β-nitrostirena yang memiliki

aktivitas antiinflamasi yaitu dengan memiliki persen inhibisi >20%. Sedangkan

asam p-metoksisinamat tidak memiliki aktivitas antiinflamasi. Namun, natrium

diklofenak, etil p-metoksisinamat dan 4-metoksi-β-nitrostirena tersebut memiliki

pola nilai aktivitas yang berbeda. Etil p-metoksisinamat dan natrium diklofenak

memiliki aktivitas menghambat denaturasi protein seiiring dengan meningkatnya

konsentrasi. Sedangkan 4-metoksi-β-nitrostirena semakin kecil konsentrasi maka

aktivitas penghambatan denaturasi protein semakin meningkat (lihat tabel 4.4).

Pada penelitian ini dilakukan uji antiinflamasi dari etil p-metoksisinamat

dan senyawa hasil modifikasi dengan metode BSA yaitu dengan pengamatan

mengenai efek penghambatan denaturasi protein. Hasil dari penelitian

menunjukkan bahwa etil p-metoksisinamat memiliki aktivitas menghambat

denaturasi protein mulai dari konsentrasi rendah yaitu konsentrasi 0,1 ppm dan

meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi dimana pada konsentrasi 100


46

ppm senyawa etil p-metoksisinamat memiliki daya hambat denaturasi protein

sebesar 54,01%.

Tabel 4.4 Hasil uji aktivitas antiinflamasi etil p-metoksisinamat dan senyawa hasil modifikasi

Gambar 4.11 Grafik presentase inhibisi etil p-metoksisinamat dan senyawa hasil modifikasi

Keterangan: NaD = Natrium Diklofenak; EPMS= Etil p-metoksisinamat; APMS = Asam p-

metoksisinamat; 4MBN = 4-Metoksi-β-Nitrostirena

-20

0

20

40

60

80

100

120

0,1 1 10 100

NaD

EPMS

APMS

4MBN

No. Sampel Konsentrasi % Inhibisi

1. Natrium Diklofenak

0,1 1.59

1 4.56

10 26.75

100 98.85

2. Etil p-Metoksisinamat

0,1 32,56

1 40,13

10 42,73

100 54,01

3. Asam p-Metoksisinamat

0,1 -0.41

1 -0,31

10 -0,28

100 0,43

4. 4-Metoksi-β-Nitrostirena

0,1 36.73

1 29.80

10 24.27

100 -6.80


47

Senyawa hasil modifikasi melalui proses hidrolisis adalah senyawa asam p-

metoksisinamat. Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa asam

p-metoksisinamat tidak memiliki efek penghambatan denaturasi protein. Pada

konsentrasi 0,1 ppm hingga 100 ppm dari senyawa asam p-metoksisinamat, tidak

memiliki efek antidenaturasi.

Senyawa hasil modifikasi melalui proses nitrasi adalah senyawa 4-metoksi-

β-nitrostirena. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 4-metoksi-β-nitrostirena

memiliki efek penghambatan denaturasi protein yang meningkat seiring dengan

menurunnya konsentrasi. Pada konsentrasi 100 ppm senyawa 4-metoksi-β-

nitrostirena tidak memiliki efek penghambatan denaturasi protein. Senyawa 4-

metoksi-β-nitrostirena memiliki aktivitas menghambat denaturasi protein sebesar

36,73% pada konsentrasi 0,1 ppm. Efek penghambatan denaturasi protein yang

meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi tidak hanya pada senyawa 4-

metoksi-β-nitrostirena, melainkan pada senyawa hasil isolasi dari Butea

monosperma Bark. yaitu senyawa BM-01 dan pada beberapa ekstrak yang telah

diuji yaitu ekstrak Annona cherimola, ekstrak Boehmeria jamaicensis, dan ekstrak

Gliricida sepium (Tatti et al, 2012; Verma et al, 2011; William et al, 2008).

Berdasarkan hasil uji aktivitas terhadap etil p-metoksisinamat, asam p-

metoksisinamat, dan 4-metoksi-β-nitrostirena, dapat dianalisa bahwa penggantian

gugus ester (COOR) menjadi gugus karboksilat (COOH) dan gugus nitro (NO2)

mempengaruhi aktivitasnya dalam penghambatan denaturasi protein. Penggantian

yang dilakukan pada gugus ester (COOR) menjadi gugus karboksilat (COOH)

menyebabkan hilangnya efek penghambatan denaturasi protein. Sedangkan

penggantian gugus ester (COOR) menjadi gugus nitro (NO2) menyebabkan

menurunnya efek penghambatan denaturasi protein. Berdasarkan data hasil

analisa tersebut diketahui bahwa gugus ester (COOR) dari etil p-metoksisinamat

memiliki peranan penting terhadap aktivitasnya sebagai antiinflamasi.


48

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa:

a. Modifikasi senyawa etil p-metoksisinamat telah berhasil dilakukan

melalui dua proses yaitu proses hidrolisis yang menghasilkan asam p-

metoksisinamat dan proses nitrasi yang menghasilkan 4-metoksi-β-

nitrostirena.

b. Penggantian gugus ester menjadi karboksilat menyebabkan hilangnya

efek penghambatan denaturasi protein.

c. Penggantian gugus ester menjadi gugus nitro menyebabkan menurunnya

efek penghambatan denaturasi protein.

d. Berdasarkan hasil analisa hubungan struktur aktivitas terhadap senyawa

etil p-metoksisinamat dan senyawa hasil modifikasinya menunjukkan

bahwa gugus ester memiliki peranan penting dalam aktivitasnya sebagai

antiinflamasi.

e. Etil p-metoksisinamat memiliki aktivitas menghambat denaturasi protein

seiring dengan meningkatnya konsentrasi maka aktivitas penghamabatan

denaturasi protein semakin meningkat. Sedangkan 4-metoksi-β-

nitrostirena semakin kecil konsentrasi maka aktivitas penghambatan

denaturasi protein semakin meningkat.

5.2 Saran

a. Penelitian ini perlu dikembangkan lagi, terutama untuk melihat apakah

ada pengaruh terhadap efek penghambatan protein ketika modifikasi

dilakukan pada gugus ester, misalnya dengan adanya penambahan C

pada gugus ester tersebut.

b. Perlu dilanjutkan penelitian untuk pengujian antiinflamasi secara in vivo.


49

DAFTAR PUSTAKA

Aderogba, A; M. Kgatle, T; D. McGaw, J. L; Eloff, N, J. 2011. Isolation of

Antioxidant Constituents From Combretum apiculatum subsp. Apiculatum.

South African Journal of Botany.

Al-Fattah, Muhammad Hatta. 2011. Mukjizat Pengobatan Herbal dalam Al-

Qur’an. Mirqat: Jakarta.

Anonim. 2000. Albumin from Bovine Serum. Produck Information. Sigma-

Aldrich.

Anonim, 2001. Introduction to Fourier Transform Infrared Spectrometry. Thermo

Nicolet Corporation.

Ashley, Noah T.; Weil, Zachary M.; Nelson, Randy J. 2012. Inflammation:

Mechanisms, Costs, and Natural Variation. Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 43.

385–406.

Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2004. Keputusan Kepala Badan Pengawas

Obat dan Makanan Republik Indonesia No. HK. 00.05.4.2411 tentang

Ketentuan Pengelompokkan dan Penandaan Obat Bahan Alam Indonesia.

Jakarta: Badan Pengawasan Obat dan Makanan.

Bangun, Robijanto. 2011. Semi Sintesis N,N-Bis(2-Hidroksietil)-3-(4-

Metoksifenil) Akrilamida dari Etil P-Metoksisinamat Hasil Isolasi Rimpang

Kencur (Kaempferia Galanga, L) melalui Amidasi dengan Dietanolamin.

Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Sumatera Utara. Medan.

Barus, Rosbina. 2009. Amidasi Etil p-Metoksisinamat yang Diisolasi dari Kencur

(Kaempferia galanga, Linn). Tesis. Sekolah Pascasarjana Universitas

Sumatera Utara. Medan.

Beg, S.; Swain, S.; Hasan, H.; Barkat, M. A.; Hussain, Md S. 2011. Systematic

Review of Herbal as Potential Anti-Inflammatory Agents: Recent

Advances, Current Clinical Status and Future Perspectives. Pharmacogn

Rev. 5(10). 120-137.

Bogdal, Dariusz. 2005. Microwave-assisted Organic Synthesis. Elsevier:

Academic Press.

Bose, Ajay K.; Subhendu N. Ganguly; Maghar S. Manhas; Sheetal Rao; Jeffrey

Speck; Uri Pekelny; Esteban Pombo-Villars. 2006. Microwave promoted

rapid nitration of phenolic compounds with calcium nitrate. USA:

Tetrahedron letters elsivier.

Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta.

Ekowati, J.; Tejo, B. A.; Sasaki, S.; Highasiyama, K.; Sukardiman; Siswandono;

Budiati, T. 2012. Structure Modification of Ethyl p-Methoxycinnamate and


50

Their Bioassay ss Chemopreventive Agent Against Mice‟s Fibrosarcoma.

International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 4(3).

Goodman & Gilman. 2012. Dasar Farmakologi Terapi. Jakarta: EGC.

Gritter, Roy. 1991. Pengantar Kromatografi edisi kedua. Bandung: Institut

Teknologi Bandung.

Hahn-Deinstrop, Elke. 2006. Applied Thin-Layer Chromatography, Best Practice

and Avoidance of Mistakes, Second Edition. Wiley-VCH.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia. Bandung: ITB.

Hadi, Qudsi. 2014. Modifikasi Struktur Senyawa Etil p-metoksisinamat yang

Diisolasi dari Kencur (Kaempferia galanga L.) dengan Metode Reaksi

Reduksi dan Uji Aktivitas Antiinflamasinya secara In Vitro. Skripsi.

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Jakarta.

Halen, Parmeshwari K.; Prashant R. Murumkar; Rajani Giridhar; Mange Ram

Yadav. 2009. Prodrug Designing of NSAIDs. Mini-Reviews in Medicinal

Chemistry. 9. 124-139.

Hasanah, Nur A.; Nazaruddin, F.; Febrina, E.; Zuhrotun, A. 2011. Analisis

Kandungan Minyak Atsiri dan Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Rimpang

Kencur (Kaempferia galanga L.). Jurnal Matematika & Sains. 16(3).

Heinrich, M.; Barnes, J.; Gibbons, S.; Williamso; Elizabeth M. 2004.

Fundamental of Pharmacognosy and Phytotherapi. Hungary: Elsevier.

Hartanti, Lanny dan Setiawan, Henry K. 2009. Daya Hambat Beberapa Turunan

Asam Sinamat SintetikTerhadap Enzim Tirosinase. Indo. J. Chem. 9(1).

Hasali, Nor Hazwani M.; Muhammad Nor Omar; Ahmad Muzammil Zuberdi;

Helmi Yousif AlFarra. 2013. Biotransformation of ethyl p-

methoxycinnamate from Kaemferia galanga L. using Aspergillus niger.

International Journal of Biosciences. 3(7).

Hidayati, Nur A.; Listyawati, S.; Setyawan, A. D. 2008. Kandungan Kimia dan

Uji Antiinflamasi Ekstrak Etanol Lantana Camara L. pada Tikus Putih

(Rattus nervegicus L.) Jantan. Bioteknologi. 5 (1).

Kingston HM dan Jassie LB. 1988. Introduction to Microwave Sample

Preparation Theory and Practice. ACS publishing.

Kurmis, Andrew P.; Timothy P. Kurmis; Justin X. O‟Brien; Tore Dalen. 2012.

The effect of nonsteroidal anti-inflammatory drug administration on acute

phase fracture-healing (A Review). J Bone Joint Surg Am. 94(9).

Laddha, G.S. dan Degaleesan, T.S. 1976. Transport Phenomena in Liquid-Liquid

Extraction. New Delhi: Tata McGraw-Hill Publishing Co. Ltd.


51

Larson, Richard A.; Eric J. Weber. 1994. Reaction Mechanism In Environmental

Organic Chemistry. United State of America: Lewis Publisher.

Loupy, Andre. 2006. Microwaves in Organic Synthesis, Second Edition. Wiley-

VCH.

Martunus dan Helwani, Zuchra. 2007. Ekstraksi Dioksin dalam Limbah Air

Buangan Industri Pulp dan Kertas dengan Pelarut Toluen. Jurnal Sains dan

Teknologi. 6(1). 2.

Meek, Inger L.; Mart A.F.J.; van de Laar; Harald E. Vonkeman. 2010. Non-

Steroidal Anti-Inflammatory Drugs: An Overview of Cardiovascular Risks.

Pharmaceuticals.3.

Mohan, Chandra. 2003. Buffers, A guide for the preparation and use of buffers in

biological systems. Darmstadt: EMD Biosciences, Inc.

Mufidah, Syarifatul. 2014. Modifikasi Struktur Senyawa Etil p-metoksisinamat

yang diperoleh dari Kencur (Kaempferia galanga Linn.) melalui

Transformasi Gugus Fungsi Serta Uji Aktivitas Sebagai Antiinflamasi.

Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta. Jakarta.

Mycek, Mary J.; Harvey, Richard A.; Champe, Pamela C. 2001. Farmakologi:

Ulasan Bergambar. Jakarta: Widya Medika.

Nuraini, D. A. 2007. Ekstraksi antibakteri dan antioksidan dari biji teratai

(Nymphaea pubescens Wild). Departemen Ilmu Dan Teknologi Pangan

Fakultas Teknologi Pertanian. Institur Pertanian Bogor.

Olah, George A.; Subhash C. Narang; Judith A. Olah; Koop Lammertsma. 1982.

Recent aspect of nitration: New Preparative Methods and Mechanism

studies (A Review). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79. 4487-4494.

Omar, M. N.; Hasali, N. H. M.; Alfarra, H. Y.; Yarmo, M. A.; Zuberdi, A. M.

2014. Antimicrobial Activity and Microbial Transformation of Ethyl p-

Methoxycinnamate Extracted from Kaempferia galanga. Orient. J. Chem.

30(3).

Ono, Noburu. 2001. The Nitro Group In Organic Synthesis. A John Wiley &

Sons, Inc., Publication.

Pavia, Donald L.; Gary M.Lampman; George S.Kriz; James R. Vyvyan. 2008.

Introduction to Spectroscopy, Fourth Edition. Brooks/Cole Cengage

Learning. USA.

PubChem. n. d. Diclofenac. Diakses Tanggal Desember 14, 2014.

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/diclofenac#section=Top

R. Ramalingam, Madhavi, B. B.; Nath, A. R.; N. Duganath, Sri, Udaya, Banji,

David. 2010. In-vitro Anti-denaturation and Antibacterial Activities of

Zizyphus oenoplia. Der Pharmacia Lettre. 2(1).

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/diclofenac#section=Top


52

Rates, K, M, S. 2001. Plants As Source Of Drugs. Toxicon 39.

Rostiana, O.; S. M. Rosita; H. Wawan; Supriadi; A. Siti. 2003. Status Pemuliaan

Tanaman Kencur. Perkembangan Teknologi TRO. 15(2).

Riswiyanto. 2009. Kimia Organik. Jakarta: Penerbit Erlangga.

Riyanto, Sugeng. 1986. Transformasi Etil p-Metoksisinamat yang berasal dari

Kaempferia galanga Linn. menjadi p-Metoksistiril Metil Keton. Tesis.

Program Pasca Sarjana Institut Teknologi Bandung. Bandung.

Saleem, M. TK.; Azeem, AK.; Dilip, C.; Sankar, C.; Prasanth, NV.; Duraisami, R.

2011. Anti-inflammatory Activity of The Leaf Extract of Gendarussa

vulgaris Ness. Asian Pac J Trop Biomed. 1(2).

Tatti, Praveen Ningappa; S. Anitha; S .Shashidhara; M .Deepak; Sanjeevkumar

Bidari. 2012. Evaluation of In-Vitro Anti-Denaturation Activity of Isolated

Compound of Butea monosperma Bark. International Journal of

Pharmaceutical Sciences. 3(4).

Triyati, Etty. 1985. Spektrofotometer Ultra-violet dan Sinar Tampak Serta

Aplikasinya dalam Oseanografi. Oseana. 10(1): 42.

Umar, M. I.; Asmawi, M. Z.; Sadikun, A.; Atangwho, J. I.; Yam, Fei Mun, Altaf,

R.; Ahmed, A. 2012. Bioactivity-Guided Isolation of Ethyl-p-

methoxycinnamate, an Anti-inflammatory Constituent, from Kaempferia

galanga L. Extracts. Molecules. 17.

Verma M.; Adarsh, Kumar P.; Ajay, Kavitha D.; Anugrag KB. 2011. Anti

Denaturation and Antioxidant Activities of Annona cherimola In vitro.

International Journal of Pharma and Bio Sciences. 2(2).

Watson, David G. 2009. Analisis Farmasi: Buku Ajar untuk Mahasiswa. Jakarta:

EGC.

William, LAD.; Connar, A O.; Latore, L.; Dennis, O.; Ringer, S.; Whittaker, JA.;

Conrad, J.; Vogler, B.; Rosner, H.; Kraus, W. 2008. The in vitro Anti-

denaturation Effects Induced by Natural Products and Non-steroidal

Compounds in Heat Treated (Immunogenic) Bovine Serum Albumin is

Proposed as a Screening Assay for Detection of Anti-inflammatory

Compounds, without the use of Animals, in the Early Stages of the Drug

Discovery Process. West Indian Med J. 57(4).

Yulianto, Yogo Tri. 2010. Prarancangan Pabrik Nitrobenzen dari Benzen

dan Asam Campuran dengan Proses Kontinyu Kapasitas 120.000

Ton/Tahun. Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Muhammadiyah

Surakarta.


53

Lampiran 1. Alur Penelitian

Senyawa EPMS

(Etil p-metoksisinamat)

Proses Hidrolisis

Proses Nitrasi

Pemurnian Senyawa Hasil Nitrasi dan Identifikasi Senyawa

Uji Aktivitas Antiinflamasi dengan Metode BSA

Analisis Hubungan Struktur Aktivitas


54

Lampiran 2. Spektrum IR Senyawa Etil p-Metoksisinamat


55

(Lanjutan)

Ikatan Daerah Absorbansi (

C=O 1704,18

C-O 1367,59-1321,3

C-H Aril 3007,15-3045,73

C=C Aril 1629,92-1573,02

C-H Alifatik 2979,18-2842,23

C-O Aril 1252,82-1210,38; 1029,07


56

56

Lampiran 3. Spektrum GCMS Senyawa Etil p-Metoksisinamat


57

57

(Lanjutan)


58

58

Lampiran 4. Spektrum 1H-NMR Senyawa Etil p-Metoksisinamat


59

59

(Lanjutan)


60

(Lanjutan)

Hasil analisis 1H-NMR menggunakan pelarut CDCl3 menunjukkan nilai

pergeseran kimia (δ) sebagai berikut:

Posisi Pergeseran Kimia (δ, ppm) (CDCl3)

1 6,90 (d, 1H, J=9,05)

2 7,47 (d, 1H, J=8,45)

4 7,47 (d, 1H, J=8,45)

5 6,90 (d, 1H, J=9,05)

7 7,65 (d, 1H, J=16,25)

8 6,31 (d, 1H, J=15,6)

11 4,25 (q, 2H, J=7,15)

12 1,33 (t, 3H, J=7,15)

15 3,82 (s, 3H)

Struktur Etil p-metoksisinamat

Spektrum 1H-NMR memberikan sinyal pada pergeseran kimia 1,33 ppm (3H)

berbentuk triplet dan juga pada 4,25 ppm (2H) berbentuk quartet. Sinyal ini lebih

downfield karena berikatan dengan oksigen yang berperan sebagai senyawa penarik

elektron. Spektrum 1H-NMR juga memberikan sinyal pada pergeseran kimia 3,82

ppm (3H) berbentuk singlet. Sinyal ini lebih downfield karena berikatan dengan

Oksigen (-OCH3, metoksi). Pergeseran kimia 6,31 ppm (1H) berbentuk doublet

memiliki hubungan dengan puncak pada pergeseran kimia 7,65 ppm (1H) berbentuk

doublet, dengan rentang nilai konstanta kopling yang dekat yaitu 15,6 dan 16,26 Hz.

Bentuk tersebut adalah olefin dengan proton berkonfigurasi trans. Kemudian pada

pergeseran kimia 6,9 ppm-7,4 ppm (4H) merupakan proton-proton dari benzen

dengan dua subtitusi. Pola sinyal ini menunjukkan bahwa 2 proton yang ekivalen

terkopling secara ortho dengan 2 proton yang ekivalen lainnya, yang kemudian

menunjukkan bahwa sinyal ini adalah sinyal H 1,5 dan H 2,4.


61

Lampiran 5. Spektrum GCMS Senyawa Asam p-Metoksisinamat


62

Lampiran 6. Hasil Analisa DSC Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena


63

Lampiran 7. Spektrum IR Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

80

85

90

95

100

%T

34

18

.01

31

05

.53

29

21

.32

28

45

.13

16

11

.59

15

08

.40 1

44

1.8

5

13

23

.22

12

62

.46

11

81

.45

11

20

.69

10

29

.07

97

2.1

6

82

4.6

0

55

9.3

8

4-metoksibetanitrostirena-5


64

Lampiran 8. Spektrum GCMS Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena


65

(Lanjutan)


66

Lampiran 9. Spektrum 1H-NMR Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena


67

(Lanjutan)


68

(Lanjutan)


69

(Lanjutan)


70

Lampiran 10. Spektrum 13

C-NMR Senyawa 4-Metoksi-β-Nitrostirena


71

Lampiran 11. Perhitungan Reaksi

a. Perhitungan Bahan untuk Reaksi Hidrolisis

1) Etil p-Metoksisinamat

Terpakai = 15,480 g (BM = 206,24 g/mol)

Mol =

=

= 0.075 mol

2) NaOH

BM = 40 g/mol

Mol = 1,6 x 0,075 = 0,12 mol

Massa (g) = mol x BM = 0,12 x 40 = 4,8 gram ≈ terpakai 4,8 g

3) Etanol p.a

BM = 46,07 g/mol

ρ = 0,789 g/mL

Mol = 85 x 0,075 = 85,63 mol

Massa = mol x BM = 6,422 x 46,07 = 295,875 g

Volume =

=

= 375 mL

b. Perhitungan Bahan untuk Reaksi Nitrasi

1) Asam p-Metoksisinamat

Terpakai = 1,00 g (BM = 178 g/mol)

Mol =

=

= 0,0056 mol

2) Asam Nitrat

BM = 63,01 g/mol

ρ = 1,4 g/mL

Mol = 16 x 0,0056 = 0,0896 mol

Massa (g) = mol x BM = 0,0896 x 63,01 = 5,645 g

Volume =

=

= 4 mL


72

Lampiran 12. Optimasi Reaksi Nitrasi

Reaksi nitrasi apabila dilakukan dari senyawa etil p-metoksisinamat

menghasilkan hasil yang kecil dengan banyak hasil samping. Oleh karena itu

dilakukan reaksi dengan metode yang sama namun dari senyawa asam p-

metoksisinamat. Senyawa yang dihasilkan tetap sedikit namun hasil samping

berkurang. Oleh karena itu dilakukan optimasi dari reaksi nitrasi dari senyawa

asam p-metoksisinamat.

Asam p-metoksisinamat Daya Waktu Hasil GCMS Rendemen

200 mg 450 W 2 menit * 87,13%

200 mg 300 W 2 menit ** 87,59%

200 mg 300 W 1 menit *** 87,84%

200 mg 300 W 30 detik (-) 90,35%

* = banyak peak dan senyawa target bukan major (Gambar 2).

** = banyak peak dan tidak menghasilkan senyawa target (Gambar 3).

*** = banyak peak dan senyawa target salah satu peak major (Gambar 4).

(-) = tidak bereaksi

Berdasarkan hasil optimasi, dipilih reaksi dengan daya 300 W dan waktu 1

menit. Hal tersebut dikarenakan senyawa target dapat terbentuk jika kondisi pada

saat akan reaksi dan sesudah iradiasi masih dalam keadaan dingin. Oleh karena itu

dipilih reaksi dengan daya yang rendah dengan waktu yang rendah pula.

Kesimpulan: Reaksi dilakukan 300 watt selama 1 menit.

Gambar 1. KLT senyawa hasil hidrolisis dengan eluen heksan etil asetat 1:4

(Visualisasi UV λ 245 nm)

Keterangan: (1) Asam p-metoksisinamat (2) Reaksi nitrasi 300 W waktu 30 detik (3)

Reaksi nitrasi 300 W waktu 1 menit (4) Reaksi nitrasi 300 W waktu 2 menit (5) Reaksi

nitrasi 450 W waktu 2 menit

1 2 3 4 5


73

(Lanjutan)

Gambar 2. Hasil GCMS reaksi 450 W selama 2 menit

Keterangan: (1) Senyawa 4-metoksi-β-Nitrostirena

Gambar 3. Hasil GCMS reaksi 300 W selama 2 menit

(1)


74

(Lanjutan)

Gambar 4. Hasil GCMS reaksi 300 watt selama 1 menit


(1)


75

(Lanjutan)

Gambar 5. Hasil GCMS reaksi EPMS dengan daya 450 watt selama 2 menit


(1)


Lampiran 13. Hasil Perhitungan Uji Antiinflamasi

Sampel


Uji 1 Uji 2 Uji 3

% Inhibisi rata-rata SD Kontrol negatif

Abs= 2,594

Kontrol negatif

Abs= 2,594

Kontrol negatif

Abs= 2,594

Abs % inh Abs % inh Abs % inh

0,1 2,601 -0,28 2,600 -0,25 2,612 -0,70 -0,41 0,25

1 2,600 -0,27 2,599 -0,22 2,605 -0,43 -0,31 0,11

10 2,602 -0,32 2,599 -0,19 2,602 -0,33 -0,28 0,08

100 2,588 0,24 2,588 0,25 2,602 0,81 0,43 0,33

Keterangan: Abs= Absorbansi; % inh= Persen inhibisi; SD: Standar Deviasi.

Sampel

4-Metoksi-β-nitrostirena

Uji 1 Uji 2 Uji 3


Abs= 1,200

Kontrol negatif

Abs= 1,200

Kontrol negatif

Abs= 0,745


0,1 0,765 36,27 0,727 39,39 0,488 34,51 36,73 2,48

1 0,848 29,45 0,850 29,21 0,515 30,89 29,80 0,95

10 0,918 23,52 0,917 23,63 0,553 25,74 24,27 1,24

100 1,296 -7,93 1,269 -5,75 - - -6,8 1,56


77

Natrium diklofenak

Uji 1 Uji 2


Abs= 1,030

Kontrol negatif

Abs= 2,040

Abs % inh Abs % inh

0,1 1,012 1,84 2,013 1,34 1,59 0,36

1 0,994 3,53 1,990 2,45 2,99 0,74

10 0,760 26,23 1,558 23,63 24,93 1,84

100 0,022 97,87 0,062 96,99 97,43 0,62

Keterangan: Abs= Absorbansi; % inh= Persen inhibisi; SD= Standar Deviasi.


Uji 1 Uji 2 Uji 3


Abs= 1,002

Kontrol negatif

Abs= 1,002

Kontrol negatif

Abs= 0,944


0,1 0,676 32,60 0,674 32,8 0,639 32,27 32,56 0,27

1 0,602 39,90 0,597 40,5 0,566 39,98 40,13 0,32

10 0,557 44,40 0,593 40,8 0,538 42,98 42,73 1,81

100 0,449 55,20 0,477 52,4 0,43 54,43 54,01 1,45


78

Lampiran 14. Gambar Bahan Untuk Reaksi Hidrolisis, Reaksi Nitrasi, dan

Uji Anttinflamasi dengan Metode BSA

1. Bahan Reaksi Hidrolisis

EPMS

NaOH Etanol

HCl


79

2. Bahan Reaksi Nitrasi

APMS

Asam Nitrat (65%)

3. Bahan Uji Antiinflamasi dengan Metode BSA

Natrium Diklofenak

Bovine Serum Albumin

Tris Buffer

Aquabidest

Metanol p.a NaCl


80

Asam Asetat Glasial

EPMS

APMS

4-Metoksi-β-nitrostirena


81

Lampiran 15. Gambaran Proses Hidrolisis dan Identifikasi

Penggerusan NaOH

Pelarutan NaOH dalam Etanol

Di stirer sampai larut sempurna

Masukkan APMS

Ukur suhu (60oC)

Identifikasi menggunakan KLT


82

Lampiran 16. Gambaran Proses Nitrasi dan Identifikasi

Penimbangan APMS

Microwave 300 watt, 1 menit

Penambahan aquadest dingin

Setelah penambahan aquadest

dingin

Disaring

Dikering-anginkan

Hasil Nitrasi

Pemurnian dengan kromatografi

kolom Hasil pemurnian:

(1) APMS; (2) Senyawa hasil

nitrasi

1 2


83

Lampiran 17. Gambar Senyawa Hasil Modifikasi

EPMS

APMS

4MBN

Keterangan : EPMS = Etil p-metoksisinamat

APMS = Asam p-metoksisinamat

4MBN = 4-Metoksi-β-nitrostirena

Gambar 1. Hasil Optimasi Nitrasi

Keterangan: (1) 300 watt selama 30 detik; (2) 300 watt selama 1 menit; (3) 300 watt

selama 2 menit; (4) 450 watt selama 2 menit

1 2 3 4


84

Lampiran 18. Gambar Proses Uji Antiinflamasi dengan Metode BSA

Hasil Pengenceran

Adjust pH TBS hingga 6,3

Inkubasi 30 menit di suhu ruang

(27oC)

Panaskan 5 menit pada suhu

72oC

Dibiarkan 25 menit di suhu

ruang (27oC)

Ukur turbiditas dengan menggunakan spektrofotometer Uv-Vis (660 nm)


85

Lampiran 19. Gambar Alat Identifikasi Senyawa

Gambar 1. FTIR

Gambar 2. GCMS


86

(Lanjutan)

Gambar 3. NMR

Gambar 4. DSC

modifikasi struktur senyawa etil p...

Documents