isolasi fraksi aktif antibakteri dari ekstrak etil...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI FRAKSI AKTIF ANTIBAKTERI DARIEKSTRAK ETIL ASETAT BUAH PARIJOTO

(Medinilla speciosa Blume)

SKRIPSI

SYAIMA1111102000056

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATANPROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTAJULI 2015

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI FRAKSI AKTIF ANTIBAKTERI DARIEKSTRAK ETIL ASETAT BUAH PARIJOTO

(Medinilla speciosa Blume)

SKRIPSIDiajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

SYAIMA1111102000056

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATANPROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTAJULI 2015

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya sendiri,

dan semua sumber baikyang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama

I\tIM

Tanda Tangan

Syaima

Tanggal 2 Juli 2015

ilt

HALAN{AN PERSETUJ UAN SKRIPSI

Nama : Syaima

NIVI :1111102000056

Progran'r Stucli : Farnrasi

Judul Skripsi : Isolasi Fraksi Aktif Antibakteri Dari Ekstrak Etil Asetat Buah

Parij oto (.iule cl n il I a Sp e c i o s a BlLrme)

Disetujui oleh :

Pembimbing I Pembimbing II

AW,Puteri Amelia. M.Farm.. Apt

NIP. 1 9801 2042011012004

Ismiami Komala. Ph.D.. Apt

NrP. 1 9870 $A2006042A01

Mengetahui,

Kepala Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ffiYardi. Ph.D.. M.Si." Apt

NrP. 19741 123200801 1014

IV

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Syairna

11i1102000056Farmasi

Isolasi Fraksi Aktif Antibakteri Dari Ekstrak Etil r\setat Buah

Pariioto (lvIe dnill u Sp e c i o s ct Blune)

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterimasebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelarSarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran danIlmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif HidayatullahJakarta.

DEWAN PEI\GUJI

77"Ur^"d

4P,Penguji

Penguji

Skripsi ini diaiukan oleh

Nama

NIMProgram Studi

Judul Skripsi

Pembimbing

Pembimbing

Ditetapkan di : JakartaTanggal :2Juli2015

Puteri Amelia, M.Farm., Apt

Ismiarni Komala, Ph.D., Apt

Drs. Umar Mansur, M.Sc

Eka Putri, M.Si., Apt

(

(

(

vi

ABSTRAK

Nama : Syaima

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Isolasi Fraksi Aktif Antibakteri dari Ekstrak Etil Asetat BuahParijoto (Medinilla speciosa Blume)

Parijoto (Medinilla speciosa Blume) merupakan tanaman obat yang telah banyakdigunakan masyarakat untuk mengobati penyakit sariawan, diare, kolesterol sertasebagai nutrisi bagi ibu hamil. Penelitian terdahulu menyebutkan bahwa ekstraketil asetat buah parijoto memiliki aktivitas antibakteri terbesar dibandingkanekstrak metanol dan n-heksan terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichiacoli. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi ekstrak etil asetat buah parijotodan mengetahui aktivitas antibakteri dari fraksi-fraksi hasil isolasi. Ekstrak etilasetat diperoleh dengan metode maserasi dan partisi. Isolasi fraksi dilakukandengan teknik kromatografi kolom. Fraksi hasil isolasi diuji aktivitas antibakteridengan menggunakan metode bioautografi langsung pada konsentrasi 50 mg/mLterhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Hasil kromatografi kolomdidapatkan 25 fraksi dan dari uji aktivitas 25 fraksi diketahui bahwa 21 fraksiaktif terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, 2 fraksi aktif hanyaterhadap Staphylococcus aureus, dan 2 fraksi aktif hanya terhadap Escherichiacoli. Fraksi 13 mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi terhadap Staphylococcusaureus yaitu sebesar 18,5 mm. Sedangkan fraksi 24 mempunyai aktivitasantibakteri tertinggi terhadap Escherichia coli yaitu sebesar 14,7 mm.

Kata kunci : isolasi, Medinilla speciosa Blume, antibakteri, fraksi, bioautografi.

vii

ABSTRACT

Name : Syaima

Program Study : Pharmacy

Title : Isolation of Active Antibacterial Fraction from Ethyl AcetateExtract Medinilla speciosa Blume

Parijoto (Medinilla speciosa Blume) is an medicinal plant that has widely beenused of society to treat the disease like mouth sores, diarrhea, antihyperlipidemia,and nutrients for pregnant women. The previous research showed that ethylacetate extract of Medinilla speciosa had the most extensive antibacterial activitycompared to methanol extract and n-hexane extract against Staphylococcus aureusand Escherichia coli. This research aimed to isolate ethyl acetate extract ofMedinilla speciosa and to investigate the antimicrobial activity of isolatedfractions. Ethyl acetate extract was obtained with maseration and partitionmethod. Isolation of fractions conducted through the column chromatographytechnique. Fractions were carried out by bioautography thin layer chromatographyat concentration 50 mg/mL against Staphylococcus aureus and Escherichia coli.The results of column chromatography were 25 isolated fractions, andantibacterial test of isolated fractions showed that 21 fractions were active againstStaphylococcus aureus and Escherichia coli, 2 fractions were active againstStaphylococcus aureus only, and 2 fractions were active against Escherichia colionly. Fraction 13 has the highest antibacterial activity to Staphylococcus aureusthat is 18.5 mm. While fraction 24 has the highest antibacterial activity toEscherichia coli that is 14.7 mm.

Keyword : isolation, Medinilla speciosa Blume, antibacterial, fraction,bioautographic

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, pujji syukur saya panjatkan kepada Allah azza wa jalla

yang telah melimpahkan rahmat dan karuniaNya kepada saya. Sholawat serta

salam semoga selalu tercurah kepada junjungan kita Nabi Muhammad SAW.

Berkat rahmat dan pertolongan Allah, saya dapat menyelesaikan penelitian dan

penulisan skripsi yang berjudul “Isolasi Fraksi Aktif Antibakteri dari Ekstrak Etil

Asetat Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume)”. Skripsi ini disusun sebagai

salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi dari Program Studi

Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai

pihak mulai dari masa perkuliahan hingga penyusunan skripsi, sangatlah sulit

untuk menyelesaikan skripsi ini. Dalam kesempatan ini, penulis menyampaikan

terimakasih kepada :

1. Ibu Puteri Amelia, M.Farm., Apt dan Ibu Ismiarni Komala, Ph.D., Apt

selaku dosen pembimbing yang dengan penuh kesabaran telah banyak

memberikan bimbingan, arahan, ilmu, waktu, tenaga, dan semangat selama

proses penyelesaiian penelitian ini.

2. Prof. Dr. Arief Sumantri S.KM, M.KM selaku Dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan motivasi dan dukungan.

4. Bapak dan Ibu dosen pengajar Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

yang telah banyak memberikan ilmu dan teladan selama masa perkuliahan.

5. Kedua orang tua terkasih, Abi Farid Ahmad Okbah dan Mama Jamilah

Ganis atas kasih sayang, dukungan, semangat, doa yang tiada henti, serta

bimbingan dan teladan yang baik. Semoga selalu dalam lindungan Allah.

ix

6. Adik-adik dan kakak-kakak yang saya sayangi, Ahmad Fatih, Kamal, Afaf,

Ibrahim, dan Yusuf yang selalu mendukung, memberikan semangat,

hiburan, dan doa yang saya butuhkan.

7. Sahabat-sahabat yang mendampingi hari-hari saya selama 3 tahun,

Umniyaty Mufidah dan Athirotin Halawiyah, yang telah banyak

memberikan semangat, motivasi, dukungan, nasihat-nasihat yang

membangun, serta kepada M.Saiful Amin yang telah banyak membantu

dalam proses pengerjaan penelitian ini.

8. Keluarga Akademi Thibbun Nabawi angkatan 5 yang selalu mendukung,

mendoakan, memberikan hiburan. Semoga kebersamaan dan kekeluargaan

ini terus terjalin.

9. Teman-teman seperjuangan Farmasi angkatan 2011 atas persaudaraan dan

pertemanan yang berkesan selama 4 tahun ini.

10. Pihak-pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu

kelancaran pengerjaan skripsi ini.

Semoga Allah azza wa jalla membalas kebaikan semua pihak yang telah

membantu. Akhirnya dengan segala kerendahan hati, penulis berharap kritik

dan saran atas kekurangan dan keterbatasan penelitian ini. Semoga hasil

penelitian ini bermanfaat untuk banyak pihak dan perkembangan ilmu

pengetahuan.

Ciputat, Juli 2015

Penulis

Nama

NIM

Prograrn Studi

Fakultas

Jenis Karya

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Univsrsitas Islam Negeri (U$D Syarif Hidayatullah

Jakarta saya yang bertandatangan di bawah ini :

Syaima

1111102000056

Farmasi

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Skripsi

Yang menyatakan,

ffiArlY,t*"i

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi&arya ilmiah

saya,.dengan judul :

ISOLASI FRAKSI AKTIX'AI\TTIBAKTERI DARI EKSTRAK ETIL

ASETAT BUAH PARIJOTO (Medinilh speciosa Blume)

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lainnya yutu DigttalLibrary Perpustakaan Universitas Islaur Negeri (utr$) Syarif Hidayatullah Jakartauntuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.Demikian pemyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenanrya.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : 2 Juli 2015

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL................................................................................. iiHALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .................................... iiiHALAMAN PERSETUJUAN SKRIPSI ................................................ ivHALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI.................................................. vABSTRAK ................................................................................................. viABSTRACT ................................................................................................ viiKATA PENGANTAR............................................................................... viiiHALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.............. xDAFTAR ISI.............................................................................................. xiDAFTAR GAMBAR................................................................................. xiiiDAFTAR TABEL ..................................................................................... xivDAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xv

BAB 1 PENDAHULUAN ......................................................................... 11.1 Latar Belakang .......................................................................... 11.2 Perumusan Masalah.................................................................. 31.3 Tujuan Penelitian...................................................................... 31.4 Manfaat Penelitian..................................................................... 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA............................................................... 42.1 Tanaman Medinilla speciosa Blume......................................... 42.2 Simplisia.................................................................................... 62.3 Ekstraksi.................................................................................... 62.4 Tinjauan Bakteri........................................................................ 92.5 Media Pertumbuhan Bakteri..................................................... 142.6 Antibakteri................................................................................ 162.7 Uji Aktivitas Antibakteri.......................................................... 182.8 Kromatografi............................................................................. 202.9 Pemurnian Isolat........................................................................ 232.10 Uji Kemurnian......................................................................... 242.11 Identifikasi Struktur Senyawa................................................. 25

BAB 3 METODOLOGI KERJA............................................................. 283.1 Tempat dan Waktu Penelitian.................................................... 283.2 Alat dan Bahan.......................................................................... 283.3 Cara Kerja.................................................................................. 29

3.3.1 Penyiapan Simplisia................................................... 293.3.2 Pembuatan dan Partisi Ekstrak................................... 293.3.3 Skrining Fitokimia...................................................... 303.3.4 Penetapan Kadar Air Ekstrak..................................... 31

xii

3.3.5 Isolasi dan Pemurnian Ekstrak................................... 323.4.5.1 Kromatografi Kolom................................... 323.4.5.2 KLT............................................................. 333.4.5.3 Rekristalisasi................................................ 33

3.3.6 Pewarnaan Gram......................................................... 343.3.7 Uji Aktivitas Antibakteri............................................ 343.3.8 Uji Kemurnian Senyawa............................................. 36

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 374.1 Pemeriksaan Simplisia ............................................................. 374.2 Penyiapan Simplisia ................................................................. 374.3 Ekstraksi dan Partisi ................................................................. 374.4 Pengukuran Kadar Air Ekstrak Etil Asetat .............................. 394.5 Uji Penapisan Fitokimia Ekstrak Etil Asetat ............................ 394.6 Isolasi Senyawa Menggunakan Kromatrografi Kolom............ 404.7 Uji Bioautografi Non-Elusi Fraksi ........................................... 434.8 Pemurnian dan Uji Kemurnian Fraksi 9................................... 514.9 Uji Bioautografi Elusi Fraksi 9 ................................................ 52

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN..................................................... 565.1 Kesimpulan................................................................................ 565.2 Saran.......................................................................................... 56

DAFTAR PUSTAKA................................................................................ 57

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Pohon dan Buah Medinilla speciosa.................................. 5Gambar 2.2 Rumus bangun Kloramfenikol........................................... 17Gambar 4.1 Profil KLT eluat hasil fraksinasi dari ekstrak etil asetat

dengan kromatrografi kolom ............................................. 41Gambar 4.2 Profil KLT fraksi gabungan............................................... 42Gambar 4.3 Hasil pewarnaan Gram bakteri S.aureus dan E.coli di

bawah mikroskop perbesaran 100 x 10 ............................. 44Gambar 4.4 Hasil uji bioautografi dari ekstrak etil asetat terhadap

bakteri S.aureus dan E.coli ................................................ 48Gambar 4.5 Profil KLT fraksi 9 sebelum rekristalisasi......................... 51Gambar 4.6 Profil KLT 2 dimensi fraksi 9 setelah rekristalisasi .......... 52Gambar 4.7 Hasil uji bioautografi elusi fraksi 9 terhadap S.aureus

dan E.coli ........................................................................... 53Gambar 4.8 Diagram hasil uji bioautografi 25 fraksi............................ 54

xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1 Perbedaan ciri-ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif 10Tabel 4.1 Hasil rendemen ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol . 38Tabel 4.2 Hasil uji penapisan fitokimia ekstrak etil asetat .................. 39Tabel 4.3 Hasil uji bioautografi fraksi dari ekstrak etil asetat

terhadap bakteri S.aureus dan E.coli ................................... 46

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil determinasi tanaman Medinilla speciosa Blume ... 63Lampiran 2. Bagan alur penelitian....................................................... 64Lampiran 3. Bagan alur kerja ekstraksi dan partisi buah Medinilla

speciosa ........................................................................... 65Lampiran 4. Bagan kerja fraksinasi dengan kromatografi kolom ....... 66Lampiran 5. Bobot masing-masing fraksi hasil kromatografi kolom.. 67Lampiran 6. Data profil KLT eluat hasil fraksinasi dari ekstrak etil

asetat dengan kromatrografi kolom................................. 68Lampiran 7. Bagan alur kerja uji antibakteri dengan metode

bioautografi ..................................................................... 69Lampiran 8. Hasil skrining fitokimia .................................................. 70

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Penyakit infeksi merupakan salah satu masalah kesehatan dengan

prevalensi yang cukup tinggi di Indonesia. Infeksi adalah proses invasif oleh

mikroorganisme dan berproliferasi di dalam tubuh yang menyebabkan sakit

(Potter & Perry, 2005). Infeksi dapat disebabkan oleh virus, jamur, parasit, dan

bakteri. Bakteri patogen yang sering menyebabkan infeksi pada manusia

diantaranya adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Infeksi oleh

S.aureus ditandai dengan kerusakan jaringan yang disertai abses bernanah.

Beberapa penyakit infeksi yang disebabkan oleh S. aureus adalah bisul, jerawat,

impetigo, dan infeksi luka. Infeksi yang lebih berat diantaranya pneumonia,

mastitis, plebitis, meningitis, infeksi saluran kemih, osteomielitis, dan

endokarditis. S. aureus juga merupakan penyebab utama infeksi nosokomial,

keracunan makanan, dan sindroma syok toksik (Ryan, et al., 1994; Warsa, 1994).

Infeksi yang disebabkan oleh E.coli adalah infeksi saluran kemih, diare, sepsis,

dan meningitis (Jawetz et al., 1996).

E. coli adalah bakteri yang merupakan anggota flora normal usus. E. coli

berperan penting dalam sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu,

asam-asam empedu dan penyerapan zat-zat makanan. E. coli menjadi patogen jika

jumlah bakteri ini dalam saluran pencernaan meningkat atau berada di luar usus

(Jawetz et al., 1996). Pengobatan infeksi dilakukan dengan pemberian antibiotik,

tetapi banyak bakteri yang telah resisten terhadap antibiotik sehingga perlu

dilakukan pencarian antibakteri baru.

Penelitian-penelitian pencarian bahan antibakteri telah banyak dilakukan

terutama dari berbagai jenis tumbuhan. Para ilmuwan terus berusaha untuk

mencari sumber antibakteri baru. Tumbuhan yang digunakan untuk obat

tradisional dapat dijadikan alternatif pencarian zat antibakteri, karena pada

umumnya memiliki senyawa aktif yang berperan dalam bidang kesehatan (Zuhud,

2001).

2


Tumbuhan dikenal mengandung berbagai golongan senyawa kimia

tertentu sebagai bahan obat yang mempunyai efek fisiologis terhadap organisme

lain, atau sering disebut sebagai senyawa bioaktif. Kurang lebih 80% obat-obatan

yang digunakan oleh masyarakat Indonesia berasal dari tumbuhan obat. Telah

banyak senyawa aktif asal tumbuhan yang memasuki aplikasi komersial untuk

berbagai kegunaan. Senyawa alam hasil isolasi dari tumbuhan, juga digunakan

sebagai bahan asal untuk sintesis bahan-bahan biologis aktif dan sebagai senyawa

model untuk merancang senyawa baru yang lebih aktif dengan sifat toksik yang

lebih rendah (Sasongko, 2002).

Indonesia merupakan negara dengan kekayaan alam yang melimpah.

Hampir segala jenis tumbuhan dapat tumbuh di wilayah negara ini. Wilayah hutan

tropika Indonesia memiliki keanekaragaman hayati tertinggi ke-2 di dunia setelah

Brazil. Sebanyak 40.000 jenis flora yang ada di dunia, terdapat 30.000 jenis dapat

dijumpai di Indonesia dan 940 jenis diantaranya diketahui berkhasiat sebagai obat

dan telah dipergunakan dalam pengobatan tradisional secara turun-temurun oleh

berbagai etnis di Indonesia. Jumlah tumbuhan obat tersebut sekitar 90% dari

jumlah tumbuhan obat yang terdapat dikawasan Asia (Masyhud, 2010).

Popularitas dan perkembangan obat tradisional semakin meningkat seiring

dengan slogan “kembali ke alam” yang kian menggema sehingga banyak yang

tertarik untuk mengeksporasi manfaat tumbuhan negeri ini. Diantara tumbuhan

yang digunakan dan diteliti adalah buah parijoto (Medinilla speciosa Blume) yang

merupakan anggota famili Melastomataceae. Buah parijoto merupakan tanaman

khas dari Desa Colo Kecamatan Dawe Kabupaten Kudus Jawa Tengah.

M.speciosa tumbuh liar di lereng-lereng gunung atau di hutan-hutan dan kadang

dibudidayakan sebagai tanaman hias (Wibowo,dkk., 2012).

Buah parijoto telah digunakan secara empiris untuk mengobati penyakit

sariawan, diare, kolesterol serta sebagai nutrisi bagi ibu hamil (Anonim, 2013).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Wachidah (2013), ekstrak buah

parijoto memiliki berbagai kandungan kimia, seperti: saponin, glikosida,

flavonoid, dan tannin. Flavonoid, saponin, dan tanin dapat menghambat

pertumbuhan bakteri. (Mojab, 2008 ; Ajizah, 2004).

3


Pada penelitian sebelumnya (Mukarromah, 2015) telah dilaporkan bahwa

ekstrak etil asetat buah parijoto memiliki aktivitas antibakteri paling besar

terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dibandingkan

dengan ekstak metanol atau ekstak n-heksan buah parijoto. Oleh karena itu, sangat

perlu untuk melakukan isolasi dari ekstak etil asetat buah parijoto.

1.2.Rumusan Masalah

Rumusan masalah yang mendasari penelitian ini adalah manakah diantara

fraksi-fraksi hasil isolasi dari ekstrak etil asetat buah parijoto yang menunjukkan

aktivitas antibakteri terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

1.3.Tujuan Penelitian

Tujuan yang diharapkan dari penelitian ini adalah memberikan informasi

mengenai aktvitas antibakteri dari fraksi-fraksi hasil isolasi ekstrak etil asetat buah

parijoto terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.

1.4. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat menjadi salah satu sumber informasi

ilmiah mengenai aktivitas antibakteri dari buah Medinilla speciosa Blume yang

berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan dan menjadi dasar informasi untuk

penelitian selanjutnya.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tanaman Medinilla speciosa Blume

2.1.1. Klasifikasi Tanaman

Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)

Super divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)

Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua /dikotil)

Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Myrtales

Famili : Melastomataceae

Genus : Medinilla

Spesies : Medinilla speciosa Blume

(www.plantamor.com)

2.1.2. Morfologi Tanaman

Parijoto merupakan tanaman perdu dengan tinggi 1-2 m, batang bulat,

kulit dengan lapisan gabus jika tua, bergerigi, kasar, putih kecoklatan; daun

tunggal, bersilang berhadapan, tangkai pendek, bulat, lunak, warna ungu

kemerahan, helaian daun berbentuk lonjong, pangkal dan ujung runcing, tepi rata,

panjang 10-20 cm, lebar 5-15 cm, pertulangan melengkung, permukaan atas licin,

berwarna hijau, permukaan bawah kasar, warna hijau kelabu; bunga majemuk, di

ketiak daun, sempurna, berkelamin ganda, kelopak 5 helai, ujung runcing, pangkal

berlekatan, panjang 3-8 mm, warna ungu tua, benang sari 2 kali lipat jumlah

mahkota, kepala sari berupa kuncup membengkok, warna merah keunguan, kepala

putik duduk di atas bakal buah, kepala putik bulat, ungu, mahkota lepas, 5 helai,

bentuk kuku, panjang 5-8 mm, warna merah muda; buah buni, bulat, bagian ujung

berbenjol bekas pelekatan kelopak, diameter 5-8 mm, warna merah keunguan; biji

bulat, jumlah banyak, kecil, putih; akar serabut, putih kotor (Anonim, 2013).

5


(a) (b)

Gambar 2.1 Pohon (a) dan Buah (b) Medinilla speciosa

(Sumber : Koleksi pribadi)

2.1.3. Tempat Tumbuh

Medinilla speciosa merupakan tumbuhan liar di lereng-lereng gunung atau

di hutan-hutan dan kadang dibudidayakan sebagai tanaman hias. Tumbuhan ini

tumbuh baik pada tanah yang berhumus tinggi dan lembab, pada ketinggian 800

m sampai 2.300 m di atas permukaan laut. Berbunga pada bulan November –

Januari dan waktu panen yang tepat bulan Maret – Mei (Anonim, 2013).

2.1.4. Khasiat

Secara tradisional buah parijoto digunakan sebagai obat sariawan,

antiradang dan antibakteri (Anonim, 2013). Parijoto dipercaya oleh masyarakat di

daerah Gunung Merapi dapat meningkatkan kesuburan janin dan kesehatan ibu

(Anggana, 2011).

2.1.5. Kandungan Kimia

Buah parijoto memiliki berbagai kandungan kimia yaitu: saponin,

glikosida, flavonoid, dan tannin (Wachidah, 2013). Flavonoid yang merupakan

senyawa fenol dapat menyebabkan penghambatan terhadap sintesis dinding sel

(Mojab et al., 2008). Flavonoid yang merupakan senyawa fenol dapat bersifat

koagulator protein (Dwijoseputro, 1994). Protein yang menggumpal tidak akan

dapat berfungsi lagi sehingga akan mengganggu pembentukan dinding sel bakteri.

6


Pada konsentrasi yang biasa digunakan (larutan dalam air 1-2%), fenol dan

derivatnya menimbulkan denaturasi protein (Jawetz et al., 1996). Saponin

merupakan zat hemolitik yang kuat serta memiliki sifat seperti sabun. Saponin

juga bersifat spermisida, antimikrobia, antiperadangan dan memiliki aktivitas

sitotoksik (Tjay dan Rahardja, 2002).

Kandungan senyawa kimia lain, yaitu tanin, mempunyai sifat sebagai

pengelat berefek spasmolitik, yang dapat mengerutkan membran sel sehingga

mengganggu permeabilitas sel. Akibat terganggunya permeabilitas, sel tidak dapat

melakukan aktivitas hidup sehingga pertumbuhannya terhambat atau bahkan mati.

Efek antibakteri tanin antara lain melalui reaksi dengan membran sel, inaktivasi

enzim dan destruksi atau inaktivasi fungsi materi genetik (Ajizah, 2004).

2.2. Simplisia (Depkes, 2000)

Simplisia adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang

belum mengalami pengolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain, berupa

bahan yang dikeringkan. Simplisia dibedakan menjadi simplisia nabati, simplisia

hewani dan simplisia mineral. Simplisia nabati adalah simplisia yang berupa

tumbuhan utuh, bagian tumbuhan atau eksudat tumbuhan.

Eksudat tumbuhan adalah isi sel yang secara spontan keluar dari tumbuhan

atau isi sel yang dengan cara tertentu dikeluarkan dari selnya, atau senyawa nabati

lainnya yang dengan cara tertentu dipisahkan dari tumbuhannya dan belum berupa

senyawa kimia murni.

2.3. Ekstraksi

2.3.1. Pengertian Ekstraksi dan Ekstrak

Ekstraksi merupakan pemisahan zat berkhasiat yang terkandung dalam

jaringan tumbuhan atau hewan dari komponen inaktif atau inert menggunakan

pelarut selektif (Handa, 2008). Hasil dari ekstraksi disebut ekstrak. Menurut FI

IV, ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif

dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai,

kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan.

7


Ekstrak dikelompokan atas dasar sifatnya, yaitu (Voight, 1995) :

a. Ekstrak encer adalah sediaan yang memiliki konsistensi semacam madu

dan dapat dituang.

b. Ekstrak kental adalah sediaan yang dilihat dalam keadaan dingin dan tidak

dapat dituang. Kandungan airnya berjumlah sampai 30%.

c. Ekstrak kering adalah sediaan yang memiliki konsistensi kering dan

mudah dituang, sebaiknya memiliki kandungan lembab tidak lebih dari

5%.

d. Ekstrak cair adalah ekstrak yang dibuat sedemikiannya sehingga 1 bagian

simplisia sesuai dengan 2 bagian ekstrak cair.

2.3.2. Metode Ekstraksi

Metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut terdiri dari 2 cara, yaitu :

A. Ekstraksi dengan Cara Dingin

1. Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi dengan cara merendam simplisia dengan

pelarut tertentu dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada

temperatur ruangan. Jumlah pelarut yang dipakai tergantung pada banyaknya

sampel. Cara ini dapat menarik zat-zat berkhasiat yang tidak tahan pemanasan

(Depkes, 2000).

Maserasi merupakan cara ekstraksi yang paling sederhana. Dasar dari

maserasi adalah melarutnya bahan kandungan simplisia dari sel yang rusak, yang

terbentuk pada saat penghalusan, ekstraksi (difusi) bahan kandungan dari sel yang

masih utuh. Setelah selesai waktu maserasi, artinya keseimbangan antara bahan

yang diekstraksi pada bagian dalam sel dengan masuk ke dalam cairan, telah

tercapai maka proses difusi segera berakhir. Selama maserasi, tujuan

dilakukannya pengocokan berulang adalah untuk menjamin keseimbangan

konsentrasi bahan ekstraksi yang lebih cepat di dalam cairan. Keadaan diam

selama maserasi menyebabkan turunnya perpindahan bahan aktif. Semakin besar

perbandingan simplisia terhadap cairan pengekstraksi, akan semakin banyak hasil

yang diperoleh (Voight, 1995).

8


2. Perkolasi

Perkolasi adalah proses ekstraksi menggunakan alat perkolator yang

dilakukan dengan cara mengalirkan cairan pelarut organik pada sampel yang

sebelumnya telah dibasahi. Prinsip dari metode perkolasi adalah pelarut yang

telah jenuh yang berada di dalam perkolator akan digantikan oleh pelarut yang

lebih baru dan segar. Ekstraksi ini membutuhkan pelarut yang lebih banyak

(Depkes, 2000).

B. Ekstraksi dengan Cara Panas

1. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,

selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan

adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu

pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna

(Depkes, 2000).

2. Sokhlet

Soklet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru, umumnya

dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi terus menerus dengan

jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Dalam metode ini,

simplisia diletakkan di dalam kantong yang terbuat dari kertas saring dan

ditempatkan dalam alat Sokhlet. Pelarut dipanaskan sampai menguap dan uap

yang dihasilkan akan mengalami kondensasi dan mengekstraksi simplisia

(Depkes, 2000 dan Handa, 2008).

3. Digesti

Digesti merupakan metode maserasi kinetik (dengan pengadukan terus

menerus) yang menggunakan temperatur hangat yaitu 30-40 0C selama proses

ekstraksinya. Metode ini digunakan untuk sampel yang pada suhu kamar tidak

tersari dengan baik (Depkes, 2000 dan Handa, 2008).

4. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98 0C)

9


selama waktu tertentu (15-20 menit). Infus dapat dikatakan sebagai metode

modifikasi dari maserasi (Singh, 2008).

5. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih dan pada temperatur sampai

titik didih air (Depkes, 2000). Metode ini digunakan untuk mengekstraksi zat

yang larut air dan stabil terhadap pemanasan.

2.4. Tinjauan Bakteri

2.4.1. Karakteristik Bakteri

Bakteri adalah sekelompok mikroorganisme yang bersel satu, tidak

berklorofil, berkembang biak dengan pembelahan diri, dan sangat kecil hingga

hanya terlihat dengan bantuan mikroskop (Dwidjoseputro, 1994).

Ada beberapa bentuk dasar bakteri yaitu (Pratiwi, 2008) :

1. Bulat (cocus atau cocci)

2. Batang atau silinder (bacillus atau bacilli)

3. Spiral

Umumnya bakteri adalah monomorfik (memiliki hanya satu bentuk)

namun ada bakteri tertentu yang memiliki banyak bentuk (pleomorfik) misal

bentuk iregular pada termoplasma. Sebagian besar bakteri memiliki diameter

dengan ukuran 0,2-2,0 mm dan panjang berkisar 2-8 mm. Biasanya sel-sel bakteri

muda berukuran jauh lebih besar daripada sel-sel yang tua. Bentuk dan ukuran

suatu bakteri dapat dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti temperatur

inkubasi, umur kultur, dan komposisi media pertumbuhan (Pratiwi, 2008).

2.4.2. Bakteri Gram Positif dan Negatif

Berdasarkan pewarnaan Gram, bakteri dapat dibedakan menjadi dua

golongan, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Contoh bakteri

Gram positif diantaranya adalah Staphyloccocus aureus dan Bacillus subtilis.

Sedangkan bakteri Gram negatif diantaranya adalah E.coli dan Pseudomonas.

10


Tabel 2.1. Perbedaan ciri-ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif

Ciri Gram Positif Gram Negatif

Struktur dinding selTebal (15 – 80 nm) Tipis (10 – 15 nm)

Berlapis tunggal Berlapis tiga

Komposisi dinding sel

Kandungan lipid rendah

(1 – 4%)

Kandungan lipid tinggi

(11 – 22%)

Peptidoglikan ada sebagai

lapisan tunggal,

komponen utama

merupakan lebih dari

50% berat kering pada

beberapa sel bakteri

Peptidoglikan ada di

dalam lapisan kaku

sebelah dalam, jumlahnya

sedikit merupakan sekitar

10% berat kering.

Ada asam tekoat Tidak ada asam tekoat

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada banyak

spesies

Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik

Lebih resisten Kurang resisten

(Pelczar et al, 1998)

2.4.3. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang digunakan

untuk mengidentifikasi bakteri. Pewarnaan Gram menggunakan lebih dari satu

pewarna dan memiliki reaksi yang berbeda untuk setiap jenis bakteri, sehingga

dapat membedakan dua kelompok besar bakteri yaitu Gram positif dan Gram

negatif (Pratiwi, 2008).

Pada pewarnaan Gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga

membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu kristal

violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut

pewarna primer. Selanjutnya pewarna dicuci dan pada noda spesimen ditetesi

iodin yang merupakan mordant (penajam). Setelah iodin dicuci, baik bakteri

Gram positif maupun bakteri Gram negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya

noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan agen peluntur warna yang

11


pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah

alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan

pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke

dalam Gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke

dalam Gram negatif (Pratiwi, 2008).

Perbedaan warna yang terjadi disebabkan oleh adanya perbedaan struktur

pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung

peptidoglikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung

lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakeri

Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan

yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram negatif alkohol akan

merusak lapisan lipopolisakarida sehingga kompleks kristal violet-iodin dapat

tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna

merah setelah diberi safranin (Pratiwi, 2008).

2.4.4. Pertumbuhan Bakteri

Pertumbuhan bakteri adalah peningkatan semua komponen sel, sehingga

menghasilkan peningkatan ukuran sel dan jumlah sel yang akan menyebabkan

peningkatan jumlah individu di dalam populasi. Inokulum hampir selalu

mengandung ribuan organisme, pertumbuhan menyatakan pertambahan jumlah

atau massa melebihi yang ada di dalam inokulum asalnya (Pelczar et al, 1998).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri, yaitu (Nurwanto, 1997) :

1. Suhu

Bakteri tumbuh pada suhu biasa/umum seperti halnya organisme lainnya.

Kebanyakan bakteri tumbuh pada kisaran suhu tertentu, sekitar 30 0C. Spesies

bakteri dapat tumbuh pada suhu minimum, optimum, dan maksimum tertentu.

Suhu minimum : suhu terendah untuk bakteri tetap dapat hidup.

Suhu optimum : suhu dimana bakteri tumbuh dengan baik.

Suhu maksimum : suhu tertinggi untuk bakteri tetap dapat hidup.

12


Berdasarkan faktor suhu, bakteri dibagi dalam 3 kelompok :

• Psikrofil, hidup pada suhu dingin, di bawah 20 0C, optimum 15 0C.

• Mesofil, hidup pada suhu antara 10-45 0C.

• Termofil, hidup pada suhu tinggi 40-60 0C.

2. pH

Kebanyakan bakteri tumbuh pada kisaran sempit, pH mendekati netral

(6,5-7,5). Sedikit bakteri yang tumbuh pada pH asam dibawah 4, tetapi ada bakteri

bahkan dapat hidup pada pH 1. Keperluan akan pH tertentu ini digunakan untuk

mengisolasi bakteri. Untuk mengatur pH dapat ditambahkan HCl, KOH atau

NaOH.

3. Tekanan osmosis

Air merupakan bahan yang sangat penting bagi pertumbuhan bakteri

karena 80%-90% bakteri tersusun dari air. Tekanan osmosis sangat diperlukan

untuk mempertahankan bakteri agar tetap hidup. Apabila bakteri berada dalam

larutan yang konsentrasinya lebih tinggi daripada konsentrasi yang ada dalam sel

bakteri, maka cairan dari sel akan keluar melalui membran sitoplasma yang

disebut plasmolisis.

4. Oksigen

Berdasarkan kebutuhan oksigen sebagai akseptor elektron, bakteri dapat

dibedakan menjadi dua golongan, yaitu bakteri aerob dan anaerob. Bakteri aerob

adalah bakteri yang dapat menggunakan oksigen sebagai sumber akseptor

elektron terakhir dalam proses bioenerginya. Sebaliknya, bakteri anaerob adalah

bakteri yang tidak dapat menggunakan oksigen sebagai sumber akseptor elektron

dalam proses bioenerginya.

Berdasarkan kebutuhan oksigen, maka bakteri dapat diklasifikasikan dalam empat

kelompok :

a. Aerob, yaitu bakteri hanya dapat tumbuh apabila ada oksigen bebas.

b. Anaerob, yaitu bakteri hanya dapat tumbuh jika tidak ada oksigen bebas.

c. Anaerob fakultatif, yaitu bakteri yang dapat hidup dalam lingkungan dengan

atau tanpa oksigen bebas.

13


d. Mikroaerofil, yaitu bakteri yang dapat tumbuh apabila ada oksigen dalam

jumlah kecil.

2.4.5. Bakteri yang Digunakan dalam Penelitian

2.4.5.1. Escherichia coli

Klasifikasi Escherichia coli (Krieg, 1984):

Divisio : Protophyta

Kelas : Shizomycetes

Ordo : Eubacteriaceae

Famili : Enterobacteriaceae

Suku : Escherichiaeae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif non spora berbentuk

batang pendek yang memiliki panjang sekitar 2 µm, diameter 0,7 µm, lebar sekitar

0,4-0,7µm dan bersifat anaerob fakultatif. E. coli membentuk koloni yang bundar,

cembung, dan halus dengan tepi yang nyata (Smith-Keary, 1988 ; Jawetz et al.,

1996). Suhu optimum pertumbuhan adalah 37 0C.

E. coli adalah anggota flora normal usus. E. coli berperan penting dalam

sintesis vitamin K, konversi pigmen-pigmen empedu, asam-asam empedu dan

penyerapan zat-zat makanan. E. coli termasuk ke dalam bakteri heterotrof yang

memperoleh makanan berupa zat oganik dari lingkungannya karena tidak dapat

menyusun sendiri zat organik yang dibutuhkannya. Zat organik diperoleh dari sisa

organisme lain. Bakteri ini menguraikan zat organik dalam makanan menjadi zat

anorganik, yaitu CO2, H2O, energi, dan mineral. Di dalam lingkungan, bakteri

pembusuk ini berfungsi sebagai pengurai dan penyedia nutrisi bagi tumbuhan

(Ganiswarna, 1995).

E. coli menjadi patogen jika jumlah bakteri ini dalam saluran pencernaan

meningkat atau berada di luar usus. E. coli menghasilkan enterotoksin yang

menyebabkan beberapa kasus diare. E. coli berasosiasi dengan enteropatogenik

menghasilkan enterotoksin pada sel epitel (Jawetz et al., 1996).

14


2.4.5.2. Staphylococcus aureus

Klasifikasi Staphylococcus aureus :

Divisio : Protophyta

Class : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Famili : Micrococcaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Stapylococcus aureus

(Dwijoseputro, 1994)

S. aureus adalah bakteri berbentuk bulat, bersifat Gram positif, biasanya

tersusun dalam rangkaian tidak beraturan seperti buah anggur. Beberapa

diantaranya tergolong flora normal pada kulit dan selaput mukosa manusia,

menyebabkan penanahan, abses, berbagai infeksi piogen dan bahkan septikimia

yang fatal. S. aureus mengandung polisakarida dan protein yang berfungsi sebagai

antigen dan merupakan substansi penting di dalam struktur dinding sel, tidak

membentuk spora, dan tidak membentuk flagel (Jawetz et al., 1996).

S. aureus tumbuh dengan baik pada berbagai media bakteriologik dibawah

suasana aerobik atau mikro-aerobik. Tumbuh dengan cepat pada temperatur 37 0C

dan pH 7,4 namun pembentukan pigmen yang terbaik adalah pada temperatur

kamar (20-35 oC) (Jawetz et al., 1996).

2.5. Media

Media adalah bahan atau campuran bahan yang digunakan untuk

menumbuhkan dan mengembangbiakkan bakteri. Media yang digunakan harus

dalam keadaan steril, artinya sebelum ditumbuhi bakteri yang dimaksud, tidak

ditumbuhi bakteri lain yang tidak diharapkan (Dwijosaputro, 1994).

Media yang paling baik bagi pemeliharaan bakteri adalah media yang

mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa

makanan, atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. Media buatan manusia

dapat berupa (Dwijosaputro, 1994):

15


a. Media cair

Media cair yang biasa dipakai adalah kaldu yang dibuat dengan kombinasi

air murni, kaldu daging lembu dan pepton. Pepton mengandung banyak N2,

sedangkan kaldu berisi garam-garam mineral. pH medium diatur menjadi sedikit

asam atau netral yaitu pada pH 6,8-7 yang disesuaikan untuk kebanyakan bakteri.

Kaldu kemudian disaring dengan kertas saring kemudian dimasukkan ke dalam

tabung dan disumbat dengan kapas. Kemudian barulah dimasukan ke autoklaf.

b. Media padat

Media padat dibuat dari kaldu yang dicampur dengan sedikit agar-agar,

kemudian disterilkan, dan dibiarkan mendingin hingga menjadi media padat.

Agar-agar ialah sekedar zat pengental dan bukan zat makanan bagi bakteri.

Gelatin dapat juga digunakan sebagai zat pengental, tetapi gelatin mencair pada

suhu 23oC sehingga tidak dapat diletakkan pada suhu ruangan.

c. Media diperkaya

Beberapa bakteri memerlukan zat makanan tambahan berupa serum atau

darah yang tidak mengandung fibrinogen. Fibrinogen adalah zat yang

menyebabkan darah menjadi kental apabila keluar di luka. Serum atau darah

dicampurkan ke dalam media yang sudah disterilkan. Jika pencampuran dilakukan

sebelum sterilisasi, maka serum atau darah akan mengental akibat pemanasan.

d. Media kering

Media ini berupa serbuk kering yang dilarutkan dalam air lalu disterilkan.

Pada media ini tidak perlu dilakukan pemeriksaan pH karena sudah dilakukan

pada waktu pembuatan serbuk.

e. Media sintetik

Media sintetik berupa ramuan-ramuan zat organik yang mengandung zat

karbon dan nitrogen. Bakteri autotrof dapat hidup dalam media ini. Bakteri

saprofit juga dapat hidup dalam media ini, tetapi perlu penambahan natrium sitrat

dan natrium amonium fosfat yang merupakan sumber karbon dan sumber

nitrogennya.

16


2.6. Antibakteri

Antibakteri adalah zat yang membunuh bakteri atau menekan

pertumbuhan dan reproduksi bakteri (Volk, dkk,. 1993). Berdasarkan jenis daya

tahan kerjanya terhadap bakteri, zat antibakteri dibagi dalam dua kelompok yaitu

bakteriostatik dan bakterisidal. Zat bakterisidal adalah zat-zat yang dapat

membunuh bakteri, sedangkan zat bakteriostatik hanya menghambat pertumbuhan

bakteri (Irianto, 2006).

Macam-macam mekanisme aksi antibakteri adalah (Pratiwi, 2008) :

1. Menghambat sintesis dinding sel

Penghambatan dilakukan dengan cara merusak lapisan peptidoglikan yang

menyusun dinding sel bakteri Gram positif maupun Gram negatif.

2. Merusak membran plasma

Antibakteri bekerja dengan mengubah permeabilitas membran plasma sel

bakteri. Membran plasma bersifat semipermeabel dan mengendalikan transpor

berbagai metabolit ke dalam dan ke luar sel. Adanya gangguan atau kerusakan

pada membran plasma akan menghalangi proses osmosis dan proses biosintesis

dalam membran.

3. Menghambat sintesis protein

Membunuh bakteri dengan cara menghambat sintesis protein sehingga

bakteri tidak mampu mensintesis protein yang penting untuk pertumbuhannya.

4. Menghambat sintesis asam nukleat

Antibakteri bekerja dengan cara menghambat proses transkripsi dan

replikasi bakteri.

5. Menghambat sintesis metabolit esensial

Sintesis metabolit esensial bisa dihambat dengan antimetabolit yang

merupakan kompetitor substrat normal dari enzim pemetabolisme.

17


2.6.1. Antibakteri yang Digunakan Sebagai Kontrol Positif

Kloramfenikol yang digunakan sebagai kontrol positif, memiliki

karakteristik sebagai berikut (Ditjen POM, 1979):

Rumus Bangun :

Gambar 2.2. Rumus bangun kloramfenikol

Rumus molekul : C11H12Cl2N2O5

Pemerian : Merupakan hablur halus berbentuk jarum atau

lempeng memanjang; putih sampai putih kelabu atau putih kekuningan;

tidak berbau; rasa sangat pahit.

Kelarutan : Larut dalam lebih kurang 400 bagian air, dalam

2,5 bagian etanol (95%) P dan dalam 7 bagian propilenglikol P; sukar

larut dalam kloroformP dan dalam eter.

Kloramfenikol merupakan antibiotik berspektrum luas yang dapat

menghambat atau membunuh bakteri dari golongan Gram positif maupun

Gram negatif. Kloramfenikol bekerja dengan cara bereaksi pada sub unit 50S

ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase. Enzim ini

berfungsi untuk membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang

masih melekat pada tRNA dengan asam amino terakhir yang sedang

berkembang. Sebagai akibatnya, sintesis protein bakteri akan terhenti seketika

dan menyebabkan bakteri mati (Pratiwi, 2008).

18


2.7. Uji Aktivitas Antibakteri

Ada beberapa metode yang dapat digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri,

diantara yaitu :

a. Uji Difusi

Metode yang paling sering digunakan adalah metode difusi agar. Cakram

kertas saring berisi sejumlah tertentu obat ditempatkan pada permukaan media

padat yang sebelumnya telah diinokulasi bakteri uji pada permukaannya. Setelah

inkubasi, diameter zona hambatan sekitar cakram dipergunakan mengukur

kekuatan hambatan obat terhadap organisme uji. Metode ini dipengaruhi oleh

beberapa faktor fisik dan kimia, selain faktor antara obat dan organisme (misalnya

sifat medium dan kemampuan difusi, ukuran molekular dan stabilitas obat).

Meskipun demikian, standarisasi faktor-faktor tersebut memungkinkan melakukan

uji kepekaan dengan baik (Jawetz et al, 1996).

Terdapat tiga jenis interpretasi zona hambat dalam metode difusi agar, yaitu:

Zona hambat radikal jika zona hambat yang terbentuk jernih tanpa ada

pertumbuhan bakteri.

Zona hambat iradikal bila masih ada bakteri yang tumbuh di dalam zona

hambat.

Zona hambat nol bila tidak terbentuk zona hambat (Lorian, 1980).

b. Uji Dilusi

Metode ini digunakan untuk mengukur Kadar Hambat Minimum (KHM)

dan Kadar Bunuh Minimum (KBM). Metode dilusi ada dua jenis yaitu dilusi cair

dan dilusi padat. Pada dilusi cair, dibuat seri pengenceran antibakteri dalam media

cair berisi bakteri uji. Media dengan konsentrasi agen antibakteri terkecil yang

jernih tanpa pertumbuhan bakteri uji ditetapkan sebagai KHM. Media yang jernih

tanpa pertumbuhan bakteri uji dikultur ulang dalam media padat tanpa bakteri uji

dan agen antimikroba. Media selanjutnya diinkubasi selama 18-24 jam. Jumlah

koloni yang tumbuh dalam media padat dihitung. Media dengan jumlah koloni

bakteri uji yang mengalami penurunan seribu kali lipat dibandingkan dengan

jumlah koloni inokulum awal ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008).

19


Metode dilusi padat pada dasarnya sama seperti metode dilusi cair, tetapi

media yang dipakai dalam metode ini adalah media padat. Keuntungan metode ini

adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk

menguji beberapa mikroba uji (Pratiwi, 2008).

c. Uji Bioautografi

Bioautografi merupakan metode spesifik untuk mendeteksi bercak pada

kromatogram hasil KLT yang memiliki aktivitas antibakteri, antifungi, dan

antivirus. Dengan metode ini, maka dapat diketahui bercak yang memiliki

aktivitas dan dapat dilakukan isolasi senyawa aktif. Metode ini sangat praktis dan

mudah, namun memiliki kerugian yaitu tidak dapat digunakan untuk menentukan

KHM atau KBM-nya (Pratiwi, 2008).

Ada dua macam uji bioautografi :

1. Bioautografi langsung

Metode ini dapat dilakukan dengan dua cara :

a. Plat hasil KLT disemprot dengan suspensi bakteri uji.

b. Plat KLT disentuhkan di atas media agar yang telah ditanami bakteri uji

(sering disebut bioautografi kontak).

Setelah diinkubasi, area jernih di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteri

merupakan spot senyawa aktif (Pratiwi, 2008).

2. Bioautografi overlay

Metode ini dilakukan dengan cara menuangkan media agar ke dalam petri

dan ditunggu hingga memadat. Selanjutnya plat hasil KLT diletakkan di atas

media agar tersebut. Media agar berisi bakteri uji dituang di atas plat hasil KLT

dan ditunggu hingga memadat. Area hambatan setelah inkubasi pada suhu 37°C

selama 18-24 jam dilihat dengan cara menyemprotkan tetrazolium klorida. Spot

senyawa aktif akan muncul sebagai area jernih dengan latar belakang ungu

(Pratiwi, 2008).

20


2.8. Kromatografi

Kromatografi adalah prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses

migrasi diferensiasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase

atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah

tertentu dan didalamnya zat-zat tersebut menunjukkan perbedaan mobilitas

disebabkan adanya perbedaan dalam adsorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap,

ukuran molekul, atau kerapatan muatan ion. Perbedaan tersebut menjadi acuan

dalam identifikasi atau penetapan masing-masing zat dengan metode analitik

(Depkes RI, 1995). Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung

pada sifat kelarutan dan keatsirian senyawa yang akan dipisah (Harbone, B.J.,

1987).

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan

dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi, yaitu

kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi gas cair, dan

kromatografi cair kinerja tinggi (Harbone, B.J., 1987).

2.8.1. Kromatografi Lapis Tipis.

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan fisikokimia

yang didasarkan atas penjerapan, partisi (pembagian) atau gabungannya (Harmita,

2006). Menurut Kowalska, dkk (2008) KLT adalah teknik kromatografi yang

digunakan untuk analisis kualitatif senyawa organik, isolasi senyawa tunggal dari

senyawa campuran, analisis kuantitatif, dan isolasi skala preparatif.

Prinsip KLT yaitu perpindahan analit pada fase diam karena pengaruh fase

gerak. Proses ini biasa disebut elusi. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase

diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja

KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut

pengembang akan bergerak sepanjang fase diam kerena pengaruh kapiler pada

pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada

pengembangan secara menurun (descending) (Rohman, 2007).

21


Keuntungan dari penggunaan metode KLT adalah :

a. Membutuhkan biaya yang relatif lebih rendah dibandingkan dengan metode

pemisahan lainnya (Poole, 2003).

b. Dapat mengidentifikasi banyak sampel dalam waktu bersamaan (Poole, 2003).

c. Waktu yang diperlukan untuk analisis cukup singkat, yaitu sekitar 15-60 menit

(Harmita, 2006).

d. Jumlah zat yang dianalisis cukup kecil, sekitar 0,01 g senyawa murni atau 0,1 g

simplisia (Harmita, 2006).

e. Teknik pengerjaan sederhana dan tidak diperlukan ruang besar (Harmita,

2006).

Kerugian menggunakan metode ini hanya pada prosedur pembuatan

lempeng yang membutuhkan tambahan waktu, kecuali jika telah tersedia lempeng

yang diproduksi secara komersial (Harmita, 2006). Hal-hal yang harus

diperhatikan dalam kromatografi lapis tipis adalah :

A. Fase diam

Fase diam KLT merupakan sebuah lapisan dibuat dari salah satu penjerap

yang khusus digunakan untuk KLT. Lapisan penjerap yang umum digunakan

adalah silika gel, alumunium oksida, kieselguhr, selulosa dan turunannya,

poliamida, dan lain-lain. Silika gel merupakan penjerap yang paling banyak

digunakan dalam KLT (Stahl, 1987).

Prinsip pemisahan pada lempeng yang menggunakan silika gel adalah

interaksi ikatan hidrogen atau dipol dengan permukaan silanol dimana fase gerak

yang digunakan adalah zat yang bersifat lipofilik. Zat akan memisah dari silanol

berdasarkan tingkat kepolarannya (Sherma dan Fried, 2003).

B. Fase gerak

Dalam KLT, fase gerak sering disebut sistem pelarut. Pelarut dapat dipilih

dari pustaka, namun pelarut umumnya dipilih berdasarkan coba-coba dari para

analisis. Prinsip umum pemilihan pelarut dalam KLT adalah pelarut yang dipilih

sesuai dengan sampel dan lapisan adsorben yang digunakan karena pelarut akan

berkompetisi dengan zat yang dipisahkan (sampel). Zat polar membutuhkan

pelarut polar untuk bermigrasi pada sisi lapisan adsorben. Pelarut yang memiliki

22


daya yang lebih besar akan meningkatkan nilai Rf. Untuk KLT yang

menggunakan silika gel sebagai adsorbennya, pelarut yang digunakan bersifat

sedikit polar (Sherma dan Fried, 2003).

Hal-hal yang perlu diperhatikan pada saat penggunaan pelarut pada KLT

(eluen) antara lain : eluen harus murni, campuran eluen yang digunakan dapat

terdiri dari dua sampai tiga jenis eluen, komposisi eluen dapat berubah karena

penyerapan atau penguapan, komponen campuran eluen kemungkinan dapat

bereaksi satu sama lain (Harmita, 2006).

C. Deteksi senyawa

Senyawa yang sudah berwarna langsung dideteksi dengan mata,

sedangkan senyawa yang tidak berwarna dideteksi dengan sinar UV pada panjang

gelombang 254 nm. Untuk senyawa yang menghasilkan fluoresensi, senyawa

tersebut diperiksa dengan sinar UV pada panjang gelombang 366 nm (Sherma dan

Fried, 2003). Jika dengan kedua cara itu senyawa tidak dapat dideteksi, maka

harus dicoba dengan menggunakan pereaksi kimia tanpa atau dengan pemanasan

(Stahl, 1985).

2.8.2. Kromatografi Kolom

Salah satu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar adalah

menggunakan kromatografi kolom. Kromatografi kolom merupakan kromatografi

cair dimana fase diam ditempatkan dalam tabung kaca berbentuk silinder pada

bagian bawahnya tertutup dengan katup atau kran dan fase gerak dibiarkan

mengalir ke bawah karena adanya gaya gravitasi (Gritter, Bobbit & Schwarting,

1991). Hal-hal yang harus diperhatikan dalam kromatografi kolom adalah :

a. Fase diam

Fase diam untuk kolom biasanya berukuran 63 – 250 µm. Sifat fase diam

bergantung pada pH dan tingkat keaktifannya. Fase diam yang biasa digunakan

adalah silika gel, selulosa, alumina, arang, polistiren atau poliamida (Gritter,

Bobbit & Schwarting, 1991).

23


b. Fase gerak

Fase gerak yang digunakan dapat dimulai dengan pelarut non polar

kemudian ditingkatkan kepolarannya secara bertahap, baik dengan pelarut tunggal

ataupun kombinasi dua pelarut yang berbeda kepolarannya dengan perbandingan

tertentu sesuai tingkat kepolaran yang dibutuhkan (Stahl, 1969).

c. Pemilihan pelarut

Pemilihan pelarut perlu dilakukan untuk mengetahui pelarut atau

campuran pelarut mana yang dapat menghasilkan pemisahan yang diinginkan. Hal

itu dapat dilakukan dengan tiga pendekatan yaitu, penelusuran pustaka, penerapan

data KLT pada pemisahan dengan kolom, dan pemakaian elusi landaian umum

mulai dari pelarut yang tidak menggerakkan linarut sampai pelarut yang lebih

polar yang menggerakkan linarut (Gritter, Bobbit & Schwarting, 1991).

d. Deteksi senyawa hasil kromatografi kolom

Fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi ditampung dalam

penampung dengan ukuran yang dikehendaki dan dilihat profilnya dengan

menggunakan metode KLT. Jika menghasilkan profil KLT yang mirip, maka

fraksi tersebut digabung. Fraksi yang telah digabung, selanjutnya diuapkan

pelarutnya sehingga didapatkan isolat. Noda pada plat KLT dideteksi dengan

lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm untuk senyawa-

senyawa yang mempunya gugus kromofor, dengan penampakan noda seperti

larutan Iod, FeCl3 dan H2SO4 dalam metanol 10% (Stahl, 1969).

2.9. Pemurnian Senyawa

Pemurniaan dilakukan untuk memisahkan senyawa yang menjadi target

dari pengotornya. Pemurnian senyawa dapat dilakukan dengan berbagai cara,

diantaranya :

2.9.1. Rekristalisasi

Rekristalisasi adalah teknik pemurnian suatu zat padat dari campuran atau

pengotornya yang dilakukan dengan cara mengkristalkan kembali zat tersebut

setelah dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Ada beberapa syarat agar suatu

pelarut dapat digunakan dalam proses kristalisasi yaitu : memberikan perbedaan

24


daya larut yang cukup besar antara zat yang dimurnikan dengan zat pengotor,

tidak meninggalkan zat pengotor pada kristal, dan mudah dipisahkan dari

kristalnya (Rositawati, dkk., 2013).

Prinsip dasar rekristalisasi adalah perbedaan kelarutan antara zat yang

akan dimurnikan dengan kelarutan zat pencampur atau pencemarnya. Larutan

yang terbentuk dipisahkan satu sama lain, kemudian larutan zat yang diinginkan

dikristalkan dengan cara menjenuhkannya (Rositawati, dkk., 2013).

2.10. Uji Kemurnian

Kemurnian merupakan hal yang penting dimiliki suatu senyawa hasil

isolasi. Oleh karena itu, perlu dilakukan uji kemurniaan terhadap senyawa hasil

isolasi. Metode yang dapat digunakan untuk uji kemurniaan antara lain dengan

penentuan titik leleh dan penggunaan KLT dua dimensi.

2.10.1. Penentuan Titik Leleh

Titik leleh suatu padatan kristalin didefinisikan sebagai suhu dimana

padatan berubah menjadi cairan di bawah tekanan total satu atmosfer. Senyawa

murni memiliki rentang titik leleh yang tajam dimana jarak temperatur senyawa

tersebut sangat kecil ketika berubah sempurna dari padat ke cair. Rentang

temperatur maksimum untuk senyawa murni adalah 1-2 0C (Margono dan

Zandrato, 2006).

Penentuan titik leleh adalah salah satu metode yang cepat dan mudah

untuk memastikan kemurnian dari suatu padatan dengan mengukur titik lelehnya.

Teknik penentuan titik leleh dari senyawa organik menggunakan metode mikro

dengan menggunakan pipa kapiler banyak digunakan karena mudah,

menggunakan sampel yang sedikit dan datanya memuaskan (Gilbert dan Martin,

2011).

Ada beberapa pertimbangan dalam menentukan titik leleh. Diantaranya

adalah rentang titik leleh yang diamati bergantung pada beberapa faktor yaitu :

jumlah sampel, laju pemanasan selama penentuan, dan kemurnian serta sifat kimia

dari sampel. Akurasi dari pengukuran suhu bergantung sepenuhnya pada kualitas

dan kalibrasi dari termometer (Gilbert dan Martin, 2011).

25


2.10.2. KLT Dua Dimensi

Langkah dari metode ini yaitu sampel ditotolkan pada bagian pojok dari

fase diam dan dilakukan proses elusi. Selanjutnya lempeng diangkat, dikeringkan,

diputar 900, dan dilakukan elusi dengan eluen yang berbeda dari eluen pertama.

Keuntungan dari KLT dua dimensi antara lain :

a. Merupakan salah satu metode sederhana tanpa menggunakan peralatan

yang rumit.

b. Lempeng yang digunakan sekali pakai sehingga tidak perlu prosedur yang

sulit untuk membersihkan sampel yang diuji.

c. Tidak ada batasan dalam penggunaan fase gerak karena sebelum dilakukan

elusi kedua, dilakukan penguapan terlebih dahulu terhadap eluen pertama.

d. Mampu menganalisis senyawa campuran.

e. Hasil pemisahan mudah dilihat. (Cielsa dan Waksmundzka, 2009)

2.11. Identifikasi Struktur Senyawa

Identifikasi struktur dapat dilakukan dengan berbagai cara, diantaranya yaitu :

2.11.1. Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti (NMR) merupakan salah satu

metode yang bermanfaat dalam penentuan struktur senyawa organik. Dasar dari

metode spektroskopi ini adalah kajian terhadap momen magnet dari inti atom. Inti

atom dalam molekul yang timbul akibat perputaran inti tersebut. Momen magnet

dari suatu inti atom dipengaruhi oleh atom-atom yang ada di dekatnya, sehingga

atom yang sama dapat mempunyai momen magnet yang berbeda bergantung pada

lingkungannya. Bila inti atom diletakkan diantara kutub-kutub magnet yang

sangat kuat, inti akan mensejajarkan medan magnetiknya sejajar (paralel) atau

melawan (antipararel) dengan medan magnet (Achmadi, 2003). Sifat inilah yang

digunakan untuk menentukan struktur suatu molekul. Inti yang paling penting

dalam penetapan struktur senyawa organik yaitu 1H dan 13C.

1. 13C NMR (Carbon Nuclear Magnetic Resonance)

Spektroskopi 13C NMR memberikan informasi tentang jumlah atom

karbon dari suatu struktur molekul. Pergeseran kimia 13C terjadi pada daerah yang

26


lebih lebar dibandingkan daerah pergeseran kimia inti 1H. Keduanya diukur

terhadap senyawa standar yang sama, yaitu tetrametilsilen (TMS), yang semua

karbon metilnya ekuivalen dan memberikan sinyal yang tajam. Pergeseran kimia

untuk 13C dinyatakan dalam satuan δ (Achmadi, 2003).

2. 1H NMR (Hydrogen Nuclear Magnetic Resonance)

Spektroskop 1H NMR memberikan informasi mengenai banyaknya sinyal

dan pergeseran kimianya dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis inti 1H

yang secara kimia berbeda di dalam molekul, luas puncak menginformasikan

banyaknya inti 1H dari setiap jenis yang ada, pola pembelahan spin-spin

menginformasikan tentang jumlah 1H tetangga terdekat yang dimliki oleh inti 1H

tertentu (Achmadi, 2003).

Spektrum NMR 1H biasanya diperoleh dengan cara melarutkan sampel

senyawa yang sedang dikaji (biasanya hanya beberapa miligram) dalam sejenis

pelarut yang tidak memiliki inti 1H. Contoh pelarut seperti ini adalah CCl4 atau

pelarut dengan hidrogen yang digantikan oleh deuterium, seperti CDCl3

(deuteriokloroform) dan CD3COCD3 (heksadeutioaseton). Salah satu cara untuk

menetapkan puncak dari spektra 1H NMR adalah dengan mengintregasikan luas di

bawah setiap puncak. Luas puncak (peak area) berbanding lurus dengan jumlah

inti 1H yang menyebabkan terjadinya puncak tersebut. Cara yang lebih umum

untuk menetapkan puncak adalah dengan membandingkan pergeseran kimia

dengan proton yang serupa dengan senyawa rujukan yang diketahui (Achmadi,

2003).

2.11.2. FTIR (Fourier Transform Infra Red)

Spektrofotometri inframerah (IR) merupakan salah satu alat yang dapat

digunakan untuk menganalisa senyawa kimia. Spektra inframerah suatu senyawa

dapat memberikan gambaran dan struktur molekul senyawa tersebut. Spektra IR

dapat dihasilkan dengan mengukur absorbsi radiasi, refleksi atau emisi di daerah

IR (Harjono, 1992).

Syarat suatu gugus fungsi dalam suatu senyawa dapat terukur pada spektra

IR adalah adanya perbedaan momen dipol pada gugus tersebut. Vibrasi ikatan

akan menimbulkan fluktuasi momen dipol yang menghasilkan gelombang listrik.

27


Untuk pengukuran menggunakan IR biasanya berada pada daerah bilangan

gelombang 400-4500 cm-1. Daerah pada bilangan gelombang ini disebut daerah

IR sedang, dan merupakan daerah optimum untuk penyerapan sinar IR bagi

ikatan-ikatan dalam senyawa organik (Harjono, 1992).

Absorpsi molekul pada infra merah terjadi ketika molekul tereksitasi ke

tingkat energi yang lebih tinggi. Suatu molekul hanya menyerap energi tertentu

dari radiasi infra merah. Kegunaan spektroskopi IR adalah sebagai sidik jari suatu

molekul dan untuk menentukan informasi struktural dari suatu molekul (Pavia, et

al. 2001).

Bila suatu senyawa menyerap radiasi pada suatu panjang gelombang

tertentu, intensitas radiasi yang diteruskan oleh sampel akan berkurang. Hal

tersebut mengakibatkan penurunan nilai %T dan terlihat pada spektrum sebagai

suatu sumur yang disebut puncak absorbsi atau pita absorbsi (Kosela, 2010). Pita-

pita absorbsi dalam spektrum inframerah dapat dikelompokkan menurut

intensitasnya, yaitu: kuat (s), medium (m), dan lemah (w). Suatu pita lemah yang

bertumpang tindih dalam suatu pita kuat disebut bahu (sh). Istilah-istilah tersebut

hanya bersifat kualitatif (Supratman, 2010).

Untuk menentukan spektrum IR dari suatu senyawa, senyawa harus

ditempatkan di sampel holder atau sel. Sel harus terbuat dari bahan ionik seperti

natrium klorida atau kalium bromida. Plat KBr lebih mahal dan memiliki

kelebihan dalam penggunaan direntang 4000 sampai 400 cm-1. Natrium klorida

digunakan secara luas karena murah dan penggunaannya pada rentang 4000

sampai 650 cm-1 (Pavia, et al. 2001).


BAB 3

METODOLOGI KERJA

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Program

Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri

Syarif Hidayatullah Jakarta. Waktu penelitian dimulai pada bulan Januari hingga

Juni 2015.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : blender (Philip),

gelas ukur (Pyrex), erlenmeyer (Iwaki), beacker glass (Iwaki), timbangan analitik,

corong, tabung reaksi (Pyrex), rak tabung reaksi, botol gelap, kolom kromatografi,

batang pengaduk, pipet tetes, spatula, seperangkat alat vaccum rotary evaporator

(Eyela), kaca arloji, cawan porselen, pipa kapiler, vial, plat KLT, cawan petri,

jarum ose, hot plate, magnetic stirrer, oven, autoklaf, lampu spiritus, mikroskop,

Laminar Air Flow, mikropipet, lemari pendingin, incubator (Memmert), vortex.

3.2.2. Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan adalah ekstrak etil asetat dari buah parijoto

(Medinilla speciosa Blume) dengan spesifikasi warna ungu tua dan rasa asam

sepat yang berasal dari Kecamatan Dawe, Kudus Jawa Tengah yang diambil pada

bulan Februari 2015. Sampel ini sebelumnya telah dideterminasi di Herbarium

Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi LIPI, Bogor, Jawa Barat.

3.2.3. Bahan Kimia dan Bahan Biologi

Bahan kimia yang digunakan antara lain : pelarut n-heksana, etil asetat,

metanol, etanol 96%, pereaksi Dragendorf, HCl 2N, aquadest, kloroform, asam

asetat anhidrida, asam sulfat pekat, logam magnesium, FeCl3, plat silika F254,

silika gel 60, larutan NaCl fisiologis, p-iodonitrotetrazolium violet (INT), kertas

29


saring, kapas, aluminium foil. Bahan biologi yang digunakan adalah : kultur

bakteri Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan Escherichia coli ATCC 35218,

medium NA (Nutrient Agar), medium BHI (Brain Heart Infussion).

3.3. Cara Kerja

3.3.1. Penyiapan Simplisia

Buah Medinilla speciosa Blume yang telah diperoleh dari Kecamatan

Dawe, Kudus dicuci bersih, kemudian dilakukan sortasi basah untuk memisahkan

kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing lainnya. Buah yang telah bersih

dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Buah segar tersebut kemudian

dihaluskan dengan blender. Setelah diblender, ditimbang sampel yang didapat

kemudian dilakukan ekstraksi.

3.3.2. Pembuatan dan Partisi Ekstrak

Buah segar yang telah diblender dan ditimbang kemudian diekstraksi

dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol. Sampel direndam dengan

pelarut metanol di dalam botol gelap hingga sampel terendam 3 cm dibawah

pelarut. Pergantian pelarut dilakukan setiap 1 hari sambil sesekali botol dikocok.

Setelah 1 hari, hasil maserasi disaring menggunakan kapas untuk memisahkan

ampasnya, kemudian larutan maserat disaring kembali menggunakan kertas

saring. Ampas yang diperoleh dimaserasi kembali oleh metanol selama dua hari

dan disaring kembali. Proses ini diulang hingga diperoleh larutan maserat yang

bening. Larutan maserat dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator pada suhu

40oC hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh, dihitung

untuk diketahui hasil rendemennya (Depkes, 2000).

= 100%Ekstrak metanol yang telah diperoleh dipartisi menggunakan pelarut

n-heksan dan etil asetat. Ekstrak metanol dilarutkan dengan sedikit metanol

hingga ekstrak dapat dituang ke dalam corong pisah. Dimasukkan n-heksan ke

dalam corong pisah kemudian dikocok selama beberapa menit sambil sesekali

30


membuka kran pada corong untuk mengeluarkan gas yang terbentuk. Dibiarkan

beberapa menit sampai terlihat bidang batas antara lapisan metanol dan lapisan

n-heksan. Lapisan yang berada di atas adalah lapisan n-heksan dan yang berada di

bawah adalah lapisan metanol. Lapisan dipisahkan dengan cara membuka kran

corong pisah untuk mengambil lapisan metanol, lapisan atas yang tertinggal

dikumpulkan. Lapisan metanol dimasukkan kembali ke dalam corong pisah dan

ditambahkan pelarut n-heksan yang baru. Partisi dilakukan dengan cara yang

sama hingga pelarut n-heksan bening.

Partisi dilakukan kembali menggunakan pelarut etil asetat. Ekstrak

metanol dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian dimasukkan pelarut etil

asetat. Corong pisah dikocok dan dibiarkan beberapa menit hingga terbentuk dua

lapisan. Lapisan atas merupakan lapisan etil asetat dan lapisan bawah merupakan

lapisan metanol. Partisi diulang hingga pelarut etil asetat bening. Lapisan n-

heksan, lapisan etil asetat, dan lapisan metanol dipekatkan menggunakan vaccum

rotary evaporator pada suhu 40oC hingga diperoleh ekstrak kental. Masing-

masing ekstrak kemudian ditimbang (Dai, 2012).

3.3.3. Skrining Fitokimia Ekstrak

Analisis fitokimia merupakan analisis kualitatif yang dilakukan untuk

mengetahui komponen bioaktif yang terkandung dalam ekstrak buah Medinilla

speciosa Blume. Analisis fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, saponin,

terpenoid dan steroid, flavonoid, tannin dan polifenol.

a. Pengujian Golongan Alkaloid

Sebanyak 0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam asam klorida 1% dan

disaring. Filtrat dibagi menjadi dua bagian, salah satu bagian ditetesi dengan

pereaksi Mayer dan bagian yang lain ditetesi dengan pereaksi Dragendorf. Hasil

positif ditunjukkan dengan terbentuknya endapan putih dengan perekasi Mayer

dan endapan merah dengan pereaksi Dragendorf (Ahmad et al, 2013).

b. Pengujian Golongan Saponin

Sebanyak 0,5 gram ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi,

ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan dan kemudian dikocok vertikal selama

31


10 detik. Pembentukan busa setinggi 1–10 cm yang stabil selama tidak kurang

dari 10 menit menunjukkan adanya saponin. Pada penambahan 1 tetes HCl 2N,

busa tidak hilang (Depkes RI, 1989).

c. Pengujian Golongan Terpenoid dan Steroid

Pemeriksaan steroid dan triterpenoid dilakukan dengan reaksi

Liebermann-Burchard. Sebanyak 0,5 gram ekstrak ditambahkan 5 mL kloroform,

kemudian ditambahkan asam asetat anhidrida dan beberapa tetes asam sulfat

pekat. Hasil uji positif untuk terpenoid bila terbentuk warna hijau gelap. Hasil uji

positif untuk steroid bila terbentuk warna merah muda atau merah (Ahmad et al,

2013)..

d. Pengujian Golongan Flavonoid

Sebanyak 1 gram sampel diekstraksi dengan 5 mL etanol kemudian

ditambahkan beberapa tetes HCl pekat dan 1,5 gram logam magnesium. Adanya

flavonoid diindikasikan dari terbentuknya warna pink atau merah magenta dalam

waktu 3 menit (Ahmad et al, 2013)..

e. Pengujian Golongan Tannin dan Polifenol

Sebanyak 0,5 gram ekstrak dilarutkan dalam 5 mL air aquadest kemudian

diteteskan larutan besi (III) klorida 10%, jika terjadi warna biru tua atau hitam

kehijauan menunjukkan adanya tanin dan polifenol (Ahmad et al, 2013).

3.3.4. Penetapan Kadar Air Ekstrak (Depkes RI, 2000)

Penetapan kadar air menggunakan metode gravimetri. Krusibel porselin

kosong dikonstankan terlebih dahulu dengan pemanasan pada suhu 100 – 105 oC

selama 2 jam, didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 1 g sampel

ditimbang dalam krusibel yang telah diketahui beratnya, dikeringkan dalam oven

pada suhu 105 – 110 oC selama 5 jam, didinginkan dalam desikator dan

selanjutnya ditimbang kembali. Perlakuan diulang sampai beratnya konstan.

Kadar air dihitung dalam persen terhadap berat sampel awal.

32


3.3.5. Isolasi dan Pemurnian Ekstrak (Harborne, 1987)

3.3.5.1.Kromatografi Kolom

Sistem kromatografi kolom yang digunakan adalah kromatografi kolom

fase normal, dimana fase diamnya adalah silika gel 60 yang bersifat polar dan fase

geraknya adalah kombinasi sistem eluen yaitu n-heksan: etil asetat: metanol

dengan perbandingan tingkat kepolaran secara bergradien.

Penyiapan kolom kromatografi. Pertama-tama pada ujung kolom

kromatografi diberikan kapas untuk menahan agar silika gel tidak keluar.

Ditimbang silika gel seberat 30 kali berat ekstrak kental, kemudian di masukkan

ke dalam beacker glass dan ditambahkan pelarut n-heksana sehingga

menghasilkan silika dengan konsistensi seperti bubur, kemudian diaduk hingga

terbentuk suspensi. Suspensi silika gel yang telah terbentuk, dimasukkan ke dalam

kolom kromatografi yang telah berisi n-heksan sedikit demi sedikit sambil

diketuk-ketuk. Pelarut yang mengalir ke ujung kolom ditampung, kemudian

dimasukkan kembali ke dalam kolom. Hal ini dilakukan secara berulang-ulang

hingga silika gel menjadi padat. Kemudian ekstrak etil asetat yang telat

diadsorpsikan dengan silika dimasukkan ke dalam kolom melalui bagian atas

kolom dengan cara menaburkannya sedikit demi sedikit.

Pembuatan sistem pelarut. Pelarut dibuat dengan perbandingan antara

pelarut nonpolar, semipolar dan polar sehingga terjadi peningkatan polaritas atau

yang disebut sistem gradien. Pelarut yang digunakan adalah n-heksana, etil asetat,

dan metanol, dimana setiap gradien kepolarannya ditingkatkan 10%. Setiap

pelarut dibuat dengan volume 700 mL.

Proses fraksinasi. Fraksinasi pertama dimulai dengan menggunakan

pelarut n-heksana 100% sebanyak 300 mL. Pelarut n-heksana 100% dimasukkan

ke dalam kolom kromatografi sedikit demi sedikit, kemudian kran kolom dibuka

sehingga pelarut tersebut akan turun melalui kolom. Hasil kolom yang keluar

ditampung pada vial-vial dan diberi nomor berurutan. Penggantian gradien fasa

gerak dilakukan ketika gradien sebelumnya telah habis digunakan untuk mengaliri

kolom. Setelah pelarut n-heksana 100% habis di dalam kolom, ditandai dengan

33


hanya tinggal selapis larutan diatas permukaan sampel, kemudian ditambahkan

pelarut dengan tingkat kepolaran kedua yaitu n-heksan : etil asetat dengan 9 : 1

sebanyak 700 mL, dan ditampung eluatnya seperti sebelumnya. Fraksinasi

dilakukan hingga fasa gerak yang digunakan telah mencapai gradien akhir yaitu

etil asetat 100%. Hasil eluat yang telah ditampung dalam vial yang telat diberi

nomor secara berurutan di analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk

melihat pola noda masing-masing eluat. Eluat yang memberikan pola noda

dengan nilai Rf yang sama, digabungkan menjadi satu dan selanjutnya diuji

aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi.

3.3.5.2.Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

KLT dilakukan untuk mengamati pola pemisahan dari fraksi hasil

kromatografi kolom. Sebagai fase gerak digunakan pelarut pengembang yang

sesuai, dilakukan uji coba untuk mendapatkan perbandingan pelarut yang

memberikan pemisahan yang terbaik. Fase gerak yang telat dibuat, dimasukkan ke

dalam bejana KLT dan dimasukkan kertas saring untuk menjenuhkan larutannya,

bejana ditutup dan biarkan sampai kertas saring terbasahi semuanya. Selanjutnya,

fraksi dilarutkan dengan pelarut yang sesuai dan ditotolkan pada plat KLT

menggunakan pipa kapiler dengan posisi di garis batas bawah.

Plat KLT dielusi di dalam masing-masing bejana KLT yang berisi fase

gerak hingga fase gerak mencapai garis batas atas, kemudian diangkat. Plat KLT

dibiarkan kering di udara, kemudian dilakukan pengamatan di lampu UV pada

panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Diberi tanda spot yang terlihat dalam

lampu UV dan dihitung Rf dari tiap noda yang terlihat.

3.3.5.3.Rekristalisasi

Untuk senyawa berbentuk kristal, pemurniannya dapat dilakukan dengan

rekristalisasi. Rekristalisasi dilakukan dengan cara melarutkan senyawa dengan

pelarut atau campuran pelarut yang cocok. Pelarut yang dipilih berdasarkan

kemampuan melarutkan zat yang akan dimurnikan. Adanya perbedaan kelarutan

akibat penambahan pelarut lain akan menyebabkan senyawa utama akan

mengkristal lebih dahulu (Rositawati, dkk. 2013).

34


3.3.6. Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram digunakan untuk identifikasi anggota dari domain

bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli diambil masing-masing 1 ose dan

digores-goreskan pada permukaan kaca objek steril, ditetesi NaCl 0,9 %,

kemudian dilakukan fiksasi. Kristal violet sebanyak 1 tetes ditambahkan ke

permukaan kaca objek yang terdapat lapisan bakteri tersebut dan didiamkan

selama 1 menit. Setelah 1 menit, kaca objek dibilas dengan air sampai zat warna

luntur. Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, larutan lugol

sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek tersebut dan didiamkan

selama 1 menit. Setelah 1 menit, kaca objek dibilas dengan air. Kaca objek dibilas

dengan alkohol 96% sampai semua zat warna luntur kemudian dicuci dengan air.

Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, safranin sebanyak 1

tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek dan didiamkan selama 45 detik.

Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan. Preparat diamati menggunakan

mikroskop dengan perbesaran 100x (Pratiwi, 2008).

3.3.7. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi dari Ekstrak Etil Asetat Buah

Parijoto

a. Pembuatan Medium serta Sterilisasi Alat dan Bahan

Medium yang digunakan untuk membiakkan bakteri uji adalah medium

NA (Nutrient Agar). Serbuk NA sebanyak 2,8 gram dicampur dengan 100 mL

aquadest di dalam erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan

stirer di atas hotplate hingga larut. Medium yang digunakan untuk membuat

suspensi bakteri adalah BHI (Brain Heart Infussion). Serbuk BHI sebanyak 3,7

gram dicampur dengan 100 mL aquadest di dalam erlenmeyer kemudian

dipanaskan dan diaduk menggunakan stirer di atas hotplate hingga larut. Bahan

yang telah dibuat disumbat dengan kapas yang telah dibungkus kasa, termasuk

aquadest dan NaCl 0,9%. Cawan petri yang telah dibungkus dengan kertas, tabung

reaksi yang telah disumbat dengan kapas dilapisi kasa, dan tip dimasukkan ke

dalam plastik tahan panas. Seluruh alat dan bahan yang telah siap disterilisasi

dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit. Setelah

35


disterilisasi, semua alat dan bahan disimpan dalam Laminar Air Flow yang

sebelumnya sudah disterilisasi dengan lampu UV selama 30 menit dan

dibersihkan dengan alkohol 70% (Staf Pengajar FKUI, 1994).

Untuk membuat agar miring, NA yang telah disterilkan dituang pada suhu

60 – 50 oC ke dalam tabung reaksi yang telah disterilkan sebanyak 5 mL,

kemudian disumbat dengan kapas steril dan diposisikan miring sekitar 45o

kemudian ditunggu sampai mengeras.

b. Peremajaan Bakteri

Disiapkan agar miring NA steril, lalu diambil stok bakteri Staphylococcus

aureus ATCC 6538 dan Escherichia coli ATCC 35218 dengan menggunakan ose

steril yang telah dipijarkan lalu ditanam pada permukaan agar miring dan

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 oC (Valgas et al, 2007).

c. Pembuatan Suspensi Bakteri

Stok bakteri uji Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang telah

diremajakan pada medium NA miring, diambil 1 ose lalu disuspensikan ke dalam

9 mL NaCl fisiologis 0,9% steril. Kekeruhan suspensi dibandingkan dengan

standar McFarland III (109 CFU/mL). Kemudian diencerkan dengan kaldu BHI

sampai 106 CFU/mL (Valgas et al, 2007).

d. Uji Bioautografi Fraksi Hasil Kromatografi Kolom

Fraksi hasil kromatografi kolom yang telah digabungkan berdasarkan nilai

Rf, dilarutkan dengan pelarut yang sesuai hingga konsentrasi menjadi 50 mg/mL.

Larutan fraksi sebanyak 10 µL ditotolkan pada plat KLT berukuran 6,5 x 7 cm

kemudian dikering anginkan untuk menghilangkan pelarutnya. Suspensi bakteri

106 CFU/mL dituang dalam cawan petri steril. Plat KLT yang telah ditotolkan

larutan fraksi sebanyak 10 µL, dicelupkan dalam campuran BHI dan suspensi

bakteri dalam cawan petri sebanyak 10 mL selama 5 detik. Selanjutnya plat KLT

disimpan dalam cawan petri lainnya yang telah diberi kapas yang dibasahi dengan

aquadest yang telah disterilkan. Plat diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.

Setelah diinkubasi, plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium (INT)

36


konsentrasi 2 mg/mL dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC (Ismail et al,

2011 ; Valgas et al, 2007).

Untuk mengetahui nilai Rf senyawa aktif antibakteri maka dilakukan uji

bioautografi elusi pada fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri dengan spot

paling sedikit, dilihat dari profil KLT. Fraksi tersebut dilarutkan dengan metanol

sehingga diperoleh larutan fraksi dengan konsentrasi 50 mg/mL. Larutan fraksi

sebanyak 10 µL ditotolkan pada plat KLT, kemudian dielusi menggunakan fase

gerak n-heksana : etil asetat (4:6). Setelah larutan fraksi dielusi, plat KLT

dicelupkan dalam campuran BHI dan suspensi bakteri dalam cawan petri

sebanyak 10 mL selama 5 detik. Selanjutnya plat KLT disimpan dalam cawan

petri lainnya yang telah diberi kapas yang dibasahi dengan aquadest yang telah

disterilkan. Plat diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Setelah diinkubasi,

plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium (INT) konsentrasi 2 mg/mL

dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 oC.

3.3.8. Uji Kemurnian Senyawa

a. KLT dua dimensi

Plat KLT dibuat dengan bentuk bujur sangkar yang setiap sisinya memiliki

ukuran 5 cm. Kemudian isolat dilarutkan dengan etil asetat dan ditotolkan pada

salah satu sisi plat dengan pipa kapiler, selanjutnya plat KLT dielusi dengan fase

gerak n-heksana : etil asetat (8:2) dan dibiarkan kering sesaat (Pramita, 2013). Plat

KLT dielusi kembali pada sisi lainnya dengan menggunakan fase gerak yang

sama. Noda yang timbul dilihat dibawah lampu UV 254 nm. Jika kromatogram

menunjukkan satu pola noda, maka dapat dikatakan isolat tersebut relatif murni.

b. Uji Titik Leleh

Sampel dibuat dengan memasukkan kristal ke ujung pipa kapiler yang

telah ditutup salah satu ujungnya, kemudian diketuk-ketuk hingga kristal mampat.

Selanjutnya pipa kapiler dimasukkan ke alat pengukur melting point. Kemudian

dilakukan pengamatan rentang suhu ketika kristal mulai melebur dari awal

melebur hingga melebur sempurna.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pemeriksaan Simplisia

Tanaman Medinilla speciosa Blume yang digunakan dalam penelitian ini

telah dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi LIPI,

Bogor, Jawa Barat. Determinasi dilakukan untuk memastikan keaslian tumbuhan

yang digunakan dan menghindari kesalahan dalam pemilihan tumbuhan. Hasil

determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang diperoleh merupakan Medinilla

speciosa Blume yang berasal dari suku Melastomataceae (Lampiran 1.)

4.2. Penyiapan Simplisia

Buah parijoto sebanyak 4 kg disortasi basah untuk memisahkan buah dari

ranting-ranting yang tidak digunakan. Buah dicuci bersih menggunakan air yang

mengalir untuk menghilangkan kotoran yang melekat pada buah. Buah

dikeringanginkan untuk menghilangkan air pada lapisan luar buah, kemudian

buah diblender sehingga diperoleh simplisia sebanyak 3,2 kg dan dilakukan

ekstraksi. Pengecilan ukuran dengan blender bertujuan untuk memperbesar luas

permukaan simplisia sehingga kontak antara pelarut dengan simplisia semakin

besar dan proses ekstraksi dapat berjalan lebih maksimal.

4.3. Ekstraksi dan Partisi

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode maserasi atau perendaman.

Prinsip maserasi adalah pelarut yang digunakan dalam proses maserasi akan

masuk ke dalam sel tanaman melewati dinding sel, isi sel akan larut karena

adanya perbedaan konsentrasi antara larutan di dalam dengan di luar sel melalui

proses difusi hingga terjadi keseimbangan antara larutan di dalam sel dan larutan

di luar sel (Ansel, 1989). Keuntungan ekstraksi menggunakan metode maserasi

adalah prosedur dan peralatan yang digunakan relatif sederhana.

Buah parijoto sebanyak 3,2 kg dimaserasi dengan 15 L metanol sambil

sesekali diaduk. Maserasi dilakukan hingga maserat yang diperoleh tidak

38

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

berwarna untuk mendapatkan hasil ekstraksi yang maksimal. Hasil maserasi

disaring dan dipekatkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator

sehingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak metanol yang diperoleh sebanyak

126,077 gram dengan persen rendemen 3,94 %.

Sebanyak 99,82 gram ekstrak metanol dipartisi dengan pelarut n-heksan

dan etil asetat menggunakan corong pisah. Partisi ekstrak dilakukan untuk

memisahkan senyawa berdasarkan tingkat kepolarannya. Pelarut pertama yang

digunakan dalam partisi adalah n-heksan yang bersifat non polar. Senyawa-

senyawa yang bersifat non polar akan tertarik pada pelarut n-heksan. Setelah

pelarut n-heksan tidak berwarna yang menunjukkan bahwa tidak adanya senyawa

nonpolar yang tertarik lagi, maka diganti dengan pelarut kedua yaitu etil asetat

yang bersifat semi polar. Senyawa-senyawa yang bersifat semipolar akan tertarik

pada pelarut etil asetat. Senyawa-senyawa yang tidak tertarik di kedua pelarut

sebelumnya dan tertinggal dalam ekstrak metanol merupakan senyawa-senyawa

polar. Hasil partisi yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan

vaccum rotary evaporator dan didapatkan ekstrak kental n-heksan sebanyak 6,73

g, ekstrak kental etil asetat sebanyak 25,59 g, dan ekstrak kental metanol

sebanyak 48,32 g.

Tabel 4.1. Hasil rendemen ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol

No. Fraksi Berat Ekstrak (gram) Rendemen (%)*

1. n-heksan 6,73 gram 6,74 %

2. Etil asetat 25,59 gram 25, 64 %

3. Metanol 48,32 gram 48,41 %

*dihitung terhadap berat ekstrak kasar metanol awal yaitu 99,82 gram.

Ekstrak yang digunakan untuk pengujian selanjutnya adalah ekstrak etil

asetat. Berdasarkan penelitian Mukarromah (2015), didapatkan data bahwa

ekstrak n-heksan, ekstrak etil asetat, dan ekstrak metanol buah parijoto memiliki

zona hambat masing-masing sebesar 5,67 mm; 11,7 mm; dan 8,17 mm terhadap

pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus dan masing-masing sebesar 7 mm;

11,33 mm; dan 9 mm terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli.

39


4.4. Pengukuran Kadar Air Ekstrak Etil Asetat

Kadar air ekstrak yang diperoleh adalah 8,7%. Hal ini sesuai dengan

literatur yang menyatakan bahwa kadar air ekstrak tidak boleh melebihi 10%.

Semakin sedikit kadar air pada ekstrak maka semakin sedikit kemungkinan

ekstrak terkontaminasi oleh pertumbuhan jamur (Saifudin dkk, 2011).

Kadar air merupakan salah satu parameter penting yang menentukan daya

tahan ekstrak dan terkait dengan aktivitas mikroorganisme selama penyimpanan.

Ekstrak yang mempunyai kadar air yang tinggi lebih mudah ditumbuhi oleh

mikroorganisme. Ekstrak dengan kadar air rendah relatif lebih stabil dalam

penyimpanan jangka panjang daripada ekstrak yang berkadar air tinggi (Pardede

dkk, 2013).

4.5. Uji Penapisan Fitokimia Ekstrak Etil Asetat

Uji penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui macam-macam

metabolit sekunder yang terkandung dalam ekstrak etil asetat buah parijoto

sehingga dapat diketahui senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri.

Tabel 4.2. Hasil Uji Penapisan Fitokimia Ekstrak Etil Asetat

Metabolit Sekunder Hasil Pengamatan Hasil Uji

Alkaloid

Tidak terbentuk endapan merah jingga

dengan pereaksi Dragendorf-

Tidak terbentuk endapan putih dengan

pereaksi Mayer-

Saponin Terbentuk busa stabil +

Terpenoid Tidak terbentuk warna hijau gelap -

Flavonoid Terjadi perubahan warna +

Tanin Terbentuk warna hijau kehitaman +

40


4.6. Isolasi Senyawa Menggunakan Kromatografi Kolom

Ekstrak etil asetat buah parijoto difraksinasi dengan menggunakan

kromatografi kolom. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 60 (0,063 –

0,200 mm) dan fase gerak yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksan dan

etil asetat dengan perbandingan tingkat kepolaran secara gradien.

Kolom kromatografi yang digunakan memiliki tinggi 80 cm dan diameter

4 cm. Kolom yang akan digunakan dibersihkan terlebih dahulu, kemudian kran

pada kolom dioleskan vaselin untuk memudahkan memutar kran dan mencegah

kebocoran. Pada ujung kolom dimasukkan kapas yang telah dibasahi oleh pelarut

n-heksan untuk menahan silika. Silika gel sebanyak 90 gram disuspensikan

dengan pelarut n-heksan hingga membentuk bubur silika. Bubur silika

dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi pelarut n-heksan sambil diketuk-

ketuk hingga silika gel rata dan memadat. Ekstrak etil asetat sebanyak 19,6 gram

diadsorbsi dengan 7 gram silika sehingga menjadi serbuk lalu dimasukkan ke

dalam kolom sedikit demi sedikit kemudian dilakukan fraksinasi. Tujuan

dilakukan adsorbsi dengan silika adalah untuk menghilangkan pelarut yang masih

berada dalam ekstrak.

Fraksinasi dimulai dengan memasukkan eluen perlahan-lahan dimulai dari

pelarut n-heksan 100%, dan ditingkatkan kepolarannya 10 % menjadi n-heksan :

etil asetat = 9:1 hingga etil asetat 100%. Masing-masing gradien dibuat sebanyak

700 mL. Hasil pemisahan ditampung dalam vial-vial kosong yang sebelumnya

telah ditimbang dan diberi nomor. Vial yang telah terisi kemudian ditutup

menggunakan alumunium foil dan diberi lubang-lubang kecil. Dari hasil

pemisahan kromatografi kolom, diperoleh eluat sebanyak 84 vial.

Hasil eluat selanjutnya dilakukan kromatografi lapis tipis untuk melihat

pola noda dari masing-masing eluat. Fase diam yang digunakan adalah plat silika

gel 60 F254 dan fase gerak yang digunakan adalah campuran pelarut yang dapat

memberikan pemisahan yang baik. Plat KLT yang telah dibuat batas bawah dan

batas atas 0,5 cm, ditotolkan dengan eluat menggunakan pipa kapiler pada batas

bawah. Kemudian plat KLT dimasukkan ke dalam chamber yang berisi kombinasi

41


fase gerak yang telah dijenuhkan menggunakan kertas saring. Plat KLT diangkat

ketika fase gerak telah mencapai batas atas pada plat KLT, kemudian plat

dikeringanginkan dan dilihat pola pemisahannya. Profil KLT eluat ditunjukkan

pada gambar 4.1.

42


Gambar 4.1. Profil KLT eluat 84 vial hasil fraksinasi dari ekstrak etil asetatdengan kromatografi kolom.

Eluat yang memberikan bercak dengan nilai Rf yang sama digabungkan

dalam satu vial sehingga diperoleh 25 fraksi (F1 – F25). 25 fraksi di KLT kembali

untuk melihat pola pemisahan dari gabungan eluat. Fraksi-fraksi tersebut

kemudian dikeringanginkan untuk menguapkan pelarut yang terdapat dalam

fraksi. Bobot masing-masing fraksi ditimbang ketika pelarut telah menguap.

Bobot fraksi dan penggabungan nomor eluat dapat dilihat pada lampiran 5.

Selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri terhadap 25 fraksi menggunakan

metode bioautografi. Profil KLT fraksi ditunjukkan pada gambar 4.2.

F.1 F.2 F.3 F.4 F.5 F.6 F.7

NH : E (4:6)

F.8 F.9 F.10 F.11 F.12

43


Gambar 4.2. Profil KLT Fraksi Gabungan

4.7. Uji Aktivitas Antibakteri Menggunakan Metode Bioautografi

Metode uji aktivitas antibakteri yang digunakan adalah metode

bioautografi langsung. Teknik bioautografi digunakan untuk mengidentifikasi

komponen aktif antibakteri yang terkandung dalam fraksi ekstrak etil asetat.

Tahap-tahap yang dilakukan dalam pengujian bioautografi ialah :

a. Identifikasi Bakteri Uji dengan Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang digunakan

untuk mengidentifikasi bakteri ke dalam dua kelompok besar yaitu bakteri Gram

positif dan bakteri Gram negatif (Pratiwi, 2008). Pewarnaan bakteri dilakukan

sebelum dilakukannya uji aktivitas antibakteri dengan tujuan untuk memastikan

bahwa bakteri yang digunakan benar adalah bakteri kultur yang dibiakkan dan

tidak ada kontaminasi bakteri lain pada kultur yang dibiakkan. Bakteri yang

dibiakkan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang mewakili

kelompok Gram positif dan Gram negatif. Hasil pewarnaan Gram ditunjukkan

pada gambar 4.3.

F.13 F.14 F.15 F.16 F.17 F.18 F.19 F.20 F.21 F.22 F.23 F.24 F.25

44


(a) (b)

Gambar 4.3. Hasil pewarnaan Gram bakteri Staphylococcus aureus (a) dan

Escherichia coli (b) di bawah mikroskop perbesaran 100 x 10

Gambar (a) menunjukkan bahwa bakteri yang dibiakkan pada kultur kerja

adalah bakteri S.aureus yang merupakan bakteri Gram positif berbentuk kokus

(bulat) seperti buah anggur. Sedangkan gambar (b) menunjukkan bahwa bakteri

yang dibiakkan pada kultur kerja lainnya adalah bakteri E.coli yang merupakan

bakteri Gram negatif berbentuk basil (batang).

Perbedaan warna yang terjadi disebabkan oleh adanya perbedaan struktur

pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung

peptidlogikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung

lipopolisakarida. Kompleks kristal violet-iodin yang masuk ke dalam sel bakeri

Gram positif tidak dapat tercuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan

yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram negatif alkohol akan

merusak lapisan lipopolisakarida sehingga kompleks kristal violet-iodin dapat

tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna

merah setelah diberi safranin (Pratiwi, 2008).

b. Penyiapan Media serta Strerilisasi Alat dan Bahan

Media adalah bahan atau campuran bahan yang digunakan untuk

menumbuhkan dan mengembangbiakkan bakteri. Media yang digunakan dalam

penelitian ini adalah Nutrient Agar (NA) dan Brain Heart Infussion (BHI). Bahan

dan alat yang akan digunakan disterilasi terlebih dahulu. Sterilisasi dilakukan

45


untuk membunuh mikroorganisme yang terdapat pada media dan alat sehingga

dalam pengerjaan uji tidak terjadi kontaminasi bakteri lain yang tidak diinginkan.

Sterilisasi dilakukan menggunakan autoklaf untuk alat-alat yang presisi dan

media, sedangkan alat-alat non presisi seperti cawan petri disterilisasi

menggunakan oven. Mekanisme autoklaf dalam membunuh bakteri adalah uap

panas pada autoklaf akan mendenaturasi dan mengkoagulasi protein pada bakteri

sehingga bakteri menjadi mati. Dibandingkan dengan panas lembab (autoklaf),

panas kering (oven) kurang efisien dan membutuhkan suhu lebih tinggi serta

waktu lebih lama untuk sterilisasi. Hal ini disebabkan karena tanpa kelembapan

tidak ada panas laten (Cahyani, 2009).

c. Peremajaan Bakteri Uji

Bakteri uji yang akan digunakan dilakukan peremajaan untuk

meregenerasi bakteri sehingga diperoleh sel bakteri yang muda. Nutrient Agar

(NA) digunakan sebagai media pembiakan bakteri. Dilakukan penanaman bakteri

pada agar miring NA dan kemudian diinkubasi dalam incubator selama 24 jam

dengan suhu 37oC. Tujuan dilakukan inkubasi yaitu untuk mengkondisikan

lingkungan pada suhu optimum perkembangan bakteri sehingga dapat diketahui

bahwa bakteri berkembang dengan baik (Valgas et al, 2007).

d. Pembuatan Suspensi Bakteri

Bakteri uji hasil peremajaan diambil 1 ose lalu disuspensikan ke dalam 9

mL NaCl fisiologis 0,9% steril. Kekeruhan suspensi dibandingkan dengan standar

McFarland III (109 CFU/mL). Kemudian diencerkan dengan kaldu BHI sampai

106 CFU/mL. Pengujian dilakukan pada jumlah bakteri uji 106 CFU/mL karena

pada jumlah ini bakteri mulai menjadi patogen (Valgas et al, 2007).

e. Uji Bioautografi Non-Elusi Fraksi

Pada pengujian non elusi, dibuat larutan dengan konsentrasi 50 mg/mL

dari setiap fraksi, ditotolkan pada plat KLT sebanyak 10 µL dan ditunggu hingga

pelarut menguap. Konsentrasi ini dipilih berdasarkan hasil percobaan yang

dilakukan oleh Mukarromah (2015) dimana telah dilakukan uji bioautografi

46


dengan konsentrasi 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL,dan 50 mg/mL. Pada tiga

konsentrasi awal tidak terlihat zona hambat pertumbuhan bakteri dan pada

konsentrasi 50 mg/mL menunjukkan zona hambat, sehingga konsentrasi yang

dipilih adalah 50 mg/mL. Plat yang telat berisi fraksi dicelupkan ke dalam

suspensi bakteri selama 5 detik dan dipindahkan pada cawan steril lain yang berisi

kapas yang telah dibasahi. Adanya kapas yang telah dibasahi disekitar cawan

adalah untuk menjaga udara di dalam cawan tetap lembab. Plat kemudian

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 36oC ± 1oC (Ismail, 2011).

Zona hambat yang terbentuk kemudian divisualisasikan dengan

menyemprotkan reagen pendeteksi yaitu INT sehingga terjadi reaksi enzimatik

antara bakteri dengan INT. Enzim dehidrogenase yang terdapat dalam bakteri

akan mengubah INT menjadi formazan yang berwarna ungu. Setelah disemprot,

plat dinkubasi kembali selama 4 jam, kemudian diukur zona hambat yang

terbentuk menggunakan jangka sorong. Zona hambat komponen aktif antibakteri

ditandai dengan terbentuknya daerah putih pada plat yang berlatar ungu

(Hamburger, et al. 1987). Hasil pengujian aktivitas antibakteri seluruh fraksi

terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dapat dilihat pada

tabel 4.3.

Tabel 4.3. Hasil uji bioautografi fraksi dari ekstrak etil asetat terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

Fraksi Diameter Zona Hambat

S. aureus E.coli

1 - 5,9 mm

2 - 4,4 mm

3 5,3 mm 6,2 mm

4 8,4 mm 4,7 mm

5 7,9 mm 5,9 mm

6 8,0 mm -

7 14,3 mm 3,8 mm

47


8 10,2 mm -

9 8,6 mm 5,6 mm

10 10,7 mm 6,3 mm

11 11,9 mm 7,4 mm

12 13,8 mm 8,9 mm

13 18,5 mm 10,6 mm

14 12,7 mm 7,0 mm

15 11 mm 8,3 mm

16 7,8 mm 8,2 mm

17 11,1 mm 6,5 mm

18 6,0 mm 7,6 mm

19 6,2 mm 7,3 mm

20 6,8 mm 5,7 mm

21 7,8 mm 6,8 mm

22 7,7 mm 7,7 mm

23 12,7 mm 13,8 mm

24 12,9 mm 14,7 mm

25 11,2 mm 13,3 mm

Kontrol (+) kloramfenikol 26,3 mm 28,3 mm

Kontrol (-) n-heksan - -

Kontrol (-) etil asetat - -

Kontrol (-) metanol - -

Keterangan : (-) = tidak ada aktivitas antibakteri

48


Hasil uji bioautografi fraksi dari ekstrak etil asetat terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli ditunjukkan oleh gambar 4.4.

(a.1) (b.1)

(a.2) (b.2)

(a.3) (b.3)

11 22 33 44

5 5 66 7 7 88

9 9 1010

11 12 13 14

15 16 17 18

19 20

11 12 13 14

15 16 17 18

19 20

E N E

E E

N

M M

M M

21 22 23

24 25

21 22 23

24 25

49


(a.4) (b.4)

Gambar 4.4. Hasil uji bioautografi fraksi dari ekstrak etil asetat terhadap bakteri

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli

Keterangan :

(a.1) Hasil pengujian fraksi 1-10 terhadap bakteri Staphylococcus aureus



(a.4) Hasil pengujian kloramfenikol terhadap bakteri Staphylococcus aureus

(b.1) Hasil pengujian fraksi 1-10 terhadap bakteri Escherichia coli



(b.4) Hasil pengujian kloramfenikol terhadap bakteri Escherichia coli

Gambar diatas menunjukkan bahwa dari 25 fraksi ekstrak etil asetat,

terdapat 21 fraksi yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, 2 fraksi yang memiliki aktivitas

antibakteri terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus, dan 2 fraksi yang

memiliki aktivitas antibakteri terhadap pertumbuhan Escherichia coli. Fraksi hasil

fraksinasi memiliki kepekaan yang berbeda-beda terhadap kedua bakteri uji.

Fraksi 1 dan 2 tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri

S.aureus, sedangkan fraksi 6 dan 8 tidak menunjukkan aktivitas penghambatan

terhadap bakteri E.coli. Hal ini terjadi diduga karena perbedaan kemampuan

senyawa yang terkandung dalam fraksi untuk berdifusi ke dalam sel bakteri dan

menimbulkan penghambatan (Rifda, dkk. 2005).

K (+) K (+)

50


Kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut fraksi yaitu n-heksan, etil

asetat, dan metanol. Natheer et al (2012) menyebutkan bahwa zat yang dijadikan

sebagai konrol negatif adalah pelarut yang digunakan sebagai pelarut uji.

Tujuannya adalah sebagai pembanding bahwa pelarut yang digunakan tidak

mempengaruhi hasil uji antibakteri fraksi. Hasil uji bioautografi menunjukkan

bahwa tidak adanya zona hambat yang terbentuk pada kontrol negatif. Hal ini

mengindikasikan bahwa pelarut yang digunakan tidak berpengaruh terhadap

aktivitas antibakteri fraksi.

Kontrol positif yang digunakan adalah kloramfenikol 200 ppm.

Kloramfenikol dipilih karena merupakan antibiotik berspektrum luas yang dapat

menghambat atau membunuh bakteri dari golongan Gram positif maupun Gram

negatif. Kloramfenikol memberikan efek dengan cara bereaksi pada sub unit 50S

ribosom dan menghalangi aktivitas enzim peptidil transferase. Enzim ini berfungsi

untuk membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang masih melekat

pada tRNA dengan asam amino terakhir yang sedang berkembang. Sebagai

akibatnya, sintesis protein bakteri akan terhenti seketika dan menyebabkan bakteri

mati (Pratiwi, 2008).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa mayoritas penghambatan bakteri

dengan zona hambat yang luas ditunjukkan oleh fraksi-fraksi yang bersifat

semipolar. Menurut Kanazawa et al (1995), suatu senyawa yang mempunyai

polaritas optimum akan mempunyai aktivitas antibakteri maksimum, karena untuk

interaksi suatu senyawa antibakteri dengan bakteri diperlukan keseimbangan

hidrofilik dan lipofilik. Sifat hidrofilik diperlukan untuk menjamin senyawa larut

dalam fase air yang merupakan tempat hidup bakteri, tetapi senyawa yang bekerja

pada membran sel hidrofobik memerlukan pula sifat lipofilik sehingga senyawa

antibakteri memerlukan keseimbangan hidrofilik dan lipofilik untuk mencapai

aktivitas yang optimal.

Hasil penelitian juga menunjukkan bahwa rata-rata zona hambat yang

terbentuk pada E.coli (Gram negatif) lebih kecil dibandingkan dengan S.aureus.

Hal ini menunjukkan bahwa E.coli lebih tahan terhadap senyawa antibakteri

51


dibandingkan S.aureus. Hal ini sesuai dengan pernyataan Zuhud et al. (2001)

bahwa bakteri Gram negatif mempunyai ketahanan yang lebih baik terhadap

senyawa antimikroba dibandingkan bakteri Gram positif. Perbedaan ketahanan

hambatan mungkin dikarenakan perbedaan susunan dinding sel bakteri dimana

E.coli mempunyai lapisan dinding sel yang lebih kompleks dibandingkan

S.aureus (Natheer et al, 2012).

Berdasarkan hasil profil KLT fraksi, fraksi 9 memiliki spot paling sedikit

diantara fraksi lainnya dan berdasarkan hasil uji bioautografi fraksi 9 memiliki

aktivitas antibakteri dengan diameter zona hambat sebesar 8,6 mm terhadap

Staphylococcus aureus dan 5,6 mm terhadap Escherichia coli, sehingga fraksi 9

dipilih untuk dilakukan pemurnian lebih lanjut.

4.8. Pemurnian dan Uji Kemurnian Fraksi 9

Pemurnian fraksi 9 dilakukan dengan cara rekristalisasi, yaitu berdasarkan

perbedaan kelarutan antara zat utama yang dimurnikan dengan senyawa minor

dalam suatu pelarut tunggal atau campuran pelarut yang cocok. Fraksi 9 yang

berbentuk kristal dibersihkan dari pengotornya dengan menambahkan n-heksan

untuk menarik pengotor yang bersifat nonpolar, karena berdasarkan profil KLT

fraksi 9 menunjukkan adanya pengotor diatas spot. Proses rekristalisasi ini

diulang sehingga didapatkan senyawa berbentuk kristal yang lebih murni yang

diuji kemurniannya menggunakan KLT 2 Dimensi.

Gambar 4.5. Profil KLT fraksi 9 sebelum rekristalisasi di bawah UV 254 nm

pengotorNH:E (4:6)

52


Uji kemurnian senyawa dengan KLT dua dimensi dilakukan dengan cara

melarutkan ekstrak dalam metanol dan ditotolkan pada plat KLT berbentuk bujur

sangkar dengan sisi 5 cm. Plat KLT dielusi dengan fase gerak n-heksan : etil

asetat = 4 : 6 dan dibiarkan sesaat. Kemudian plat dielusi kembali pada sisi

lainnya menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat = 8 : 2. Hasil uji kemurnian

dari KLT dua dimensi menunjukkan adanya spot mayor dengan sedikit pengotor

pada Rf 0,7.

Gambar 4.6. Profil KLT 2 dimensi fraksi 9 setelah rekristalisasi di bawah UV

254 nm

4.9. Uji Bioautografi Elusi Fraksi 9

Fraksi 9 kemudian diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode

bioautografi elusi. Fraksi 9 dengan konsentrasi 20 mg/mL ditotolkan pada plat

KLT sebanyak 10 µL dan dielusi menggunakan eluen n-heksan : etil asetat = 4 : 6.

Eluen dipilih karena memberikan pola pemisahan yang baik. Plat kemudian

dicelupkan ke dalam suspensi bakteri selama 5 detik dan dipindahkan pada cawan

steril lain yang berisi kapas yang telah dibasahi. Plat kemudian diinkubasi selama

24 jam pada suhu 36oC ± 1oC. Plat divisualisasikan dengan penyemprotan INT.

NH:E (4:6)

1

NH:

E (8

:2)

2

53


(a) (b)

Gambar 4.7. Hasil uji bioautografi elusi fraksi 9 terhadap Staphylococcus aureus

(a) dan Escherichia coli (b).

Berdasarkan hasil bioautografi elusi, fraksi 9 menunjukkan adanya

beberapa spot. Hal ini menunjukkan bahwa fraksi 9 belum murni. Perbedaan hasil

profil KLT dengan hasil uji bioautografi terjadi diduga karena adanya perbedaan

konsentrasi fraksi yang ditotolkan pada plat KLT. Fraksi 9 dengan nilai Rf 0,7

memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia

coli yang ditandai dengan adanya zona bening diatas spot dan tidak adanya bakteri

yang tumbuh pada spot senyawa. Tetapi penghambatan yang ditunjukan oleh

fraksi 9 sangat kecil, sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap

fraksi-fraksi lain yang memiliki daya hambat yang besar pada uji bioautografi non

elusi seperti fraksi 13. Fraksi 9 tidak dilakukan pemurniaan lebih lanjut

dikarenakan jumlah fraksi tidak mencukupi.

Dari pengujian antibakteri yang dilakukan terhadap fraksi-fraksi hasil

fraksinasi dari ekstrak etil asetat buah parijoto dengan kromatografi kolom

diperoleh hasil bahwa dari 25 fraksi, terdapat 21 fraksi aktif antibakteri terhadap

Staphylococcus aureus dan Escherichia coli, 2 fraksi aktif antibakteri terhadap

Staphylococcus aureus, dan 2 fraksi aktif antibakteri terhadap Escherichia coli.

Diagram hasil uji bioautografi terhadap 25 fraksi ditunjukkan pada gambar 4.8.

54


Gambar 4.8. Diagram hasil uji bioautografi 25 fraksi terhadap S.aureus dan

E.coli

Keterangan :

A : Jumlah fraksi yang aktif terhadap bakteri S.aureus

B : Jumlah fraksi yang aktif terhadap bakteri S.aureus dan E.coli

C : Jumlah fraksi yang aktif terhadap bakteri E.coli

Adanya penghambatan bakteri yang ditunjukkan oleh fraksi diduga terjadi

karena adanya kandungan metabolit sekunder pada ekstrak etil asetat yang dilihat

dari hasil uji fitokimia ekstrak. Metabolit sekunder yang terkandung dalam

ekstrak adalah tanin, flavonoid, dan saponin dimana diketahui bahwa ketiga

metabolit sekunder ini telah dilaporkan memiliki peran penting dalam aktivitas

penghambatan bakteri.

Tanin sebagai antibakteri bekerja dengan cara menghambat enzim reverse

transkriptase dan DNA topoisomerase sehingga sel bakteri tidak dapat terbentuk.

Tannin memiliki aktifitas antibakteri yang berhubungan dengan kemampuannya

untuk menginaktifkan adhesin sel bakteri juga menginaktifkan enzim, dan

menggangu transport protein pada lapisan dalam sel. Tanin juga mempunyai

target pada polipeptida dinding sel sehingga pembentukan dinding sel menjadi

kurang sempurna. Hal ini menyebabkan sel bakteri menjadi lisis karena tekanan

osmotik maupun fisik sehingga sel bakteri akan mati. Selain itu, kompleksasi dari

ion besi dengan tanin dapat menjelaskan toksisitas tanin. Bakteri yang tumbuh

di bawah kondisi aerobik membutuhkan zat besi untuk berbagai fungsi, termasuk

reduksi dari prekursor ribonukleotida DNA. Hal ini disebabkan oleh kapasitas

pengikat besi yang kuat oleh tanin (Ngajow, dkk. 2013).

Flavonoid sebagai antibakteri bekerja dengan cara membentuk senyawa

kompleks dengan protein ekstraseluler dan terlarut sehingga dapat merusak

55


membrane sel bakteri dan diikuti dengan keluarnya senyawa intraseluler. Selain

berperan dalam inhibisi pada sintesis DNA – RNA dengan interkalasi atau ikatan

hidrogen dengan penumpukan basa asam nukleat, flavonoid juga berperan dalam

menghambat metabolisme energi yang dibutuhkan untuk penyerapan aktif

berbagai metabolit dan untuk biosintesis makromolekul (Ngajow, dkk. 2013).

Saponin sebagai antibakteri bekerja dengan cara menurunkan tegangan

permukaan sehingga mengakibatkan naiknya permeabilitas atau kebocoran sel dan

mengakibatkan senyawa intraseluler akan keluar. Senyawa ini berdifusi melalui

membran luar dan dinding sel yang rentan, lalu mengikat membran sitoplasma

dan mengganggu dan mengurangi kestabilan sel. Hal ini menyebabkan sitoplasma

bocor keluar dari sel yang mengakibatkan kematian sel (Ngajow, dkk. 2013).

Data diatas menunjukkan bahwa fraksi-fraksi dari ekstrak etil asetat buah

parijoto berpotensi menghasilkan senyawa antibakteri, sehingga perlu dilakukan

penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan senyawa aktif antibakteri.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

1. Dari hasil isolasi ekstrak etil asetat buah Medinilla speciosa menggunakan

kromatografi kolom didapatkan 25 fraksi.

2. Hasil pengujian aktivitas antibakteri 25 fraksi terhadap Staphylococcus

aureus dan Escherichia coli dengan metode bioautografi menunjukkan

bahwa terdapat 21 fraksi (fraksi 3-6, 7, 9-25) yang aktif terhadap kedua

bakteri uji, 2 fraksi (fraksi 1 dan 2) yang hanya aktif terhadap

Staphylococcus aureus dan 2 fraksi (fraksi 6 dan 8) yang hanya aktif

terhadap Escherichia coli.

5.2. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai isolasi senyawa aktif

antibakteri yang terkandung dalam fraksi-fraksi dari ekstrak etil asetat

buah Medinilla speciosa .

2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap fraksi aktif antibakteri

dengan menggunakan bakteri Gram positif dan Gram negatif lainnya.

3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai bioaktivitas lainnya dari

fraksi-fraksi tersebut.

57


DAFTAR PUSTAKA

Achmadi, S.S. 2003. Kimia Organik edisi 11. Jakarta : Erlangga.

Ahmad, Tasneef., Swatantra Bahadur S.,S. Pandey.2013. Phytochemical

Screening and Physicochemical Parameters of Crude Drugs : A Brief Review.

International Jurnal of Pharma Research and Review; 2(12):53-60. India

Ajizah, A. 2004. Sensivitas Salmonella Typhimurium Terhadap Ekstrak Daun

Psidium Guajava L. Bioscientiae. Vol.1 (31-38)

Anggana, A.F. 2011. Kajian Etnobotani Masyarakat di Sekitar Taman Nasional

Gunung Merapi. Skripsi. Bogor : Institut Pertanian Bogor.

Ansel, H. C..1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi IV. Universitas

Indonesia, Jakarta,

Cahyani, Vita. 2009. Pengaruh Beberapa Metode Sterilisasi Tanah Terhapad

Status Hara, Populasi Mikrobiota, Potensi Infeksi Mikrorisa dan Pertumbuhan

Tanaman. Jurnal Ilmiah Ilmu Tanah dan Agroklimatologi.

Choma, I.M, Grzelak, E.M. 2010. Bioautographic Detection in Thin Layer

Chromatography. Journal of Chromatography A. Poland : Elseveir.

Ciesla, L. dan Waksmundzka-Hajnos, M. 2009. Two Dimensional Thin-Layer

Chromatography in the Analysis of Secondary Plant Metabolites. Journal of

Chromatography A, 1216: 1035-1052.

Dai, Muhammad.,Fiqhanisa. 2012. Pengaruh Partisi Bertingkat Cair-Cair Ekstrak

Etanol Rimpang Jahe Terhadap Profil Kandungan Senyawa Kimia dan Aktivitas

Antiradikalnya. Naskah Publikasi, UMS.

Dwijosaputro, D. 2010. Dasar-Dasar Mikrobiologi Cetakan 17. Jakarta:

Djambatan.

Departemen Kesehatan RI. 1989. Materia Medika Indonesia V. Jakarta:

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Hal. 549-553.

58


Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : Dirjen

POM Departemen Kesehatan RI.

Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan

Obat. Jakarta : Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan.

Ganiswarna S. G. 1995. Farmakologi dan Terapi ed. 4. Jakarta : UI-Fakultas

Kedokteran.

Gilbert, John C. and Stephen F. Martin. 2011. Experimental Organic Chemistry :

A Miniscale and Microscale Approach. Boston : Cengange Learning.

Gritter, R.J., Bobbit, J.M., & Schwarting A.E,. 1991. Pengantar Kromatografi.

Terjemahan dari Introduction to Chromatography (Padwinata K & Soediro I,

Penerjemah). Bandung : ITB Press.

Handa, S. 2008. Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants

(hal.22-24). Trieste : International Centre for Science and High Technology.

Harborne, J.B.1987. Metode Fitokimia II. Diterjemahkan oleh Kosasih

Patmawinata dan Iwang Sudiro. Bandung : Penerbit ITB.

Harjono, Sastrohamidjojo. 1992. Spektroskopi Inframerah. Yogyakarta : Liberty.

Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok : Departemen Farmasi

FMIPA UI.

Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Jilid 2.

Jakarta.

Ismail, Sabariah. 2011. An Antimicrobial Compound Isolated from Cinnamomum

Iners Leaves with Activity against Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus.

Molecules journal 1420-3049.

Jawetz, M. And Adelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran edisi 20. Jakarta :

EGC.

59


Jones, W. P., Kinghorn, A. D. 2006. Extraction of Plant Secondary Metabolites.

In : Sharker, S.D. Latif Z., Gray A.L, eds. Natural Product Isolation, 2nd Edition.

New Jersey : Humana Press. Pp. 341342.

Kanazawa A, Ikeda T, Endo T. 1995. A Novel Approach to Made of Action on

Cationic Biocides : Morfological Effect on Antibacterial Activity. Jappl Bacteriol

78 : 55-60

Kosela, S. 2010. Cara Mudah dan Sederhana Penentuan Struktur Molekul

Berdasarkan Spektra Data. Jakarta : UI Press.

Kowalska, T., dkk. 2008. Thin Layer Chromatography in Phytochemistry. Boca

Raton : CRC Press.

Krieg, N.R and Holt. J.G. 1984. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol

I. Baltimore. USA.

Lorian, V.1980. Antibiotics in Laboratory Medicine Jilid I. Universitas Indonesia

Press, Jakarta.

Margono, S.A. dan Zandrato, R.N. 2006. Sintesis diasetil gamavuton dengan

menggunakan asetil klorida sebagai acylating agent. Majalah Farmasi Indonesia,

17 (1), 25-31.

Masyhud. 2010. Tanaman Obat Indonesia. http://www.dephut. go.id/indexphp

=id /node/54(diakses tanggal 12 Januari 2011).

Mojab F, Poursaeed M, Mehrgan H, Pakdaman S (2008). Antibacterial activity of

Thymus daenensis methanolic extract. Pak. J. Pharm Sci., 21(3): 210-213

Mukarromah, Nurul. 2015. Uji Aktivitas Antibakteri Beberapa Fraksi Dari

Ekstrak Buah Parijoto Dengan Metode Bioautografi. Jakarta (skripsi) Program

Studi Farmasi UIN.

Natheer, S.E., C. Sekar., P. Amutharaj., M. Syed Abdul Rahman and K. Keroz

Khan. 2012. Evaluation of Antibacterial Activity of Morinda citrifolia, Vitex

60


trifolia and Chromolaena odorata. African journal of Pharmacy and

Pharmacology Vol.6, pp. 783-788

Ngajow, Mercy, dkk. 2013. Pengaruh Antibakteri Ekstrak Kulit Batang Matoa

terhadap Bakteri S.aureus secara In vitro. Jurnal MIPA Unsrat.

Nurwanto dan Djariah, A. S. 1997. Mikrobiologi Pangan Hewan Nabati. Kanisius:

Yogyakarta.

Pardede, Antoni, dkk. 2013. Ekstraksi dan Karakterisasi Pektin dari Kulit Kemiri.

Media Sains Vol 5 No.1.

Pavia,D.L., Lampman, G.M. and Kriz, G.S., 2001, Introduction to Spectroscopy,

Third Edition, Thomson Learning.

Pelczar, M.J. dan E.C.S. Chan. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi jilid 1 dan 2.

Jakarta : UI Press.

Poole, C. 2003. Thin-layer chromatography : challenges and opportunities.

Journal of Chromatography A, 1000: 963-984.

Potter, P.A, Perry, A.G. 2005. Buku Ajar Fundamental Keperawatan : Konsep,

Proses, dan Praktik.Edisi 4.Jakarta:EGC.

Pramita, Diasyti, dkk. 2013. Karakterisasi Senyawa Alkaloid dari Fraksi Etil

Asetat Daun Kesum (Polygonum minus Huds).

Pratiwi, S.,T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga.

Retnaningtyas, E dan S. Mulyani. 2008. Uji Antibakteri Ekstrak Metanol Daun

Senggani (Melastoma candidum, D. Don) terhadap Bakteri Salmonella typhi,

Shigela dysentriae dan Escherichia coli. Laporan Penelitian. Surakarta: LPPM

UNS.

Rohman, Abdul. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar.

61


Rositawati, Agustina L, dkk. 2013. Rekristalisasi Garam Rakyat dari Daerah

Demak untuk Mencapai SNI Garam Industri. Jurnal Teknologi Kimia dan

Industri, vol.2 No.4: 217-225.

Ryan, K.J., J.J. Champoux, S. Falkow, J.J. Plonde, W.L. Drew, F.C. Neidhardt,

and C.G. Roy. 1994. Medical Microbiology An Introduction to Infectious

Diseases. 3rd ed. Connecticut: Appleton&Lange. p.254.

Saifudin, A., Rahayu, V. and Teruna, H.Y. 2011. Standardisasi Bahan Obat Alam.

Yogyakarta: Graha Ilmu.

Sasongko, H & W. Asmara, 2002, Pengaruh Minyak Atsiri Dlingo (Acorus

calamus L.) terhadap Profil Protein Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif,

Teknosains, 15(3): 527-543.

Sherma, J. Dan Fried, B. 2003. Handbook of Thin-Layer Chromatography edisi

ketiga. New York : Marcell Dekker.

Smith-Keary P.F. 1988. Genetic Elaments In Escherichia coli, Macmillan

Molecular biology series, London.

Singh, J. 2008. Maceration, Percolation and Infusion Technique for the

Extraction of Medicinal and Aromatic Plants (Hal 81). Trieste : International

Centre for Science and High Technology.

Staf Pengajar Fakultas Kedokteran UI. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran

Edisi Revisi. Binarupa Aksara, Jakarta.

Stahl, Egon. 1969. Apparatus and General Techniques in TLC. Berlin : Springer-

Verlag.

Stahl, Egon. 1985. Analisa Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi.

Penerjemah : Kosasih Padmawinata. Bandung : Penerbit ITB.

Supratman, Unang. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik Metode

Spektroskopi untuk Penentuan Senyawa Organik. Bandung : Widya Padjajaran.

62


Tjay, T.H. dan K. Rahardja. 2002. Obat-Obat Penting. Khasiat, Penggunaan dan

Efek-efek Sampingnya. Jakarta: Penerbit PT. Elex Media Komputindo Kelompok

Gramedia.

Valgas, Cleidson, Simone Machado de Souza, Elza F A Smania, Artur Smania Jr.

2006. Screening Method to Deterrmine Antibacterial Activity of Natural Products.

Brazilian Journal Microbiologi 38:369-380.

Voight, T. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi edisi V. Alih Bahasa

Noerono, S. Universitas Gajah Mada Press : Yogyakarta. Hal 564.

Volk, W.A dan Margareth, F.W. 1993. Mikrobiologi Dasar Penerbit Erlangga.

Jakarta. hal 200-207.

Wachidah, Leliana N. 2013. Uji Aktivitas Antioksidan Serta Penentuan

Kandungan Fenolat Dan Flavonoid Total Dari Buah Parijoto. Jakarta (skripsi)

Program Studi Farmasi UIN.

Warsa, U.C. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Edisi Revisi. Jakarta :

Penerbit Binarupa Aksara. hal. 103-110.

Wibowo, H.A., Wasino & Dewi Lisnoor Setyowati. 2012. Kearifan Lokal dalam

Menjaga Lingkungan Hidup (Studi Kasus Masyarkan di Desa Colo Kecamatan

Dawe Kabupaten Kudus). Journal of educational Social Studies 1 (1) : 25-30

Zuhud,. 2001. Aktivitas antimikroba ekstrak kedaung (Parkia roxburghii G Don)

terhadap bakteri pathogen, Teknol & Indusri Pangan. XII(1): hal. 6-12

63


Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Medinilla speciosa Blume

64


Lampiran 2. Alur Penelitian

Penyiapan simplisia

Pembuatan ekstrak parijoto denganmetode maserasi dengan metanol dandipartisi dengan n-heksan dan etil asetat.

Ekstrak etil asetat

Pengukuran Kadar Air Skrining FitokimiaFraksinasi dengankromatografi kolom

Uji aktivitas antibakteri dengan bioautografi

Fraksi aktif antibakteri

Pemurnian fraksi dengan rekristalisasi

Uji Bioautografi Elusi

65


Dievaporasi dengan vacum evaporator

Dievaporasi dengan vacum evaporator

Dipartisi dengan 100 ml n-hekksan

Dipartisi dengan 100ml etil asetat

Lampiran 3. Bagan Alur Kerja Ekstraksi dan Partisi Buah Medinilla speciosa

Blume

Buah Medinillaspeciosa segar

disortasi kering

Sampel halus dimaserasidengan metanol 15 L

Buah diblenderdan ditimbang

3,2 kg

Dicuci dengan airmengalir dan

dikeringanginkan

Disaring

Maserat Ampas

Ekstrak kental

Fraksi n-heksan Fraksi metanol

Fraksi etil asetat Fraksi metanol

Ekstrak etil asetat Ekstrak metanolEkstrak n-heksan

Pemisahan dengankromatrografi kolom

66


Difraksinasi denga kromatrografi kolom Fasa diam silika gel 90 g Fase gerak : N-heksana : etil asetat

dengan sistem gradien

Lampiran 4. Bagan Kerja Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom

Ekstrak etil asetat buah Medinilla speciosa sebanyak 19,6 g

F.11-3

F.24-7

F.38-9

F.410-12

F.513-17

F.618-21

F.722-25

F.826

F.927

F.1028

F.1129

F.1230

F.1331-32

F.1433-34

F.1535-36

F.1637-38

F.1739-40

F.1841-49

F.1950

F.2051

F.2152-53

F.2254-56

F.2357-70

F.2471-78

F.2579-84

Uji aktivitas antibakteridengan metode bioautografi

67


Lampiran 5. Bobot Masing-Masing Fraksi Hasil Kromatografi Kolom

Fraksi Gabungan VialNomor

Bobot (g)

1 1 – 3 0,01392 4 – 7 0,55523 8 – 9 0,08894 10 – 12 0,24535 13 – 17 0,02506 18 – 21 0,03637 22 – 25 0,04838 26 0,18289 27 0,294710 28 0,039011 29 0,021812 30 0,011913 31 – 32 0,022514 33 – 34 0,024715 35 – 36 0,099616 37 – 38 0,051717 39 – 40 0,055618 41 – 49 0,340319 50 0,139720 51 0,195521 52 – 53 0,311122 54 – 56 0,184523 57 – 70 1,068024 71 – 78 4,091325 79 – 84 0,9402

68


Lampiran 6. Data Profil KLT Eluat Hasil Fraksinasi dari Ekstrak Etil Asetat

dengan Kromatografi Kolom

No.Eluat

Fase Gerak JumlahSpot

No.Eluat

Fase Gerak Jumlahspot

Gam

bar

(a)

1 n-heksan : etil asetat (8:2) 1

Gam

bar

(b)

26 n-heksan : etil asetat (4:6) 43 n-heksan : etil asetat (8:2) 1 28 n-heksan : etil asetat (4:6) 35 n-heksan : etil asetat (8:2) 4 29 n-heksan : etil asetat (4:6) 27 n-heksan : etil asetat (8:2) 4 30 n-heksan : etil asetat (4:6) 38 n-heksan : etil asetat (8:2) 4 31 n-heksan : etil asetat (4:6) 310 n-heksan : etil asetat (8:2) 4 32 n-heksan : etil asetat (4:6) 312 n-heksan : etil asetat (8:2) 4 33 n-heksan : etil asetat (4:6) 314 n-heksan : etil asetat (8:2) 5 34 n-heksan : etil asetat (4:6) 316 n-heksan : etil asetat (8:2) 5 35 n-heksan : etil asetat (4:6) 318 n-heksan : etil asetat (8:2) 1 36 n-heksan : etil asetat (4:6) 320 n-heksan : etil asetat (8:2) 1 37 n-heksan : etil asetat (4:6) 322 n-heksan : etil asetat (8:2) 2 38 n-heksan : etil asetat (4:6) 324 n-heksan : etil asetat (8:2) 2 39 n-heksan : etil asetat (4:6) 3


No.Eluat

Fase Gerak JumlahSpot

No.Eluat

Fase Gerak Jumlahspot

Gam

bar

(C)


Gam

bar

(e)

71 etil asetat : metanol (8:2) 242 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 72 etil asetat : metanol (8:2) 343 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 73 etil asetat : metanol (8:2) 344 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 74 etil asetat : metanol (8:2) 345 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 75 etil asetat : metanol (8:2) 346 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 76 etil asetat : metanol (8:2) 347 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 77 etil asetat : metanol (8:2) 348 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 78 etil asetat : metanol (8:2) 349 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 79 etil asetat : metanol (8:2) 350 n-heksan : etil asetat (4:6) 2 80 etil asetat : metanol (8:2) 351 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 81 etil asetat : metanol (8:2) 352 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 82 etil asetat : metanol (8:2) 253 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 83 etil asetat : metanol (8:2) 254 n-heksan : etil asetat (4:6) 4 84 etil asetat : metanol (8:2) 255 n-heksan : etil asetat (4:6) 456 n-heksan : etil asetat (4:6) 4

Gam

bar

(d)

57 n-heksan : etil asetat (4:6) 458 n-heksan : etil asetat (4:6) 459 n-heksan : etil asetat (4:6) 460 n-heksan : etil asetat (4:6) 461 n-heksan : etil asetat (4:6) 462 n-heksan : etil asetat (4:6) 463 n-heksan : etil asetat (4:6) 464 n-heksan : etil asetat (4:6) 565 n-heksan : etil asetat (4:6) 566 n-heksan : etil asetat (4:6) 567 n-heksan : etil asetat (4:6) 568 n-heksan : etil asetat (4:6) 569 n-heksan : etil asetat (4:6) 570 n-heksan : etil asetat (4:6) 4

69


Lampiran 7. Bagan Alur Kerja Uji Antibakteri dengan Metode Bioautografi

25 fraksi dari ekstrak etil asetat hasil kromatrografi kolom

Dibuat konsentrasi 50 mg/mL dan ditotolkan sebanyak 10µL keplat KLT

Plat KLT dicelupkan pada cawan petri steril yang berisi suspensibakteri

Plat KLT dipindahkan pada cawan petri steril yang telah berisikapas basah

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC

Disemprotkan INT 2 mg/mL pada permukaan plat

Terbentuk zona berwarna putih – krim pada latar plat yangberwarna ungu atau merah menandakan aktivitas antibakteri

70


Lampiran 8. Hasil Skrining Fitokimia

Ekstrak Etil AsetatAlkaloid Saponin Terpenoid Flavonoid Tanin dan

Polifenol

Pereaksidragendorf→ tidakterbentukendapanmerahjingga (-)

Pereaksimeyer →tidakterbentukendapanputih (-)

Terbentukbusa yangstabil (+)

Tidakterbentukwarna hijaugelap (-)

Terjadiperubahanwarna (+)

Terbentukwarna hijaukehitaman(+)

isolasi fraksi aktif antibakteri dari ekstrak etil...

Documents