BAB IPENDAHULUAN

1.1 Maksud dan Tujuan Percobaan1.1.1Maksud PercobaanPercobaan ini dimaksudkan untuk mengetahui aktivitas antimikroba dari ekstrak tumbuhan terhadap pertumbuhan mikroba uji dan proses isolasi senyawa antimikroba tersebut.1.1.2Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan untuk mengetahui cara-cara isolasi senyawa antimikroba dan tumbuhan penghasil senyawa antimikroba dan pengujian aktivitas senyawa antimikroba dari ekstrak bahan alam.

1.2 Prinsip PercobaanPrinsip percobaan ini adalah menguji daya hambat aktivitas antimikroba dari ekstrak tumbuhan bawang tiwai (Eleutherine americana), temulawak (Curcuma xanthorriza) dan temukunci (Boesenbergia pandurata) dengan metode difusi agar terhadap mikroba uji Escherichia coli, Streptococcus mutans dan Malassezia globosa dengan media agar Potato Dextrose Agar dan Nutrient Agar, lalu diamati zona hambat setelah diinkubasi. Tahap selanjutnya adalah pengujian terhadap bioautografi dengan adanya metode kotak dengan prinsip plat KLT yang telah ditotalkan dengan ekstrak uji dan dielusidasi dengan perbandingan campuran eluen yang sesuai lalu noda yang terbentuk bersama plat KLT ditotolkan di dalam cawan petri yang telah berisi medium dan suspensi bakteri dan jamur selama 45 menit, diangkat plat KLT dan diinkubasi 1x24 jam dan 2x24 jam untuk jamur. Diamati zona bening yang terbentuk disekeliling bekas tempelan plat KLT pada medium agar.

BAB IIIMETODE KERJA

3.1. Alat dan Bahan3.1.1. Alat1. Autoclave1. Batang pengaduk1. Cawan petri1. Cawan porselen1. Chamber 1. Cutter1. Erlenmeyer 100 ml, 250 ml1. Freezer1. Gelas kimia 100 ml1. Gelas ukur 10 ml1. Hair dryer1. Hot plate1. Inkubator1. Jarum1. Kaca arloji1. Labu ukur 10 ml1. Laminar Air Flow (LAF)1. Lampu UV portable1. Mikrometer sekrup1. Mikropipet1. Ose bulat1. Oven1. Pembakar spritus1. Penggaris1. Penutup chamber1. Pinset1. Pipa kapiler1. Pipet tetes1. Rak tabung1. Spatel1. Spoid 10 ml1. Tabung reaksi1. Timbangan analitik1. Tip mikropipet1. Vortex3.1.2. Bahan1. Alumunium foil1. Aquades1. Etil asetat1. H2SO41. Kapas1. Medium Nutrient Agar (NA) sintetik1. Medium Sabouraud Dextrose Agar (SDA) sintetik1. NaCl 0,9%1. N-heksan1. Paper disk1. Plat KLT3.1.3. Sampel1. Ekstrak libo (Piper miniatum BI.)1. Ekstrak miana (Coleus atropurpureus Benth.)1. Ekstrak sirsak (Annona muricata L.)1. Ekstrak temukunci (Boesenbergia pandurata)3.1.4. Bioindikator1. Escherichia coli1. Malassezia globosa1. Streptococcus mutans

1. Prosedur Kerja1. Pembuatan Medium Nutrient Agar (NA)1. Ditimbang 5 gram medium NA sintetik, dilarutkan dengan sedikit aquades di dalam gelas kimia.1. Dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml.1. Ditambahkan aquades sampai tanda batas.1. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk.1. Didinginkan, ditutup dengan kapas dan alumunium foil.1. Disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121C selama 15 menit.1. Pembuatan Medium Sabouraud Dextrose Agar (SDA)1. Ditimbang 6,5 gram medium SDA sintetik, dilarutkan dengan sedikit aquades di dalam gelas kimia.1. Dimasukkan ke dalam erlenmeyer 100 ml.1. Ditambahkan aquades sampai tanda batas.1. Dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih sambil diaduk.1. Didinginkan, ditutup dengan kapas dan alumunium foil.1. Disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121C selama 15 menit.1. Pembiakan Bakteri1. Disiapkan 2 tabung reaksi steril dan biakan murni bakteri Escherichia coli dan Streptococcus mutans.1. Dimasukkan 5 ml medium NA ke dalam masing-masing tabung reaksi dan dimiringkan tabung reaksi 10, lalu didiamkan hingga memadat.1. Diambil 1 ose biakan murni dari masing-masing bakteri lalu digoreskan ke dalam masing-masing tabung reaksi yang telah berisi medium.1. Ditutup tabung reaksi dengan kapas.1. Diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37C.1. Pembiakan Jamur1. Disiapkan tabung reaksi steril dan biakan murni jamur Malassezia globosa.1. Dimasukkan 5 ml medium SDA ke dalam masing-masing tabung reaksi dan dimiringkan tabung reaksi 10, lalu didiamkan hingga memadat.1. Diambil 1 ose biakan murni dari jamur lalu digoreskan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi medium.1. Ditutup tabung reaksi dengan kapas.1. Diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 25C.1. Pembuatan Suspensi Bakteri 1:401. Disiapkan 4 tabung reaksi steril biakan bakteri Escherichia coli dan Streptococcus mutans.1. Dimasukkan 9 ml NaCl 0,9% ke dalam biakan bakteri Escherichia coli, lalu dihomogenkan (tabung I).1. Diambil 5 ml larutan dari tabung I, dipindahkan ke tabung II yang telah berisi 5 ml NaCl 0,9% (suspensi 1:20).1. Diambil 5 ml larutan dari tabung II, dipindahkan ke tabung III yang telah berisi 5 ml NaCl 0,9% (suspensi 1:40).1. Diulangi langkah b hingga d untuk membuat suspensi Streptococcus mutans.1. Pembuatan Suspensi Jamur 1:101. Disiapkan biakan jamur Malassezia globosa.1. Dimasukkan 9 ml NaCl 0,9% ke dalam biakan jamur Malassezia globosa, lalu dihomogenkan (suspensi 1:10).1. Pembuatan Larutan Stok Konsentrasi 5%1. Ditimbang 0,5 gram ekstrak.1. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml.1. Ditambahkan aquades hingga tanda batas, lalu dihomogenkan.1. Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak 1. Konsentrasi 0,5%1. Diambil 1 ml dari larutan stok ekstrak.1. Dimasukkan labu ukur 10 ml.1. Ditambahkan aquades sampai tanda batas, lalu dihomogenkan.1. Konsentrasi 1%1. Diambil 2 ml dari larutan stok ekstrak.1. Dimasukkan labu ukur 10 ml.1. Ditambahkan aquades sampai tanda batas, lalu dihomogenkan.1. Konsentrasi 2%1. Diambil 4 ml dari larutan stok ekstrak.1. Dimasukkan labu ukur 10 ml.1. Ditambahkan aquades sampai tanda batas, lalu dihomogenkan.1. Penyiapan Plat KLT1. Diaktifkan plat KLT dengan cara dipanaskan dalam oven selama 30 menit.1. Dipotong plat dengan ukuran 2 cm x 7 cm dengan cutter.1. Ditandai dengan jarum pentul 0,5 cm pada batas atas plat KLT dan 1 cm dari batas bawah plat KLT.1. Pembuatan Eluen1. Daun Libo n-heksan:etil asetat (3:7) (Polar).1. Diambil 1,5 ml n-heksan, dimasukkan ke dalam chamber.1. Diambil 3,5 ml etil asetat, dimasukkan ke dalam chamber dan dihomogenkan.1. Ditutup chamber kemudian ditunggu hingga jenuh1. Daun Libo n-heksan:etil asetat (7:3) (Non-Polar).1. Diambil 3,5 ml n-heksan, dimasukkan ke dalam chamber1. Diambil 1,5 ml etil asetat, dimasukkan ke dalam chamber dan dihomogenkan.1. Ditutup chamber kemudian ditunggu hingga jenuh1. Daun Sirsak n-heksan:etil asetat (1:3) (Polar).1. Diambil 1,25 ml n-heksan, dimasukkan ke dalam chamber1. Diambil 3,75 ml etil asetat, dimasukkan ke dalam chamber dan dihomogenkan1. Ditutup chamber kemudian ditunggu hingga jenuh1. Daun Sirsak n-heksan:etil asetat (3:1) (Non-Polar).1. Diambil 3,75 ml n-heksan, dimasukkan ke dalam chamber1. Diambil 1,25 ml etil asetat, dimasukkan ke dalam chamber, dan dihomogenkan.1. Ditutup chamber kemudian ditunggu hingga jenuh1. Pengujian Daya Hambat1. Dimasukkan 0,02 ml suspensi bakteri dan 10 ml medium NA ke dalam cawan petri (metode tuang), kemudian dihomogenkan dan didiamkan hingga memadat.1. Diletakkan paper disk yang telah ditetesi dengan larutan ekstrak dari masing-masing konsentrasi dan aquades sebagai kontrol pada permukaan medium di dalam cawan petri.1. Diinkubasi selama 1x24 jam pada suhu 37C.1. Diamati dan diukur zona hambat yang terbentuk dengan menggunakan mikrometer sekrup.1. Dihitung secara statistika dari hasil pengukuran.1. Uji Bioautografi1. Diambil ekstrak menggunakan pipa kapiler lalu ditotol pada garis bawah plat KLT.1. Dimasukan plat KLT kedalam chamber, ditunggu hingga eluen naik sampai garis akhir kemudian diangkat plat dari chamber dan dikeringkan.1. Dilihat perpendaran pada sinar UV 254 nm dan 366 nm.1. Disemprot plat KLT dengan H2SO4 menggunakan alat semprot (plat kontrol).1. Diulangi langkah a dan b untuk plat uji.1. Dimasukkan 0,02 ml suspensi bakteri dan 10 ml medium NA ke dalam cawan petri (metode tuang), lalu dihomogenkan dan didiamkan hingga memadat (untuk bakteri Escherichia coli dan Streptococcus mutans).1. Dimasukkan 0,02 ml suspensi jamur dan 10 ml medium SDA ke dalam cawan petri (metode tuang), lalu dihomogenkan dan didimkan hingga memadat (untuk jamur Malassezia globosa).1. Diletakkan plat uji diatas medium dan didiamkan 30 menit, lalu diangkat.1. Diinkubasi 1x24 jam pada suhu 37C (untuk bakteri) dan 2x24 jam pada suhu 25C (untuk jamur).1. Diamati hasil dan dihitung nilai Rf.Berdasarkan literatur yaitu penelitian yang dilakukan oleh Fitriani (2015) bahwa daun sirsak memiliki kandungan metabolit sekunder yang beraktivitas antibakteri yaitu alkaloid, fenol, flavonoid, tanin, saponin dan triterpenoid. Penelitian ini diperkuat oleh Pathak (2010) yang diterbitkan oleh International Journal of Pharma Research and Development bahwa daun sirsak memiliki aktivitas antibakteri baik terhadap bakteri gram positif maupun bakteri gram negatif.

BAB VIPENUTUP

6.1. KesimpulanBerdasarkan percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:a. Ekstrak temukunci (Boesenbergia pandurata) memiliki aktivitas antibakteri yang signifikan terhadap bakteri Escherichia coli.b. Ekstrak temukunci (Boesenbergia pandurata) memiliki aktivitas antibakteri yang non signifikan terhadap bakteri Streptococcus mutans.c. Ekstrak miana (Coleus atropurpureus) memiliki aktivitas antibakteri yang sangat signifikan terhadap bakteri Echerichia coli.d. Ekstrak miana (Coleus atropurpureus) tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap bakteri Streptococcus mutans.e. Ekstrak daun libo (Ficus variegata) pada metode KLT bioautografi tidak terdapat senyawa hasil pemisahan yang memberikan aktivitas antimikroba terhadap Escherichia coli, Streptococcus mutans dan Malasseizia sp.f. Ekstrak daun sirsak (Annona muricata) metode KLT bioautografi pada noda 1 dengan RF 0 dan noda 3 dengan RF 0,18 memiliki aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dengan eluen n-heksan:etil asetat (1:3).g. Ekstrak daun sirsak (Annona muricata) metode KLT bioautografi pada noda 1 dengan RF 0 dan noda 6 dengan RF 0,81 memiliki naktivitas antimikroba terhadap bakteri Escherichia coli dan noda 2 dengan RF 0,09 terhadap jamur Malasseizia sp. Dengan eluen n-heksan:etil asetat (3:1).

6.2. SaranSebaiknya pengujian dilakukan secara aseptis karena berpengaruh pada hasil pengamatan dan meminimalisir kontaminan dari luar serta perlu dilakukannya identifikasi metabolit sekunder dalam sampel ekstrak sehingga dapat diketahui metabolit yang berperan sebagai antimikroba terhadap mikroba uji.

DAFTAR PUSTAKA

Adila, Rahmi dkk. 2013. Uji NAtimikroba Curcuma sp. Terhadap Pertumbuhan Candida albicans, Staphylococcus dan Escherichia coli. Jurnal Biologi Universitas Andalas Vol 2 No 1

Atun, Sri. 2014. Metode Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Organik Bahan Alam. Jurnal Konversi Cagar Budaya Borobudur Vol 2 No 2

Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesi Edisi IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia: Jakarta

Djide, Nasir. 2008. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Laboratorium Mikrobiologi Farmasi. Universitas Hasanuddin: Makassar

Entjang, Berna. 2001. Mikrobiologi dan Parasitologi. PT. Citra Aditya Bakti: Bandung

Harmita, Maksum Radji. 2008. Buku Ajar Analisis Hayati. EGC: Jakarta

Isa, Shualbu dkk. 2013. Isolation and Indetification of Malassezia globosa. Assosiated eith Dandruff Amony Female Student of Gombe State University. Greener Journal Of Microbiology and Antimicrobials Vol 1 No 1

Joyce, L. 1996. Farmakologi: Pendekatan Proses Keperawatan. EGC: Jakarta

Sumbali, G. 2009. Principle of Microbiology. New Delhi: McGraw Hill