Laporan Praktikum Hari/tanggal : Senin, 10 Maret 2014Struktur dan Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB

PJP : Syaefudin, Ssi, MsiAsisten : Syahrul Mustopa

Puji Rahmadani Mustika Weni

Eva Selenia Desi

PENENTUAN KADAR PROTEIN DENGAN METODE BRADFORD

Kelompok 14

Herlani Tri Widhiastuti G84120046Bella Marisa G84120016Dhani Lutfi R G84120078

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2014

PENDAHULUAN

Protein adalah senyawa organik yang banyak dijumpai kalam semua

makhluk hidup. Protein terdiri dari karbon, hydrogen, dan nitrogen dan umumnya

juga mengandung sulfur. Molekulnya berkisar antara 6000 hingga jutaan. Satu

molekul protein terdiri dari rantai panjang polipeptida. Polipeptida ini berasal dari

asam. Asam amino yang saling berikatan dengan urutan yang khas. Ikantan teratur

yang berurutan ini dinamakan struktur primer protein. Polipeptida dapat melipat

atau menggulung yang menyebabkan timbulnya struktur sekunder. Struktur tersier

asam amino berbentuk tiga dimensi dari polipeptida yang menggulung atau

melipat ini. Struktur kuartener muncul polipeptida yang terlibat. Pemanasan

dengan suhu diatas 500C atau pemberian asam basah kuat akan membuat protein

kehilangan struktur tersiernya yang khas. Hal ini juga dapat menimbulkan

koagulat yang tak larut (misalnya patih telur). Proses ini dapat membuat sifat

hayatinya menjadi tidak aktif. Seiring meningkatnya pH melebihi kenetralan (pH

7), lingkungan yang semakin basa cenderung menetralisasi gugus-gugus karboksil

yang asam dari protein. Seiring menurunnya pH di bawah kenetralan, lingkungan

yang semakin asam cenderung menetralisasi gugus-gugus amino yang basa lagi

(Susan 2007).

Metode analisis protein dapat ditentukan dengan cara kuantitatif dan

kualitatif. Uji kualitatif dapat dilakukan untuk mengetahui keberadaan atau jenis

protein dalam suatu bahan, sedangkan uji kuantitatif dapat dilakukan untuk

mengetahui jumlah kandungan protein dalam suatu bahan. Beberapa jenis uji yang

dilakukan pada protein di antaranya adalah Uji Ninhidrin, semua asaam amino

bereaksi dengan triketohidrindena hidrat (ninhidrin) untuk membentuk aldehida

yang lebih kecil, dengan membebaskan karbon dioksida, ammonia, dan

menghasilkan warna biru violet (untuk prolin dan hidroksiprolin dihasilkan warna

kuning). Uji Biuret, uji ini baik di gunakan untuk uj umuum terhadap protein,

karena uji ini dapat mendeteksi kehadiran ikatan peptida. Uji Xentroprotein,

reaksi ini menyebabkan nitrasi dari inti benzena dalam molekul protein. Uji

Hopkins-Cole, reaksi ini tergantung dari adanya triptofan dalm molekul protein.

Uji Heller, uji ini dapat digunakan untuk menetukan adanya protein secara

kualitatif dan cepat. Uji Bradford, uji Bradford sangat cepat dan menggunakan

jumlah yang sama dengan uji protein pada uji Lowry. Metode Mikro-Kjeldahl,

prinsip metode Kjeldahl adalh mula-mula bahan atau butiran Zn (Lebowitz et al

2002).

Tujuan praktikum praktikum kali ini adalah menentukan kadar protein

dalam suatu sampel dengan metode Bradford dengan menggunakan instrumen

spektrofotometer 20 D dan  kurva standar absorbansi.

METODE PRAKTIKUM

Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Lantai 5. Waktu

praktikum yaitu hari Senin, 10 Maret 2014 pukul 08.00 – 11.00 WIB.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spectronic 20-D,

kuvet, labu takar, pipet tetes, pipet mohr, tabung reaksi, dan gelas piala. Bahan-

bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain reagen Bradford, sampel

protein, BSA (Bovine Serum Albumin), larutan NaCl, dan aquades.

Prosedur Percobaan

Pembuatan larutan. Sebanyak 6 tabung disiapkan dan diisi dengan

larutan standar BSA dan NaCl dengan perbadingan 0:100, 10:90, 20:80, 30:70,

50:50, dan 100:0 dalam satuan µl. Kemudian masing-masing tabung ditambahkan

reagen Braford sebesar 5 µl, kemudian dikocok perlahan dan didiamkan selama 5

menit sampai 1 jam.

Pengukuran absorbansi. Tabung pertama (0:100) dijadikan sebagai

larutan blanko dan sisanya dijadikan sampel percobaan. Masing-masing tabung

diukur absorbansinya menggunakan panjang gelombang 595 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tabel 1 Kurva standar BSATabung Konsentrasi

(mg/ml)Absorbansi terkoreksi

1 0 02 0,1 0,1333 0,2 0,6604 0,3 0,3355 0,5 0,4746 1 0,983

Contoh perhitungan :

Tabung 2

V1.M1 = V2.M2

0,01 ml. 1 mg/ml = 0,1 ml. M2

M2 =0,1 mg/ml

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.20

0.20.40.60.8

11.2

f(x) = 0.856564885496183 x + 0.131035623409669R² = 0.74765797303457

Konsentrasi (mg/ml)

Abso

rban

si

Gambar 1 Kurva standar BSA

Tabel 2 Konsentrasi protein sampel

Sampel Konsentrasi (mg/ml)

Absorbansi

1 0,4471 0,5142 0,4203 0,491

Contoh perhitungan :

Konsentrasi dari persamaan garis

Y = a + bx

0,514 = 0,8566x + 0,131

X = 0,4471 mg/ml

Metode Bradford ialah suatu metode yang dapat digunakan untuk

menganalisis kandungan protein di dalam suatu larutan dengan menggunakan zat

warna Coomassie Blue G-250 sebagai pengikat protein. Zat warna tersebut akan

mengikat protein dan mengubah warna pada larutan yang mengandung protein

tersebut dari warna kemerahan menjadi warna kebiruan. Ikatan yang terjadi antara

zat warna Coomassie Blue G-250 dan protein dapat terjadi dikarenakan adanya

gaya van der walls antara keduanya. Gaya van der walls dapat terjadi karena

adanya bagian protein yang bersifat hidrofobik mengikat bagian dari zat warna

Coomassie Blue G-250 (penyusun reagen Bradford) yang bersifat non polar

sehingga mengakibatkan zat warna tersebut melepaskan elektronnya ke bagian

hidrofobik protein. Selain itu, antara zat warna dan protein juga terdapat kekuatan

ionik yang memperkuat  ikatan antara keduanya dan membuat zat warna tersebut

menjadi stabil. Hal ini lah yang  digunakan pada metode Bradford untuk

menentukan kadar protein di dalam suatu larutan. Kandungan protein yang

berikatan dengan zat warna tersebut dapat diukur dengan menggunakan

instrument spectronic 20 D untuk mengukur nilai absorbansnya pada panjang

gelombang kisaran 465-595 nm. Selanjutnya, nilai absorbans tersebut dapat

digunakan untuk membuat kurva standar yang menjadi dasar penentuan

konsentrasi dan kadar protein di dalam larutan (Bradford 1976).

Metode Bradford memiliki beberapa keuntungan, antara lain keakuratan

dalam menentukan konsentrasi protein yang cukup akurat, mudah diaplikasikan,

sederhana, dan dapat digunakan untuk jumlah sampel yang banyak. Meskipun

akurat, metode Bradford juga memiliki beberapa kelemahan, antara lain senyawa

deterjen ataupun noda yang dapat membuat hasil pengamatan kurang akurat.

Selain deterjen terdapat juga beberapa senyawa kimia yang dapat merusak hasil

pengamatan dengan metode Bradford. Untuk mencegah hal-hal tersebut, peralatan

yang digunakan mesti dibilas beberapa kali hingga dapat dipastikan bahwa tidak

ada bekas yang tersisa (Bintang 2010).

Metode Bradford ini memiliki reagen khusus yaitu reagen Bradford. Reagen ini

tersusun atas larutan 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol

95% dan 100 ml 85% (w/v) asam fosfat diencerkan hingga volume 1 L dengan

aquades. Sebelum digunakan campuran penyusun reagen tersebut disaring oleh

kertas saring whatman nomor satu dan disimpan dalam botol amber (gelap) pada

suhu ruang agar tidak terbentuk endapan, reagen akan stabil setelah beberapa

minggu penyimpanan dan bisa digunakan (Suada 2011).

Hasil percobaan menunjukkan ketidakstabilan nilai absorbansi yang

didapat, hal ini dapat dilihat dari tabel dan grafik yang ada. Nilai absorbansi yang

diperoleh bersifat fluktuatif, yaitu pada tabung pertama dan kedua nilai

absorbansinya meningkat, namun pada tabung ketiga nilai absorbansi sangat

menurun dari 0,660 menjadi 0,335. Kemudian setelah itu nilai absorbansi naik

kembali. Seharusnya seiring bertambahnya konsentrasi sampel maka nilai

absorbansi pun akan meningkat. Ketidak sesuaian tersebut dapat disebabkan

karena adanya kesalahan saat mengocok larutan sehingga kurang homogen, selain

itu juga dapat disebabkan karena larutan sampel terlalu lama didiamkan sehingga

dapat menyebabkan reagen tidak stabil lagi dan mempengaruhi nilai absorban.

Penambahan NaCl berfungsi sebagai pelarut yang akan diukur. Jika NaCl

yang ditambahkan ke dalam larutan Bovine Serum Albumin (BSA) semakin

banyak maka protein yang terlarut akan semaki banyak pula. Hal ini

mengakibatkan pengompleksan antara protein dan zat warna Coomassie Brilliant

BlueG-250 dalam reagen Bradford akan semakin sedikit terjadi (Khopkar 2007).

Selain itu literatur lain juga mengatakan bahwa penembahan NaCl dapat

meningkatkan stabilitas protein (Siswoyo 2006).

SIMPULAN

Metode Bradford merupakan metode yang efektif digunakan dalam

penentuan kadar protein pada larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA)

dengan zat warna Coomassie Brilliant Blue G-250. Metode Bradford

menggunakan kurva standar hubunga antara nilai absorbansi dengan konsetrasi

sampel dalam mg/ml. Nilai absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi

sampel. Semakin banyak penambahan NaCl dalam BSA maka semakin kecil nilai

absorbansi.

DAFTAR PUSTAKA

Bintang M.2010. Biokimia teknik Penelitian. Jakarta (ID): Erlangga.

Bradford MM.1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72: 248-254.

Lebowitz J et al. 2002. Modern analytical ultracentrifugation in protein science. Protein Science.11(9):2067–2079.

Siswoyo TA. 2006. Effect of sodium chloride on thermal properties of 30 kDa protein isolated from melinjo seed. Jurnal Teknologi dan Industri Pangan. 17(3): 214-220.

Suada KI. 2011. Keefektivan ekstrak biota laut Aglaophenia terhadap aktivitas enzim ekstraseluler dan kandungan protein fusarium serta persentase busuk batang vanili. Jurnal Hama Dan Penyakit Tumbuhan Tropika. 11(2): 157 – 165.

Susan E dan Stanstfield W. 2007. Genetika; Edisi keempat. Jakarta (ID): Erlangga.