HPLCHPLC

Iswandi S.Si., M. Farm. Apt.

Fakultas Farmasi USB

HPLC HPLC HPLC HPLC

High Performance Liquid ChromatographyHigh Pressure Liquid ChromatographyKromatografi Cair Kinerja TinggiAtau dapat disingkat LC

Chromatography � teknik pemisahan

Liquid � Fase gerak berupa cairan

High Pressure � digunakan tekanan tinggi

untuk mengalirkan fase gerak melalui kolom

HPLCHPLC

• Dikembangkan pada awal 1970-an• Dewasa ini merupakan teknik paling banyak

digunakan untuk pemisahan dan analisis dari berbagai bidang seperti farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer dan makanan.

• Merupakan “method of choice for the analysis of a wide variety compounds”

Keunggulan dan Kelemahan HPLC Keunggulan dan Kelemahan HPLC

Keunggulan• Dilakukan pada suhu

kamar• Analisis kuantitatif yang

cepat dengan presisi dan akurasi yang tinggi

• Dapat dioperasikan secara otomatis

• Sensitivitas detektor yang tinggi

• Dapat diaplikasikan untuk berbagai analit dalam jenis sampel yang lebih luas

Kelemahan• Sulit ditemukan

detektor yang universal

• Efisiensi pemisahan lebih rendah daripada GC

• Lebih rumit dalam pelaksanaannya

• Lebih mahal

Klasifikasi HPLC Berdasarkan

Mekanisme

Klasifikasi HPLC Berdasarkan

Mekanisme

• Kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography)

• Kromatografi Partisi (partition chromatography) • Kromatografi Pertukaran ion (ion exchange

Chromatography)• Size exclusion chromatography (SEC)

– Kromatografi Permeasi Gel– Kromatografi Filtrasi Gel

Fase normal dan Fase terbalikFase normal dan Fase terbalik

� Normal Phase (Fase normal)� Fase diam polar dan fase gerak non polar� Contoh Fase gerak: Chloroform, heksana

dll.

• Reversed Phase (Fase terbalik)• Fase diam non polar dan fase gerak polar• Contoh fase gerak: air, metanol, asetonitril dll.

Kromatografi Fase NormalKromatografi Fase Normal

• Disebut juga kromatografi cair-padat atau kromatografi adsorpsi (adsorption chromatography)

• Pemisahan didasarkan atas adsorpsi/desorpsi analit pada fase diam polar (silika atau alumina)

• Analit polar lebih tertahan daripada analit non polar karena gugus silanol pada silika.

Kromatografi Fase terbalikKromatografi Fase terbalik

• Pemisahan didasarkan atas koefisien partisi analit dalam fase diam dan fase gerak

• Urutan elusi: analit polar terelusi lebih dahulu, analit non plar terelusi terakhir

• Cocok untuk analisis zat-zat yang larut dalam air, semipolar atau beberapa senyawa non polar.

• Untuk analit berupa ion dapat dianalisis dengan RP-HPLC menggunakan dapar dan teknik pasangan ion (ion-pair).

InstrumentationInstrumentation

Pump

Injector

ColumnDetector

Mobile Phases

Gradient

Controller

•

Instrumentation

Pump

70 mbar

Eluent

Degasser

Gradient mixer

A

A

B

C

B

C

A

B

C

A B C

A B C

Detector

Column

Instrumentation

Fase GerakFase Gerak

• Fase gerak diletakkan dalam botol-botol reservoir.

Fase GerakFase Gerak

• Zat cair yang digunakan sebagai fase gerak harus saling campur.

HPLC Mobile PhaseHPLC Mobile Phase

• High solubility for the sample components• Non corrosive to HPLC system components• High purity, low cost, UV transparency• Others: low viscosity, low toxicity, non

flammability

Reversed-phase mobile phasesReversed-phase mobile phases

• Water• Methanol• Acetonitrile• THF• Additives, salts, acids, bases• Ion pairing

Kemurnian Fase gerakKemurnian Fase gerak

• Diperlukan solvent dengan kemurnian tinggi

• Adanya pengotor (impurities) pada solvent dapat menimbulkan gangguan analisis.

• Gunakan HPLC grade• Air sebagai fase gerak:

digunakan water for injection

Solvent UV Cutoff (nm)

Acetonitrile 190Water 190Cyclohexane 195

Hexane 200Methanol 210Ethanol 210Diethyl Ether 220

Dichloromethane 220

Chloroform 240Carbon Tetrachloride 265

Tetrahydrofuran 280 (220)

Toluene 285

Isocratic elution: Constant mobile phase composition during run

Isocratic and Gradient Elution

Gradient elution: Programme a changing (stepwise or continuous) mobile

phase composition during the run � For more complex

mixtures

Gradient AnalysisGradient Analysis

Advantages:• Better suited for complex samples• Better resolution of early and late eluting peaks• Better sensitivity of late eluting peaks• Higher peak capacity (fit more peaks in the

chromatogram)

Disadvantages• More complex HPLC instrument• Method development, implementation and transfer are

more difficult• Typically longer analysis times since column must be

calibrated with initial mobile phase

DegasserDegasser

• Menghilangkan udara (gas nitrogen dan oksigen) yang terlarut.

• Adanya udara dapat menimbulkan variasi tekanan pada pompa atau timbulnys noise pada detektor tertentu (RID, FLD dan Amperometric Detector)

• Cara: vacuum degassing, pengaliran gas helium atau ultrasonikasi.

Pompa HPLCPompa HPLC

• Pompa Pencampur � untuk menarik solvent fase gerak dari botol reservoir

• Pompa Analisis � mengalirkan fase gerak ke dalam kolom

• Sistem Pompa:– Tekanan Tinggi– Tekanan rendah

van Deemter Equation

H = A + B/u +(Cs + Cm)u

van Deemter Equation

H = A + B/u +(Cs + Cm)u

• H = A + B/u + Cu

A = 2λ dp

� λ depends on particle size distribution, the narrower the distribution the smaller the λ

• dp = particle sizeIndependent of mobile phase flow rate

Also known as eddy diffusion

Skoog and Leary: Principals of Instrumental Analysis, 5th ed. Suanders, 1998

Longitudinal Diffusion (B)

H = A + B/u + Cu

B/u = 2γγγγDM/u

1. γ = constant depending on quality of packing

2. DM is the mobile phase diffusion coefficient

3. Inversely related to mobile phase flow rate

Mass Transfer (Cs + Cm)

H = A + B/u + (Cs + Cm)u

CS = fS(k’)df2 / DS

CM = fM(k’)dp2 / DM

• DM is the mobile phase diffusion coefficient

• DS is the stationary phase diffusion coefficient

• df is film thickness• dp is particle size• Directly related to mobile phase

flow rate

Skoog and Leary: Principals of Instrumental Analysis, 5th ed. Suanders, 1998

Pada : HPLC Mengapa perlu tekanan

tinggi?

Pada : HPLC Mengapa perlu tekanan

tinggi?

• Pada HPLC digunakan ukuran partikel packing kolom (silika) yang sangat kecil, umumnya 3-10um.

• Faktor C pada hukum van Deemter sebanding dengan dp2

• Ukuran partikel makin kecil � luas permukaan makin besar � transfer massa dari fase gerak ke fase diam atau sebaliknya makin besar � kolom semakin efisien dan resolusi peak semakin baik.

• Penggunaan ukuran partikel kecil � diperlukan tekanan tinggi

• Pada kecepatan alir 0.5 sampai 5 ml/menit, panjang kolom 10-30 cm dibutuhkan tekanan 70-400 atm (1000 –6000 psi)

Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)

Units of Pressure

1 pascal (Pa) = 1 N/m2

1 atm = 760 mmHg = 760 torr

1 atm = 101,325 Pa

1 atm = 1,013 bar = 14,7 psi

(Pound-force per square inch)

psi = lb/in2 = 6894.757 Pa5.2

Barometer

Pressure = ForceArea

(force = mass x acceleration)

Sample InjectionSample Injection

– Load and Inject -Position

Load – Inject

Position

Sample InjectionSample Injection

– Load and Inject -Position

HPLC ColumnsHPLC Columns

Column: the key part of the separation

HPLC Column CategoriesHPLC Column Categories

• Column Hardware: Standard or Cartridge, stainless, PEEK, titanium

• Chromatographic Modes: Normal-phase (NPC), reversed-phase (RPC), ion-exchange (IEC), size exclusion (SEC)

• Dimensions (: Prep, semi-prep, analytical, fast LC, micro, nano

• Support Types: Silica, polymer, zirconia, hybrid

HPLC Column: SpecificationHPLC Column: Specification

CS-Chromatographie ServiceMultospher 120 RP-18 HP 5µ

Art.-Nr. xxxx HPLC-column 250x3 mmMultospher 120 RP-18 HP-5Ch. 70801

Column-Nr. 0103-01 Flow --------����

Producer of silica gel

Pore size (Angström)

Modification of silicagel

Particle size in µm

Length x ID

Flow direction

HPLC ColumnsHPLC Columns

• Column Dimensions– Length and internal diameter of packing bed� Short (30-50mm) - short run times, low backpressure� Long (250-300mm) - higher resolution, long run times� Narrow (≤ 2.1mm) - higher detector sensitivity� Wide (10-22mm) - high sample loading

• Particle Shape– Spherical or irregular– Spherical particles � reduced back

pressures and longer column life

HPLC ColumnsHPLC Columns

• Particle Size– The average particle diameter,

typically 3-20µm– Smaller particles offer higher efficiency

but also cause higher backpressure< 2µm � UPLC

• Surface Area– Sum of particle outer surface and interior pore

surface, in m2/gram– High surface area generally provides greater

retention, capacity and resolution – Low surface area packings generally

equilibrate quickly, especially important in gradient analyses.

Van Deemter Plot (smaller particles have smaller A & C terms)

(300 psi)(1300 psi)(10,000 psi)(34,000 psi)

Particle Size and Column Performance

•Pore Size– Average size of pores or cavities in

particles, ranging from 60-10,000Å– Larger pores allow larger solute

molecules to be retained longer through maximum exposure to the surface area of the particles.

– Choose a pore size of 150Å or less for sample MW ≤ 2000.

HPLC Columns: Particle Physical Characteristics

Chromatography Stationary PhasesChromatography Stationary Phases

relatively polar surface

O O O

| | |

−O−Si−O−Si−O−Si−O−H

| | |

O O O

| | |

−O−Si−O−Si−O−Si−O−H

| | |

O O O

bulk (SiO2)x surface

relatively nonpolar surface

Silica Gel

O O O

| | |

−O−Si−O−Si−O−Si−O−R

| | |

O O O

| | |

−O−Si−O−Si−O−Si−O−R

| | |

O O O

bulk (SiO2)x surface

Derivatized Silica Gel

Where R = C18H37

hydrocarbon chain

(octadecylsilyl deriv.

silica or “C18”)

“normal phase” “reversed phase”

Bonded PhasesBonded Phases

• C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3

• CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-CN

• C-18 Octadecyl Silyl -Si-(CH2)17-CH3

• C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3

•Carbon Load– Amount of bonded phase attached to

base material, expressed as %C– Higher carbon loads generally offer greater

resolution and longer run times.– Low carbon loads shorten run times and

many show a different selectivity.

•Endcapping

– “Capping” of exposed silanols with short hydrocarbon chains after the primary bonding step

HPLC Columns: Particle Physical Characteristics

Protection of Siloxane Bonds With Bulky Alkyl Groups

Recommended starting conditions for RP-HPLC

Column: C18 or C8, endcappedParticle Size: 3 - 5µm

Dimensions: �50-100 mm x 4.6 mm i.d � for simple samples (e.g. assays

of the main component)

�100-150 mm x 3.0-4.6 mm i.d � for purity testing or Component of complex samples

�20-150mm x 2.0mm i.d � for LC/MS

Pemeliharaan kolomPemeliharaan kolom

• Kolom umumnya tahan 3-24 bulan atau 1000-3000 x injeksi tergantung jenis fase gerak dan sampel

• Tutup ujung kolom bila tidak dipakai• Cuci kolom sebelum dan sesudah digunakan• Gunakan guard column (jika bekerja dengan

sampel-sampel kotor)• Untuk kolom silika, jangan bekerja di luar pH yang

diperbolehkan • Hindari bekerja pada temperatur tinggi

HPLC Detectors

• To detect the separated analytes

An ideal Detector:• UNIVERSAL (i.e. detects everything)• SENSITIVE (i.e. detects a very small amount of analytes)• LINEAR RESPONSE (i.e. linear relationship between

intensity of response and amount of analyte).• give STRUCTURAL INFORMATION (i.e. tell you what the

analyte is, even if you didn’t know beforehand).

HPLC DetectorsHPLC Detectors

• UV-Vis Detector• Photodiode array Detector (PDA = DAD)• Refractive Index Detector (RID)• Fluorescence Detector (FLD)• Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)• Electrochemical Detector (ECD)• Conductivity Detector• Radiometric Detector

Hyphenated Systems• LC-MS; LC-MS/MS; LC-NMR

HPLC DetectorsHPLC Detectors• UV-Vis

– Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105)– Can be used with gradient elution– Requires chromophore

• Refractive Index– Poor detection limits (100-1000 ng; linear range 102)– Isocratic only– Nearly universal detection

• Evaporative Light Scattering– Good detection limits (0.1-1 ng; linear range 105); – Non-linear calibration required– Can be used with gradient elution– Nearly universal detection

Pilihan pertama ���� UV/Vis atau DAD Untuk analit non chromophor ���� RID atau ELSD

UV-Vis DetectorUV-Vis Detector• Paling banyak digunakan• Tersusun dari Lampu deuterium, monokromator dan flow

cell• Monokromator terdiri dari grating atau prisma yang dapat

bergerak dan dapat memilih panjang gelombang spesifik yang masuk melalui celah (slit)

• 190 – 600nm• Ditambah lampu tungsten untuk meningkatkan

sensitivitas pada daerah visibel.• Macam UV-Vis:

– Fixed wave length– Variable wave length– Multiple variable wave length– Photo diode-array

UV-Vis DetectorUV-Vis Detector

Lamp

Grating

Flow cell

Reference diode

Sample diode

Cut-off filter

Holmium oxide filter

Slit

Mirror 2

Mirror 1

UV-VIS Diode Array Detector

PDAPDA

• Disebut juga diode array detector• Untuk mengukur spektrum UV dari peak yang

terelusi• Mampu melakukan identifikasi peak• Sensitivitas detektor lebih rendah pada model

terdahulu tetapi pada model terkini memiliki sensitivitas tinggi

• PDA umumnya menggunakan charge coupled diode-array with 512-1,024 diode (or pixels) �mampu resolusi spektro 1 nm.

PDAPDA

• Dengan software pengevaluasi spektra � dapat menampilkan kromatogram dan spektra sampel

• Dapat mengenali panjang gelombang maksimum, peak matching (menghitung match factor atau MF), library search dan evaluasi kemurnian peak (peak purity)

• Dapat menampilkan 3-D spektra dan countor maps.

Overlay spectraOverlay spectra

nm200 250 300 350 400

Peak Purity test: HPLCPeak Purity test: HPLC

• Spektra UV/Vis analit dan zat standar (authentic reference material) dengan diode array detector � overlay �Evaluasi korelasinya (r, MF, FTIR, MS)

• Pengukuran spektra pada “upslope, apex dan down slope”

• Peak harus “pure”

Match FactorMatch Factor

• MF = 1000 � r = 1 �100% pure peak• MF > 990 � pure• MF < 900 � not pure• 900 < MF < 950 � contaminated

Pure and Impure HPLC peaks

• Peak purity tests can also be evaluated with

– The 3D-spectra of Photodiode array detectors

– Mass spectrometry

Comparison by 3 Point Spectrum

Acetyl Salicylic AcidAcetyl Salicylic AcidAcetyl Salicylic AcidAcetyl Salicylic Acid

down slope

up slope, peak top

Refractive indexRefractive index

• Mengukur perubahan indeks refraksi antara sel sampel yang mengandung analit yang terelusi dengan sel pembanding.

• Sensitivitas lebih rendah (0,01-0,1 ug) • Dapat mendeteksi hampir semua senyawa dan digunakan

umumnya untuk analit yang memiliki gugus kromofor lemah seperti gula, trigliserida, asam-asam organik dll.

• Detektor standar untuk GPC• Tidak dapat digunakan untuk gradien

Refractive Index Detector

Evaporative Light Scattering Detector

Memilih Panjang Gelombang

Detektor UV

Memilih Panjang Gelombang

Detektor UV

Pemilihan Panjang Gelombang (UV)

????