Marlia Singgih WibowoSekolah Farmasi ITB

16 Juni 2009

PENDAHULUANPrinsip Praktek Pengujian yang Baik(Good Analytical Practices) :Pengujian dilakukan untuk memenuhi suatu tujuan tertentu

atau kebutuhan penggunaa. Pengujian dilakukan dengan menggunakan metode, 

prosedur dan peralatan yang telah teruji untukmenjamin kesesuaian dan tujuan pengujian

b. Pengujian dilakukan oleh personel yang memilikikualifikasi dan kompeten

d. Hasil pengujian harus ajeg atau konsisten, tidakdipengaruhi oleh faktor lokasi, personel dan peralatan

e. Laboratorium penguji harus mempunyai prosedurjaminan dan pengendalian mutu yang memadai

f. Laboratorium penguji harus diuji dan dievaluasi olehbadan yang kompeten dan tidak memihak (akreditasi)

Validasi Metode AnalisisDefinisi :Validasi Metode Analisis adalah proses pembuktianatau konfirmasi pengujian yang obyektif diLaboratorium, dan bahwa metode itu memenuhipersyaratan yang telah ditentukan, yang sesuaidengan tujuan penggunaannya.

Validasi Metode Analisis (lanjutan)

Tujuan :Mengevaluasi kinerja metode : kepekaan, selektivitas, akurasi, presisi, dll., sekaligus menguji kelemahan danketerbatasan metodeMenguji faktor‐faktor yang dapat mempengaruhikinerja metode dan mengetahui besarnya pengaruhitu terhadap hasil analisisMelakukan verifikasi atau membuktikan kinerjametode analisis baku yang diadopsi/digunakanlaboratorium

Validasi Metode Analisis (lanjutan)

Syarat :Menggunakan instrumen dan peralatan yang terkalibrasiDilaksanakan oleh personnel yang kompeten

Jenis Validasi MetodeValidasi primer dilakukan jika laboratoriummenggunakan metode analisis “baru” hasilpengembangan , atau metode yang di modifikasiterhadap suatu metode standard. Validasi sekunder dilakukan untuk verifikasi, jikalaboratorium menggunakan atau mengadopsi metodestandard yang telah divalidasi.

Pedoman Validasi Metode AnalisisMikrobiologi

Farmakope Indonesia edisi 4, 1995The United States Pharmacopeia (USP) 30, 2008 or new editionISO/IEC 17025:2005: General recommendations regarding the proficiency of test and calibration laboratoriesInternational Conference on Harmonization, 1996Method Validation of Microbiological Methods, guidance note : C & B and ENV 002, Singapore Accreditation Council, July 2002.Feldsine, et.al., AOAC International method Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Method of Analysis, Journal of AOAC International Vol.85, No.5, 2002

Thompson, M., Ellison, S.L.R. and Wood, R.: HarmonisedGuidelines for Single‐Laboratory Validation of Methods of Analysis, Pure Appl. Chem., 74, 835‐855 (2002).Kromidas, S.: Handbook of Validation in Analysis, VerlagWiley‐VCH, Weinheim, ISBN 3‐527‐29811‐8 (2000).Water quality – Guidance on Validation of Microbiological Methods, Technical Report, ISO/TR 13843 : 2000.Procedure for The Estimation and Expression of Measurement Uncertainty in Chemical Analysis, Nordic Committee on Food Analysis, NMKL, No.5, 1997.APHA Standard methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed., 1998.Acuan lain yang relevan

Parameter Validasi metodeanalisis mikrobiologi

Akurasi – KecermatanPresisi (repeatability, reproducibility dan intermediate precision) – KeseksamaanSensitivitas – (limit deteksi, limit kuantifikasi)‐KepekaanSelektivitas dan SpesifisitasLinearitasRentang Hitung yang diterima (acceptable) (batas atas dan batas bawah dari rentang perhitungan)Robustness (Ketegaran) metodeRuggedness (Ketangguhan) metode

Metode Analisis MikrobiologiKualitatif :Uji langsung  terhadap mikroba indikatorMetode kultur untuk identifikasi makroskopik dan mikroskopikMetode alternatif (Dye‐reduction Test, Electrical Methods, ATP Determination)Metode Cepat deteksi mikroba spesifik dan toksinnya  (metode imunokimia, metode biologi molekuler)

Kuantitatif :Angka Lempeng Total (Total Plate Count)MPN (Most Probable Number)Uji potensi antibiotikUji sterilitas Uji koefisien fenol (uji desinfektan dan antiseptik)Uji efektivitas pengawet 

Metode kuantitatif

Metode analisis yang responsnya berupa jumlah darianalit , baik yang diukur secara langsung (misalnya : enumerasi mikroba) maupun secara tidak langsung(misalnya : Nilai Absorbans, intensitas warna, diameter hambat , impedansi, dll)

Contoh hasil uji potensi antibiotik

Tahap Persiapan ValidasiSebelum validasi dilakukan, hendaknya laboratoriummenyediakan atau menyiapkan beberapa hal :1. Mikroorganisme target atau acuan (lihat SR‐02 :

persyaratan tambahan untuk akreditasilaboratorium, Pengujian Kimia dan BiologiSNI 17025, DP.01.16, Januari 2004)

2. Peralatan dan Instrumen ukur yang telah dikalibrasi3. Personel yang kompeten4. Program Statistika untuk menghitung, 

mengevaluasi dan menginterpretasikan hasilpengujian

Akurasi (Kecermatan)Definisi :Akurasi adalah kemampuan metode untuk mengukurdan mendeteksi nilai aktual atau nilai sebenarnya darimikroorganisme target dalam sampelAkurasi merupakan ukuran ketepatan atau kedekatanhasil pengujian dengan hasil yang sebenarnya

Akurasi (Kecermatan) (lanjutan)Rekoveri (Recovery) = Persen perolehan kembali% Rek = H/A  x  100

Galat Relatif : (H – A)/A   x  100H = hasil pengujian dengan metodeA = hasil sebenarnya dari mikroorganisme target

Rekoveri Relatif :  H/B  x  100H = hasil pengujian metodeB = hasil pengujian metode standard

Akurasi (Kecermatan) (lanjutan)Cara pengujian :Spiked‐placebo Recovery MethodStandard  Addition Method

Menggunakan 9 kali pengukuran ( 3 level konsentrasidengan 3 replikasi)

Perhitungan

% Rekoveri = Hsl.metode uji x   100%

Hsl teoritis

= 125/125   x   100%  = 100%

% Rekoveri relatif =   Metode uji x    100%Metode baku

= 125/125  x   100%  =  100%

Presisi (Keseksamaan)

DefinisiPresisi adalah tingkat kesesuaian antara hasilpengujian individual dengan hasil rata‐rata pengujianberulang pada sampel yang homogen dengan kondisipengujian yang samaPresisi : keterulangan (repeatability), ketertiruan(reproducibility), keseksamaan antara (intermediate precision)

Presisi (Keseksamaan) (lanjutan)Cara PerhitunganSimpangan baku relatif (SBR = Relative Standard Deviation=RSD) untuk intermediate precision KV =  100 x SBR  

Sensitifitas dan Spesifisitas

Sensitifitas (Kepekaan) : Kemampuan metode untukmendeteksi/mengukur mikroorganisme target dalamjumlah sekecil mungkinSpesifisitas (Kemenjenisan): Kemampuan metodeuntuk mendeteksi/mengukur mikroorganismetertentu secara cermat dan seksama dengan adanyamikroorganisme asing atau bahan/matriks lain

Rentang Hasil PengujianRentang menunjukkan nilai terendah dan tertinggihasil pengujian yang dapat ditentukan dengan cermatdan seksama

Batas terendah (Lower limit) Hasil analisis / pengujian terendah yang ditandaidengan galat analisis 20,0% dari rata‐rata (pengukuran minimal 3 kali)

Batas tertinggi (Upper limit)Hasil analisis /pengujian koloni tertinggi yang masih dapat dihitung dengan cermat dan seksamaditandai dengan galat analisis 15,0% dari rata‐rata (pengukuran minimal 3 kali)

Rentang hasil pengujian

Linearity (Kelinieran)

Keliniearan adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalamrentang konsentrasi memiliki respon analit yang proporsionaldengan konsentrasi, secara langsung ataupun melaluitransformasi matematika

Kurva baku disiapkan dan dianalisis 3  kali dengan konsentrasiantara 50 – 150% kadar aktual (FDA), untuk penentuan kadardalam sampel, tiga larutan baku digunakan : 80, 100 dan 120% konsentrasi target

Linearity (Kelinieran) (lanjutan)

ParameterKurva baku, dengan persamaan garis (regresi linear, logaritma atau polinomial)Kepekaan analisis , F = ∆ y/ ∆ x untuk setiapkonsentrasi pada kurva bakuSimpangan baku residual garis regresi

Sy/x = [∑(y‐ŷ)2/n‐2]1/2

y = respon analitŷ = dihitung dari persamaan garis regresi

Linearity (Kelinieran) (lanjutan)Koefisien variasi fungsi regresi

Vx0 =  S y/x .  100%   , (Vx0 ≤ 2%)b.x

Koefisien korelasi ( r ≥ 0,999)

Linearity (Kelinieran) (lanjutan)

Perhitungan KadarDiameter Hambat

Log Ci

xx

xx

x

a. Menggunakan persamaan garis

D = b log C + a

log Cs = (Ds – a)/ b

dimana :

Cs = kons. analit dlm sampel

Ds = Diameter hambat

b.   Menggunakan satu larutan bakudan larutan blangko

log Cs = (Ds – a)/(Db – a) . log Cb

dimana :

Cb = kons. analit dlm lar.baku

Robustness (Ketegaran) metodePengujian Ketangguhan sebenarnya harus dilakukanpada saat fase pengembangan metode dan tergantungpada faktor‐faktor yang berpengaruh pada pengujianJika pengujian sangat peka terhadap perubahan dalamkondisi analisis,maka kondisi pengujian hendaknyadikendalikan atau dilakukan dengan penuh kehati‐hatianHasil pengujian dievaluasi secara Statistikamenggunakan ANOVA atau Algoritma dari Yate

Robustness (Ketegaran) metode (lanjutan)nJenis keragaman kondisi pengujian yang harusdiperhatikan :

Stabilitas sampelPengaruh suhu inkubasiPengaruh waktu inkubasiKondisi aerobik atau anaerobik (untuk pengujianmikroba tertentu)Pengaruh jenis media (nutrisi), dll

Ruggedness (ketangguhan)Terminologi lama = Intermediate precisionBila suatu metode analisis telah diuji reproducibility nya melalui uji antar Lab/uji kolaborasi, makaRuggedness tidak diperlukan lagi

Faktor yang mempengaruhi hasil ujipotensi dengan metode lempeng agar

Penyiapan larutan bakuKetebalan agarKonsentrasi inokulumTemperatur‐waktuKomposisi mediapH

Questions regarding antibiotic potency assay

What different antibiotic potency assay methods are read and calculated? 

USP (United States Pharmacopoeia), EP (European Pharmacopoeia), BP (British Pharmacopoeia), JP (Japanese Pharmacopoeia), AOAC (American Association of Analytical Chemists), US‐CFR (Code of Federal Registry) and a custom single plate method.  

•Is plate to plate variation accounted and corrected for in USP method calculations? 

Yes. Sometimes the depth of agar, temperature differences in an incubator, or other factors may result in conditions that should be corrected in the calculations of sample concentrations. This is automatically performed by the standard sample layout and calculations in the USP/CFR/AOAC methods. 

What purpose does the standard curve graph serve? (USP/CFR/AOAC only) 

The standard curve graph is performed to help the user where the standard and unknown samples are plotted relative to the curve. The graph is not used for calculations; the calculations are performed by mathematical formulas

Can samples be put onto paper disks, into wells cut in the agar, and into metal cylinders? 

Yes, liquid samples may be placed in any of these. Some method guidelines specify which of these may be used

ContohBMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1. Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472‐6904‐9‐1.PMCID: PMC2640365Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.

Application of microbiological assay to determine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics

Andres F Zuluaga,1,2 Maria Agudelo,1 Carlos A Rodriguez,1,2 and Omar Vesga1,3

1GRIPE: Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas, University of Antioquia, Medellín, Colombia

2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Antioquia, Medellin, Colombia3Section of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Antioquia, Medellin, ColombiaCorresponding author.Andres F Zuluaga: andreszuluaga@une.net.co ; Maria Agudelo: mariaag10@yahoo.com ; Carlos A Rodriguez: 

andreios@yahoo.com ; Omar Vesga: omar.vesga@siu.udea.edu.co

Received June 14, 2008; Accepted January 16, 2009.

Metode

Pengujian dilakukan berdasarkan variasi konsentrasiterhadap efek inhibisi pada bakteri uji : Bacillus subtilisATCC 6633,  Staphylococcus  aureus ATCC 6538p  danStaphylococcs epidermidis ATCC 12228, yang ditumbuhkan pada media agar (Difco™ Antibiotic Media), menghasilkan hubungan linear antara konsentrasi zat ‐respons e linear dengan dua parameter : y‐intercept (concentration) and slope (potency).  Dibandingkan dua parameter tersebut dari 22 product generik (amikacin 4, gentamicin 15, and vancomycin 3 produk) dengan sediaan pembanding by Overall Test for Coincidence of the Regression Lines (Graphpad Prism 5.0).

Pengolahan data dalam proses validasi

Ditentukan linearity, limit of quantification, precision, accuracy, dan specificity utk menvalidasimethod for testing pharmaceutical equivalence. Untuk tujuan tersebut,  log‐transformed concentrations (x‐axis, log10 mg/L) dari setiap produkdiplot terhadap masing‐masing diameter hambat nya(y‐axis, rata‐rata  diameter dalam mm); intercept (perpotongan dan kemiringan/slope garis regresilinear yang diekspresikan dengan persamaan y = b + mx, dengan b sebagai nilai y‐intercept dan m sebagainilai kemiringan nya

5 Konsentrasi yang digunakan untuk masing‐masingantibiotik : 0.5 – 256 mg/L (amikacin), 0.125 – 64 mg/L (gentamicin), dan 0.25 – 128 mg/L  (vancomycin)  The goodness of fit to the model (linearity) : dinyatakan dalam coefficient of determination (r2) dan standard error of estimate (Syx). Dihitung pula x‐intercept (log10 mg/L) dankemiringan garis regresi dengan kepercayaan 95% confidence intervals (95% CI)

ResultsValidasi metode menghasilkan linearitas (r2 ≥ 0.98), precision (intra‐assay variation ≤ 11%; inter‐assay variation ≤ 10%), accuracy, and specificity tests , sesuai dengan syarat international pharmacopoeial . Kecuali pada vancomycin yang ditambahkan 25%  API (Py‐intercept = 0.001), penentuan potensi antibiotikmenunjukkan hasil yang ekuivalen. 21 sediaan generikmemberikan undistinguishable  slopes  danintercepts (P > 0.66). Estimasi potensi antibiotik: amikacin 99.8 ‐ 100.5 , gentamisin 99.7 ‐ 100.2,  dan vancomycin 98.5 ‐ 99.9%

Vancomycinconcentration (mg/L)

Inhibition zone diameters (mean in

mm ± SD)

Coefficient of variation (%) Intra-day

Coefficient of variation (%) Inter-day

128 18.00 ± 0.04 8.3 10.3

64 16.33 ± 0.02 5.6 10.5

32 14.16 ± 0.11 11.0 1.0

16 11.62 ± 0.37 7.4* 2.3

8 9.59 ± 0.00 4.6 6.5

Precision of the vancomycin bioassay

*An outlier value was excluded from the calculations (we only used five data to compute the CV)

BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1. Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1.Copyright © 2009 Zuluaga et al; licensee BioMed Central Ltd.

Kurva baku masing2 antibiotik

Penetapan nilai potensi antibiotik

Terima kasih

Sekolah Farmasi ITBGedung Yusuf Panigoro

Lab.Tek VII Jalan Ganesa 10 BandungTelp./Fax. +62‐22‐2504852marlia@fa.itb.ac.id

0816611886