BAB 1. PENDAHULUAN1.1 Latar BelakangBioinformatik merupakan suatu studi interdisiplin yang mempelajari analisis kuantitatif dari informasi yangberkaitan dengan makromolekul biologi, ditunjang oleh perangkat komputer. Komputer berperan untuk menyimpan, mendapatkan kembali, memanipulasi,dan mendistribusikan informasi yang berkaitan dengan makromolekul biologi, seperti DNA, RNA dan protein. Peranan komputer sangat diperlukan karena kebanyakan analisis data genomik memerlukan pengulangan tinggi ataupun fungsi matematika yang kompleks (Attwood, dan Parry,1999).Bioinformatik berbeda dari komputasi biologi. Bioinformatik terbatas pada analisis sekuens, struktur dan fungsi gen dan genom dan produknya, sedangkan komputasi biologi meliputi semua area penelitian biologi yang memerlukan komputer, seperti memodelkan ekosistem, populasi, dinamika, perilaku ataupun kekerabatannya (Rao, 2008).DiIndonesia perkembangan bioinformatika belum cukup menggembirakan karena hanya sebatas dipahami dan diaplikasikan oleh peneliti biomolekuler yang mengharuskan mereka untuk menggunakan perangkat bioinformatika sebagai tools dalam analisis data. Aplikasi TI dalam bidang biomolekuler telah melahirkan bioinformatika dan kajiannya tidak bisa lepas dari perkembangan biomolekuler modern yang ditandai dengan kemampuan manusia untuk memahami genom, yaitu cetak biru informasi genetik yang menentukan sifat setiap makhluk hidup yang disandi dalam bentuk pita molekul DNA. Kemampuan untuk memahami dan memanipulasi kode genetik DNA ini sangat didukung oleh TI melalui perangkat keras maupun lunak. Hal ini bisa dilihat pada upaya Celera Genomics, perusahaan bioteknologi Amerika Serikat yang melakukan pembacaan sekuen genom manusia yang secara maksimal memanfaatkan TI sehingga bisa melakukan perjalanannya dalam waktu singkat, dibanding usaha konsorsium lembaga riset publik AS, Eropa, dan lain-lain yang memakan waktu lebih dari 10 tahun (Michelia, 2011).Permasalahan pangan di Indonesia bukanlah suatu hal yang dapat dianggap remeh. Kompleksitas masalahnya dimulai dari kecilnya lahan pertanian, minimnya produktivitas tanaman pangan, birokrasi pertanian yang kurang menguntungkan petani, mahalnya harga komponen pertanian, kegagalan program diversifikasi pangan, dan segudang masalah lainnya. Berkaitan dengan permasalahan produktivitas pangan, mungkin Indonesia patut mencontoh negara-negara maju seperti Amerika Serikat, negara-negara Eropa Barat, dan Jepang. Mereka merupakan negara yang sangat meningkatkan produktivitas tanaman pangannya karena sangat menerapkan ilmu bioteknologi pertanian dan bioinformatika (Michelia, 2011).1.2 Rumusan MasalahDari latar belakang di atas, maka dapat ditarik rumusan masalah sebagai berikut :a. Apa yang dimaksud dengan Bioinformatika?b. Bagaiamana peran bioinformatika pada buah kakao?c. Bagaimana karakterisasi sekuen gen inhibitor proteinase pada buah kakao?1.3 TujuanTujuan penyusunan makalah ini adalah,untuk mengetahui-hari. Selain itu,penyusunan makalah ini digunakan untuk mengetahui peran bioinformatika pada kehidupan seharanalisis dan karakterisasi sekuen gen inhibitor proteinase pada kulit buah kakao.

BAB 2. PEMBAHASANa. Definisi BioinformatikaBioinformatika berasal dari kata bio dan informatika yang merupakan gabungan dari ilmu biologi dan teknik informasi (IT). Teknologi bioinformatika ini bertujuan untuk mengaplikasikan data-data dari alat komputasi melalui suatu analisa untuk menangkap dan menginterpretasikan data-data biologis yang terkandung dibalik sistem nyata yang ada di setiap makhluk hidup. Bioinformatika sekarang ini digolongkan sebagai disiplin ilmu baru yang mencakup tak hanya ilmu komputer dan biologi sebagai dasar dunia kedokteran, namun juga matematika dan fisika yang secara bersama-sama diintegrasikan pada suatu aplikasi dalam membuka aspek-aspek yang belum terjelaskan dalam ilmu terapi konvensional. Rujukan terbesarnya merupakan bentuk terkecil dari makhluk hidup yang dikenal sebagai gen, yang meliputi DNA dan RNA sebagai protein yang membentuk sel makhluk hidup itu sendiri. Perangkat pendukungnya sendiri sebenarnya tak serumit penjelasan atas namanya. Ada software yang dilahirkan dari banyak penelitian gabungan untuk mendeteksi bentuk biologis terkecil itu, yang kemudian diaplikasikan dalam sejumlah software lain untuk mempetakan setiap data yang tersedia (Cohen, 2004).Latar belakang maraknya teknologi ini juga didorong oleh penemuan atas pemetaan gen manusia yang dikenal sebagai genome project oleh para pencetusnya yang hingga kini telah berhasil mendata pembacaan gen makhluk hidup dari tingkat paling rendah ke yang paling tinggi, dimana gen manusia sendiri terdiri dari 2.91 juta bp (pasangan basa dalam protein pembentuk gen tersebut). Tingkat akurasinya dinilai banyak ahli cukup tinggi dalam menentukan sifat-sifat biologis yang secara mendasar bisa berbeda-beda pada tiap individu, dan nantinya akan berhubungan dengan penentuan terapi dan perjalanan penyakit. Proses ke arah sana mungkin mutlak menjadi milik orang- orang yang memahami sepenuhnya ilmu-ilmu terapan ini (Sofyan, 2012).

Teknologi rekayasa genetika merupakan salah satu bidang yang sangat membutuhkan riset bioinformatika. Sekuens gen unggul pada suatu organisme agar dapat disisipkan ke organisme lain yang diinginkan dapat ditentukan melalui analisis genomik dari basis data genom organisme tersebut. Analisis genomik merupakan salah satu ranah bioinformatika. Revolusi pertanian dapat mengubah paradigma pertanian konvensional dengan menghasilkan spesies tanaman pangan unggul hasil rekayasa genetika (Singh, 2011).b. Peran Bioinformatika Pada Buah KakaoKakao adalah komoditas yang secara sosial maupun ekonomi penting bagi Indonesia. Namun, usaha peningkatan produksi kakao di Indonesia terkendala antara lain oleh adanya serangan hama penggerek buah kakao PBK (Conopomorpha cramerella). Untuk menanggulangi serangan PBK tersebut perlu adanya satu cara pengendalian yang efektif dan efisien, sehingga dapat mendorong usaha pengembangan bahan tanaman yang tahan PBK. Karena sampai saat ini belum ada cara yang efisien untuk mengendalikan hama PBK. Pemakaian pestisida diyakini kurang efektif karena hama target dapat bersembunyi di dalam buah yang tidak terjangkau oleh penyemprotan. Pemakaian agensia biologis sering kurang konsisten hasilnya. Penerapan pangkas eradikasi kurang disukai oleh para pekebun karena mengurangi pendapatan pekebun kecil. Sementara itu,cara sarungisasi tergolong padat tenaga kerja yang kurang sesuai untuk perkebunan besar. Serta masih banyak cara-cara yang masih belum memberikan hasil yang nyata dan efektif terhadap hama PBK. Sulitnya pengendalian hama yang penyebarannya cepat ini, mendorong usaha penemuan tanaman kakao tahan PBK (Sofyan, 2012).Ada beberapa cara yang dapat dilakukan untuk menguji kembali ketahanan klon-klon harapan tersebut. Efikasi bibit klonal dari klon-klon harapan tahan terhadap hama tersebut dengan cara penanaman kembali di daerah serangan PBK hingga tanaman perbanyakan berbuah. Setelah itu dilakukan evaluasi tingkat serangan PBK terhadap buah kakao. Cara ini dapat memberikan indikasi langsung mengenai ketahanan tanaman terhadap hara tersebut. Namun demikian, hal ini memerlukan waktu yang relatif lama karena memerlukan proses perbanyakan tanamandan waktu hingga tanaman dapat berbuah. Selain itu juga memerlukan lahan yang luas. Cara yang lebihefisiendapat ditempuh dengan menggunakan penanda molekuler. Penanda yang demikian dapat dikembang-kan atas dasar sekuen gen yang menentukan gen ketahanan hama semacam ini, seperti gen inhibitor proteinase (Park& Thornburg, 1996).Beberapa peneliti telah menemukan cara yang lebih efisien penanggulangan serangan terhadap buah kakao yang ditempuh menggunakan penanda molekuler. Penanda yang demikian dapat dikembangkan atas dasar sekuen gen yang menentukan gen ketahanan hama semacam ini., seperti gen inhibitor proteinase (PIN). PIN diketahui memiliki peranan yang penting dalam sistem pertahanan tanaman terhadap predator dan pathogen. Protein yang temakan oleh hama target akan berinteraksi dengan protease dalam usus hama target sehingga akan terikat dan terkunci pada situs aktif protease. Dengan demikian karena asam amino yang mudah diserap tidak dapat dihasilkan oleh proteasenya, hama menjadi kekurangan nutrisi sehingga pertumbuhan dan perkembanganya terhambat (Mollah, 2004).

c. Karakterisasi Sekuen Gen Inhibitor Proteinase Pada Buah KakaoBioinformatika sebenarnya merupakan ranah ilmu yang tergolong baru dan belum banyak berkembang di Indonesia. Bioinformatika merupakan gabungan antara ilmu biologi dengan informatika, dimana hasil penelitian biologi dibentuk menjadi data digital dan kemudian diolah untuk menghasilkan suatu informasi baru. Bioinformatika membantu kehidupan manusia dalam berbagai hal, contohnya saja dalam peningkatan produksi pangan atau pertanian. Revolusi pertanian dapat mengubah paradigma pertanian konvensional dengan menghasilkan spesies tanaman pangan unggul hasil rekayasa genetika. Teknologi rekayasa genetika merupakan salah satu bidang yang sangat membutuhkan riset bioinformatika (Claveri, 2003).Kakao merupakan komoditas yang secara sosial maupun ekonomi penting bagi Indonesia. Namun perkebunan kakao mengalami permasalahan yang cukup serius akibat hama penggerek buah kakao (PBK). Hingga saat inipun belum ditemukan cara yang efektif untuk memberantas PBK. PIN (inhibitor proteinase) merupakan gen yang membawa sifat ketahanan tanaman terhadap hama ulat seperti PBK. Harapannya PIN dalam buah kakao akan diidentifikasi dan diklonkan. Deteksi PIN di dalam kakao dikerjakan dengan PCR. Vektor kloning pGEM-T digunakan untuk mengklon produk PCR. Analisis sekuen dilakukan dengan program BLAST dari situs NCBI.

Sedangkan analisis penjajaran (alignment) untuk menentukan kemiripan genetik menggunakan program CLUSTALW dari situs EBI.

Terlihat bahwa riset bioinformatika ternyata juga memegang peranan penting dalam permasalahan pangan dan bionformatika sangat membantu dalam peranan science. Deteksi PIN didalam kakao dikerjakan dengan PCR menggunakan primer heterologous yang spesifik terhadap PIN dan DNA genomik kakao sebagai templatenya. Kloning DNA fragmen produk PCR spesifik dilakukan menggunakan pGEM-T dan sel inang E. coli. Elektro- foresis dari hasil PCR beberapa klon kakao ditampilkan pada Gambar 1.

pb

600

400

200

123456 78 9 10 11 12 131415 1617

Gambar 1. PCR DNA genomik kakao. Lini 1, 2-17 adalah Smart ladder, and MJ1-tahan, MJ1-tahan, LW4- peka, LW4-peka, LW1-tahan, LW1-tahan, PN3-peka, PN3-peka, PN6-tahan, PN6-tahan, MM2- peka, MM2-peka, MM1-tahan, MM1-tahan, MJ2-peka dan MJ2-peka, masing-masing dengan pasangan primer pin-FR2 dan pin-FR1.

AmplifikasiDNAgenomic kakao menggunakan PCR dengan primer spesifik PIN menghasilkan pita-pita DNA yang intensitasnya bervariasi. Secara umum PCR DNA namun intensitasnya relatif sangat lemah. ). Bervariasinya intensitas pita DNA ini mungkin karena tingkat kemurnian DNA yang tidak sama, jumlah copy gen, atau afinitas primer dengan templet berbeda-beda. Untuk memastikan lebih lanjut mana yang benar perlu dilaku- kan pengujian. Hasil ini mengindikasikan bahwa gen target penyandi protein 21kDa yang diekspresikan pada biji kakao dapat dijadikan dasar dalam perancangan primer heterologous spesifik PIN (Santoso, 2001). Selain itu primer tersebut dapat digunakan untuk mendeteksi PIN kakao harapan tahan asal Sulawesi Selatan yang diuji. klon-klon harapan tahan PBK, memberikan pita DNA yang relatif kuat sedangkan PCR klon-klon kontrol yang peka tidak mem- berikan pita DNA atau menghasilkan pita.

Beberapa tanaman kakao sampel menghasilkan amplikon dari analisis PCR dengan menggunakan primer heterologous spesifik PIN. Elektroforesis pada gel agarosa hasil PCR tersebut terlihat seperti pada Gambar 2, menunjukkan bahwa sebagian besar menghasilkan amplikon sesuai dengan yang diperkirakan.

AB

pb

600400200

12345678910

Gambar 2. Profil elektroforesis dari klon terseleksi. Lini 1, 2-9 (A), dan 10 (B) adalah Smart Ladder, hasil PCR dengan primer universal FR M13 dari koloni putih yang tumbuh pada media seleksi, dan plasmid rekombinan hasil miniprep.

Analisis homologi dari sekuen DNA spesifik yang diperoleh, dilakukan dengan pendekatan teknik bioinformatika melalui program BLAST yang dapat diakses pada situs NCBI yaitu hhttp://www.ncbi.nlm.nih.ov/BLAST/. Berikut ini merupakan hasil analisis sekuen DNA menggunakan program Blast :

gi|21909|emb|CAA39860.1| 21 kDa seed protein [Theobroma cacao2683e-71gi|19171719|gb|AAL85654.1| trypsin inhibitor [Theobroma cacao]2661e-70gi|2654440|gb|AAC63057.1| Lemir [Lycopersicon esculentum]..1062e-22gi|37625527|gb|AAQ96377.1| miraculin-like protein [Solanum .1022e-21gi|12083240|gb|AAG48779.1| putative lemir (miraculin) prote. 963e-19gi|5689166|dbj|BAA82842.1| miraculin homologue [Taraxacum o955e-19gi|5689164|dbj|BAA82841.1| miraculin homologue [Youngia jap. 933e-18gi|688430|dbj|BAA05474.1| tumor-related protein [Nicotiana . 862e-16gi|23198316|gb|AAN15685.1| putative trypsin inhibitor [Arab. 786e-14gi|7438251|pir||S74136 latex proteinase inhibitor - papaya 755e-13gi|1708872|sp|P80691|LSPI_CARPA Latex serine proteinase inh. 725e-12gi|11596180|gb|AAG38518.1| miraculin-like protein 2 [Citrus. 718e-12gi|6538776|gb|AAF15901.1| putative proteinase inhibitor [Ni. 663e-10Score E Sequencesproducingsignificantalignments:(bits) value

Gambar 3. Hasil BlastX dengan entri sekuen fragmen DNA dari klon harapan MJ-1.

Gambar 3 menunjukkan bahwa sekuen asam amino klon kakao dengan Theobroma yang lain dan spesies tanaman lainnya yang ada pada data base memiliki distribusi perbandingan sangat tinggi. Hasil BlastX memperlihatkan kecenderungan tingkat homologi yang relatif tinggi yang berkisar pada daerah sekuen > 200 bp. Secara teoritis kisaran skor > 50 bits dengan E-value > e-04 pada analisis blast menunjuk- kan tingkat kemiripan yang tinggi (Claveri et al., 2003; Santoso 2001).

Selanjutnya untuk mengetahui tingkat kekerabatan antara klon kakao uji (MJ-1 dan LW-1) dengan kakao lain dan spesies tanaman lain yang ada pada data base, dilakukan analisis ClustalW dalam bentuk dendogram. Analisis kekerabatan (filo- genetik) untuk asam nukleat dan protein blast tentang tingkat kemiripan dari MJ-1, LW-1 yang sama-sama tahan sebagai tanaman uji dan beberapa spesies kakao lain dan spesies tanaman lain yang ada pada data base relatif tinggi. Hal ini memperlihatkan bahwa tingkat kemiripan gen antar spesies yang dianalisis menggambarkan tingkat kekerabatan, ada yang sangat dekat, agak dekat, dan ada pula yang jauh tidak berdekatan kekerabatan. Klon MJ-1 dan LW-1 masih dalam satu kekerabatan yang sangat dekat dibandingkan dengan spesies dari di base. Data ini memberikan suatu asumsi bahwa gen TcPIN yang ada pada MJ-1 masih kerabat dengan TcPIN pada LW-1, demikian pula dengan PIN dari data base yang lebih dekat dibandingkan dengan spesies-spesiestanaman lain CpPIN, AtPIN, IbPIN, StPIN, CrPIN dan GmPIN Selanjutnya untuk melihat kemiripan antara sekuen TcPIN dari klon harapan tahan PBK. LW-1 dan MJ-1 dilakukan analisis Blast Spesial terhadap sekuen TcPIN dari kedua klon tersebut. Hasil analisis menunjukkan bahwa gen PIN yang terkandung pada kedua klon tersebut memiliki tingkat kemiripan sangat tinggi yakni mencapai sekitar 96%. Dengan Score bits 671, E value mencapai sempurna 0,0.Pada Gambar 5 terlihat bahwa sekuen nukleotida dari gen TcPIN LW-1 dengan TcPIN MJ-1 yang masing-masing merupa- kan klon harapan tahan PBK teridentifikasi mengandunggen penyandiproteinase inhibitor yang memiliki tingkat kemiripan yang sangat tinggi. Hasil analisis di tingkat DNA ini dan sebelumnya mengindikasikan bahwa proteinase inhibitor terkait dengan ketahanan kakao terhadap PBK.

Analisis penjajaran(alignment) untuk menentukan kemiripan genetik menggunakan program ClustalW dari situs EBI yaitu htp://www.ebi.ac.uk/egi-bin/CLUSTALW/. Dan hasilnya adalah :

MjPIN:0.03447

LwPIN:0.02852TcPINdb:0.06354

CpPINdb:0.32683

AtPINdb:0.33351IbPINdb:0.41068

StPINdb:0.37180

CrPINdb:0.36016

GmPINdb:0.40290

Gambar 4 . Analisis homologi dengan ClustalW dari sekuen PIN beberapa spesies dan kakao klon harapan tahan PBK MJ1 (MjPIN) dan LW1 (LwPIN). Tc dari kakao tidak diketahui sifat tahan PBK.

Score = 671 bits (349), Expect = 0.0, Identities = 374/386 (96%), Gaps = 2/386 (0%), Strand = Plus/PlusQuery: 87 gggttcaatattacgtcttgtcatcgatatcgggtgctgggggtggagggctagccctag 146 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 5 gggttcaatattacgtcttgtcatcgatatcgggtgctgggggtggagggctagccctag 64Query: 147 gaagggctacangtcaaagctgcccagaaattgttgtccaaagacgatccgaccttgaca 206 ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 65 gaagggctacaggtcaaagctgcccagaaattgttgtccaaagacgatccgaccttgaca 124Query: 207 atggtactcc-tgtaatcttttcaaatgcggatagcaaagatgatgttgtcc-gcntatc 264 |||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| Sbjct:125 atggtactccctgtaatcttttcaaatgcggatagcaaagatgatgttgtcccgcgtatc 184Query: 265 tactgatgtaaacatanagttcgttcccatcagagacagactctgctcaacgtcaactgt 324 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 185 tactgatgtaaacatagagttcgttcccatcagagacagactctgctcaacgtcaactgt 244Query: 325 gtggaggcttgacaattatgacaactcggcaggcaaatggtgggtgacaactgatggggt 384 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct: 245 gtggaggcttgacaattatgacaactcggcaggcaaatggtgggtgacaactgatggggt 304Query: 385 taaaggtgaacctggtcctaacactttgtgcngttggtttaanattganaaggccggagt 444 |||||||||||| |||||||||||||||||| |||||||||| ||||| ||||||||||| Sbjct: 305 taaaggtgaaccaggtcctaacactttgtgcagttggtttaagattgagaaggccggagt 364Query: 445 actcggntacnaattcangttctgtc 470|||||| ||| |||||| |||||||| Sbjct: 365 actcggttacaaattcaggttctgtc 390

Gambar 5 . Hasil Blast spesial sekuen fragmen TcPIN dari klon harapan tahan PBK LW-1 dan MJ-1.

BAB 3. KESIMPULANTiga belas dari 18 klon kakao yang diuji, menunjukkan adanya homolog PIN. Dua DNA fragmen dari klon harapan tahan, MJ-1, dan LW-1 telah ditentukan sekuen nukleotidanya. Satu diantaranya, MJ-1 berhasil diklon. Analisis sekuen kedua klon tersebut menunjukkan identitas sebagai homolog PIN dan keduanya memiliki kemiripan genetik yang tinggi. Terlihat bahwa riset bioinformatika ternyata juga memegang peranan penting dalam permasalahan pangan. Indonesia yang saat ini banyak tertinggal riset dasar dan terapannya harus berbenah diri dengan meningkatkan jumlah dan kompetensi riset demi mengejar ketertinggalan di berbagai sektor dari negara maju, bahkan negara berkembang seperti China dan India.

DAFTAR PUSTAKAAttwood, T.K., dan D.J.Parry-Smith.1999.Introduction to Bioinformatics. Harlow: Pearson Education.Cohen, Jacques. 2004. BioinformaticsAn Introduction for Computer Scientists. Waltham: Brandeis University press.Claveri, J.M. & C. Notredame (2003). Bioinformatics For Dummies. 2nd ed., New York, Wiley Publ. Inc., p, 215-238.Michelia,Rynda.2011.http://ryndamichelia.wordpress.com/2011/08/17/bioinformatik-vs-biologi-komputasi/. diakses 02 Mei 2013 [12.29]Mollah, Abdul. 2004. Deteksi dan Analisis Sekuen Gen Inhibitor Proteinase pada Beberapa Klon Kakao Harapan Tahan Penggerek Buah Kakao dari Sulawesi Selatan. 72(1), 1-10 Park, S. & R.W. Thornburg (1996). Loss of Specific Sequences in a Natural Variant of Potato Proteinase Inhibitor II Gene Results in a Loss of Wound-Inducible Gene Expression.Agric.Chem. Biotech., 39, 104-111.Rao, Vaddi Srinivasa, dkk. 2008. Recent developments in life sciences research: Role of Bioinformatics. India: ISSN 16845315.Santoso, D. (2001). Pengembangan Pelacak DNA spesifik gen melalui bioinformatika: Identifikasi gen penyandi protein biji 21kDa pada kakao UAH Indonesia. Menara Perkebunan, 69 (1), 10-17.Sofyan,AbiGhifari.2012.http://www.chem-istry.org/artikel_kimia/ bioinformatika-dan-revolusi-pertanian/. diakses pada tanggal 02 Mei 2013 [14.15]

V. K. Singh, dkk. 2011.Role of Bioinformatics in Agriculture adn Sustainable Development. India: ISSN: 09753087.