LAPORAN RESMIPRAKTIKUM BIOTEKNOLOGIACARA I: EKSTRAKSI DNA DAN ISOLASI DNA

Disusun Oleh:Kelompok 2Cherenny Agmelia N26020112130063

Asisten :

PROGRAM STUDI ILMU KELAUTANJURUSAN ILMU KELAUTANFAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTANUNIVERSITAS DIPONEGOROSEMARANG2014

LEMBAR PENILAIAN PENGESAHANACARA 1 : EKSTRAKSI DAN ISOLASI DNANo.KeteranganNilai

1.Pendahuluan

2.Tinjauan Pustaka

3MateridanMetode

4.Hasil dan Pembahasan

5.Penutup

6.Daftar Pustaka

7.Lampiran

8.Bonus

Total

Semarang, 30 Mei 2014

Asisten Praktikan

Sakti Imam Muchlissin 26020111130065Cherenny Agmelia N26020112130063

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangPada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, DNA rekombinan, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain (Peters, 1993).Bioteknologia dalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, jamur, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa (Merck, 2005).Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang berulang-ulang dan vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample (Anonim,2013).

1.2 Tujuan1.2.1 Metode Ekstraksi Freeze and Thaw Agar mahasiswa mampu mengaplikasikan Spektrofometer Agar mahasiswa mampu menentukan kemurnian serta konsentrasi suatu DNA1.2.2 Metode Ekstraksi Konvensional Mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana Melihat presipitasi DNA

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sejarah Ekstraksi DNAPada masa ini, bioteknologi berkembang sangat pesat, terutama di negara negara maju. Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi semisal rekayasa genetika, kultur jaringan, DNA rekombinan, pengembangbiakan sel induk, kloning, dan lain-lain (Peters, 1993).Kemajuan di bidang bioteknologi tak lepas dari berbagai kontroversi yang melingkupi perkembangan teknologinya. Sebagai contoh, teknologi kloning dan rekayasa genetika terhadap tanaman pangan mendapat kecaman dari bermacam-macam golongan.Bioteknologi secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui aplikasi teknologi. Aplikasi teknologi tersebut dapat memodifikasi fungsi biologis suatu organisme dengan menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada organisme tersebut (Smith, 2004).Bioteknologi secara sederhana sudah dikenal oleh manusia sejak ribuan tahun yang lalu. Sebagai contoh, di bidang teknologi pangan adalah pembuatan bir, roti, maupun keju yang sudah dikenal sejak abad ke-19, pemuliaan tanaman untuk menghasilkan varietas-varietas baru di bidang pertanian, serta pemuliaan dan reproduksi hewan (Smith, 2004). Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik; artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktivitas sel. Ini berlaku umum bagi setiap organisme. Di antara perkecualian yang menonjol adalah beberapa jenis virus (dan virus tidak termasuk organisme) seperti HIV (Human Immunodeficiency Virus) (Muladno, 2010).DNA pertama kali berhasil dimurnikan pada tahun 1868 oleh ilmuwanSwissFriedrich Miescher, diTubingen,Jerman yang menamainya nuclein berdasarkan lokasinya di dalam inti sel. Namun demikian, penelitian terhadap peranan DNA di dalam sel baru dimulai pada awal abad 20, bersamaan dengan ditemukannya postulat genetikaMendel. DNA danproteindianggap dua molekul yang paling memungkinkan sebagai pembawa sifat genetis berdasarkan teori tersebut. Dua eksperimen pada dekade 40-an membuktikan fungsi DNA sebagai materi genetik. Dalam penelitian olehAverydan rekan-rekannya, ekstrak dari sel bakteri yang satu gagal mentransformsel bakteri lainnya kecuali jika DNA dalam ekstrak dibiarkan utuh. Eksperimenyang dilakukanHersheydanChasemembuktikan hal yang sama dengan menggunakanpencari jejak radioaktif(bahasa Inggris:radioactive tracers) (Gibbons, A. 1993).Dua eksperimen pada dekade 40-an membuktikan fungsi DNA sebagai materi genetik. Dalam penelitian oleh Avery dan rekan-rekannya, ekstrak dari sel bakteri yang satu gagal men-transform sel bakteri lainnya kecuali jika DNA dalam ekstrak dibiarkan utuh. Eksperimenyang dilakukan Hershey dan Chase membuktikan hal yang sama dengan menggunakanpencari jejak radioaktif (bahasa Inggris: radioactive tracers). Misteri yang belum terpecahkan ketika itu adalah: bagaimanakah struktur DNA sehingga ia mampu bertugas sebagai materi genetik? Persoalan ini dijawab oleh Francis Crick dan koleganya James Watson berdasarkan hasil difraksi sinar X pada DNA oleh Maurice Wilkins dan Rosalind Franklin. (Gibbons, A. 1993).Pada tahun 1953, James Watson dan Francis Crick mendefinisikan DNA sebagai polimeryang terdiri dari 4 basa dari asam nukleat, dua dari kelompok purina:adenina dan guanina; dan dua lainnya dari kelompok pirimidina:sitosina dan timina. Keempat nukleobasa tersebut terhubung dengan glukosa fosfat. (Muladno, 2010).Maurice Wilkins dan Rosalind Franklin menemukan bahwa molekul DNA berbentuk heliksyang berputar setiap 3,4 nm, sedangkan jarak antar molekul nukleobasa adalah 0,34 nm, hingga dapat ditentukan bahwa terdapat 10 molekul nukleobasa pada setiap putaran DNA. Setelah diketahui bahwa diameter heliks DNA sekitar 2 nm, baru diketahui bahwa DNA terdiri bukan dari 1 rantai, melainkan 2 rantai heliks. Crick, Watson, dan Wilkins mendapatkan hadiah Nobel Kedokteran pada 1962 atas penemuan ini. Franklin, karena sudah wafat pada waktu itu, tidak dapat dianugerahi hadiah ini. Konfirmasi akhir mekanisme replikasi DNA dilakukan lewat percobaan Meselson-Stahl yang dilakukan tahun 1958. (Muladno, 2010).

2.2 Metode Ekstraksi DNAMetode ekstraksi DNA sel hewan yang diperkenalkan oleh Laird et al (1991) sangatlah sederhana. Metode ini mengurangi langkah pemipetan sehingga sangat berguna bagi pemula seperti saya. Metode ini tidak seperti metode konvensional yang biasanya menghendaki pemindahan sebagian material dari satu tabung ke tabung yang lain, karena itu, dapat diharapkan total DNA dapat diisolasi. Metode ini sangat bermanfaat terutama jika kita harus mengekstrak DNA dari banyak sampel (Gibbons, A. 1993).DNA hasil ekstraksi metode ini cukup baik kualitasnya dan dapat kita gunakan untuk analisis dengan menggunakan PCR, sekuensing, Southern blot, atau untuk dipotong-potong dengan enzym restriksi tanpa perlu dimurnikan lagi (dengan metode PCI-ethanol, misalnya). Kekurangan metode ini adalah, karena total DNA diisolasi, maka konsentrasi sampel DNA sangat tinggi. Akibatnya, butuh larutan TE yang cukup banyak dan waktu yang cukup lama untuk menunggu sampai DNA larut rata. Jika kita tidak membutuhkan DNA genomik dalam sampel DNA tersebut, sampel DNA tersebut dapat kita sonifikasi atau dilewatkan jarum suntik G > 21 untuk menghilangkan kekentalannya. Kelebihan metode ini adalah sangat sederhana. Untuk percobaan yang mengharuskan kita mengekstrak DNA sel hewan (pengalaman saya metode ini tidak hanya untuk sel mamalia) dari banyak sampel, metode ini sangatlah membantu (Anonim, 2014)Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkahlangkah kerjaan alisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasukdarah), bagaimana diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak (Brown 1992).2.3 DNADNA (Deoxyribose Nucleic Acid) merupakan suatu makromolekul beruntai ganda dan berbentuk heliks dengan basa yang menonjol ke bagian dalam molekul tersebut. Basa nitrogen DNA terdiri atas adenin, timin, sitosin dan guanin. Adenin selalu berikatan dengan timin dan sitosin dengan guanian, urutan nukleotida kedua untai bersifat komplementer. Untaian yang satu merupakan cetakan pembentuk untaian yang lain (Mathews dan van Holde, 1997).DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA terdapat pada nukleus, mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA pada nucleus memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang terletak pada mitokondria dan plastida berbentuk lingkaran (Anonim, 2014).DNA merupakan materi yang membentuk kromosom-kromosom dan juga merupakan informasi genetik yang tersimpan dalam tubuh makhluk hidup. Informasi genetik ini pada dasarnya merupakan kumpulan instruksi/perintah yang mengatur sel untuk bisa melakukan hal-hal tertentu. DNA singkatan dari deoxyribonucleic acid, atau dalam Bahasa Indonesia disebut dengan Asam Deoksiribosa Nukleat atau ADN. Kata deoxyrybo mengacu pada nama gula yang terkandung dalam DNA, yaitu deoxyrybose (deoksiribosa). James Watson dan Francis Crick memenangkan Nobel di tahun 1962 mengenai model penyatuan sturktur DNA. Bersama dengan Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins, mereka menyatakan bahwa struktur DNA merupakan dua untaian nukleotida yang disebut dengan double helix, dimana untaian tersebut tersusun secara spiral dengan posisi gula dan gugus fosfat terletak di sisi luar dan basa-basa nitrogen saling berpasangan di sisi dalam (menyambung kedua untaian tersebut) (Anonim, 2014).

Gambar 1. Struktur Molekul DNA Utas Ganda (Double Helix)(Anonim, 2014).Urutan pasangan basa merupakan hal yang sangat menentukan dalam proses replikasi/penggandaan DNA. Penggandaan DNA merupakan proses dimana DNA ditiru untuk membentuk DNA baru yang sama kode genetiknya. Selama penggandaan, rantai DNA terbuka (karena ikatan hidrogen yang lemah terputus), sehingga ikatan antar-basa dalam struktur molekul DNA terputus. Dari masing-masing utas DNA tersebut (selanjutnya disebut utas cetakan) kemudian nukleotida-nukleotida yang baru disintesis berdasarkan urutan basa yang ada di utas cetakan. Rantai nukleotida yang baru memliki urutan basa yang komplemen dengan urutan basa pada utas cetakannya. Kemudian, sepasang utas DNA tersebut (utas DNA cetakan dan utas DNA yang baru) saling terikat untuk membentuk utas DNA utuh yang baru dan memiliki kode genetik yang sama dengan utas ganda DNA sebelumnya. Jadi, proses penggandaan tersebut menghasilkan 2 molekul DNA yang sama, yakni satu utas ganda DNA lama dan baru. Oleh karena itu, proses ini dikenal sebagai semiconservative replication (penggandaan semikonservatif) karena satu rantai DNA menghasilkan satu rantai DNA baru yang sama (Gibbons, A. 1993).

Gambar 2. Replikasi DNA terjadi ketika untaian DNA terbuka dan tiap satu rantai dibuat tiruannya sehingga memiliki kode genetik yang sama(Anonim, 2014)DNA dan RNA mempunyai sejumlah sifat kimia dan fisika yang sama sebab antara unit-unit mononukleotida terdapat ikatan yang sama yaitu melalui jembatan fosfodiester antara posisi 3 suatu mononukleotida dan posisi 5 pada mononukleotida lainnya (Van Berkum, 1995). Asam-asam nukleat seperti asam dioksiribosa nukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) memberikan dasar kimia bagi pemindahan keterangan di dalam semua sel. Asam nukleat merupakan molekul makro yang memberi keterangan tiap asam nukleat mempunyai urutan nukleotida yang unik sama seperti urutan asam amino yang unik dari suatu protein tertentu karena asam nukleat merupakan rantai polimer yang tersusun dari satuan monomer yang disebut nukleotida (Van Berkum, 1995).2.4 RNAAsam ribonukleat(bahasa Inggris:ribonucleic acid, RNA) adalah satu dari tigamakromolekulutama (bersama denganDNAdanprotein) yang berperan penting dalam segala bentuk kehidupan.Asam ribonukleat berperan sebagai pembawabahan genetikdan memainkan peran utama dalamekspresi genetik. Dalamdogma pokok(central dogma)genetika molekular, RNA menjadi perantara antara informasi yang dibawa DNA dan ekspresifenotipikyang diwujudkan dalam bentuk protein (Anonim, 2014).Struktur dasar RNA mirip dengan DNA, RNA merupakan polimer yang tersusun dari sejumlah nukleotida. Setiap nukleotida memiliki satu gugus fosfat, satuguguspentosa, dansatugugusbasa nitrogen (basa N). Polimer tersusun dari ikatan berselang selingan tara gugus fosfat dari satu nukleotida dengan gugus pentosa dari nukleotida yang lain. Perbedaan RNA dengan DNA terletak pada satu gugus hidroksil cincin gulapentosa, sehingga dinamakan ribosa, sedangkan gugus pentosa pada DNA disebut deoksiribosa. Basa nitrogen pada RNA sama dengan DNA, kecuali basa timin pada DNA diganti dengan urasil pada RNA. Jadi tetap ada empat pilihan: adenina, guanina, sitosina, atau urasil untuk suatu nukleotida (Anonim,2014).Pada sekelompokvirus(misalnyabakteriofag), RNA merupakan bahan genetik. Ia berfungsi sebagai penyimpan informasi genetik, sebagaimana DNA pada organisme hidup lain. Ketika virus ini menyerang sel hidup, RNA yang dibawanya masuk ke sitoplasma sel korban, yang kemudianditranslasioleh sel inang untuk menghasilkan virus-virus baru.Namun demikian, peran penting RNA terletak pada fungsinya sebagai perantara antaraDNAdanproteindalam prosesekspresi genetikkarena ini berlaku untuk semua organisme hidup. Dalam peran ini, RNA diproduksi sebagai salinan kode urutan basa nitrogen DNA dalam prosestranskripsi. Kode urutan basa ini tersusun dalam bentuk 'triplet', tiga urutan basa N, yang dikenal dengan namakodon. Setiap kodon berelasi dengan satuasam amino(atau kode untuk berhenti), monomer yang menyusun protein. Lihatekspresi genetikuntuk keterangan lebih lanjut.Penelitian mutakhir atas fungsi RNA menunjukkan bukti yang mendukung atas teori'dunia RNA', yang menyatakan bahwa pada awal prosesevolusi, RNA merupakan bahan genetik universal sebelum organisme hidup memakai DNA (Gibbons, A. 1993).

III. MATERI METODE3.1 Materi3.1.1 WaktuPraktikum Bioteknologi Ekstraksi dan Isolasi DNA ini dilaksanakan pada :Hari / Tanggal: Senin, 23 Mei 2014Jam: 07.00 - SelesaiTempat: Ruang Laboratorium Bioteknologi, Lantai 2, Gedung E Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Undip.3.1.2 Alat dan Bahan3.1.2.1 Metode Freeze and ThawTabel 1. Alat dan Bahan Metode Freeze and ThawNoAlat dan BahanGambarFungsi

1Mikropipet

Untuk mengambil sampel/cairan yang konsentrasinya sangat sedikit.

2TipsUntuk membantu memindahakan cairan/sampel pada mikropipet.

3Eppendorf 1,5ml

Sebagai tempat kultur,aquabides. Untuk suspensi.

4Sentrifuge

Untuk mengendapkan hasil suspensi.

5Waterbath

Untuk perendaman. Serta proses Thaw (peningkatan suhu suhu)

6Spektrofotometer

Untuk mengukur kemurnian DNA menggunakan gelombang.

7Kultur Padat Bakteri Laut

Bahan untuk suspensi. Diamati

8ddH2O/AquabidesSebagai pelarut kultur bakteri di ependorf.

9Aquades

Proses thaw (perendaman)

3.1.2.2 Metode KonvensionalTabel Alat dan Bahan Metode KonvensionalNoAlat dan BahanGambarFungsi

1Tabung Sentrifuge 50mlUntuk proses Ekstraksi pengamatan pita DNA.

2Beaker Glass

Tempat homogency buffer lysis

3Plastik Zip-Lock

Tempat untuk menghaluskan sampel/bahan.

4Saringan

Untuk menyaring/memisahkan residu

5Alkohol 95%Memperjelas visualisasi DNA serta campuran bahan buffer.

6KerangBahan sampel yang dimabil pita DNAnya

7Air Destilasi/Kran

Bahan pelarut/pengencer buffer.

8Enzim RNAse (cairan softlen)

Mmpercepat pelepasan dinding sel.

9Lysis Buffer (Shampoo)

Memecah dinding/membran sel serta pemisah lemak/protein dengan DNA.

10Garam Iodium

Katalisator, Percepatan reaksi. Serta buffer.

3.2 Metode 3.2.1 Cara Kerja Metode Freeze and Thaw

1(satu) Ose kultur Bakteri. Masukan ke Ependorf berisi 100ml aquabides.

Masukan ke dalam pendingin -70oC. Hingga mengkristal.

Rendam suspensi dalam air 95oC selama 10 menit. Setelah itu masukan ke dalam pendingin kembali.

Lakukan sampai 5x Pendinginan dan Perendaman.

Menyimpan ekstrak DNA padasuhu -20oC

3.2.2 Cara Kerja Metode Konvensional

Mengambil sampel kerang dan membaginya menjadi 2 bagian

Menggerus sampel kerang hingga menjadi cairan jus

Menambahkan 10ml buffer lysis kedalam plastic ziplock dan menutup kembali.

Meremas plastic, agar buffer lysis dan sampel kerang tercampur

.

Menyaring dan membiarkannya selama 10 menit

Membuang residu yang ada

Memasukkan 2 tetes enzim kedalam tabung sentrifuge 50ml

Menuangkan 30 ml alkohol 95% dinginkedalamtabung centrifuge

Menuanglarutankedalamtabungreaksikemudianmenutup. Mengamatipresipitasi DNA

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil4.1.1 MetodeKonvensional

Hasil tersebut memperlihatkan bahwa sampel tenggelam didasar dan terlihat juga pita pita DNA bergerak naik ke permukaan.

4.1.2 Metode Freeze and Thaw

Hasil tersebut terlihat bening seperti air.

4.2 Pembahasan4.2.1 Metode Freeze and ThawDari praktikum Bioteknologi Acara I ini dapat diketahui bahwa kelebihan digunakannya metode freeze and thaw ini jika dibandingkan dengan metode konvensional adalah waktu. Secara umum metode freeze and thaw lebih cepat dan simpel.Lebih cepat terbentuk pengkristalan hasil/sampel yang akan di proses nanodrop. Mengenai proses metode ini Suatu kultur dimasukan ke dalam ependorf yang berisi aquabides dimaksudkan untuk homogency kultur bakteri. Kemudian dilakukan proses Freezing (pendinginan) pada suhu 0oC dilanjutkan proses Thawing (pemanasan),(Giacomazzi et all,2205). Hal ini dimaksudkan agar mempercepat perusakan dinding dan membran sel. Hasil dari metode freeze and thaw disini adalah dalam bentuk kristal suspensi yang nanti akan ditambahkan nanodrop untuk melihat kemurniannya di laptop/PC. Hasil dari proses ini nantinya akan dilanjutkan proses untuk mengetahui kemurnian dan dilanjutkan proses menggunakan thermocycler, elektroforesis dan PCR.Freeze - thaw itu sendiri merupakan metode yang sangat umum digunakan untuk melisiskan sel bakteri . Teknik ini melibatkan pembekuancepat suspensi sel dalam bak es etanol kering dan kemudian pencairandengan cepat sel-sel dalam bak air yang sangat panas (antara 800C sampai 900C). Metode lisis menyebabkan sel membengkak dan menyusut, akhirnya melonggar karena kristal es yang terbentuk selama proses pembekuan. Beberapa siklus freeze-thaw diperlukan untuk membuatkerusakan membran sel dan pelepasan DNA untuk eksperimen lebih lanjut (Ross et al, 1990).Menurut Radjasa, (2007) menjalaskan bahwa metode freeze and thaw diawali dengan memngencerkan kultur bakteri dengan aquabides dalam ependorf, kemudian didinginkan dalam pendingin bersuhu