BAB 1PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangDewasa ini pembuatan kultur jaringan sudah menjadi

hal lumrah dilakukan, baik dari skala penelitian hingga pembelajaran. Sebagian besar pembuatan kultur jaringan menggunakan sel tumbuhan sebagai bahan percobaannya. Sel tumbuhan lebih banyak digunakan karena memiliiki sifat totipotensi, yaitu sifat dimana sel tumbuhan mampu membentuk individu baru pada kondisi lingkungan yang mendukung. Penggunaan kultur jaringan pada tumbuhan dimanfaatkan untuk memperoleh jumlah anakan yang banyak dalam waktu singkat, khususnya pada tanaman yang membutuhkan waktu lama untuk melakukan perkembangbiakan generatif. Untuk itu melalui praktikum kali ini akan dibahas lebih mendalam tentang kultur jaringan. 1.2 Tujuan

1.2.1 Syarat Eksplan dalam Kultur Jaringan 1.2.2 Faktor Penentu Keberhasilan Kultur Jaringan 1.2.3 Tahap Kultur Jaringan 1.2.4 Jenis Kontaminasi pada Eksplan (ciri-ciri pada masing2 kontaminasi) 1.2.5 pengaruh media terhadap pertumbuhan eksplan 1.2.6 Tahapan Pertumbuhan Eksplan

BAB 2TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Syarat Eksplan dalam Kultur JaringanMenurut Ariebowo (2007) eksplan adalah bagian dari

tanaman yang digunakan dalam kulturasi. Eksplan ini menjadi bahan dasar bagi pembentukan kalus (bentuk awal calon tunas yang kemudian mengalami proses pelengkapan bagian tanaman, seperti daun, batang, dan akar). Sebagian eksplan sebaiknya:

Dipilih pucuk muda tanaman dewasa (karena lebih mudah beregenerasi dan aktif membelah) yang diketahui asal-usul dan varietasnya

Eksplan tidak terinfeksi oleh penyakit, maka harus disterilkan terlebih dahulu

Eksplan dipilih dari jenis yang unggul

2.2 Faktor Penentu Keberhasilan Kultur JaringanMenurut Ariebowo (2007) terdapat beberapa hal yang menentukan keberhasilan berhasil, yaitu Pemilihan eksplan

Sebagian eksplan sebaiknya d ipilih pucuk muda tanaman dewasa yang diketahui asal-usul dan varietasnya , e ksplan tidak terinfeksi oleh penyakit dan berasal dari jenis yang unggul .

Media yang cocok Media yang baik, harus meme-nuhi syarat nutrisi yang diperlukan eksplan untuk tumbuh dan berkembang. Oleh karena itu, di dalam media kultur jaringan ditambahkan berbagai macam mineral, vitamin, sumber karbohidrat, dan zat pengatur tumbuh (hormon).

Keadaan yang aseptik dan pengaturan udara yang baik Semua tahapan yang dilakukan dalam kultur jaringan harus dilakukan secara aseptik. Hal ini guna menghindari kontaminasi oleh jamur maupun bakteri. Oleh karena itu, sterilisasi eksplan ke dalam media dilakukan di dalam laminar air flow cabinet untuk mencegah kontaminasi.

Penyimpanan kultur juga harus di dalam ruangan dengan suhu, pencahayaan, dan pengaturan udara yang baik.

2.3 Tahap Kultur JaringanMenurut Hendaryono (1994), tahapan yang

dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah:

1. Pembuatan media Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlu-kan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.

2. Inisiasi Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman

yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.

3. Sterilisasi Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar air flow cabinet (LAFC) dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.

4. Multiplikasi Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di LAFC untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan.

5. Pengakaran Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur.

6. Aklimatisasi Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap

serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.

2.4 Jenis Kontaminasi pada EksplanMenurut Susilowati (2001) kontaminasi pada kultur

jaringan adalah kejadian terikutnya atau masuknya unsur-unsur yang tidak dikehendaki ke dalam objek yang tengah diamati. Proses kontaminasi lazim terjadi pada kultur jaringan. Kontaminan bisa berasal dari lingkungan kerja, eksplan, atau alat inokulasi yang responnya bisa berlangsung cepat atau beberapa waktu sesudah inokulasi eksplan.

Dilihat dari sisi kecepatan, maka kontaminasi dibagi dalam dua bagian yaitu:

Initial contaminant Initial contaminant yaitu kontaminasi yang berproses beberapa waktu sesudah inokulasi akibat kontaminannya ada dalam jaringan eksplan. Penyebabnya materi kultur (eksplan) dari greenhouse atau lapangan yang terlalu kotor serta sterilisasi yang kurang optimal.

Latent contaminant.. Latent contaminant muncul 30 hari setelah inokulasi, bersifat internal, yakni di luar jaringan tumbuhan. Contoh jenis kontaminasi yaitu : Klasifikasi Mucor

Divisi : Amastigomycota Subdivisi : Zygomucotina Kelas : Zygomycetes

Ordo : Mucorales Familia : Mucoraceae Genus : Mucor

Ciri morfologi koloni: hifa seperti benang putih; bagian tertentu tampak sporangium dan sporangiofor berupa titik-titik hitam seperti jarum pentul. Klasifikasi Rhizopus

Divisi : Amastigomycota Subdivisi : Zygomycotina Kelas : Zygomycetes Ordo : Mucorales Familia : Mucoraceae Genus : Rhizopus

Ciri morfologi koloni: hifa seperti benang berwarna putih sampai kelabu hitam; bagian tertentu tampak sporangium dan sporangiofora berupa titik-titik hitam seperti jarum pentul. Klasifikasi Aspergillus

Divisi : Amastigomycota Subdivisi : Deuteromycotina Kelas : Deuteromycetes Subkelas : Hyphomycetidae Ordo : Moniliales Familia : Moniliaceae Genus : Aspergillus

Ciri morfologi koloni: koloni berwarna hijau kebiruan dengan area kuning sulfur pada permukaannya; miselium berbentuk benang halus. Klasifikasi Saccharomyces

Divisi : Amastigomycota Subdivisi : Ascomycotina Kelas : Ascomycetes Subkelas : Hemiascomycetidae

Ordo : Endomycetales Familia : Saccharomycetaceae Genus : Saccharomyces

Ciri morfologi koloni: tidak membentuk miselium, koloni berupa lendir berwarna putih, permukaan koloni licin.

2.5 Pengaruh Media terhadap Pertumbuhan EksplanMenurut Sriyanti (2002), media merupakan faktor

utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.. Campuran media yang satu mungkin cocok dengan jenis tanaman tertentu, namun tidak cocok untuk jenis tanaman yang lain. Hal ini disebabkan karena setiap spesies tanaman dan bagian dari tanaman mempunyai kemampuan yang tidak sama dalam mensintesa atau merombak zat - zat yang menyusun media. Oleh karena itu tidak ada formulasi yang sesuai untuk semua jenis tanaman yang menyebabkan diciptakannya berbagai macam media yang disesuaikan dengan jenis tanaman yang akan dikulturkan .

Untuk menjamin pertumbuhan eksplan yang ditanam , media kultur jaringan tanaman harus berisi semua zat yang diperlukan media tersebut dan harus berisi garam mineral berupa unsur makro dan mikro, gula, protein, vitamin, dan hormon tumbuh. Media kultur jaringan harus mengandung unsur hara makro dan unsur hara mikro dalam kadar perbandingan tertentu, sumber energi (sukrosa), satu atau dua macam vitamin dan zat pengatur tumbuh . Unsur-unsur yang diberikan dalam bentuk garam organik, unsure hara makro sangat menunjang pertumbuhan jaringan dan diberikan dalm jumlah banyak dari unsur mikro. Zat pengatur tumbuh (ZPT) yang diberikan sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan differensiasi .

Tanpa penambahan ZPT dalam media, pertumbuhan mungkin terhambat bahkan tidak tumbuh.

2.6 Tahap Pertumbuhan Eksplan1. Pemilihan dan penyiapan tanaman induk

sumber eksplan. Tanaman yang akan dilakukan

perbanyakan kultur jaringan harus jelas jenis,

spesies, varietas, sehat dan bebas dari hama

dan penyakit.

2.    Inisiasi kultur. Inisiasi adalah pengambilan

eksplan dari bagian tanaman yang akan

dikulturkan. Bagian tanaman yang sering

digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah

tunas. Eksplan yang dikulturkan diharapkan

dapat menginisiasi pertumbuhan baru sehingga

akan memungkinkan dilakukan pemilihan

tanaman yang tumbuhnya paling kuat untuk

perbanyakan (multiplikasi tahap selanjutnya).

3.    Multiplikasi atau perbanyakan propagul

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak

calon tanaman dengan menanam eksplan pada

media. Pada tahapan ini, eksplan yang sudah

diinisiasi akan menggandakan propagul atau

bahan tanaman yang diperbanyak seperti tunas

atau embrio, serta memeliharanya dalam

keadaan tertentu sehingga sewaktu-waktu bisa

dilanjutkan untuk tahap berikutnya .

4.   Pemanjangan tunas, induksi, dan

perkembangan akar Pengakaran adalah fase

dimana eksplan akan menunjukkan adanya

pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses

kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan

dengan baik. Tahapan ini bertujuan untuk

membentuk akar dan pucuk tanaman yang kuat

untuk dapat bertahan hidup sampai dipindahkan

ke lingkungan Tunas-tunas yang dihasilkan pada

tahap multiplikasi di pindahkan ke media lain

untuk pemanjangan tunas. Pengakaran tunas in-

vitro dapat dilakukan dengan memindahkan

tunas ke media pengakaran yang umumnya

memerlukan auksin seperti NAA atau IBA.

Menurut Pierek, auksin secara umum

menyebabkan perpanjangan sel, pembesaran

sel, pembentukan kalus dan pembentukan akar;

dan menurut Wattimena, mendorong

pertumbuhan pucuk. Keberhasilan tahap ini

tergantung pada tingginya mutu tunas yang

dihasilkan pada tahap sebelumnya.

5.   Aklimatisasi Tahapan ini merupakan tahap kritis

dalam perbanyakan kultur jaringan untuk

produksi massal. Prosedur pembiakan dengan

kultur jaringan baru bisa dikatakan berhasil jika

planlet dapat diaklimatisasi ke kondisi eksternal

dengan keberhasilan yang

tinggi(Gunawan,1992).

BAB 3METODE

3.1 Alat dan Bahan3.1.1 Alat

a) Gelas ukur 400ml : tempat cairan yang di butuhkan

b) Saringan : menyaring bahan cairan yang menggumpal

c) Skapel : berfungsi sebagai pisau pembedah / pemotong

d) Petridish : cawan petri / tempat menaruh eksplan sementara

e) Bunsen atau korek : Pembakaran pada proses penanaman eksplan

f) Botol kultur 10 buah : media penanaman g) Cutter atau gunting : memotong eksplan sebelum

di sterilkan h) LAFC : ruangan penanaman i) Sprayers : menyemprotkan cairan j) Pisau : memotong bahan eksplan k) Pinset : alat untuk mengambil eksplan secara

steril l) Spatula : mengaduk cairan

3.1.2 Bahan a) Tunas ketiak krisan : bahan eksplan /

penanaman b) Detergen : bahan sterilisasi dari kotoran c) Bayclean : bahan sterilisasi d) Fungisida 5% : bahan sterilisasi dari jamur e) Clorox 30 % : bahan aktif NaOCl f) Aquades 50 ml : penambah / pembuat larutan

3.2 Cara KerjaAmbil eksplan (tunas ketiak krisan)

Gojok dengan detergen 10% selama 5 menit (buat 50 ml,timbang 5 gr + 50 ml aquades

Bilas dengan air mengalir

Rendam dengan clorox 30 % (buat 50 ml,ambil 15 ml + 35 ml aquades gojok selama 10 menit

Bilas dengan air mengalir

Rendam dengan fungisida 5 % selama 5 menit (buat 50 ml,timbang 2,5 gr + 50 ml aquades)

Bilas dengan aquades, pH 7 dan kemudian rendam dengan aquades

Rendam dengan aquades steril,simpan di LAFC

Siapkan alat dan bahan serta planlet yang telah disediakan

Sebelum digunakan,bersihkan LAFC kemudian sterilkan dengan sinar UV selama 20 menit

Sebelum melakukan penanaman , semprotkan alcohol 70% pada tangan dan semua botol yang akan digunakan

Alat-alat yang digunakan diatur dengan rapi pada LAFC, posisi scalpel dan pinset serta alcohol 90% yang digunakan untuk mensterilkan dissecting kit (scalpel dan pinset ) disebelah kiri Bunsen sedangkan botol kultur disebelah kanan

Masukkan planlet kedalam LAFC

Ambil planlet dan keringkan dengan tissue steril

Planlet dipotong dengan pisau scalpel di atas petridish

Sebelum dan sesudah menggunakan pinset maupun scalpel celupkan ke dalam ethanol 90%, lalu dibakar pada nyala api bunsen

Tanam eksplan pada media tanam yang bibir botolnya sudah disterilkan dengan cara dibakar pada nyala api bunsen

Botol kultur ditutup plastic wrapping atau aluminum foil lalu diikat dengan karet gelang

Simpan botol kultur yang telah ditanami eksplan pada ruang kultur

Kultur diamati 3 hari sekali selama 2 minggu dan dokumetasikan

3.3 Analisa PerlakuanPertama yang dilakukan adalah menyiapkan alat

dan bahan, di mana untuk sterilisai awal bahan (eksplan) yang digunakan adalah krisan. Eksplan yang diambil adalah pada bagian tunas di ketiak daun bunga krisan. Eksplan yang digunakan adalah 10 tunas ketiak (lebihkan ukuran pemotongannya agar mudah pada saat penanaman). Kemudian eksplan di rendam dengan detergen selama kurang lebih 5 menit yang untuk menghilangkan atau mensterilisasi dari kotoran yang masih ada di eksplan. Setelah itu, bilas dengan air, untuk membersihkan dari sisa detergen yang terisisa. Setelah itu, cuci dengan klorox (bayclean) sebagai desinfektan atau sterilisasi lagi, lalu bilas ulang dengan air untuk menghilangkan bayclean yang tersisa. Kemudian rendam di dalam fungisida selama 5 menit, sebagai bahan sterilisasi dari jamur yang kemungkinan melekat di eksplan, kemudian bilas lagi dengan menggunakan aquades dan rendam dengan aquades steril kemudian simpan di LAFC.

Sebelum melakukan penanaman, semprotkan alkohol 70 % pada tangan dan semua bagian botol yang akan digunakan. Pada proses penanaman eksplan di LAFC. Diawali dengan mengambil planlet dan dikeringkan terlebih dahulu kemudian memotong bagian eksplan menggunakan scalpel pada di sisi-sisi bagian tanaman yang rentan terkena kontaminasi. Sebelum dan sesudah menggunakan pinset maupun scalpel celupkan ke dalam ethanol 90%,lalu dibakar pada api bunsen yang menyala. Semua bagian di dalam media MS yang sudah disiapkan.

Eksplan harus menempel pada media kultur dengan tujuan agar eksplan bisa tumbuh dengan baik.

Mulut botol dipanaskan untuk mensterilkan mulut botol dari bakteri atau kontaminan yang lain. Tutup dengan plastic atau alumunium foil lalu kareti pada botol tersebut. Lakukan pengamatan 3 hari sekali selama 2 minggu dan dokumentasikan.

BAB 4HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

No

Botol kultur ke- + tggl pngamtn

Dokumentasi Kondisi eksplan

keterangan

Kontaminan/tidak

kontaminan1 Botol 1

tanggal 22 nov 2013

Tidak kontaminan

Kondisi eksplan dan media masih sehat

2 Botol 2tanggal 22 nov 2013

Tidak kontaminan

Kondisi eksplan dan media masih sehat

3 Botol 1tanggal 26 nov 2013

Tidak kontaminan

Kondisi eksplan dan media masih sehat

4 Botol 2tanggal 26 nov 2013

Tidak Kontaminan

Kondisi eksplan dan media masih sehat

5 Botol 1tanggal 29 nov 2013

kontaminan Kondisi eksplan dan media terkontaminasi. Eksplan mulai tumbuh hifa disebabkan jamur

6 Botol 2tanggal 29 nov 2013

Tidak kontaminan

Kondisi eksplan dan media masih sehat

7 Botol 1tanggal 3 Des 2013

kontaminan Kondisi eksplan dan media terkontaminasi. Eksplan banyak tumbuh hifa

8 Botol 2tanggal 3 Des 2013

Tidak Kontaminan

Kondisi eksplan dan media masih sehat

4.2 Pembahasan Salah satu indikator keberhasilan dalam

pembuatan media kultur jaringan tanaman yang baik adalah tingkat kontaminasi media yang kita buat. Semakin sedikit media yang terkontaminasi maka semakin baik tingkat keberhasilan kita. Autoklaf merupakan salah satu alat yang penting dalam pembuatan media kultur jaringan. Autoklaf dapat dipakai untuk membunuh mikroorganisme seperti bakteri dan cendawan, sehingga media yang kita buat dapat steril dari mikroorganisme – mikroorganisme tersebut. (Coleman, 2003).

Kegagalan kultur jaringan dapat dilihat dari warna media tanamnya. Jika warnanya menjadi keruh seperti susu, kultur terkontaminasi oleh bakteri. Jika di permukaan media terlihat lapisan putih atau kelabu kehitaman media terkontaminasi oleh jamur. Apabila didiamkan, lapisan ini akan menutupi seluruh permukaan media. Jika kontaminasi jamur atau bakteri sudah parah, sebaiknya botol kultur dan tanamnya disterilkan dengan cara direbus sampai mendidih atau dimasukkan dalam autoklaf. Setelah itu, dibuang di tempat yang aman.(Agromedia,2005)

Pada pratikum kelompok kali ini, dari sepuluh botol penanaman, yang berhasil tidak terkontaminasi ada 3

botol, sementara lainnya terkontaminasi. Penanaman yang saya lakukan termasuk yang kontaminasi. Pada pengamatan pertama dan kedua belum terjadi kontaminasi, namun saat pengamatan ke tiga dan empat kontaminasi tersebut timbul.

Kontaminasi pada botol milik saya sepertinya merupakan kontaminasi jamur. Hal ini dikarenakan pada bahan tanamnya muncul hifa. Jelas ini merupakan kontaminasi disebabkan jamur.

Kontaminasi ini dapat disebabkan adanya kontaminasi terlebih dahulu pada media tanam, dapat pula disebabkan saat bahan tanam sudah disterilisasi eksplan tidak langsung ditanam sehingga terkontaminasi dengan udara luar. Selain itu dapat pula disebabkan saat proses penanaman pemotongan eksplan tidak benar-benar terpotong dengan baik.

BAB 5PENUTUP

5.1 KesimpulanTerdapat beberapa faktor yang mempengruhi

keberhasilan penanaman eksplan, yaitu pemilihan eksplan, media yang cocok, kondisi yang aseptik dan kondisi penyimpanan yang sesuai. Berdasarkan hasil praktikum dieroleh hasil dari 10 eksplan yan ditanam, 9 diantaranya terkontaminasi. Eksplan yang masih dalam kondisi sehat terdapat pada botol kedua. Botol yang terkontaminasi kemungkinan berasal dari alat-alat yang kurang steril atau praktikan yang membawa kontaminan saat melakukan penanaman eksplan. 5.2 Saran

Untuk praktikum kedepannya dimohon tidak memakan waktu yang lama, sehingga tidak mengganggu jadwal kuliah atau praktikum yang lain.

Daftar PustakaAgromedia. 2005. Anggrek: Anda bertanya, Pakar dan

Praktisi menjawab . Jakarta: Redaksi Agromedia Coleman, J. O. D., Evans, D.E., and Kearns, A. 2003.

Plant Cell Culture . New York: BIOS Scientific Publishers.

Ariebowo , Moekti dan Fictor Ferdinand P. 2007.   Praktis Belajar Biologi untuk Kelas XI . Jakarta. Penerbit : Grafindo .

Gunawan LW. 1992. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan Tana PAU

Bioteknologi IPB.Hendaryono dkk. 1994. Teknik Kultur Jaringan.

Yogyakarta: Kanisius. Sriyanti, Daisy P. dan Ari Wijayani. 2002.   Teknik Kultur

Jaringan : Pengenalan dan Petunjuk Perba nyakan Tanaman Secara Vegetatif- Modern . Kanisius, Yogyakarta.

Susilowati, Ari dan Shanti Listyowati. 2001. Keanekaragaman Jenis Mikroorganisme Sumber Kontaminasi Kultur In vitro di Sub-Lab. Biologi Laboratorium MIPA Pusat UNS. Surakarta : Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta