laporan praktikum biokimia 7 rx kromatografi lapis tipis

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

I. II. III.

Nomor Percobaan Nama Percobaan Tujuan Percobaan

: : :

VII (Tujuh) Kromatografi Lapis Tipis Untuk Mengetahui Cara Pemisahan Asam Amino Dengan KLT Dan Mengetahui Harga Rf Asam Amino

IV.

Landasan Teori

Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut. Banyak metode yang dapat dilakukan dalam pemisahan dan identifikasi asam amino, seperti metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu meteode yang paling banyak digunakan dalam pemisahan asam-asam amino adalah metode romatografi. Metode kromatografi merupakan metode pemisahan dua atau lebih

senyawa atau ion berdasarkan pada perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ion-ion tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Metode kromatografi bermacammacam, dapat digolongkan berdasarkan mekanisme pemisahannya serta alat yang digunakan. Salah satu jenis kromatograi adalah kromatografi lapis tipis (KLT). kromatografi jenis ini murah dan mudah dilakukan serta rutin digunakan di berbagai laboratorium. Asam amino mempunyai sifat yaitu dapat dipisahkan. Pada umumnya, asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh dengan campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masingmasing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut. Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri,WINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

1

mikrobiologi, kromatografi, dan elektroforesis. Salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi adalah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan

kromatografi penukar ion. Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut (Poedjiadi, 2005). Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetri, kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. salah satu metode yang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi. Macam-macam kromatografi ialah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion (Poedjiadi, 2005). Kromatografi adalah salah satu metode pemisahan fisik, dimana komponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa, salah satu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang luas, yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut sepanjang landasan stasioner. Fase stasioner dapat berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase bergerak dapat berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zatzat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, dan tentu saja laju pemisahan terlatak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda. Zat terlarut di dalam suatu fasa gerak mengalir pada suatu fasa diam. Zat terlarut yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan demikian senyawa-senyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat perbedaan migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam. Penggolongan kromatografi dapat didasarkan atas mekanisme

pemisahannya serta alat yang digunakan. Berdasarkan mekanisme pemisahannya, kromatografi digolongkan atas kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pasangan ion, kromatografi penukar ion, dan kromatografi eksklusiWINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

2

ukuran. Sedangkan berdasarkan alat yang digunakan, kromatografi dibedakan atas kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC), serta kromatografi gas. Kromatografi kertas adalah salah satu jenis kromatografi partisi, aitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis diteteskan sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung kertas dilarutkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini, asam-asam amino akan terpisah satu dengan yang lain, dan dengan menyemprotkan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang terpisah itu.Penggantung kertas

titik tempat asam amino

Pelarut

Kertas kromatografi

Kromatografi lapis tipis menggunakan aluminium oksida, serbuk selulosa atau silica gel sebagai absorben yang berupa lapis tipis yang diletakan di ata selembar kaca. Seperti halnya pada kromatografi kertas, larutan yang mengandung asam amino diteteskan di atas absorben dan dibiarkan bergerak. Pemisahan asamWINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

3

amino didasarkan perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan dua fase pelarut, misalnya pasangan fenol air, n-butanol air atau dengan tiga fase pelarut, misalnya n-butanol asam asetat air, dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Pada kromatografi partisi, kertas digunakan sebagai pendukung air (fase stasioner). Campuran komponen-komponen yang akan dipisahkan ditempatkan pada fase stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fasa mobile (zat cair), maka fasa mobile akan melalui fasa stasioner, sambil membawa komponen-komponen tersebut, dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan kecepatan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini disingkat dengan Rf (Rate of front).

Protein adalah molekul terbesar sebagai penyusun tubuh kita setelah air. Hal ini mengindikasikan pentingnya protein dalam menopang seluruh proses kehidupan dalam tubuh kita dalam kenyataannya, memang kode genetik yang tersimpan dalam untaian DNA digunakan untuk membuat protein. Protein berfungsi sebagai penyimpan dan pengantar seperti hemoglobin yang memberikan warna merah pada sel darah merah kita masih banyak lagi fungsi protein sepert hormon, antibodi dalam pertahanan tubuh.

Kromatografi Kertas Kromatografi kertas merupakan salah satu jenis kromatografi partisi, yaitu pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi kertas ini cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisisWINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

4

diteteskan sedikit pada kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung kertas dicelupkan ke dlam pelarut tertentu. Pelarut itu akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya pealrut organik, akan terbawa naik lebih jauh daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan terpisah satu dengan lain, dan dengan penyemprotan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut akan tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yang telah terpisah itu. Jarak yang telah ditempuh oleh suatu asam amino tertentu (b), dibandingkan dengan jarak yang ditempuh pelarut dari gas awal hingga garis akhir (a), lambang Rf. Harga Rf yaitu bila b/a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut tertentu. Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui macamnya pada kromatografi kertas, sehingg dapat diketahui macam asam amino yang diperiksa. Penentuan asam amino dapat dilakukan dengan menghitung harga Rf masing-masing asam amino, kemudian dibandingkan dengan harga Rf asam amino yang terdapat pada tabel yang ada.

Kromatografi penukar Ion Pemisahan asam amino dengan metode ini menggunakan polimer sintetik yang mempunyai gugu fungsi yang bersifat asam dan dapat melepaskan ion H+ atau bersifat basa dan dapat melepaskan ion OH-. Ion-ion tersebut dapat dilepaskan apabila ada ion lain yang dapat menggantikannya. Pada pelaksanaanya, larutan yang mengandung beberapa asam amino dituangkan di bagian atas suatu kolom penukar ino yang terdapat dalam sebuah tabung atau pipa gelas. Kemudian dilakukan elusi dengan jalan mengalirkan sutau larutan buffer (misalnya pH = 3,0) secara perlahan-lahan dari atas ke bawah.

Elektroferosis

WINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

5

Elektroferosis merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus alirtan fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.

Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi yang berdasarkan pada perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada pH tertentu. Keuntungan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan kromatografi kertas adalah noda yang ditimbulkan tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja yang diperlukan, juga tidak memerlukan waktu yang banyak. Kromatografi jenis ini menggunakan alumunium oksida, serbuk selulosa atau silika gel sebagai adsorben yang berupa lapis tipis yang diletakkan di atas selmbar kaca. Seperti halnya kromatografi kertas, larutan yang mengandung beberapa asam amino diteteskan di atas adsorben dan dibiarkan bergerak. Penggunaan fase gerak pada kromatografi lapis tipis biasanya menggunakan pelarut seperti : metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform. Sebagai persiapan untuk menggunakan kromatografi lapis tipis, bubk serbuk fasa diam diratakan terlebih dahulu pada lempeng kaca, ketebalan kaca tergantung pada tujuan pemisahan kromatografi. Untuk tujuan analisis, tebalnya kira0kira 0,25 mm sedangkan untuk praparatif 5 mm. Kecuali dipakai lapisan tipis gel maka setalah bubur merata maka lempeng dikeringkan. Kromatografi lapis tipis (KLT) seperti halnya kromatografi kertas tidak mahal dan sesederhan melakukannya, kromatografi ini memiliki keuntungan kecepatan diatas kromatografi kertas, prosesnya mungkin memerlukan waktu kirakira setengah jam. Kromatografi lapis taipis sangat terkenal dan digunakan secara rutin dalam banyak laboratorium. Teknik KLT ini dikembangkan pada tahun 1983 oleh Ismailoff dan Schraibar. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fasa diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam danWINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

6

terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan. Pemilihan sistem pelarut dan komposisi larutan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu mikro-syiringe (penyuntik berukuran mikro). Sampel diteteskan pada salah satu bagian tepi pelat kromatografi (sebanyak 0,01 10 g zat). Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat diciptakan dengan mengerok lapisan vertikal searah gerakan pelarut. Teknik ascending digunakan untuk melaksanakan pemisahan pada suhu kamar, sampai permukaan pelarut mencapai 15-18 cm. Waktu yang diperlukan antara 20-40 menit. Semua teknik yang digunakan untuk kromatografi kertas dapat juga digunakan dalam kromatografi lapis tipis. Zat-zat berwarna dapat dilihat langsung, tetapi juga dapat digunakan reagen penyemprot untuk melihat suatu bercak suatu zat. Asam kromat seringdigunakan sebagai pelarut organik. Untuk menempatkan posisi suatu zat, reagen dapat juga disemprotkan pada bagian tepi saja. Bagian yang dipeolrh lainnya dapat diperoleh kembali tanpa pengotoran dari reagen dengan penegrokan setelah pemisahan selesai. Kromatografi lapis tipis memiliki keuntungan jika dibandingkan dengan kromatografi kertas, diantaranya : 1. Noda zat yang timbul sesudah kromatografi tidak banyak melebar jika dibandingkan dengan noda semula oleh sebab itu maka hanya sedikit saja senyawa yang diperlukan. 2. 3. Tidak memerlukan waktu yang banyak Senyawa-senyawa yang tidak menguap serta terlalu labil untuk kromatografi cair dapat dianalisis dengan KLT 4. Dapat memeriksa adanya zat pengotor dalam pelarut.

Banyak senyawa-senyawa baik organik maupun anorganik yang dapat dipisahkan lewat kromatografi lapis tipis. Dengan menggunakan kromatografiWINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

7

lapis tipis maka akan didapatkan pemisahan yang lebih sempurna, kepekaan yang lebih tinggi, dan dapat dilaksanakan dengan cepat. Pada KLT terdapat adsorben yang bertindak sebagai fase stationer. Empat macam adsorben yang umum dipakai adalah silica gel (asam silikat), alumina (alumina oxide), kieselguhr (iatomeous earth), dan selulosa. Dari keempat macam adsroben di atas, yang sering dipakai adalah silika gel. Selain terdapat fasa stationer atau fasa diam, KLT juga memiliki fase gerak(eluen), yaitu pelarut dalam kromatografi lapis tipis. Sistem berair yang digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut miksotrop yang meliputi sifat hidrofob menaik seperti metanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, kloroform (kloroform yang distabilkan dengan etanol), ebnzen, sikloheksana, dan eter petroleum.


8

V.

Alat Dan Bahan Alat : Plat Kromatografi Selembar Kaca Penggiling Beker Gelas Pengaduk Magnetik Gelas Ukur Pipet Tetes Penyemprot Penggaris Pensil dan Oven Bahan : Silika Gel Pelarut Etanol Larutan Ninhidrin Larutan Kuprinitrat Larutan Histidin Larutan Alanin Larutan Asam Glutamat Larutan Aquades

VI.

Prosedur Percobaan Pembuatan lapis tipis Plat gelas yang dipakai harus bersih, terutama bebas dari lemak. Timbag 25 gram Silica gel G dan aduk ini dengan 50 ml air dengan pengaduk magnetik sampai homogen. Suspensi ini dimasukkan ke alat pembuatan lapis tipis (alat Stahl atau alat buatan dalam negeri). Tebal lapis tipis adalah sekitar 250 mu. Biarkan lapis tipis ini ditempatnya kira-kira 10 menit. Sesudah ini boleh dipindah tempatnya dan dibiarkan kering diudara selama semalam. Meneteskan larutan zat yang akan diperiksa Zat asam amino yang diperiksa, paling banyak 0,5 2,0 ug dalam 0,5 ul, diteteskan pada plat silica gel kira-kira 1 cm dari tepi bawah. Jika banyak macam zat yang akan diselidiki maka ini dapat diteteskan sejajar dengan jarak kira-kira 1 cm antara dua zat dan kira-kira 1,5 cm dari tepi sisi. Penetesan harus dilakukan dengan hati-hati seklai supaya permukaan lapis tidak rusak. Tempat-tempat pada plat yang akan ditaruh (ditetesi) dengan alrutan-larutan zat tersebut, sebelum diberi titik dengan ujung pensil yang runcing, guna mengetahui kelak titik-titik permulaan. Lubang-lubang yang


9

kecil ini tidak akan banyak mempengaruhi bentuk noda. Sebelum eluaen dijalankan maka tetesan-tetesan tersebut harus dibiarkan dulu sampai kering. Ruang Kromatografi Ruang kromatografi harus dapat ditutup dengan rapat. Ruang ini diisi dengan eluaen sedemikian sehingga apabila plat dimasukkan bagian bawahnya terendam sampai bawah tempat tetesan zat-zat yang diselidiki. Dinding ruang harus dilapisi dengan kertas saring yang dibasahi dengan eluen. Ini supaya ruang kromatografi mudah dan cepat dijenuhi dengan uap eluen. Cara melakukan elusi Plat-plat yang telah ditetesi asam amino dan yang telah kering, dimasukkan ke dalam ruang kromatografi. Disini yang dipakai adalah kromatografi mendaki. Hendaknya suhu dibuat tetap. Kromatografi diberhentikan setelah berjalan sekitar 10 cm. Pada batas ini semulad diberi tanda garis dengan ujung pensil yag runcing. Plat diambil dan dikeringkan pada suhu kamar. Cara perwarnaan a) Dengan hati-hati disemprot dengan larutan ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan dimasukkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apababila fase gerakj yang dipakai bersifat alkali. Kemudian plat dikeringkan pada 60oC selama 30 menit atau 110oC selama 1`0 menit. Kalau dipanasi lebih lama, maka nantinya plat akan berwarna sedikit rose. b) untuk menstabilkan noda-noda setelah diwarnakan dengan ninhidrin, maka plat kemudian disemprotkan dengan larutan penyemprot kuprinitrat (lihat bab metrial). Maka akan terjadi ikatan komplek Cu-ninhidrin yang berwarna. Warna ini hanya stabil apabila tidak ada asam bebas. Maka sesudah disemprot, plat harus dikenakan uap amonia. Juga plat tidak boleh terdisoasiasi dalam suasana basa antara pH 7-9. walau disosiasi ini reversibel. Di atas pH 9 disosiasi tersebut bersifta irreversibel.


10

VII.

Hasil Pengamatan Pada Pembuatan lapis tipis Pembuatan lapis tipis dengan silika gel pada lembar kaca menghasilkan lapisan berwarna putih. Pada Penetesan Larutan yang akan diperiksa. Zat asam amino yang akan diperiksa terdiri dari larutan asam amino Histidin, Tirosin, Alanin, Glutamin. Asam amino diteteskan pada jarak sekitar 2 cm dari tepi bawah. Tempat atau titik yang akan ditetesi terlebih dahulu dititik dengan ujung pensil yang runcing guna mengetahui letak titiktitik permulaan. Sebelum eluen dijalankan, tetesan itu harus dikeringkan terlebih dahulu. Zat yang diteteskan berupa larutan asam amino yang tidak berwarna. Setelah kering barulah lapis lipis pada kaca diletakkan dalam ruang kromatografi yang berisi eluen berupa etanol 60%. Panjangnya penyerapan eluen diatur hinggan 10 cm dari ruang titik permulaannya. Setelah eluen berjalan sampai 10 cm, penyerapan eluen dihentikan lembar kaca diambil dari kemudian dikeringkan. Kemudian untuk mengidentifikasikan warna, lembar kaca tersebut disemprotkan dengan larutan ninhidrin yang berwarna kuning muda bening. Sehingga larutan asam amino yang diteteskan tadi menimbulkan noda berwarna merah muda. Untuk menstabilkan warna yang dihasilkan agar tidak hilang maka lapis tipis disemprotkan dengan larutan kuprinitrat yang berwarna biru bening. Didapatkan warna dari noda warna merah muda itu menjadi warna biru. Kemudian dihitung jarak tempuh asam amino dari titik awal hingga akhirnya. No 1 2 3 4 Asam amino Histidin Glutamin Alanin Tirosin Jarak eluen (cm) 10 10 10 10 Jarak noda (cm) 6 8 9 9,5 Rf (cm) 0,6 0,8 0,9 0,95


11

VIII.

Analisa Data Menghitung harga Rf, yaitu perbandingan antara jarak yang ditempuh asam amino dengan jarak yang ditempauh pelarut dari awal hingga garis akhir. a) Pada Histidin, Rf =

6cm 0,6 10cm

c) Pada Glutamin, Rf = d) Pada Tirosin, Rf =

8cm 0,8 10cm

b) Pada Alanin, Rf =

9cm 0,9 10cm

9,5cm 0,95 10cm

IX.

Reaksi Kimia Reaksi asam amino alanin dengan ninhidrinO OH C C OH

C

+

H3C

CH

COOH

NH2

O

ninhidrin

alaninO

O OH C C OH HO C C H C

C

+ NH3

+

O O

ninhidrinO

hidridantin

HO C H

C

+C

H3C

CH

+ NH3 +

CO2

O

O

hidridantin


12

O

O

C C C N C

C

+C

3H2O

OH

O

diketodihidrindilendiketodihidrindamin warna biru ungu

REAKSI ASAM AMINO DENGAN ETANO L O H3N+

O O

C CH R

+

CH 3CH 2OH

H3N

+

C CH R OCH 2CH 3

+

H2O

Asam Amino

Etanol

REAKSI ASAM AMINO DENGAN NINHIDRINO C C C OH O

HOH

+

R

C

COOH

NH2

Ninhidrin NH 3

Asam Amino H

CO 2O C C C O

+OH H

R

C O

O C C C O OH OH

NinhidrinO C C C O

O C

N

C C O

+

3H 2OO

+

H

+

Berwarna merah muda


13

X.

Pembahasan

Pada percobaan kali ini berjudul Kromatografi Lapis Tipis pada asam amino yang bertujuan untuk mengetahui cara pemisahan asam amino dengan cara kromatografi lapis tipis dan menghitung harga Rf dari asamasam amino yang diselidiki. Reaksi antara ninhidrin dengan asam amino membentuk produk berwarna ungu. Pada percobaan kali ini media pemisahan yang digunakan adalah silica gel G pada lempeng kaca. Sebagai zat pengikat silica gel digunakan plester, yang juga disebut sebagai fase diam hidrofilik. Kemudian plat silica gel dibiarkan kering di udara. Kromatografi adalah suatu prosedur yang memungkinkan pemisahan campuran zat terlarut bergantung pada derajat pada mana berbagai zat terlarut diadsorpsi dibagi atau ditukar antara larutan asal (fase bergerak) dan suatu fase padat atau fase cair kedua, yang dikenal sebagai fase diam. Pada percobaan pemisahan dan identifikasi asam amino ini digunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Pada percobaan ini dilakukan identifikasi asam amino pada suatu sampel dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT), dimana dilakukan perhitungan nilai Rf beberapa asam amino yang digunakan dan asam amino sampel yang akan diidentifikasi. Adapun zat zat asam amino yang diperiksa diantaranya Alanin, Glutamin, Histidin dan Tirosin. Diteteskan pada plat kaca kira kira 2 cm dari tepi bawah plat yang diteteskan berjajar dengan jarak kira kira 2,7 cm. Lalu asam amino dimasukkan ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen. Eluen yang digunakan adalah 95 % alcohol dan air. Setiap asam amino memiliki koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Asam amino yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak (pelarut) yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan demikian asam amino dapat dipisahkan akibat perbedaan migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diamnya. Prinsip percobaan KLT ini didasarkan pada sifat fisik dan kimia asamWINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

14

amino. Sifat fisik ditunjukkan oleh kecepatan bergerak pada fase diam dari kertas kromatografi dan sifat kimianya berdasarkan pada warna ynag timbul ketika disemprot dengan larutan ninhidrin Adapun pembuatan lapisan tipis dengan menambahkan 30 gr silika gel dengan 55 ml air yang dituangkan kedalam plat kaca. Kemudian silikanya diratakan pada permukaan plat kaca yang telah diukur pinggir kanan-kirinya 2 cm dan diselotip. Perlu diperhatikan pada saat meratakan hanya dapat diratakan dengan satu perataan tidak boleh berulang-ulang agar didapatkan permukaan yang tidak bergelombang. Untuk melihat bercak zat asam amino digunakan larutan penyemprot ninhidrin. Asam asetat yang ditambahkan pada larutan penyemprot ninhidrin dimaksudkan untuk menjaga pH sekitar 5, juga apabila eluen yang digunakan bersifat alkali. Setelah disemprot, pada silica gel muncul bercak bercak atau noda. Noda yang dihasilkan oleh setiap larutan asam amino (Alanin, Histidin, Glisin, dan Tirosin) berwarna merah keunguan. Uji ninhidrin positif untuk semua asam amino yang memiliki gugus - amino bebas. Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, diperoleh nilai Rf untuk asam amino Tirosin adalah 0,95 asam amino Glutamin 0,8 asam amino Histidin 0,6 dan asam amino Alanin adalah 0,9. Hasil nilai Rf dari larutan sampel ini tidak ada yang sesuai dengan asam amino tersebut namun, nilainya mendekati dengan nilai asam amino serin atau alanin. Adanya kesalahan dari hasil percobaan yang dilakukan, yaitu perbedaan nilai Rf asam amino yang diperoleh dengan nilai Rf asam amino berdasarkan tabel, mungkin disebabkan karena saat melakukan proses elusi, chamber yang digunakan tidak terlalu rapat, atau dapat pula karena pembuatan eluaen yang tidak terlau tepat perbandingannya atau ini juga bisa terjadi karena adanya beberapa faktor yaitu pada saat penotolannya dilakukan berkali-kali pada tempat penotolan yang sama sehingga hasil penotolannya melebar, faktor yang lain pada saat proses elusi plat KLT mengenai larutan eluen sehingga asam aminonya menjadi larut dalam eluen.


15

XI.

Kesimpulan a) Kromatografi adalah suatu metode aalitik untuk pemurnian dan pemisahan senyawa-senyawa organic dan anorganik. Fraksionasi yang digunakan adalah campuran kompleks dan pemisahan untuk senyawasenyawa sejenis. b) Pada Pembuatan lapis tipis, plat kacanya yag digunakan harus benarbenar terbebas dari lemak, karena bila ada dapat mengganggu jalannya kromatografi. c) d) Pada kromatografi terdapat dua fase yaitu fase diam dan fase bergerak. Digunakan larutan cuprinitrat pada saat pewarnaan adalah untuk menstabilkan noda noda yang timbul karena terjadi ikatan kompleks Cu- ninhidrin yang berwarna. e) Nilai Rf asam amino Histidin adalah 0,6; asam amino Alanin adalah 0,9; asam amino Glutamin adalah 0,8; serta asam amino Tirosin adalah 0,95. f) Setiap asam amino memiliki koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Asam amino yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak (pelarut) yang lebih besar akan tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam.


16

XII.

Daftar Pustaka

Aisyah, 2008, Kromatografi, (online), (http://rgmaisyah.wordpress.com/ kromatografi, diakses tanggal 04 April 2012)

Anonim,

2008,

Kromatografi

Adalah,

(online),

(http://137maestro.

blogspot.com/ 2009/03/kromatografi-adalah.html, diakses tanggal 04 April 2012)

Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta

Lehninger, A. L., 1995, Dasar-Dasar Biokimia jiid 1, diterjemahkan oleh Maggy Thenawidjaja, Erlangga, Jakarta

Sukaryawan, Made. 2011. Petunjuk Praktikum Biokimia. Palembang: Universitas Sriwijaya


17

XIII.

Jawaban Pertanyaan

1) Menganalisa secara kualitatif dengan cara kromatografi lapis tipis satu dimensi. Sautu larutan asam amino yang bersedia. Dan hitung berapa harga Rfnya? Jawab : 25 gram silica gel dalam 50 ml air diaduk sampai homogen, kemudian dituangkan ke atas lempeng kaca yang telah diukur pinggir kanannya 2 cm dan ditempeli dengan plester. Setelah itu larutan silica gel dituangkan dan diratakan. Diamkan selama semalam. Setelah kering silica gel tersebut dikur dari bawah sepanjang 2,5 cm dan diberikan tanda atau garis. Pada garis itu ditotolkan dengan asam amnio, masingmasing adalah alanini, tripthofan, dan arginin. Lalu masukkan plat tersebut ke dalam ruang kromatografi yang telah diisi dengan eluen (etanol 95%). Stelah itu dikeringkan. Kemudian disemprotkan engan ninhidrin dan dikeringkan kemabli selama 30 menit. Kemudian disemprotkan kembali dengan kuprinitrat. Setelah itu diukur jarak asam amino tersebut adalah sebagai berikut serta harga Rf nya : Dari hasil pengamatan diketahui jarak yang ditempuh oleh pelarut untuk plat adalah 10 cm. sedangkan untuk asam amino adalah : Harga Rf =

jarakyangditempuholehasama min o , Maka : jarakyangditempuholeheluen

Pada Tirosin, Rf = Pada Glisin, Rf =

9,9cm 0,99 10cm

9,5cm 0,95 10cm9,7cm 0,97 10cm

Pada Fenilalanin, Rf = Pada sampel, Rf =

9,9cm 0,99 10cm


18

2) Tuliskan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino! Jawab : Reaksi asam amino alanin dengan ninhidrinO OH C C OH

C

+

H3C

CH

COOH

NH2

O

ninhidrinO OH C C OH

alaninO

C

HO

C C

+ NH3

+H

C

O O

ninhidrinO

hidridantin

HO C H

C

+C

H3C

CH

+ NH3 +

CO2

O

O

hidridantinO O

C C C N C

C

+C

3H2O

OH

O

diketodihidrindilendiketodihidrindamin warna biru ungu

3) Sebutkan factor-faktor yang mempengaruhi Rf pada KLT? Jawab : Kepolaran senyawa, jenis pelarut, jarak penetesan, dan fasa diam (adsorbennya).WINDA ARYANI (06091410004) FKIP KIMIA PALEMBANG

19

4) Terangkan bagaimana orang melakukan analisa kuantitatif suatu zat tertentu dengan cara kromatografi lapis tipis? Jawab : Dengan menyemprotkan lempeng dengan asam sulfat 50% atau 25% dalam eetanol kemudian dipanaskan sehingga semua bahan organic akan terbakar dan tampak sebagai noda-noda coklat. Mengamati lempeng dengansinar UV sehingga noda-noda yang menyerap sinar UV atau sebaliknya dengan memancarkannya. Bahan sample ditotolkan pada salah satu sudut lempeng sebagai suatu titik dan pemisahahn dilakukan setelah lmepeng kering. Kemudian dipisahkan lagi dengan satu system solven yang lain dengan arah tegak luus dari arah semula.

5) Terangkan bagaimana cara melakukan kromatografi lapis tipis dua dimensi dan bilakah orang terpaksa melakukan cara itu? Jawab : Dengan mengamati kepekatan warna yang diperoleh. Untuk cara ini, sample diteteskan dipojok kanan bawah dari plat TLC yang berukuran 20 x 20 cm, kira-kira 2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan pertama selesai, plat dikeringkan. Untuk mencegah terjadinya kerusakan senyawa yang dipisahkan selama pengeringan sebaiknya dilakukan dengan aliran gas N2. setelah dikeringkan, plat dikembangkan dengan menggunakan system pelarut yang kedua dengan memutar arah plat 90o. menggunakan cara ini mendapatkan hasil pengembangan yang lebih baik dengan penggunaan dua macam system pelarut, dan apabila pengembangan satu dimensi mendapatkan hasil yang kurang sempurna.


20

XIV.

Gambar Alat Plat Kromatografi Penyemprot

Selembar Kaca Penggaris

Beker Gelas Pensil

Pengaduk Magnetik

Oven

Gelas Ukur

Pipet Tetes

Batang pengaduk


21


22

laporan praktikum biokimia 7 rx kromatografi lapis tipis

Documents